Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение и характеристика цианобактериальных внеклеточных везикул

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

Настоящий протокол содержит подробные описания выделения, концентрации и характеристики внеклеточных везикул из культур цианобактерий. Также обсуждаются подходы к очистке везикул от культур в различных масштабах, компромиссы между методологиями и соображения по работе с полевыми образцами.

Abstract

Цианобактерии представляют собой разнообразную группу фотосинтетических грамотрицательных бактерий, которые играют решающую роль в глобальных экосистемах и служат важными биотехнологическими моделями. Недавняя работа продемонстрировала, что как морские, так и пресноводные цианобактерии продуцируют внеклеточные везикулы — небольшие мембранно-связанные структуры, высвобождаемые с внешней поверхности микробов. Хотя везикулы, вероятно, способствуют различным биологическим процессам, их специфическая функциональная роль в цианобактериальной биологии остается в значительной степени неизвестной. Для поощрения и продвижения исследований в этой области представлен подробный протокол для выделения, концентрации и очистки цианобактериальных внеклеточных везикул. В текущей работе обсуждаются методологии, которые успешно изолировали везикулы из крупных культур Prochlorococcus, Synechococcus и Synechocystis. Представлены методы количественной оценки и характеристики образцов везикул из этих штаммов. Описаны также подходы к выделению везикул из образцов водного поля. Наконец, обсуждаются типичные проблемы, возникающие при очистке цианобактериальных пузырьков, методологические соображения для различных последующих применений и компромиссы между подходами.

Introduction

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой сферические структуры диаметром ~20-400 нм, высвобождаемые практически всеми организмами в окружающуюих среду 1,2,3. Везикулы ограничены липидным бислоем и не могут воспроизводить себя. У грамотрицательных бактерий считается, что эти структуры в первую очередь возникают в результате «блеббинга» небольших порций от внешней мембраны. Тем не менее, другие процессы, включая жгутиковое движение, лизис клеток и секрецию как внутреннего, так и наружного мембранного материала, могут производить везикулы, а также 4,5. EV могут содержать различные биомолекулы, включая липиды, растворимые и мембранные белки, нуклеиновые кислоты и метаболиты, и могут транспортировать этот материал между клетками 4,5,6. Учитывая эти особенности, электромобили изучаются, чтобы понять их возможную роль в широком спектре биологических процессов, включая клеточную связь, образование биопленки, горизонтальный перенос генов, динамику фаг-хозяин и обмен питательными веществами 4,6.

Цианобактерии представляют собой большую и разнообразную группу грамотрицательных бактерий, включая одноклеточные и нитевидные организмы. Они представляют интерес со многих точек зрения, включая понимание их физиологии и разнообразия 7,8, критических функций экосистем, которые они выполняют 9,10, и их полезности для биотехнологии11,12. Цианобактерии встречаются в самых разных местах обитания, либо в виде свободноживущих организмов в морской, пресноводной и наземной средах, либо в симбиотических ассоциациях со мхами, папоротниками, растениями или в лишайниках и губках13. Они служат важнейшими первичными производителями в водных экосистемах, производя кислород и органический углерод посредством кислородного фотосинтеза 9,10, а некоторые способны также фиксировать атмосферный азот7. Морские и пресноводные цианобактерии, включая Prochlorococcus, Synechococcus и Synechocystis, производят EV в лабораторных условиях 14,15,16, а цианобактериальные везикулы также можно найти в естественной среде14,17. Биологические и экологические функции цианобактериальных везикул неизвестны, но дальнейшие исследования в этой области, вероятно, дадут новое понимание вопросов физиологии цианобактерий, дифференциации, коммуникационных стратегий, эволюции и трофических взаимодействий. Кроме того, способность цианобактериальных EV переносить различные категории биомолекул может иметь коммерческое применение 18,19.

Настоящий протокол описывает методы выделения и характеристики везикул из цианобактериальных культур и полевых образцов для обеспечения и поощрения более широкого изучения биологии цианобактериальных внеклеточных пузырьков. В то время как описанный здесь рабочий процесс аналогичен протоколам выделения и характеристики EV от других бактерий, цианобактериальные культуры и полевые образцы обычно содержат более низкие концентрации клеток и пузырьков, чем обычно наблюдаются с системами, связанными с хозяином или патогенными модельными системами 20,21,22. Таким образом, исследования цианобактериальных EV требуют особых соображений и оптимизации для культивирования и выделения пузырьков, которые дополнительно варьируются между штаммами и фонами сред. Поскольку ни один протокол не будет одинаково хорошо работать для всех штаммов, условий роста и последующих приложений, мы предоставляем несколько вариантов и обсуждаем компромиссы, чтобы исследователи могли определить подходы, наиболее подходящие для решения их экспериментальных вопросов.

Protocol

Штаммы цианобактерий получены из нескольких коллекций культур (подробнее см. Обсуждение ).

1. Культивирование цианобактерий

  1. Культивируйте морские цианобактерии Prochlorococcus и Synechococcus , следуя приведенным ниже шагам.
    1. Культивируйте штаммы Prochlorococcus и Synechococcus в поликарбонатных колбах с использованием соответствующей среды, такой как Pro99 или SN (см. Таблицу материалов). Для получения дополнительной информации, пожалуйста, смотрите ранее опубликованные ссылки23,24.
    2. Акклиматизируйте культуры, выращивая их через два-три переноса (1:20 разбавления культуры в свежие среды для каждого прохода) при желаемых условиях температуры и излучения, необходимых для эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные условия роста 23,25 включают температуру между 15-30 °C при излучении между 8-150 мкмоль фотонами m-2 s-1, но отдельные допуски деформации и оптима широко варьируются26 и должны быть установлены на основе рекомендаций из соответствующих инструкций по сбору культур или литературы. Мониторинг скорости роста с помощью флуоресценции культуры или проточной цитометрии23 и убедитесь, что культуры растут с постоянной экспоненциальной скоростью стационарного состояния до начала эксперимента.
    3. Осуществляют набор последовательных постепенных переходов от меньших к большим объемам, как только клетки достигают поздней экспоненциальной фазы (например, 20 мл < 250 мл < 2 л < 10 л < 20 л).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры большого объема не могут быть непосредственно привиты из небольших количеств исходной культуры. Обратите внимание, что более крупные культуры могут потребовать добавления буферов (таких как 1 мМ HEPES, pH 7,5 или 3,75 мМ TAPS, pH 8), наряду с дополнительным бикарбонатом натрия или пузырьками со стерильным воздухом24.
  2. Культивируют пресноводную цианобактерию Synechocystis sp. PCC 6803.
    1. Готовят культуру Synechocystis sp. PCC 6803 для использования в качестве инокулята, культивируя ее с аэрацией (пузырьковый воздух при 1 л/мин), при 30 °C, при 16 ч при свете (количество фотонов 50 мкмоль м-2 с-1) / 8 ч в темном режиме, до оптической плотности при 730 нм (OD730) 1,0 (экспоненциальная фаза) в среде BG1127.
    2. Инокулируют 30 мл этой культуры Synechocystis sp. PCC 6803 в 570 мл среды BG11 в OD730 0,05 в 1 л стеклянных газовых моющих баллонов.
    3. Дайте клеткам расти с аэрацией, при 30 °C, при 16-часовом свете (количество фотонов 50 мкмоль m-2 s-1) / 8 ч в темном режиме, до конечного OD730 1,0-1,5.

2. Отделение биомассы цианобактерий от фракции мелких частиц (пузырьков)

ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, рекомендуется отделять клетки от надосадочного вещества посредством центробежного гранулирования клеток. Однако, когда объемы культуры слишком велики для того, чтобы это было возможно, можно пропустить центрифугирование и перейти непосредственно к фильтрации целых культур с использованием капсульной фильтрации (этап 2.4).

  1. Выполняйте центрифугирование в отдельных ячейках (лучше всего для объемов до ~4 л, в зависимости от имеющейся емкости центрифуги).
    1. Автоклав или тщательно вымойте и очистите бутылки-центрифуги, используя сверхчистую воду типа I (см. Таблицу материалов), гарантируя, что не останется остаточного мыла или другого материала.
    2. Загрузите образцы культуры в соответствующее количество бутылок центрифуги и сбалансируйте их.
    3. Спиновые культуры для >10 000 х г при 4 °C в течение 10 мин. Если супернатант остается заметно мутным, увеличьте условия центрифугирования до 20 мин на максимальной скорости и повторите попытку.
    4. Тщательно декантируйте или пипеткой супернатант в чистый сосуд и переходите к одному из следующих вариантов фильтрации, упомянутых в шагах 2.2-2.4.
  2. Вариант 1: выполнить шприцевую фильтрацию с использованием фильтров 0,2 мкм (для объемов проб до ~50 мл).
    1. Заполните стерильный шприц объемом 50 мл питательной средой в значительной степени безклеточных клеток и отфильтруйте его через фильтр 0,2 (или 0,45) мкм полиэфирсульфона (PES) (см. Таблицу материалов). Соберите фильтрат в чистую, стерилизованную емкость.
    2. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока фильтр не засорится (например, становится трудно толкать шприцем). Замените его новым фильтром и продолжайте до тех пор, пока образец не будет тщательно отфильтрован.
  3. Вариант 2: выполнить вакуумную фильтрацию 0,2 мкм (до ~4 л).
    1. Тщательно промыть и очистить вакуумный аппарат с помощью воды сверхчистого класса типа I, подключив его к вакуумной ловушке и насосу (см. Таблицу материалов).
    2. Вставьте фильтр размером 0,2 мкм соответствующего диаметра и зажмите вакуумный аппарат.
    3. Добавьте небольшое количество образца культуры, следя за тем, чтобы вакуумное давление оставалось <10 фунтов на квадратный дюйм.
    4. Продолжайте фильтрацию языка и региональных параметров небольшими шагами до завершения. Если скорость фильтрации значительно замедляется, остановите вакуум и замените фильтр.
    5. Соберите фракцию <0,2 мкм, содержащую везикулы, в чистый контейнер.
  4. Вариант 3: выполнить капсульную фильтрацию 0,2 мкм (для объемов образца > ~4 л)
    1. Очистите гибкие трубки соответствующего размера и сосуд для сбора, промыв водой и мягким моющим средством. Промойте материал дистиллированной и деионизированной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед утилизацией материал должен быть промыт водой типа I - сверхчистой воды.
    2. Поместите культуру для фильтрации в безопасное, возвышенное место с конечным сосудом для сбора ниже. Подключите порт оттока капсульного фильтра 0,2 мкм (см. Таблицу материалов) к одному куску трубки и поместите его в коллекторный сосуд.
    3. Поместите еще одну трубку в образец, начните гравитационный сифон, втянув некоторый образец в трубку с помощью шприца, и подключите трубку к капсульному фильтру. Используйте вентиляционное отверстие для высвобождения избыточного воздуха и заполнения камеры надводным веществом.
    4. Позвольте материалу пройти через капсулу до тех пор, пока образец не будет тщательно отфильтрован. Если скорость потока становится слишком медленной (< ~ 1/10 начальногорасхода или выходит по каплям, в отличие от непрерывно текущего потока), подождите или приложите мягкую силу с перистальтическим насосом, пока не увеличится противодавление. В качестве альтернативы, частично восстановить скорость потока путем временного отключения фильтра, обратной промывки накопленной биомассы со стороны притока сверхчистой водой до тех пор, пока материал больше не станет видимым мутным, а затем возобновить процесс фильтрации.

3. Концентрация образца пузырьков

  1. Вариант 1: выполнить центробежную ультрафильтрацию для концентрирования небольшого (<500 мл) объема образцов.
    1. Промывайте ультрафильтрационные центробежные концентраторы ультрафильтрации 15-20 мл на выбор водой типа I - сверхчистой.
    2. Загрузите концентраторы в центрифугу и открутите при 4 400 x g при 4 °C. Отбросьте прогон и повторите этот шаг еще как минимум дважды.
    3. Загрузите образец супернатанта в промытые водой концентраторы и открутите в тех же условиях. В зависимости от целей эксперимента фильтрат образца может быть выброшен или собран для дальнейшей концентрации (с концентраторами с номинальным пределом молекулярной массы 3 кДа) и анализа.
    4. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока образец не будет сконцентрирован до конечного объема ~15-30 мл.
  2. Вариант 2: выполнить тангенциальную фильтрацию потока (TFF) для концентрирования большого (>500 мл) объема образца.
    1. Настройте аппарат TFF в соответствии с рекомендациями производителя (см. Таблицу материалов). Прикрепите перистальтический насос к впускной линии и установите регулируемые зажимы на ретентационную линию. Продезинфицируйте TFF по рекомендации производителя, а затем промыть устройство 1 л воды типа I – сверхчистой воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Линии всасывания и ретентата должны быть помещены в чистый резервуар для проб (стеклянную бутылку). Фильтратная линия (линии) должна (должны) быть направлена в сосуд для отходов или раковину.
    2. Добавьте < 0,2 мкм фильтрата в резервуар для проб. Медленно увеличивайте скорость насоса и уровни противодавления на ретентатной линии, чтобы увеличить производительность фильтратных линий.
    3. Продолжайте запускать TFF, заполняя резервуар питательным наполнителем по мере удаления материала. Избегайте выхода всасывающей линии из образца во время обработки, чтобы избежать введения пузырьков воздуха. Убедитесь, что давление подачи не превышает ~ 10 фунтов на квадратный дюйм и что ретентат вытекает из TFF в постоянном темпе обратно в резервуар.
    4. Прекратите концентрацию образца, как только объем в резервуаре достигнет минимально возможного количества, необходимого для поддержания потока в линию забора без введения пузырьков воздуха.
    5. Закройте линию оттока зажимом. Удалите противодавление на ретентатной линии и рециркулируйте концентрированный супернатант через фильтр в течение ~ 10 мин, уменьшая скорость рециркуляции до 20-40 мл / мин для максимального восстановления.
    6. Переместите ретентатную линию в чистый сосуд, извлеките всасывающую линию из образца и соберите концентрированный материал. Извлеките любой оставшийся материал в резервуаре для образцов с помощью пипетки.
    7. Фильтруйте концентрированный супернатант через шприцевой фильтр 0,2 мкм (этап 2.2), чтобы убедиться, что ячейки не останутся.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3.2.7 является необязательным.
    8. При необходимости храните конечный концентрат при 4 °C в течение ~ 3 недель, прежде чем перейти к очистке пузырьков (шаг 4).

4. Выделение и очистка везикул

  1. Гранулирование непосредственно ультрацентрифугированием, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Поместите концентрированный образец культуры <0,2 мкм в чистую ультрацентрифужную пробирку. Добавьте чистую среду или буфер по мере необходимости, чтобы убедиться, что трубка полностью заполнена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если конечный образец культуры слишком велик, чтобы поместиться в одну пробирку, либо гранулируйте материал в нескольких пробирках, которые должны быть объединены перед этапами промывки, либо гранулируйте последовательно в одной трубе.
    2. При необходимости создайте баланс и открутите при ~100 000 х г в течение 3 ч при 4 °C.
    3. Осторожно удалите супернатант пипеткой. В то время как гранулы цианобактериальных пузырьков могут показывать некоторую окраску, они часто невидимы.
    4. Промыть гранулированный материал путем добавления свежей питательной среды или промывочного буфера, такого как 1x фосфат-буферный физиологический раствор (PBS) (см. Обсуждение) в ультрацентрифужную трубку, перемешать путем щадящей пипетки и снова вращать, как на этапе 4.1.2. Повторите процесс стирки во второй раз.
    5. Повторно суспендируйте конечную гранулу в свежей культуре, многократно, но осторожно пипеткой вверх и вниз по дну трубки пипеткой объемом 1 мл. Переложить в чистый сосуд.
  2. Выполните ультрацентрифугирование градиента плотности.
    1. Подготовьте запасы йодиксанола (см. Таблицу материалов), создав 4-кратную концентрированную версию буферного фона, необходимого для образца (см. Обсуждение).
    2. Смешайте одну часть 4x буфера с тремя частями 60% йодиксанола, чтобы получить 45% раствор йодиксанола.
    3. Разбавляют 45% йодиксанола объемами 1x буфера для создания запасов градиентных сред при концентрациях 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% и 10% конечных концентраций йодиксанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее необходимое количество будет варьироваться в зависимости от мощности ротора/трубок ультрацентрифуги.
    4. Установите градиент плотности ультрацентрифуги, аккуратно наложив равное количество 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% и 0% иоксидинола в ультрацентрифужную трубку таким образом, чтобы весь объем трубки был использован.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец внеклеточного везикулы, подлежащий очистке, должен быть помещен в верхнюю часть градиента как часть 0% слоя йодиксанола. Если конечный объем образца везикул превышает размер слоя 0%, смешайте любой избыточный образец везикул с достаточным количеством 45% йодиксанола и/или буфера для получения требуемого объема 10% или более концентрационных запасов оптипрепа и используйте их в соответствующем месте в градиенте.
    5. Вращайте градиент при ~100 000 x g при 4 °C в течение 6 ч.
    6. Собирайте фракции (обычно по 0,5 мл каждая для градиента ~4,5 мл) путем тщательного пипетирования или с помощью дробного коллектора (см. Таблицу материалов).
    7. Определите плотность каждой фракции (в г/мл) с помощью аналитических весов и калиброванной пипетки для измерения веса известного объема образца. Извлеките образец из пробирки, определите вес и верните образец напрямую.
    8. Разбавьте отдельные фракции в новой ультрацентрифужной трубке с чистым буфером и промыть материал, как указано в шагах 4.1.2-4.1.4. В качестве альтернативы, используйте диализные или ультрафильтрационные колонны для восстановления частиц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цианобактериальные внеклеточные везикулы обычно мигрируют до плавучих плотностей ~1,14-1,19 г/мл в йодиксаноле.
  3. Храните везикулы при 4 °C, если они будут использоваться в течение 1-3 недель. Заморозьте везикулы при -20 °C или -80 °C, если они не используются дольше этого периода.

5. Характеристика изолированных пузырьков

  1. Выполнить электронную микроскопию с отрицательным пятном (см. Таблицу материалов) (ТЭМ; размер частиц, структура, чистота).
    1. Для улучшения качества изображения тлеющий разряд на поверхности сетки ТЭМ с прежним покрытием использует систему тлеющего разряда в соответствии с рекомендациями производителя (см. Таблицу материалов).
    2. Осторожно нанесите ~5 мкл образца пузырька и оставьте на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с концентрацией пузырьков >109 мл-1, как правило, дают наилучшие результаты; более разбавленные образцы будут иметь мало везикул на изображение.
    3. Извлеките образец, прикоснувшись краем сетки к куску чистой фильтровальной бумаги.
    4. Пипетируйте 20-50 мкл капли 2% уранилацетата (см. Таблицу материалов) на плоскую поверхность, покрытую полиэтиленовой пленкой, и поместите сетку, плавающую поверх нее в течение 2 мин.
    5. Удалите уранилацетат с помощью фильтровальной бумаги и ненадолго поплывите на капле сверхчистой воды для мытья. Повторите промывку водой во второй раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная сухая сетка готова к визуализации после этапа 5.1.5.
  2. Выполните окрашивание ультратонких участков для ТЭМ (размер частиц, внутренняя структура).
    1. Повторно суспендируют гранулу со стадии 4.1.5 с 1 мл 2,5% глутаральдегида в буфере какодилата натрия 0,1 М (рН 7) (см. Таблицу материалов) и фиксируют образец в течение 2 ч при 4 °C.
    2. Отжим при ~100 000 х г в течение 1 ч при 4 °C.
    3. Тщательно вымойте гранулу с буфером 0,1 М какодилата натрия (рН 7), а затем открутите при ~100 000 х г в течение 1 ч при 4 °C.
    4. Зафиксируйте гранулу 1 мл 1% тетроксида осмия (см. Таблицу материалов) (приготовленный в 0,1 М буфере какодилата натрия) в течение 1 ч, а затем промыть, как на этапе 5.2.3.
    5. Обезвоживать образец 1 мл восходящего ряда этанола (50%, 70%, 90% и два раза в абсолютном этаноле) с шагом по 10 мин каждый при 4 °C.
    6. Добавьте 250 мкл эпоксидной смолы (см. Таблицу материалов), смешанной с абсолютным этанолом (1:1), в гранулу и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
    7. Переложить гранулу на 500 мкл чистой смолы в течение 24 ч. Затем инкубируют смолу при 65 °C в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь смола готова к разделению ультрамикротомом в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    8. Окрашивают сетки, содержащие срезы, 2% уранилацетатом (в 50% этаноле) в течение 5 мин. Осторожно мойте горки под проточной деионизированной водой в течение 10-15 с каждая. Поместите каплю цитрата свинца (см. Таблицу материалов) и окрашивайте еще на 5 мин.
    9. Вымойте, как и раньше, удалите воду, промокав сетку на фильтровальной бумаге, и высушите сетки на воздухе. Визуализация с помощью TEM в соответствии с рекомендациями производителя (см. Таблицу материалов).
  3. Выполните анализ отслеживания наночастиц (NTA) (размер частиц, концентрация).
    1. Используя бумагу для линз, тщательно протрите любую пыль или видимый материал с оптической плоскости. Проверьте, все ли уплотнительные кольца и другие уплотнения чистые и неповрежденные. Включите прибор и запустите программное обеспечение.
    2. Используя чистый шприц, наполните камеру сверхчистой водой. Убедитесь, что пузырьки воздуха отсутствуют.
    3. Нажмите « Запустить камеру» и визуализируйте оптимальную область камеры с помощью «отпечатка пальца». Отрегулируйте ступень микроскопа по горизонтали или вертикали по мере необходимости, чтобы интенсивность сигнала была равномерной по всей изображенной области. Переместите область изображения горизонтально относительно отпечатка пальца (вправо, к вертикальной линии), найдя область поблизости с низким фоновым сигналом.
    4. Сдвиньте ползунки «Усиление экрана» и «Уровень камеры» до максимума, а затем уменьшите его до самого низкого уровня, чтобы увидеть самые тусклые частицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные настройки для цианобактериальных везикул используют усиление экрана 7 и уровень камеры между 10-12.
    5. Отрегулируйте фокус по мере необходимости, чтобы частицы были примерно одинаково видны в поле зрения. Продолжайте проталкивать сверхчистую воду через камеру, пока визуально не подтвердите, что камера чистая.
    6. Удалите остаточную воду из камеры с помощью другого шприца.
    7. Исследуйте образец среды/буфера, в котором находится ваш образец, чтобы определить фоновую концентрацию частиц, заполнив камеру средой/буфером с помощью чистого шприца объемом 1 мл.
    8. Выберите Стандартное измерение в раскрывающемся списке СОП . Измените настройки, чтобы собрать по крайней мере три технические реплики видео по 60 секунд каждая. Нажмите Создать и запустить сценарий и следуйте инструкциям на экране. Протолкните ~100 мкл образца в камеру между репликами.
    9. Когда сбор будет завершен, удалите остаточный буфер шприцем, промойте 3-5 мл сверхчистой воды через камеру и удалите оставшуюся воду.
    10. Добавьте образец пузырьков в камеру с помощью шприца объемом 1 мл и подтвердите настройки сбора. Если количество частиц не находится в линейном диапазоне прибора (обычно от 20 до 80 частиц на кадр), образец необходимо будет разбавить или сконцентрировать. Поместите не менее 500 мкл образца в камеру перед сбором данных.
    11. Собирайте видеоданные, как на шаге 5.3.8, обязательно очищая камеру сверхчистой водой между различными образцами.
    12. Собрать все последующие образцы из одного и того же организма/эксперимента, используя идентичные настройки камеры для обеспечения сопоставимости данных; изменения в настройке «Уровень камеры» могут оказать заметное влияние на полученные конечные значения.
    13. Определите параметры частиц с помощью раздела анализа программного обеспечения. Выберите Анализ > Открыть эксперимент и загрузите файл образца. Выберите Обработать выбранные файлы и дождитесь завершения анализа. Убедитесь, что для всех последующих образцов из того же эксперимента используется одинаковое пороговое значение обнаружения .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку цианобактериальные везикулы часто тусклые, порог обнаружения, как правило, необходимо настроить на наиболее чувствительное (самое низкое) значение.
  4. Выполняйте динамическое рассеяние света (DLS) (размер частиц, дзета-потенциал).
    1. Фильтруйте через фильтр размером пор 0,2 мкм для любого образца, который попадает в DLS, чтобы отсеять крупные частицы, которые мешают измерениям.
    2. Добавьте 1 мл среды/буфера в чистую кювету для изучения возможных агрегаций или других наночастиц, поступающих из среды. Положите кювету с матовой стороной слева в микропробоотборник и закройте крышку. Дайте образцу уравновеситься не менее 5 минут.
    3. Введите показатель преломления материала и поглощение материала, если они значительно отличаются от значений по умолчанию для воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свойства материала будут иметь очень небольшое влияние, если везикулы меньше 100 нм. При измерении поверхностного потенциала (дзета-потенциала) электромобилей везикулы должны быть повторно суспендированы в исходной среде роста.
    4. Нажмите на Панель управления приборами , чтобы проверить показания и начать сбор данных, нажав на зеленый значок. Если значения выглядят хорошо и ваш носитель/буфер не содержит агрегаций или других частиц, теперь вы готовы измерить свой образец.
    5. Добавьте 1 мл образца пузырьков в чистую кювету и соберите данные, как указано в шаге 5.4.4. Соберите не менее трех технических реплик по 10 минут каждая.
  5. Выполните анализ липополисахарида (LPS), чтобы подтвердить, что грамотрицательные EV присутствуют в образце.
    1. Нагревание денатурированного везикулного образца при 95 °C в течение 10 мин в стандартном буфере образца 1x Laemmli (см. Таблицу материалов).
    2. Инкубировать с 0,2 ЕД протеазы ТИПА XIV из Streptomyces griseus (см. Таблицу материалов) при 37 °C в течение 30 мин для удаления загрязняющих гликопротеинов.
    3. Отдельные обработанные образцы методом электрофореза на денатурации 16% (мас./об.) SDS-полиакриламидных гелей в соответствии с ранее опубликованным протоколом16.
    4. Для обнаружения ЛПС окрашивайте гель либо коммерчески доступными наборами окрашивания, либо модифицированной техникойокрашивания серебром 28. Количественная оценка относительного изобилия ЛПС путем денситометрического анализа окрашенных гелей в соответствии с ранее опубликованными ссылками29,30.

6. Измерение скорости производства везикул

  1. Используя анализ отслеживания наночастиц, как на этапе 5.3, или эквивалентную технологию, измерьте концентрацию частиц в среде роста для эксперимента. Если обнаружено большое количество частиц, отфильтруйте через поровой фильтр 0,1 мкм и повторно проверьте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму погрешность, концентрация фоновых частиц в среде должна составлять менее 10% от концентрации частиц, обнаруженной в культурах при самой низкой плотности.
  2. Акклиматизируйте культуру путем выращивания клеток в течение по меньшей мере двух последовательных последовательных переносов в условиях среды и окружающей среды, необходимых для экспериментов, как на этапе 1.1.2. Культуры должны передаваться, все еще находясь в фазе экспоненциального роста. Обеспечить, чтобы измеренные темпы роста культуры были последовательными во всех передачах; если нет, продолжайте передачу культур до тех пор, пока темпы роста не станут воспроизводимыми.
  3. Собирайте образцы с временным курсом после прививки и регулярно интервалов по всей кривой роста в раннюю стационарную фазу. Сдвиньте временные точки, чтобы иметь как минимум 3-4 образца, собранных во всем диапазоне экспоненциального роста. Чтобы выполнить выборку в каждый момент времени, выполните следующие действия.
    1. Фильтруйте 1 мл или более культуры непосредственно через чистый, стерильный шприцевой фильтр 0,2 мкм и сохраняйте фильтрат для измерения концентрации везикул, как на этапе 5.3. При желании заморозьте образцы тайм-курса. Используйте относительную флуоресценцию для отслеживания динамики роста культуры.
    2. Сохраните образец всей культуры для определения размера популяции с помощью метода, подходящего для организма (проточная цитометрия; покрытие колоний; или иным образом).
  4. Получение измерений клеток и пузыреобразных частиц (на мл) в каждой точке времени.
  5. Определите временные точки, которые произошли во время фазы экспоненциального роста. Чтобы вычислить r, количество везикул, образующихся на клетку за поколение, между двумя точками во время экспоненциального роста (обычно в начале и конце временного хода), используйте уравнение, приведенное в дополнительном файле 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод действителен только в условиях устойчивого роста; лежащие в основе допущения и выводы расчетов подробно описаны в ссылке14.

Representative Results

На рисунке 1 представлен обзор процесса выделения цианобактериальных пузырьков с выделением ключевых аспектов протокола, описанного здесь. Особо следует отметить этапы, детализирующие отделение биомассы цианобактерий от фракции мелких частиц (везикул), концентрацию образца везикул и выделение и очистку везикул (фиг.1, этапы 2-4), которые имеют решающее значение для получения воспроизводимых препаратов везикул. На рисунке 2 представлены репрезентативные результаты выделения и характеристики внеклеточных везикул из цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Было показано, что внешняя мембрана этой цианобактерии содержит каротиноиды31, которые придают характерную оранжевую окраску образцам везикул, собранным путем прямого гранулирования посредством ультрацентрифугирования (рисунок 2A). После того, как гранула везикулы повторно суспендирована, везикулы могут быть исследованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), либо путем отрицательного окрашивания образцов уранилацетатом (рисунок 2B), либо путем наблюдения ультратонких срезов (рисунок 2C). Распределение и концентрация везикул по размерам могут быть оценены с использованием динамического рассеяния света (DLS) (рисунок 2D) и анализа отслеживания наночастиц (NTA) (рисунок 2E). С помощью описанного протокола обычно ~3,5 ± 1,0 х 108 наночастиц на мл были получены в экспоненциально растущей культуре Synechocystis sp. PCC 6803 при OD730 1,0. Биохимический анализ изолированных EV может быть проведен для дополнения физической характеристики изолированных везикул. В качестве примера, очищенные везикулы Synechocystis sp. PCC 6803 были отделены на SDS-полиакриламидном геле и окрашены для липополисахаридов (LPS; Рисунок 2F). Поскольку ЛПС специфичны для наружной мембраны32, обнаружение ЛПС может подтвердить наличие связанных с мембраной везикул и служить маркером для анализа относительного содержания пузырьков между препаратами из того же штамма33. Проверка относительного содержания низкомолекулярных ИНС с высокой молекулярной массой может указывать на изменения состава везикул между образцами34,35.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальные процедуры, используемые для выделения и характеристики цианобактериальных EV. Схематические изображения растущих культур (1) и отделение биомассы цианобактерий от питательной среды (2). Бесклеточные образцы, содержащие везикулы, концентрируют (3), а затем EV выделяют и очищают (4). В зависимости от применения, препараты везикул могут быть охарактеризованы с использованием одной или комбинации просвечивающей электронной микроскопии (TEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA), динамического рассеяния света (DLS) и профилирования липополисахарида (LPS) (5). RT, комнатная температура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты выделения и характеристики внеклеточного пузырька для цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Фотография внеклеточной пузырьковой гранулы (гранулы EV), полученной после ультрацентрифугирования концентрированной бесклеточной внеклеточной среды из культуры Synechocystis sp. PCC 6803 объемом 600 мл, выращенной до OD730 1,0-1,5. Обратите внимание на типичную оранжевую окраску пузырьковой гранулы, полученной из каротиноидов, обнаруженных во внешней мембране. (В,С) Просвечивающая электронная микроскопия (TEM) фотографии отрицательно окрашенных (B) и ультратонких срезов (C) образцов везикул Synechocystis sp. PCC 6803. Шкала баров: 200 нм и 50 нм соответственно. Образцы визуализировали на просвечивающем электронном микроскопе, работающем на 80 кВ. (D) График типичного динамического рассеяния света (DLS), изображающий распределение объема везикул в зависимости от диаметра везикул (в нм). Цветные линии обозначают данные трех технических реплицированных измерений одного и того же образца. (E) Репрезентативный анализ отслеживания наночастиц (NTA) данных о распределении по размерам внеклеточных везикул Synechocystis (в нм). Черная линия указывает среднее значение трех технических реплик, а красные линии представляют стандартную ошибку среднего значения. (F) Профиль липополисахаридов (ЛПС) был обнаружен после отделения препарата пузырчатых пузырек электрофорезом на 16% (мас./об.) SDS-полиакриламидном геле и окрашивания коммерческим комплектом окрашивания LPS. Низко- и высокомолекулярные ЛПС, соответствующие грубым и гладко-ЛПС формам, соответственно, поддаются обнаружению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Уравнение для вычисления r. Количество везикул, образующихся на клетку за поколение между двумя точками во время экспоненциального роста (обычно в начале и конце временного хода), определяется с помощью этого уравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Общие соображения
Протокол (рисунок 1) представлен в виде набора опций, чтобы подчеркнуть, что не существует универсального метода для работы с цианобактериальными внеклеточными везикулами. Заинтересованные исследователи могут использовать разделы этого протокола, которые совместимы и подходят для их конкретного модельного организма, экспериментальных вопросов / целей и доступности оборудования. Все подходы к изоляции везикул предполагают компромиссы и неизбежно приведут к некоторой степени предвзятости. Хотя следует стремиться свести это к минимуму, когда это возможно, наиболее важным соображением является обеспечение того, чтобы используемая подробная методология представлялась в соответствии с соответствующими руководящими принципами MISEV (Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул)36.

Рост культуры
Цианобактериальные культуры могут быть легко получены из одной из многих коллекций культур, доступных во всем мире. Вот несколько примеров: Коллекция культур Роскофф (Station Biologique de Roscoff, Франция), Коллекция культур Пастера (Институт Пастера, Париж, Франция) и Национальный центр морских водорослей и микробиоты Провасоли-Гийяр (NCMA, Мэн, США). Выбранный цианобактериальный штамм должен культивироваться в соответствующей среде и условиях окружающей среды, значительно варьирующихся между различными штаммами. Список широко используемых носителей для культивирования цианобактерий можно найти на веб-сайтах коллекций культур или других публикациях 37,38,39.

Работа с цианобактериальными внеклеточными везикулами представляет некоторые уникальные проблемы по сравнению с методологиями, представленными для многих типичных модельных лабораторных гетеротрофов. Цианобактериальные культуры имеют концентрации пузырьков на порядки ниже, чем у других микробов, таких как Escherichia coli 14,16,40. Эти различия, предположительно возникающие из-за более низкой плотности клеток и/или скорости производства пузырьков, означают, что для получения достаточного количества материала для объемного анализа могут потребоваться относительно большие культуры (~1-20 л или более). Таким образом, исследователям предлагается проверить урожайность везикул из более мелких культур, чтобы определить, сколько материала потребуется для достижения желаемых конечных целей. Важность установления того, имеет ли среда, используемая для эксперимента, обнаруживаемый фон твердых частиц, также должна быть подчеркнута перед началом любого эксперимента, поскольку этот материал может потенциально запутать количественную оценку популяции везикул, снизить чувствительность измерений концентрации / размера везикул или загрязнить конечные препараты везикул.

Еще одна проблема для этой области заключается в том, что не все цианобактерии хорошо растут или вообще в чистой культуре. До тех пор, пока они не станут аксеническими, интерпретации физических характеристик везикул, скорости производства или содержимого не обязательно могут привести к четким выводам о везикулах, производимых каким-либо одним штаммом в сообществе. Исследователям также рекомендуется рассмотреть, какие другие типы частиц могут присутствовать и потенциально путаться с везикулами с помощью конкретных инструментов анализа наночастиц, которые не обязательно могут различать различные типы частиц. Например, может быть важно убедиться, что используемый штамм не имеет профага, либо с помощью секвенирования генома, индукционных анализов или других средств, либо не высвобождает другие типы твердых частиц. По нашему опыту, большинство цианобактериальных везикул имеют диаметр <0,2 мкм, но при рассмотрении нового штамма или состояния роста следует подтвердить, изменяет ли использование фильтра размером 0,45 мкм распределение очищенных частиц по размерам.

Многие аспекты условий культивирования могут влиять на выработку везикул и ихсодержание 41,42. Таким образом, физические и химические условия, используемые для роста культуры (включая световое излучение, температуру и состав среды), должны быть задокументированы и контролироваться в возможной степени для обеспечения воспроизводимости результатов. Любой химический анализ содержимого пузырьков должен учитывать фоновый состав, особенно при проведении высокопроизводительных анализов в стиле «-омики». Это может быть особенно важно при использовании неопределенных сред, таких как те, которые основаны на естественном фоне морской воды или дополнены дрожжевым экстрактом или триптоном. Использование определенной питательной среды может быть предпочтительным в зависимости от экспериментальных целей.

Исследователи должны тщательно отслеживать динамику роста культуры через регулярные промежутки времени, чтобы убедиться, что они знают, где в фазе роста находится данная культурная культура, а не просто собирают образцы через произвольное количество времени. Состав везикул может варьироваться в зависимости от фаз роста, особенно между экспоненциальной и стационарной фазами41,42. Например, по меньшей мере некоторая часть везикул, отобранных в стационарной фазе, может возникнуть из-за другого клеточного механизма, такого как лизис клеток, который не будет происходить во время экспоненциального роста. Хотя это все еще может представлять большой биологический интерес, важно знать образец. Если культура цианобактерий достигает желаемой фазы роста в то время, когда невозможно перейти непосредственно к концентрации образца, рекомендуется немедленно отделить клетки от фракции <0,2 мкм (с центрифугированием и/или прямой фильтрацией 0,2 мкм), а затем хранить бесклеточный фильтрат при 4 °C. Материал может храниться таким образом в течение нескольких дней практически без заметного влияния на концентрацию или распределение везикул по размерам.

Очистка везикул
Частая необходимость выделения везикул из культур значительного объема имеет жизненно важное значение в рабочем процессе выделения цианобактериальных пузырьков. При работе с большими объемами материала везикулы должны быть сконцентрированы перед рабочими процессами последующего разделения. Концентраторы (тангенциальные фильтрующие мембраны или центробежные колонны) с номинальным пределом молекулярной массы 100 кДа обычно рекомендуются, поскольку они позволяют отделяться от растворимого материала с низкой молекулярной массой при сохранении разумного времени концентрации, но фильтры 30 кДа также часто используются с успехом. В то время как несколько методов очистки везикул, не основанных на ультрацентрифугировании (например, хроматография с исключением размера, системы на основе микрофлюиды, методы захвата аффинности и подходы, основанные на осаждении), становятся популярными во внеклеточном пузырном поле, по нашему опыту, эти подходы могут привести к снижению урожайности и, как правило, несовместимы с необходимыми объемами культуры.

Исследователи должны рассмотреть состав фона йодиксанола и буферов промывки / ресуспенсии, используемых во время очистки пузырьков, чтобы убедиться, что они совместимы с желаемыми последующими приложениями. Во многих случаях конечный образец пузырьков может быть повторно суспендирован в питательной среде или определенном буфере, сопоставимом по составу со средой роста (например, естественная или искусственная морская вода). Однако это может быть невозможно с морскими цианобактериальными везикулами, что потребует дальнейших экспериментальных манипуляций для анализа, поскольку высокие концентрации соли, аналогичные уровням морской воды, могут ингибировать многие ферментативные реакции. В таких случаях стандартные лабораторные буферы, такие как 0,2 мкм с фильтрацией, 1x PBS, обычно хорошо работают для поддержания стабильности морских цианобактериальных везикул и могут быть более совместимы с последующими экспериментальными процессами.

Очистка градиента плотности может считаться необязательной в зависимости от экспериментальных целей и состава культуры, но настоятельно рекомендуется для получения более строго чистого и воспроизводимого образца. Популяции EV неоднородны и могут быть найдены в диапазоне плавучих плотностей, которые дополнительно варьируются в зависимости от штамма, условий роста и других факторов 4,5,6. Плотности, перечисленные выше, представляют собой те, которые обычно встречаются для везикул из цианобактериальных культур и полевых образцов в йодиксаноле, но результаты в других штаммах могут варьироваться. Другие материалы градиента плотности, такие как сахароза и CsCl, могут быть использованы для везикул, но они будут мигрировать в различные плавучие плотности на этих фонах. Различные градиентные фоны среды могут искажать восстановление вирусов, содержащих липиды43, и потенциально могут влиять на восстановление везикул из различных штаммов.

Везикулы могут быть потеряны в нескольких точках в результате изоляции везикул и описанного здесь процесса градиентной очистки, снижающего выход и увеличивающего количество исходного материала, необходимого для достижения заданного конечного выхода везикул для последующих применений. Особую осторожность следует соблюдать при работе с пузырьковыми гранулами после ультрацентрифугирования. В то время как некоторые цианобактериальные везикулы могут иметь каротиноиды или другие соединения, которые могут придавать образцам везикул некоторое количество пигментации (рисунок 2), в зависимости от штамма или количества материала, не обязательно ожидать, что они смогут визуализировать гранулы везикул напрямую. Имейте в виду, где гранула должна быть предоставлена типу используемого ротора центрифуги. Когда это возможно, очищенные образцы пузырьков предлагается исследовать с помощью электронной микроскопии для проверки состава конечного восстановленного материала.

Влияние условий хранения на везикулы и их содержимое остается открытым вопросом. Хотя установлено, что хранение не оказывает заметного влияния на размер цианобактериальных пузырьков или концентрацию14, функциональность изолированных препаратов везикул может изменяться с течением времени44. Хотя циклов замораживания/оттаивания следует избегать, когда это возможно, воздействие замораживания образцов на общее количество и размеры пузырьков представляется минимальным. Следует знать о возможности циклов замораживания-оттаивания влиять на состав содержимого пузырьков, таких как длина нуклеиновых кислот, связанных с везикулами, или стабильность белков.

Везикулы из амплов field s
Современные методы выделения внеклеточных везикул из естественной водной среды концептуально и функционально аналогичны описанным здесь для культур большого объема. Тем не менее, они могут потребовать еще больших объемов материала. Такие полевые образцы могут включать сбор, фильтрацию и концентрацию от сотен до тысяч литров воды для получения достаточного количества материала для анализа. В зависимости от мутности используемого образца может потребоваться включение одной или нескольких стадий предварительной фильтрации перед фильтром 0,2 мкм. Конкретное используемое устройство TFF должно быть подходящим для работы с такими большими объемами в разумный промежуток времени (в идеале в порядке часов) и без чрезмерного давления на образец. На практике это часто предполагает использование гораздо большей общей площади поверхности, чем может быть применено к образцам на основе культур, а также трубок большего диаметра для облегчения увеличения скорости потока. Такое увеличение площади поверхности фильтра, вероятно, приведет к незначительному увеличению потерь частиц по сравнению с меньшими структурами TFF и большим конечным объемом концентрата; однако эти проблемы должны быть сбалансированы с учетом общего времени обработки. Для таких ситуаций, как расширенный океанографический круиз, когда образцы не возвращаются в лабораторию в течение многих дней после отбора проб, мы рекомендуем проводить начальную фильтрацию 0,2 мкм и этапы TFF в полевых условиях. Этот меньший объем концентрированного материала затем может храниться при 4 °C или -80 °C на борту (в зависимости от наличия и последующих аналитических соображений) до тех пор, пока он не будет возвращен в лабораторию для окончательной обработки.

Выделение и отделение внеклеточных везикул от других мелких частиц, как органических, так и неорганических, может быть сложной задачей, а методы разделения различных частиц еще не совершенны. Например, градиенты плотности йодиксанола могут не легко разделять все классы везикул и вирусов, присутствующих в данном образце. Поскольку типы смешивающих частиц и их физические свойства будут варьироваться между участками отбора проб, в настоящее время невозможно обеспечить протокол, который будет надежно разделять все классы мелких водных частиц. Метод проб и ошибок имеют важное значение, и для максимального разделения потребуются эксперименты с диапазоном йодиксанола, используемым в условиях градиента и ультрацентрифугирования; может также потребоваться набор меньших по объему, более мелко разрешаемых фракций плотности. В зависимости от контекста, использование градиентов CsCl вместо йодиксанола может помочь отделить частицы окружающей среды45. Тем не менее, изменение осмотических условий может привести к смещениям в конечных восстановленных продуктах, как обсуждалось выше.

Характеристика везикул
Приборы для анализа наночастиц еще не доступны в микробиологических лабораторных условиях, но становятся все более доступными. Все методологии имеют свои плюсы и минусы, и мы не делаем конкретного одобрения одной платформы как лучшей, чем все другие, для работы с цианобактериальными пузырьками; действительно, все они имеют особые компромиссы в отношении затрат, разрешения, простоты использования, пределов обнаружения, совместимости с различными средами роста/буферными фонами и воспроизводимости данных. В дополнение к приборам, основанным на анализе отслеживания наночастиц, описанном выше, могут быть применены другие подходы, включая нанопотоковую цитометрию, микрофлюидное резистивное импульсное зондирование и перестраиваемое резистивное импульсное зондирование46,47. Пользователи должны быть осторожны, чтобы узнать детали имеющихся у них приборов и убедиться, что они хорошо работают с их системой, так как мы столкнулись с трудностями при использовании некоторых платформ с носителями на основе морской воды. Мы призываем эту область перейти к количественной характеристике размера везикул, концентраций и темпов производства. Измерение концентраций пузырьков на основе фундаментальной частицы на мл, а не с точки зрения содержания белка или других показателей, позволит интегрировать везикулы в более количественные рамки и обеспечить взаимное сопоставление между штаммами и условиями. Необходимы дальнейшие усилия по улучшению возможности калибровки измерений концентрации для частиц <100 нм.

Тот факт, что измерения скорости производства везикул проводятся непосредственно из 0,2 мкм фильтрованного супернатанта культуры для минимизации потерь частиц, будет связан с другими этапами очистки, описанными выше. Однако это означает, что подход не обязательно различает фактические внеклеточные везикулы и другие мелкие частицы, обнаруженные в культурах. Только подсчет частиц в пределах определенных диапазонов размеров (например, диаметр 50-250 нм) может помочь исключить некоторые выбросы, но визуальное подтверждение того, что гранулированное содержимое культуры <0,2 мкм, по-видимому, представляет собой везикулы, связанные с мембраной (с помощью TEM или других подходов), необходимо для того, чтобы иметь возможность конкретно утверждать, что кто-то измеряет производство везикул в отличие от производства частиц, подобных везикле.

Существенным фактором в характеристике везикул является обеспечение того, чтобы образец везикул анализировался в соответствующем линейном диапазоне чувствительности устройства анализа наночастиц. Когда образец слишком концентрирован, легко разбавить этот материал чистым буфером и повторно проанализировать его. С другой стороны, относительно низкая плотность клеток и/или пузырьков некоторых цианобактериальных культур иногда может давать везикулярные препараты, которые находятся ниже пределов обнаружения некоторых инструментов. В тех случаях, когда это происходит при объемной очистке пузырьков, можно рассмотреть возможность выращивания культур большего объема, повторного гранулирования и повторного использования конечного материала в меньшем объеме или оценки того, существует ли этап в процессе изоляции, где происходят чрезмерные потери и могут быть смягчены. При измерении скорости производства пузырьков исправления не обязательно так просты. Образцы могут быть сконцентрированы, если это необходимо, но первый должен увидеть, могут ли корректировки среды привести к более высокой плотности клеток или достаточно концентрированные образцы могут быть получены из более поздних временных точек во время экспоненциальной фазы, где концентрации будут выше.

Ограничения
Как и в случае с любым протоколом, изоляция пузырьков с использованием этих подходов имеет четкие ограничения. Эти подходы не полагаются на свою гарантию того, что совершенно чистый препарат везикул будет изолирован. Как культуры, так и полевые образцы могут содержать другие материалы, которые мигрируют аналогично везикулам в градиентах плотности. Тем не менее, как минимум, эти типы дополнительных методов очистки необходимы для обеспечения строгости и воспроизводимости анализа пузырьков. В то время как мы описываем подходы к выделению везикул в контексте цианобактерий, культуры многих других микробов также будут содержать везикулы в сравнительно низких концентрациях, и процедуры, описанные здесь, должны быть общеприменимыми. Ожидается, что эти методы будут служить не постоянным протоколом, а отправной точкой для стимулирования будущих достижений в работе с внеклеточными везикулами различных микробов. В будущем потребуются усилия по объединению этих методов с другими подходами, такими, как колонки исключения размеров или асимметричное фракционирование полевых потоков, с тем чтобы улучшить дискриминацию и отделение различных категорий мелких частиц от культур и образцов окружающей среды. Мы также надеемся, что эти методы могут продолжать развиваться наряду с улучшением технологий характеристики наночастиц, чтобы улучшить способность исследовать гетерогенность в популяциях пузырьков, их содержимое и их точную функциональную роль в окружающей среде.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы признают поддержку научных платформ i3S «Биоинтерфейсы и нанотехнологии» и «Гистология и электронная микроскопия», входящих в национальную инфраструктуру Португальской платформы биовизуализации (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Мы также благодарим профессора Х. А. Гонсалеса-Рейеса (Университет Кордовы, Испания) за помощь в оптимизации протокола окрашивания ультратонких участков для TEM, а также доктора Сесилию Дюрайш и доктора Ану Риту Пинту (Университет Порту, Португалия) за анализ отслеживания наночастиц.

Эта работа финансировалась Национальным научным фондом США (OCE-2049004 для SJB), фондами Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) через Оперную программу конкурентоспособности и интернационализации COMPETE 2020 (POCI), Португалия, 2020 год, и португальскими фондами через Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior в рамках проекта POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia также широко признан за стипендию PhD SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) и грант FCT Investigator IF / 00256 / 2015 (PO). М.К.М.-М. была поддержана Индивидуальной стипендией Марии Склодовской-Кюри (группа по реинтеграции) в рамках Рамочной программы Horizon 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Coelho, C., Casadevall, A. Answers to naysayers regarding microbial extracellular vesicles. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1005-1012 (2019).
  4. Schwechheimer, C., Kuehn, M. J. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nature Reviews Microbiology. 13 (10), 605-619 (2015).
  5. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  6. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological Functions and Biogenesis of Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles. Annual Review of Microbiology. 64 (1), 163-184 (2010).
  7. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  8. Flores, E., Herrero, A. Compartmentalized function through cell differentiation in filamentous cyanobacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 39-50 (2010).
  9. Flombaum, P., et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9824 (2013).
  10. Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: the structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
  11. Abed, R. M. M., Dobretsov, S., Sudesh, K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology. 106 (1), 1-12 (2009).
  12. Lea-Smith, D. J., et al. Editorial: Exploring the growing role of cyanobacteria in industrial biotechnology and sustainability. Frontiers in Microbiology. 12, 1963 (2021).
  13. Garcia-Pichel, F., Zehr, J. P., Bhattacharya, D., Pakrasi, H. B. What's in a name? The case of cyanobacteria. Journal of Phycology. 56 (1), 1-5 (2020).
  14. Biller, S. J., et al. Bacterial vesicles in marine ecosystems. Science. 343 (6167), 183 (2014).
  15. Pardo, Y. A., Florez, C., Baker, K. M., Schertzer, J. W., Mahler, G. J. Detection of outer membrane vesicles in Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 362 (20), (2015).
  16. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  17. Biller, S. J., et al. Membrane vesicles in sea water: heterogeneous DNA content and implications for viral abundance estimates. The ISME Journal. 11 (2), 394-404 (2017).
  18. Yin, H., et al. Synechococcus elongatus PCC7942 secretes extracellular vesicles to accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis. Theranostics. 9 (9), 2678-2693 (2019).
  19. Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Extracellular vesicles: An overlooked secretion system in cyanobacteria. Life. 10 (8), 129 (2020).
  20. Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e60359 (2019).
  21. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila outer membrane vesicles: Isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55146 (2017).
  22. Fantappiè, L., et al. Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  23. Moore, L. R., et al. Culturing the marine cyanobacterium Prochlorococcus. Limnology and Oceanography: Methods. 5 (10), 353-362 (2007).
  24. Rippka, R., et al. Prochlorococcus marinus Chisholm et al. 1992 subs. Pastoris subs. nov. Strain PCC 9511, the first axenic chlorophyll a2/b2-containing cyanobacterium (Oxyphotobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5), 1833 (2000).
  25. Moore, L. R., Chisholm, S. W. Photophysiology of the marine cyanobacterium Prochlorococcus: Ecotypic differences among cultured isolates. Limnology and Oceanography. 44 (3), 628 (1999).
  26. Charpy, L., Larkum, A. W. D. Bulletin de l'Institut Océanographique de Monaco, (n spécial 19). , 457-475 (1999).
  27. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  28. Fomsgaard, A., Freudenberg, M. A., Galanos, C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology. 28 (12), 2627-2631 (1990).
  29. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  30. Peterson, T. Densitometric analysis using NIH image. North American Vascular Biology Organization (NAVBO) eNewsletter. 16 (3), (2010).
  31. Jürgens, U. J., Weckesser, J. Carotenoid-containing outer membrane of Synechocystis sp. strain PCC6714. Journal of Bacteriology. 164 (1), 384-389 (1985).
  32. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 99-128 (2014).
  33. McBroom, A. J., Johnson, A. P., Vemulapalli, S., Kuehn, M. J. Outer membrane vesicle production by Escherichia coli is independent of membrane instability. Journal of Bacteriology. 188 (15), 5385-5392 (2006).
  34. Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamicin: a novel mechanism of enzyme secretion. Journal of Bacteriology. 177 (14), 3998-4008 (1995).
  35. Nguyen, T. T., Saxena, A., Beveridge, T. J. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Journal of Electron Microscopy. 52 (5), 465-469 (2003).
  36. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  37. Norena-Caro, D. A., Malone, T. M., Benton, M. G. Nitrogen sources and iron availability affect pigment biosynthesis and nutrient consumption in Anabaena sp. UTEX 2576. Microorganisms. 9 (2), 431 (2021).
  38. Rippka, R. Isolation and purification of cyanobacteria. Methods in Enzymology. , Academic Press. 3-27 (1988).
  39. Van Alphen, P., Abedini Najafabadi, H., Branco dos Santos, F., Hellingwerf, K. J. Increasing the photoautotrophic growth rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by identifying the limitations of its cultivation. Biotechnology Journal. 13 (8), 1700764 (2018).
  40. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA. mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12 (383), (2021).
  41. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
  42. Soares, N. C., et al. Associating growth-phase-related changes in the proteome of Acinetobacter baumannii with increased resistance to oxidative stress. Journal of Proteome Research. 9 (4), 1951-1964 (2010).
  43. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  44. Dell'Annunziata, F., et al. Outer membrane vesicles derived from Klebsiella pneumoniae are a driving force for horizontal gene transfer. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8732 (2021).
  45. Linney, M. D., Schvarcz, C. R., Steward, G. F., DeLong, E. F., Karl, D. M. A method for characterizing dissolved DNA and its application to the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography: Methods. 19 (3), 210-221 (2021).
  46. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  47. Cimorelli, M., Nieuwland, R., Varga, Z., vander Pol, E. Standardized procedure to measure the size distribution of extracellular vesicles together with other particles in biofluids with microfluidic resistive pulse sensing. PLoS ONE. 16 (4), 0249603 (2021).

Tags

Биология выпуск 180
Выделение и характеристика цианобактериальных внеклеточных везикул
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, S. J.,… More

Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter