Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering och karakterisering av cyanobakteriella extracellulära vesiklar

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

Det nuvarande protokollet ger detaljerade beskrivningar för isolering, koncentration och karakterisering av extracellulära vesiklar från cyanobakteriella kulturer. Metoder för att rena vesiklar från kulturer i olika skalor, avvägningar mellan metoder och överväganden för att arbeta med fältprover diskuteras också.

Abstract

Cyanobakterier är en mångsidig grupp fotosyntetiska, gramnegativa bakterier som spelar kritiska roller i globala ekosystem och fungerar som viktiga bioteknikmodeller. Nyligen utfört arbete har visat att både marina och sötvatten cyanobakterier producerar extracellulära vesiklar - små membranbundna strukturer som frigörs från mikrobernas yttre yta. Medan vesiklar sannolikt bidrar till olika biologiska processer, är deras specifika funktionella roller i cyanobakteriell biologi fortfarande i stort sett okända. För att uppmuntra och främja forskning inom detta område presenteras ett detaljerat protokoll för isolering, koncentration och rening av cyanobakteriella extracellulära vesiklar. Det aktuella arbetet diskuterar metoder som framgångsrikt har isolerat vesiklar från stora kulturer av Prochlorococcus, Synechococcus och Synechocystis. Metoder för att kvantifiera och karakterisera vesikelprover från dessa stammar presenteras. Metoder för att isolera vesiklar från vattenlevande fältprover beskrivs också. Slutligen diskuteras också typiska utmaningar med cyanobakteriell vesikelrening, metodologiska överväganden för olika nedströmstillämpningar och avvägningar mellan tillvägagångssätt.

Introduction

Extracellulära vesiklar (EV) är sfäriska strukturer, som sträcker sig mellan ~ 20-400 nm i diameter, som frigörs av praktiskt taget alla organismer i sin omgivande miljö 1,2,3. Vesiklar avgränsas av ett lipid-dubbelskikt och kan inte replikera sig själva. I gramnegativa bakterier tros dessa strukturer främst uppstå genom "blebbing" av små portioner från det yttre membranet. Ändå kan andra processer, inklusive flagellärrörelse, celllys och utsöndring av både inre och yttre membranmaterial, också producera vesiklar 4,5. Elbilar kan innehålla olika biomolekyler, inklusive lipider, lösliga och membranproteiner, nukleinsyror och metaboliter, och kan transportera detta material mellan cellerna 4,5,6. Med tanke på dessa egenskaper studeras elbilar för att förstå deras möjliga roller i ett brett spektrum av biologiska processer, inklusive cellulär kommunikation, biofilmbildning, horisontell genöverföring, värd-fagdynamik och näringsutbyte 4,6.

Cyanobakterier är en stor och mångsidig grupp av gramnegativa bakterier, inklusive encelliga och trådformiga organismer. De är av intresse ur många perspektiv, inklusive att förstå deras fysiologi och mångfald 7,8, de kritiska ekosystemfunktionerna de tjänar 9,10 och deras användbarhet för bioteknik11,12. Cyanobakterier finns i en mängd olika livsmiljöer, antingen som fritt levande organismer i marina, sötvattens- och markmiljöer, eller i symbiotiska föreningar med mossor, ormbunkar, växter eller i lavar och svampar13. De fungerar som viktiga primärproducenter i akvatiska ekosystem och producerar syre och organiskt kol genom syrefotosyntes 9,10, och vissa kan också fixera atmosfäriskt kväve7. Marina och sötvatten cyanobakterier, inklusive Prochlorococcus, Synechococcus och Synechocystis, producerar elbilar under laboratorieförhållanden 14,15,16, och cyanobakteriella vesiklar finns också i naturliga miljöer14,17. De biologiska och ekologiska funktionerna hos cyanobakteriella vesiklar är okända, men ytterligare forskning inom detta område kommer sannolikt att ge nya insikter i frågor om cyanobakteriell fysiologi, differentiering, kommunikationsstrategier, evolution och trofiska interaktioner. Dessutom kan förmågan hos cyanobakteriella elbilar att bära olika kategorier av biomolekyler ha kommersiella tillämpningar18,19.

Detta protokoll beskriver metoder för att isolera och karakterisera vesiklar från cyanobakteriella kulturer och fältprover för att möjliggöra och uppmuntra en bredare undersökning av cyanobakteriell extracellulär vesikelbiologi. Medan arbetsflödet som beskrivs här är analogt med protokoll för att isolera och karakterisera elbilar från andra bakterier, innehåller cyanobakteriella kulturer och fältprover vanligtvis lägre cell- och vesikelkoncentrationer än vad som vanligtvis observeras med värdassocierade eller patogena modellsystem 20,21,22. Studier av cyanobakteriella elbilar kräver därför särskilda överväganden och optimeringar för odling och vesikelisolering, som varierar ytterligare mellan stammar och mediebakgrund. Eftersom inget enskilt protokoll fungerar lika bra för alla stammar, tillväxtförhållanden och nedströmsapplikationer, tillhandahåller vi flera alternativ och diskuterar de avvägningar som är inblandade så att forskare kan bestämma de metoder som är mest lämpliga för att ta itu med deras experimentella frågor.

Protocol

Cyanobakteriestammarna erhålls från flera kultursamlingar (se Diskussion för detaljer).

1. Odling av cyanobakterier

  1. Odla marina cyanobakterier Prochlorococcus och Synechococcus enligt stegen nedan.
    1. Odla proklorokocker och Synechococcus-stammar i polykarbonatkolvar med hjälp av ett lämpligt medium som Pro99 eller SN (se materialtabell). För mer information, se tidigare publicerade Referenser 23,24.
    2. Acklimatisera kulturerna genom att odla dem över två till tre överföringar (1:20 utspädningar av kulturen till färska medier för varje passage) under önskade temperatur- och bestrålningsförhållanden som krävs för experimentet.
      OBS: Typiska tillväxtförhållanden23,25 inkluderar temperaturer mellan 15-30 ° C vid bestrålning mellan 8-150 μmol fotoner m-2 s-1, men individuella töjningstoleranser och optima varierar mycket26 och måste ställas in baserat på vägledning från relevanta kulturinsamlingsinstruktioner eller litteratur. Övervaka tillväxthastigheten med hjälp av odlingsfluorescens eller flödescytometri räknas23 och se till att kulturer växer med en konsekvent exponentiell hastighet i stabilt tillstånd innan experimentet påbörjas.
    3. Utför en uppsättning successiva gradvisa överföringar från mindre till större volymer när cellerna når sen exponentiell fas (t.ex. 20 ml < 250 ml < 2 L < 10 L < 20 L).
      OBS: Stora volymkulturer kan inte direkt ympas från små mängder startkultur. Observera att större kulturer kan kräva tillsats av buffertar (såsom 1 mM HEPES, pH 7,5 eller 3,75 mM TAPS, pH 8), tillsammans med kompletterande natriumbikarbonat eller bubblande med steril luft24.
  2. Odla sötvatten cyanobakterie Synechocystis sp.
    1. PCC 6803 som ska användas som inokulum genom att odla den med luftning (bubblande luftning vid 1 L/min), vid 30 °C, under ett 16 h ljus (fotonantal på 50 μmol m-2 s-1) / 8 h mörk regim, upp till en optisk densitet vid 730 nm (OD730) av 1,0 (exponentiell fas) i BG11 medium27.
    2. PCC 6803 i 570 ml BG11-medium till en OD730 på 0,05 i 1 L glasgastvättflaskor.
    3. Låt cellerna växa med luftning, vid 30 °C, under ett 16 timmars ljus (fotonantal på 50 μmol m-2 s-1) / 8 h mörk regim, upp till en slutlig OD730 på 1,0-1,5.

2. Separering av cyanobakteriell biomassa från fraktionen av små partiklar (vesikel)

OBS: För det första rekommenderas att separera celler från supernatanten genom centrifugalpelletering av celler. Men när odlingsvolymerna är för stora för att detta ska vara möjligt är det möjligt att hoppa över centrifugering och fortsätta direkt till filtrering av hela kulturer med kapselfiltrering (steg 2.4).

  1. Utför centrifugering för att separera celler (bäst för volymer upp till ~ 4 L, beroende på tillgänglig centrifugkapacitet).
    1. Autoklavera eller tvätta och rengör centrifugflaskorna noggrant med vatten av ultraren kvalitet typ I (se materialtabell), vilket säkerställer att ingen kvarvarande tvål eller annat material finns kvar.
    2. Fyll odlingsprover i ett lämpligt antal centrifugflaskor och balansera dem.
    3. Spinnkulturer för >10 000 x g vid 4 °C i 10 minuter. Om supernatanten förblir synligt grumlig, öka centrifugeringsförhållandena till 20 minuter vid maximal hastighet och försök igen.
    4. Häll försiktigt ned eller pipet supernatanten i ett rent kärl och fortsätt till ett av följande filtreringsalternativ som nämns i steg 2.2-2.4.
  2. Alternativ 1: utför sprutfiltrering med 0,2 μm filter (för provvolymer upp till ~ 50 ml).
    1. Fyll en steril 50 ml spruta med ett i stort sett cellfritt odlingsmedium och filtrera den genom ett 0,2 (eller 0,45) μm polyetersulfonfilter (PES) (se materialtabell). Samla filtratet i en ren, steriliserad behållare.
    2. Upprepa detta steg tills filtret är igensatt (t.ex. blir det svårt att trycka med sprutan). Byt ut med ett nytt filter och fortsätt tills provet filtreras ordentligt.
  3. Alternativ 2: utför 0,2 μm vakuumfiltrering (upp till ~ 4 L).
    1. Tvätta och rengör vakuumapparaten noggrant med typ I - ultrarent vatten, anslut den till en vakuumfälla och pump (se materialtabell).
    2. Sätt i ett 0,2 μm filter med lämplig diameter och kläm fast vakuumapparaten.
    3. Tillsätt en liten mängd odlingsprov och se till att vakuumtrycket förblir < 10 psi.
    4. Fortsätt att filtrera kulturen i små steg tills den är klar. Om filtreringshastigheten saktar avsevärt, stoppa vakuumet och byt ut filtret.
    5. Samla upp den <0,2 μm fraktionen innehållande vesiklar i en ren behållare.
  4. Alternativ 3: utför 0,2 μm kapselfiltrering (för provvolymer > ~ 4 L)
    1. Rengör lämpliga flexibla slangar och uppsamlingskärl genom att tvätta med vatten och milt rengöringsmedel. Skölj materialet med destillerat och avjoniserat vatten.
      OBS: Före användning ska materialet sköljas med typ I - ultrarent vatten.
    2. Placera kulturen som ska filtreras på en säker, upphöjd plats med det slutliga uppsamlingskärlet nedan. Anslut en 0,2 μm kapselfilter (se materialtabell) utflödesport till en slang och placera den i ett uppsamlingskärl.
    3. Placera en annan slang i provet, börja en gravitationssifon genom att dra in lite prov i slangen med en spruta och anslut slangen till kapselfiltret. Använd ventilen för att släppa ut överflödig luft och fyll kammaren med supernatant.
    4. Låt materialet röra sig genom kapseln tills provet filtreras ordentligt. Om flödeshastigheten blir för långsam (< ~ 1/10av startflödeshastigheten, eller kommer ut droppvis i motsats till en kontinuerligt flytande ström), vänta eller applicera mild kraft med en peristaltisk pump tills mottrycket ökar. Alternativt kan du delvis återställa flödeshastigheterna genom att tillfälligt koppla bort filtret, backflushing ackumulerad biomassa från inflödessidan med ultrarent vatten tills materialet inte längre är synligt grumligt och sedan starta om filtreringsprocessen.

3. Koncentrera vesikelprovet

  1. Alternativ 1: utför centrifugal ultrafiltrering för att koncentrera små (<500 ml) volymer prover.
    1. Skölj de 15-20 ml ultrafiltreringscentrifugalkoncentratorer som valts med typ I - ultrarent vatten.
    2. Ladda anrikningsverken i centrifugen och snurra vid 4 400 x g vid 4 °C. Kasta genomgången och upprepa det här steget minst två gånger till.
    3. Ladda supernatantprovet i vattensköljda koncentratorer och snurra under samma förhållanden. Beroende på experimentella mål kan provfiltrat kasseras eller samlas in för ytterligare koncentration (med koncentratorer med en nominell molekylviktgräns på 3 kDa) och analys.
    4. Upprepa detta steg tills provet koncentreras till en slutlig volym på ~ 15-30 ml.
  2. Alternativ 2: utför tangentiell flödesfiltrering (TFF) för att koncentrera en stor (>500 ml) provvolym.
    1. Ställ in TFF-apparaten enligt tillverkarens riktlinjer (se materialtabell). Fäst en peristaltisk pump på insugningsledningen och placera justerbara klämmor på retentatledningen. Sanera TFF enligt tillverkarens rekommendation och spola sedan enheten med 1 liter av typ I - ultrarent vatten.
      OBS: Inlopps- och retentatlinjerna ska placeras i en ren provbehållare (glasflaska). Filtratlinjen/filtratledningarna ska ledas in i ett avfallskärl eller en avfallssänka.
    2. Tillsätt <0,2 μm filtrat i provbehållaren. Öka långsamt pumphastigheten och mottrycksnivåerna på retentatledningen för att öka effekten från filtratlinjerna.
    3. Fortsätt att köra TFF och fyll på behållaren med kultursupernatant när materialet tas bort. Undvik att låta insugningsledningen komma ut ur provet under bearbetningen för att undvika att luftbubblor införs. Se till att matningstrycket inte överstiger ~ 10 psi och att retentatet rinner ut ur TFF i jämn takt tillbaka in i behållaren.
    4. Sluta koncentrera provet när volymen i behållaren når den lägsta möjliga mängd som behövs för att upprätthålla flödet i insugningsledningen utan att införa luftbubblor.
    5. Stäng utflödesledningen med en klämma. Ta bort mottrycket på retentatlinjen och återcirkulera den koncentrerade supernatanten genom filtret i ~ 10 minuter, vilket minskar återcirkulationshastigheten till 20-40 ml / min för att maximera återhämtningen.
    6. Flytta retentatlinjen till ett rent kärl, ta bort insugningslinjen från provet och samla upp det koncentrerade materialet. Återvinn eventuellt återstående material i provbehållaren med hjälp av en pipett.
    7. Filtrera den koncentrerade supernatanten genom ett 0,2 μm sprutfilter (steg 2.2) för att säkerställa att inga celler finns kvar.
      OBS: Steg 3.2.7 är valfritt.
    8. Förvara vid behov det slutliga koncentratet vid 4 °C i ~3 veckor innan det övergår till vesikelrening (steg 4).

4. Vesikelisolering och rening

  1. Pellet direkt genom ultracentrifugering enligt stegen nedan.
    1. Placera det koncentrerade odlingsprovet <0,2 μm i ett rent ultracentrifugrör. Tillsätt rena medier eller buffert efter behov för att säkerställa att röret är helt fyllt.
      OBS: Om det slutliga odlingsprovet är för stort för att få plats i ett rör, antingen pelletera materialet i flera rör som ska kombineras före tvättstegen eller pelleten seriellt i samma rör.
    2. Skapa vid behov en balans och snurra vid ~100 000 x g i 3 timmar vid 4 °C.
    3. Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett. Medan cyanobakteriella vesikelpellets kan visa viss färg, är de ofta osynliga.
    4. Tvätta det pelleterade materialet genom att tillsätta färska odlingsmedier eller tvättbuffert såsom 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (se Diskussion) till ultracentrifugröret, blanda genom mild pipettering och snurra igen som i steg 4.1.2. Upprepa tvättprocessen en andra gång.
    5. Resuspendera den slutliga pelleten i färsk kultur genom att upprepade gånger men försiktigt pipettera upp och ner runt rörets botten med en 1 ml pipett. Överför till ett rent kärl.
  2. Utför ultracentrifugering av densitetsgradient.
    1. Förbered jodoxanollager (se materialtabell) genom att göra en 4x koncentrerad version av den buffertbakgrund som önskas för provet (se Diskussion).
    2. Blanda en del av 4x-bufferten med tre delar 60% jodoxanol för att göra en 45% jodoxanollösning.
    3. Späd 45% jodoxanol med volymer av 1x buffert för att skapa lager av gradientmedia vid 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% och 10% slutliga jodoxanolkoncentrationer.
      OBS: Den totala mängd som behövs varierar med kapaciteten hos ultracentrifugrotorn / rören.
    4. Ställ in en ultracentrifugdensitetsgradient genom att försiktigt lägga över lika stora mängder 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% och 0% ioxidinol i ett ultracentrifugrör så att hela rörets volym utnyttjas.
      OBS: Det extracellulära vesikelprovet som ska renas bör placeras högst upp i gradienten som en del av 0% jodoxanolskiktet. Om vesikelprovets slutliga volym överstiger storleken på 0 %-skiktet, blanda eventuellt överskott av vesikelprov med tillräckligt med 45 % jodoxanol och/eller buffert för att generera den erforderliga volymen av optiprepbestånden på 10 % eller högre, och använd dessa på motsvarande plats i gradienten.
    5. Vrid gradienten vid ~100 000 x g vid 4 °C i 6 timmar.
    6. Samla fraktioner (vanligtvis 0,5 ml vardera för en ~ 4,5 ml lutning) genom noggrann pipettering eller med en fraktionsuppsamlare (se materialtabell).
    7. Bestäm densiteten för varje fraktion (i g/ml) med hjälp av en analysbalans och kalibrerad pipett för att mäta vikten av en känd provvolym. Ta bort provet från röret, bestäm vikten och returnera provet direkt.
    8. Späd enskilda fraktioner i ett nytt ultracentrifugrör med ren buffert och tvätta materialet enligt stegen 4.1.2-4.1.4. Alternativt kan du använda dialys- eller ultrafiltreringskolonner för att återvinna partiklar.
      OBS: Cyanobakteriella extracellulära vesiklar migrerar vanligtvis till flytande densiteter på ~ 1,14-1,19 g / ml i jodoxanol.
  3. Förvara blåsorna vid 4 °C om de ska användas inom 1-3 veckor. Frys blåsorna vid -20 °C eller -80 °C om de inte används längre än den perioden.

5. Karakterisering av de isolerade vesiklarna

  1. Utför elektronmikroskopi med negativ fläcköverföring (se materialtabell) (TEM; partikelstorlek, struktur, renhet).
    1. För att förbättra bildkvaliteten, glödladda ytan på ett tidigare belagt TEM-rutnät med hjälp av ett glödurladdningssystem enligt tillverkarens riktlinjer (se materialtabell).
    2. Applicera försiktigt ~5 μL av vesikelprovet och låt sitta i 5 min.
      OBS: Prover med vesikelkoncentrationer > 109 ml-1 ger vanligtvis de bästa resultaten; mer utspädda prover kommer att ha få vesiklar per bild.
    3. Ta bort provet genom att röra kanten på ett rutnät till en bit rent filterpapper.
    4. Pipettera en 20-50 μL droppe 2% uranylacetat (se materialtabell) på en plan yta täckt av plastfilm och placera gallret flytande ovanpå det i 2 minuter.
    5. Ta bort uranylacetat med filterpapper och flyt kort på en droppe ultrarent vatten för att tvätta. Upprepa vattentvätten en andra gång.
      OBS: Det slutliga torra rutnätet är klart för visualisering efter steg 5.1.5.
  2. Utför ultratunn sektionsfärgning för TEM (partikelstorlek, inre struktur).
    1. Återsuspendera pelleten från steg 4.1.5 med 1 ml 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkacodylatbuffert (pH 7) (se materialtabell) och fixera provet i 2 timmar vid 4 °C.
    2. Snurra vid ~100 000 x g i 1 timme vid 4 °C.
    3. Tvätta pelleten försiktigt med 0,1 M natriumkacodylatbuffert (pH 7) och snurra sedan vid ~100 000 x g i 1 timme vid 4 °C.
    4. Fixera pelleten med 1 ml 1% osmiumtetroxid (se materialtabell) (beredd i 0,1 M natriumkakodylatbuffert) i 1 timme och tvätta sedan som i steg 5.2.3.
    5. Dehydrera provet med 1 ml av en ascendent serie etanol (50 %, 70 %, 90 % och två gånger i absolut etanol) i steg om 10 min vardera vid 4 °C.
    6. Tillsätt 250 μl epoxiharts (se materialtabell) blandat med absolut etanol (1:1) till pelleten och inkubera över natten vid 4 °C.
    7. Överför pelleten till 500 μl rent harts i 24 timmar. Inkubera sedan hartset vid 65 °C i 48 timmar.
      OBS: Hartset är nu klart för sektionering med ultramikrotom, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
    8. Färga gallren som innehåller sektioner med 2% uranylacetat (i 50% etanol) i 5 min. Tvätta bilderna försiktigt under rinnande avjoniserat vatten i 10-15 s vardera. Placera en droppe blycitrat (se materialtabell) och färga i ytterligare 5 minuter.
    9. Tvätta som tidigare, ta bort vattnet genom att blotta gallret på ett filterpapper och lufttorka gallren. Visualisera med TEM enligt tillverkarens riktlinjer (se materialtabell).
  3. Utför nanopartikelspårningsanalys (NTA) (partikelstorlek, koncentration).
    1. Torka försiktigt bort damm eller synligt material från den optiska plattan med linspapper. Kontrollera om alla O-ringar och andra tätningar är rena och intakta. Slå på instrumentet och starta programvaran.
    2. Fyll kammaren med ultrarent vatten med en ren spruta. Se till att inga luftbubblor finns.
    3. Klicka på Starta kamera och visualisera det optimala området i kammaren om "tumavtrycket". Justera mikroskopsteget horisontellt eller vertikalt efter behov så att signalintensiteten är jämn över det avbildade området. Flytta bildområdet horisontellt i förhållande till tumavtrycket (till höger, mot den lodräta linjen) och hitta ett område i närheten med låg bakgrundssignal.
    4. Skjut skjutreglagen Screen Gain och Camera Level till max och minska sedan till den lägsta nivån för att se de svagaste partiklarna.
      OBS: Typiska inställningar för cyanobakteriella vesiklar använder en skärmförstärkning på 7 och kameranivå mellan 10-12.
    5. Justera fokus efter behov för att säkerställa att partiklarna är ungefär lika synliga över synfältet. Fortsätt att trycka ultrarent vatten genom kammaren tills du visuellt har bekräftat att kammaren är ren.
    6. Ta bort kvarvarande vatten från kammaren med en annan spruta.
    7. Undersök ett prov av mediet / bufferten som ditt prov befinner sig i för att bestämma bakgrundspartikelkoncentrationen genom att fylla kammaren med media / buffert med en ren 1 ml spruta.
    8. Välj Standardmått i listrutan SOP . Ändra inställningarna för att samla in minst tre tekniska replikat av 60 s videor vardera. Tryck på Skapa och kör skript och följ anvisningarna. Tryck in ~100 μl prov i kammaren mellan replikaten.
    9. När förvärvet är klart, ta bort den återstående bufferten med en spruta, spola 3-5 ml ultrarent vatten genom kammaren och ta bort det återstående vattnet.
    10. Tillsätt vesikelprovet i kammaren med en 1 ml spruta och bekräfta anskaffningsinställningarna. Om partikelantalet inte ligger inom instrumentets linjära intervall (vanligtvis mellan 20-80 partiklar / ram) måste provet spädas eller koncentreras. Tryck in minst 500 μl prov i kammaren innan du samlar in data.
    11. Samla in videodata som i steg 5.3.8 och se till att rengöra kammaren med ultrarent vatten mellan olika prover.
    12. Samla in alla efterföljande prover från samma organism/experiment med identiska kamerainställningar för att säkerställa jämförbarhet av data. ändringar i inställningen Kameranivå kan ha en märkbar effekt på de erhållna slutliga värdena.
    13. Bestäm partikelparametrar med hjälp av analysavsnittet i programvaran. Välj Analys > Öppna experiment och läs in exempelfilen. Välj Bearbeta valda filer och vänta tills analysen är klar. Se till att använda samma identifieringströskel för alla efterföljande exempel från samma experiment.
      OBS: Eftersom cyanobakteriella vesiklar ofta är svaga måste detektionströskeln vanligtvis justeras till det mest känsliga (lägsta) värdet.
  4. Utför dynamisk ljusspridning (DLS) (partikelstorlek, zetapotential).
    1. Filtrera genom ett filter med en porstorlek på 0,2 μm för alla prover som går in i DLS för att sålla bort stora partiklar som stör mätningarna.
    2. Tillsätt 1 ml av mediet/bufferten i en ren kyvett för att undersöka möjliga aggregeringar eller andra nanopartiklar som kommer från mediet. Sätt kyvetten med den frostade sidan till vänster i mikroprovtagaren och stäng locket. Låt provet balansera i minst 5 min.
    3. Ange materialets brytningsindex och materialabsorptionen om de skiljer sig avsevärt från standardvärdena för vatten.
      OBS: Materialegenskaperna skulle ha mycket liten påverkan om blåsorna är mindre än 100 nm. Vid mätning av elbilarnas ytpotential (zetapotential) bör vesiklar återsuspenderas i det ursprungliga tillväxtmediet.
    4. Klicka på Kontrollpanelen för att kontrollera avläsningarna och starta datainsamlingen genom att klicka på den gröna ikonen. Om värdena ser bra ut och ditt media/buffert inte innehåller aggregeringar eller andra partiklar är du nu redo att mäta ditt prov.
    5. Tillsätt 1 ml vesikelprov i en ren kyvett och samla in data enligt steg 5.4.4. Samla in minst tre tekniska replikat i 10 minuter vardera.
  5. Utför lipopolysackaridanalys (LPS) för att bekräfta att de gramnegativa elbilarna finns i provet.
    1. Prov på värmedenatureringsfordon vid 95 °C i 10 minuter i standard 1x Laemmli-provbuffert (se materialtabell).
    2. Inkubera med 0,2 U proteas av typ XIV från Streptomyces griseus (se materialtabell) vid 37 °C i 30 minuter för att avlägsna förorenande glykoproteiner.
    3. Separata behandlade prover genom elektrofores vid denaturering av 16% (w / v) SDS-polyakrylamidgeler enligt det tidigare publicerade protokollet16.
    4. För att upptäcka LPS, färga gelén antingen med kommersiellt tillgängliga färgningssatser eller med en modifierad silverfärgningsteknik28. Kvantifiera den relativa LPS-förekomsten genom densitometrianalys av färgade geler enligt tidigare publicerade referenser29,30.

6. Mätningar av vesikelproduktionshastighet

  1. Med hjälp av nanopartikelspårningsanalys som i steg 5.3, eller motsvarande teknik, mäta partikelkoncentrationen i tillväxtmediet för experimentet. Om ett högt partikelantal hittas, filtrera genom ett 0,1 μm porfilter och kontrollera igen.
    OBS: För att minimera felet bör mediabakgrundspartikelkoncentrationen vara mindre än 10% av partikelkoncentrationen som finns i kulturer med lägsta densitet.
  2. Acklimatisera kulturen genom att odla celler för minst två på varandra följande serieöverföringar under de media- och miljöförhållanden som önskas för experimenten enligt steg 1.1.2. Kulturer måste överföras medan de fortfarande befinner sig i exponentiell tillväxtfas. Se till att de uppmätta odlingstillväxttakterna är konsekventa mellan transfereringarna. Om inte, fortsätt att överföra kulturer tills tillväxthastigheterna är reproducerbara.
  3. Samla tidsförloppsprover vid ympning och regelbundet tidsinställda intervall över tillväxtkurvan till den tidiga stationära fasen. Förskjuta tidpunkter för att ha minst 3-4 prover samlade över hela spektrumet av exponentiell tillväxt. Utför följande steg för att ta prov vid varje tidpunkt.
    1. Filtrera 1 ml eller mer av kulturen direkt genom ett rent, sterilt 0,2 μm sprutfilter och spara filtratet för att mäta vesiklarkoncentrationen som i steg 5.3. Frys tidskursproverna om så önskas. Använd relativ fluorescens för att följa kulturens tillväxtdynamik.
    2. Spara ett prov av hela kulturen för att bestämma populationsstorleken med hjälp av en metod som är lämplig för organismen (flödescytometri, koloniplätering; eller på annat sätt).
  4. Få mätningar av celler och vesikelliknande partiklar (per ml) vid varje tidpunkt.
  5. Identifiera de tidpunkter som inträffade under den exponentiella tillväxtfasen. För att beräkna r, antalet vesiklar som produceras per cell per generation, mellan två punkter under exponentiell tillväxt (vanligtvis början och slutet av tidsförloppet), använd ekvationen i tilläggsfil 1.
    OBS: Denna metod är endast giltig under stabila tillväxtförhållanden; Underliggande antaganden och härledning av beräkningen beskrivs närmare i referens14.

Representative Results

Figur 1 visar en översikt över den cyanobakteriella vesikelisoleringsprocessen och belyser viktiga aspekter av protokollet som beskrivs här. Särskilt anmärkningsvärt är de steg som beskriver separation av cyanobakteriell biomassa från den lilla partikelfraktionen (vesikel), koncentration av vesikelprovet och vesikelisolering och rening (figur 1, steg 2 till 4), som är avgörande för att erhålla reproducerbara preparat av vesiklar. Figur 2 visar representativa resultat från isolering och karakterisering av extracellulära vesiklar från cyanobakterien Synechocystis sp. Det yttre membranet i denna cyanobakterie har visat sig innehålla karotenoider31, som ger en karakteristisk orange färg till vesiklarnas prover som samlats in genom direkt pelletering genom ultracentrifugering (figur 2A). När vesikelpelleten har återsuspenderats kan vesiklar undersökas med transmissionselektronmikroskopi (TEM), antingen genom negativ färgning av prover med uranylacetat (figur 2B) eller genom observation av ultratunna sektioner (figur 2C). Vesikelstorleksfördelning och koncentration kan bedömas med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS) (figur 2D) och nanopartikelspårningsanalyser (NTA) (figur 2E). Med det beskrivna protokollet erhölls vanligtvis ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanopartiklar per ml i en exponentiellt växande kultur av Synechocystis sp. PCC 6803 vid en OD730 av 1,0. Biokemiska analyser av isolerade elbilar kan utföras för att komplettera den fysiska karakteriseringen av de isolerade vesiklarna. PCC 6803 vesiklar separerades på en SDS-polyakrylamidgel och färgades för lipopolysackarider (LPS; Figur 2F). Eftersom LPS är specifika för det yttre membranet32 kan LPS-detektion validera närvaron av membranbundna vesiklar och fungera som en markör för att analysera relativ vesikelhalt mellan preparat från samma stam33. Inspektion av den relativa förekomsten av LPS med låg respektive hög molekylvikt kan indikera förändringar i vesikelsammansättningen mellanproverna 34,35.

Figure 1
Figur 1: Experimentella procedurer som används för cyanobakteriell EV-isolering och karakterisering. Schematiska representationer av odlingskulturer (1) och separation av cyanobakteriell biomassa från tillväxtmediet (2). Cellfria prover som innehåller vesiklar koncentreras (3) och sedan isoleras och renas elbilarna (4). Beroende på applikation kan vesikelpreparat karakteriseras med användning av en eller en kombination av transmissionselektronmikroskopi (TEM), nanopartikelspårningsanalys (NTA), dynamisk ljusspridning (DLS) och lipopolysackarid (LPS) profilering (5). RT, rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat av den extracellulära vesikelisoleringen och karakteriseringen för cyanobakterien Synechocystis sp. (A) Fotografi av den extracellulära vesikelpelleten (EV-pellet) erhållen efter ultracentrifugering av det koncentrerade cellfria extracellulära mediet från en 600 ml Synechocystis sp. PCC 6803-kultur odlad till en OD730 av 1,0-1,5. Observera den typiska orange färgen på vesikelpelleten som härrör från karotenoiderna som finns i det yttre membranet. (B,C) Transmissionselektronmikroskopi (TEM) fotografier av negativt färgade (B) och ultratunna sektioner (C) av Synechocystis sp. Skalstaplar: 200 nm respektive 50 nm. Proverna visualiserades på ett transmissionselektronmikroskop som drivs vid 80 kV. (D) Typiskt dynamiskt ljusspridningsdiagram (DLS) som visar fördelningen av vesikelvolymen som en funktion av vesikeldiametern (i nm). Färgade linjer indikerar data från tre tekniska replikatmätningar av samma prov. (E) Representativa nanopartikelspårningsanalysdata (NTA) för Synechocystis extracellulära vesikelstorleksfördelning (i nm). Den svarta linjen anger medelvärdet av tre tekniska replikat och de röda linjerna representerar medelvärdets standardfel. (F) Lipopolysackaridprofilen (LPS) detekterades efter att vesikelpreparatet separerats genom elektrofores på en 16% (w / v) SDS-polyakrylamidgel och färgning med en kommersiell LPS-färgningssats. LPS med låg och hög molekylvikt, motsvarande grova respektive släta LPS-former, är detekterbara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: Ekvation för att beräkna r. Antalet vesiklar som produceras per cell per generation mellan två punkter under exponentiell tillväxt (vanligtvis början och slutet av tidsförloppet) bestäms med hjälp av denna ekvation. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Allmänna överväganden
Protokollet (figur 1) presenteras som en uppsättning alternativ för att markera att det inte finns någon "one-size-fits-all" -metod för att arbeta med cyanobakteriella extracellulära vesiklar. Intresserade forskare kan använda de delar av detta protokoll som är kompatibla och lämpliga för deras specifika modellorganism, experimentella frågor / mål och utrustningstillgänglighet. Alla vesikelisoleringsmetoder innebär avvägningar och kommer oundvikligen att resultera i en viss grad av partiskhet. Även om man bör försöka minimera detta när det är möjligt, är det viktigaste övervägandet att se till att den detaljerade metod som används rapporteras enligt lämpliga MISEV-riktlinjer (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.

Kultur tillväxt
Cyanobakteriella kulturer kan lätt erhållas från en av de många kultursamlingar som finns tillgängliga över hela världen. Några exempel är Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrike), Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, Frankrike) och Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Den valda cyanobakteriella stammen måste odlas under lämpliga medium- och miljöförhållanden, som varierar avsevärt mellan olika stammar. En lista över vanliga medier för cyanobakteriell odling finns på kultursamlingswebbplatser eller andra publikationer 37,38,39.

Att arbeta med cyanobakteriella extracellulära vesiklar innebär några unika utmaningar jämfört med de metoder som rapporterats för många typiska heterotrofer i modelllaboratorier. Cyanobakteriella kulturer har vesikelkoncentrationer av storleksordningar lägre än de som finns i andra mikrober såsom Escherichia coli 14,16,40. Dessa skillnader, som förmodligen härrör från lägre celltätheter och / eller vesikelproduktionshastigheter, innebär att relativt stora kulturer (~ 1-20 L eller mer) kan krävas för att ge tillräckligt med material för bulkanalyser. Således uppmuntras forskare att testa vesikelutbyten från mindre kulturer för att bestämma hur mycket material som kommer att behövas för att uppnå sina önskade slutmål. Vikten av att fastställa om de medier som används för experimentet har en detekterbar partikelbakgrund måste också betonas innan ett experiment påbörjas, eftersom det materialet potentiellt kan förvirra vesikelpopulationskvantifieringen, minska känsligheten för vesikelkoncentration/ storleksmätningar eller förorena de slutliga vesikelpreparaten.

En annan utmaning för fältet är att inte alla cyanobakterier växer bra, eller alls, i ren kultur. Innan de görs axeniska kan tolkningar av fysiska vesikelegenskaper, produktionshastigheter eller innehåll inte nödvändigtvis leda till tydliga slutsatser om vesiklar som produceras av någon stam i samhället. Forskare rekommenderas också att överväga vilka andra typer av partiklar som kan vara närvarande och potentiellt förväxlas med vesiklar av specifika nanopartikelanalysverktyg, som inte nödvändigtvis kan skilja mellan olika partikeltyper. Det kan till exempel vara viktigt att verifiera att stammen som används saknar profag, antingen via genomsekvensering, induktionsanalyser eller på annat sätt eller inte släpper ut andra typer av partiklar. Enligt vår erfarenhet är de flesta cyanobakteriella vesiklar <0,2 μm i diameter, men när man tittar på en ny stam eller tillväxttillstånd bör man bekräfta om användning av ett filter på 0,45 μm porstorlek förändrar storleksfördelningen för renade partiklar.

Många aspekter av kulturförhållanden kan påverka vesikelproduktionen och dess innehåll 41,42. De fysikaliska och kemiska förhållanden som används för odlingstillväxt (inklusive lätt bestrålning, temperatur och mediesammansättning) måste därför dokumenteras och kontrolleras i den mån det är möjligt för att säkerställa resultatens reproducerbarhet. Varje kemisk analys av vesikelinnehåll måste ta hänsyn till bakgrundssammansättningen, särskilt vid utförande av analyser av hög genomströmning i "-omics"-stil. Detta kan vara särskilt viktigt när du använder odefinierade medier, såsom de som är baserade på en naturlig havsvattenbakgrund eller kompletteras med jästextrakt eller trypton. Att använda ett definierat tillväxtmedium kan vara att föredra beroende på de experimentella målen.

Forskare måste noggrant övervaka odlingstillväxtdynamiken med jämna mellanrum för att säkerställa att de vet var i tillväxtfasen en viss batchkultur är och inte bara samla in prover efter en godtycklig tid. Vesikelsammansättningen kan variera mellan tillväxtfaser, särskilt mellan exponentiella och stationära faser41,42. Till exempel kan åtminstone en viss bråkdel av vesiklar som provtas i den stationära fasen uppstå från en annan cellulär mekanism, såsom celllys, som inte kommer att inträffa under exponentiell tillväxt. Även om detta fortfarande kan vara av stort biologiskt intresse, är det viktigt att känna till provet. Om en cyanobakteriell odling når den önskade tillväxtfasen vid en tidpunkt då det inte är möjligt att gå direkt till provkoncentrationen rekommenderas att cellerna separeras från den <0,2 μm fraktionen omedelbart (med centrifugering och/eller direkt 0,2 μm filtrering) och sedan lagras det cellfria filtratet vid 4 °C. Materialet kan lagras på detta sätt i dagar med liten eller ingen märkbar inverkan på koncentrationen eller storleksfördelningen av vesiklar.

Vesikelrening
Det frekventa behovet av att isolera vesiklar från betydande volymkulturer är avgörande i arbetsflödet för cyanobakteriell vesikelisolering. Vid arbete med större volymer material måste vesiklarna koncentreras innan arbetsflöden för separation nedströms. Koncentratorer (tangentiella flödesfiltermembran eller centrifugalkolonner) med en nominell molekylviktgräns på 100 kDa rekommenderas i allmänhet, eftersom de möjliggör separation från lösligt material med låg molekylvikt samtidigt som koncentrationstiderna är rimliga, men 30 kDa-filter används också ofta med framgång. Medan flera icke-ultracentrifugeringsbaserade metoder för att rena vesiklar (t.ex. storleksuteslutningskromatografi, mikrofluidikbaserade system, affinitetsfångsttekniker och nederbördsbaserade tillvägagångssätt) blir populära i det extracellulära vesikelfältet, enligt vår erfarenhet, kan dessa tillvägagångssätt resultera i minskade utbyten och är vanligtvis oförenliga med de odlingsvolymer som behövs.

Forskare måste överväga sammansättningen av jodoxanolbakgrunden och de tvätt- / resuspensionsbuffertar som används vid vesikelrening för att säkerställa att de är kompatibla med de önskade nedströmsapplikationerna. I många fall kan det slutliga vesikelprovet återsuspenderas i tillväxtmedier eller en definierad buffert som är jämförbar i sammansättning med tillväxtmediet (t.ex. naturligt kontra artificiellt havsvatten). Detta kan dock inte vara möjligt med marina cyanobakteriella vesiklar, vilket kommer att kräva ytterligare experimentell manipulation för analys, eftersom höga saltkoncentrationer som liknar havsvattennivåerna kan hämma många enzymatiska reaktioner. I sådana fall fungerar standardlaboratoriebuffertar som 0,2 μm filtrerade, 1x PBS vanligtvis bra för att upprätthålla stabiliteten hos marina cyanobakteriella vesiklar och kan vara mer kompatibla med nedströms experimentella processer.

Densitetsgradientrening kan betraktas som valfri beroende på experimentella mål och odlingssammansättning men rekommenderas starkt för att producera ett mer rigoröst rent och reproducerbart prov. EV-populationer är heterogena och kan hittas över en rad flytande densiteter, som ytterligare varierar beroende på belastning, tillväxtförhållanden och andra faktorer 4,5,6. De densiteter som anges ovan representerar de som vanligtvis finns för vesiklar från cyanobakteriella kulturer och fältprover i jodoxanol, men resultaten i andra stammar kan variera. Andra densitetsgradientmaterial som sackaros och CsCl kan användas för vesiklar, men de kommer att migrera till olika flytande densiteter i dessa bakgrunder. Olika gradientmediabakgrunder kan påverka återhämtningen av lipidslutna virus43 och kan potentiellt påverka återhämtningen av vesiklar från olika stammar.

Vesiklar kan gå förlorade på flera punkter genom vesikelisolering och gradientreningsprocess som beskrivs här, vilket minskar utbytet och ökar mängden utgångsmaterial som behövs för att uppnå ett givet slutligt vesikelutbyte för nedströmsapplikationer. Särskild försiktighet bör iakttas vid arbete med vesikelpellets efter ultracentrifugering. Medan vissa cyanobakteriella vesiklar kan ha karotenoider eller andra föreningar som kan ge vesikelprover en viss mängd pigmentering (figur 2), beroende på stammen eller mängden material, förväntas det inte nödvändigtvis kunna visualisera vesiklarpelleten direkt. Var medveten om var pelleten förväntas vara med tanke på vilken typ av centrifugrotor som används. När så är möjligt föreslås renade vesikelprover undersökas med elektronmikroskopi för att verifiera sammansättningen av det slutliga material som återvunnits.

Lagringsförhållandenas inverkan på vesiklar och deras innehåll är fortfarande en öppen fråga. Även om det har visat sig att lagringen inte har någon märkbar effekt på cyanobakteriell vesikelstorlek eller koncentration14, kan funktionaliteten hos isolerade vesikelpreparat förändras över tiden44. Även om frys-/upptiningscykler bör undvikas när så är möjligt, verkar effekten av frysprover på det totala antalet fordon och storlekar vara minimal. Man bör vara medveten om potentialen för frys-tina cykler att påverka sammansättningen av vesikelinnehållet, såsom längden på vesikelassocierade nukleinsyror eller stabiliteten hos proteiner.

Vesiklar från field samples
Nuvarande metoder för att isolera extracellulära vesiklar från naturliga vattenmiljöer liknar konceptuellt och operativt de som beskrivs här för stora volymkulturer. Ändå kan de kräva ännu större volymer material. Sådana fältprover kan involvera insamling, filtrering och koncentration av hundratals till tusentals liter vatten för att erhålla tillräckligt med material för analys. Beroende på grumligheten hos det prov som används kan det behövas ett eller flera förfiltreringssteg före 0,2 μm-filtret. Den specifika TFF-anordning som används bör vara lämplig för att arbeta med så stora volymer inom rimlig tid (helst i storleksordningen timmar) och utan att sätta alltför stort tryck på provet. I praktiken innebär detta ofta att man använder en mycket större total ytarea än vad som kan tillämpas på odlingsbaserade prover, liksom slangar med större diameter för att underlätta ökade flödeshastigheter. Denna ökade filteryta kommer sannolikt att leda till en marginell ökning av partikelförluster jämfört med mindre TFF-arrangemang och en större slutlig volym koncentrat; Dessa farhågor måste dock vägas mot överväganden om den totala handläggningstiden. För situationer som en utökad oceanografisk kryssning där prover inte kommer tillbaka till ett laboratorium på många dagar efter provtagning rekommenderar vi att du utför initial 0,2 μm filtrering och TFF-steg i fältet. Denna mindre volym koncentrerat material kan sedan lagras vid 4 °C eller -80 °C ombord (beroende på tillgänglighet och analytiska överväganden nedströms) tills det returneras till laboratoriet för slutlig bearbetning.

Isolering och separation av extracellulära vesiklar från andra små partiklar, både organiska och oorganiska, kan vara utmanande, och metoder för att separera olika partiklar är ännu inte perfekta. Till exempel kan iodixanoldensitetsgradienter inte lätt separera alla klasser av vesiklar och virus som finns i ett givet prov. Eftersom typerna av förvirrande partiklar och deras fysikaliska egenskaper kommer att variera mellan provtagningsplatserna är det för närvarande omöjligt att tillhandahålla ett protokoll som robust delar upp alla klasser av små vattenpartiklar. Försök och fel är viktiga, och experiment med jodoxanolområdet som används i gradient- och ultracentrifugeringsförhållandena kommer att krävas för att maximera separationen; en samling mindre volymer, mer finupplösta densitetsfraktioner kan också krävas. Beroende på sammanhanget kan användning av CsCl-gradienter istället för jodoxanol hjälpa till att separera miljöpartiklar45. Ändå kan förändringen i osmotiska förhållanden leda till fördomar i de slutliga återvunna produkterna, som diskuterats ovan.

Vesikel karakterisering
Nanopartikelanalysinstrument är ännu inte rutinmässigt tillgängliga i mikrobiologiska laboratoriemiljöer men blir alltmer tillgängliga. Alla metoder har för- och nackdelar, och vi gör inget specifikt godkännande av en plattform som bättre än alla andra för cyanobakteriellt vesikelarbete; Faktum är att alla har särskilda avvägningar när det gäller kostnader, upplösning, användarvänlighet, detektionsgränser, kompatibilitet med olika tillväxtmedier / buffertbakgrunder och datareproduktion. Förutom instrument baserade på nanopartikelspårningsanalys som beskrivs ovan kan andra tillvägagångssätt, inklusive nanoflödescytometri, mikrofluidisk resistiv pulsavkänning och avstämbar resistiv pulsavkänning, tillämpas46,47. Användare bör vara noga med att lära sig detaljerna i deras tillgängliga instrumentering och verifiera att det fungerar bra med deras system, eftersom vi har stött på svårigheter när vi använder vissa plattformar med havsvattenbaserade medier. Vi uppmuntrar fältet att gå mot kvantitativ karakterisering av vesikelstorlek, koncentrationer och produktionshastigheter. Mätning av vesikelkoncentrationer på basis av en grundläggande partikel per ml, och inte i termer av proteininnehåll eller andra mätvärden, kommer att möjliggöra integrering av vesiklar i mer kvantitativa ramar och möjliggöra jämförelser mellan stammar och förhållanden. Ytterligare ansträngningar för att förbättra förmågan att kalibrera koncentrationsmätningar för <100 nm partiklar behövs.

Det faktum att mätningar av vesikelproduktionshastighet görs direkt från 0,2 μm filtrerad odlingssupernatant för att minimera partikelförluster skulle vara associerat med andra reningssteg som beskrivs ovan. Detta betyder dock att tillvägagångssättet inte nödvändigtvis diskriminerar mellan faktiska extracellulära vesiklar och andra små partiklar som finns i kulturerna. Endast räkning av partiklar inom specifika storleksintervall (t.ex. 50-250 nm diameter) kan hjälpa till att utesluta vissa avvikare, men visuell bekräftelse på att pelleterat <0,2 μm odlingsinnehåll verkar vara membranbundna vesiklar (med TEM eller andra metoder) behövs för att specifikt kunna hävda att man mäter produktionen av vesiklar i motsats till produktionen av vesikelliknande partiklar.

En väsentlig faktor vid vesikelkarakterisering är att säkerställa att vesikelprovet analyseras i lämpligt linjärt känslighetsområde för nanopartikelanalysanordningen. När ett prov är för koncentrerat är det enkelt att späda ut materialet med en ren buffert och analysera det igen. Å andra sidan kan den relativt låga cell- och/eller vesikeltätheten hos vissa cyanobakteriella kulturer ibland ge vesikelpreparat som ligger under vissa instruments detektionsgränser. I de fall där detta sker med vesikelrening i bulk kan man överväga att odla större volymkulturer, återpela och återsuspera det slutliga materialet i en mindre volym, eller utvärdera om det finns ett steg i isoleringsprocessen där alltför stora förluster uppstår och kan mildras. Vid mätning av vesikelproduktionshastigheter är korrigeringarna inte nödvändigtvis så enkla. Prover kan koncentreras vid behov, men den första bör se om justeringar av mediet kan leda till högre celltäthet eller om tillräckligt koncentrerade prover kan erhållas från senare tidpunkter under exponentiell fas där koncentrationerna blir högre.

Begränsningar
Som med alla protokoll har vesikelisolering med hjälp av dessa metoder tydliga begränsningar. Dessa tillvägagångssätt förlitar sig inte på deras garanti för att en helt ren beredning av vesiklar kommer att isoleras. Både kulturer och fältprover kan innehålla andra material, som migrerar på samma sätt som vesiklar i densitetsgradienter. Ändå är dessa typer av ytterligare reningsmetoder åtminstone väsentliga för att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet av vesikelanalys. Medan vi beskriver vesikelisoleringsmetoder i samband med cyanobakterier, kommer kulturer av många andra mikrober också att innehålla vesiklar i relativt låga koncentrationer, och de förfaranden som beskrivs här bör vara allmänt tillämpliga. Det förväntas att dessa metoder inte kommer att fungera som ett permanent protokoll utan istället som en utgångspunkt för att stimulera framtida framsteg i arbetet med extracellulära vesiklar från olika mikrober. Framtida ansträngningar krävs för att slå samman dessa metoder med andra tillvägagångssätt som storleksuteslutningskolonner eller asymmetrisk fältflödesfraktionering för att förbättra diskrimineringen och separationen av olika kategorier av små partiklar från kulturer och miljöprover. Vi hoppas också att dessa tekniker kan fortsätta att utvecklas tillsammans med förbättringar i nanopartikelkarakteriseringstekniker för att förbättra förmågan att undersöka heterogenitet inom vesikelpopulationer, deras innehåll och deras exakta funktionella roller i miljön.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna erkänner stödet från i3S vetenskapliga plattformar "Biointerfaces and Nanotechnology" och "Histology and Electron Microscopy", en medlem av den nationella infrastrukturen Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Vi tackar också prof. J. A. Gonzalez-Reyes (University of Córdoba, Spanien) för att ha hjälpt till att optimera det ultratunna sektionsfärgningsprotokollet för TEM, och Dr. Cecília Durães och Dr. Ana Rita Pinto (University of Porto, Portugal) för nanopartikelspårningsanalysen.

Detta arbete finansierades av US National Science Foundation (OCE-2049004 till SJB), av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fonder genom COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, och av portugisiska medel genom Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior inom ramen för projektet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 till PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia är också mycket erkänt för doktorandstipendiet SFRH / BD / 130478/2017 (SL) och FCT Investigator grant IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. stöddes av marie skłodowska-Curie-stipendiet (återintegreringspanelen) inom ramprogrammet Horisont 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Coelho, C., Casadevall, A. Answers to naysayers regarding microbial extracellular vesicles. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1005-1012 (2019).
  4. Schwechheimer, C., Kuehn, M. J. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nature Reviews Microbiology. 13 (10), 605-619 (2015).
  5. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  6. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological Functions and Biogenesis of Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles. Annual Review of Microbiology. 64 (1), 163-184 (2010).
  7. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  8. Flores, E., Herrero, A. Compartmentalized function through cell differentiation in filamentous cyanobacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 39-50 (2010).
  9. Flombaum, P., et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9824 (2013).
  10. Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: the structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
  11. Abed, R. M. M., Dobretsov, S., Sudesh, K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology. 106 (1), 1-12 (2009).
  12. Lea-Smith, D. J., et al. Editorial: Exploring the growing role of cyanobacteria in industrial biotechnology and sustainability. Frontiers in Microbiology. 12, 1963 (2021).
  13. Garcia-Pichel, F., Zehr, J. P., Bhattacharya, D., Pakrasi, H. B. What's in a name? The case of cyanobacteria. Journal of Phycology. 56 (1), 1-5 (2020).
  14. Biller, S. J., et al. Bacterial vesicles in marine ecosystems. Science. 343 (6167), 183 (2014).
  15. Pardo, Y. A., Florez, C., Baker, K. M., Schertzer, J. W., Mahler, G. J. Detection of outer membrane vesicles in Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 362 (20), (2015).
  16. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  17. Biller, S. J., et al. Membrane vesicles in sea water: heterogeneous DNA content and implications for viral abundance estimates. The ISME Journal. 11 (2), 394-404 (2017).
  18. Yin, H., et al. Synechococcus elongatus PCC7942 secretes extracellular vesicles to accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis. Theranostics. 9 (9), 2678-2693 (2019).
  19. Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Extracellular vesicles: An overlooked secretion system in cyanobacteria. Life. 10 (8), 129 (2020).
  20. Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e60359 (2019).
  21. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila outer membrane vesicles: Isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55146 (2017).
  22. Fantappiè, L., et al. Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  23. Moore, L. R., et al. Culturing the marine cyanobacterium Prochlorococcus. Limnology and Oceanography: Methods. 5 (10), 353-362 (2007).
  24. Rippka, R., et al. Prochlorococcus marinus Chisholm et al. 1992 subs. Pastoris subs. nov. Strain PCC 9511, the first axenic chlorophyll a2/b2-containing cyanobacterium (Oxyphotobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5), 1833 (2000).
  25. Moore, L. R., Chisholm, S. W. Photophysiology of the marine cyanobacterium Prochlorococcus: Ecotypic differences among cultured isolates. Limnology and Oceanography. 44 (3), 628 (1999).
  26. Charpy, L., Larkum, A. W. D. Bulletin de l'Institut Océanographique de Monaco, (n spécial 19). , 457-475 (1999).
  27. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  28. Fomsgaard, A., Freudenberg, M. A., Galanos, C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology. 28 (12), 2627-2631 (1990).
  29. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  30. Peterson, T. Densitometric analysis using NIH image. North American Vascular Biology Organization (NAVBO) eNewsletter. 16 (3), (2010).
  31. Jürgens, U. J., Weckesser, J. Carotenoid-containing outer membrane of Synechocystis sp. strain PCC6714. Journal of Bacteriology. 164 (1), 384-389 (1985).
  32. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 99-128 (2014).
  33. McBroom, A. J., Johnson, A. P., Vemulapalli, S., Kuehn, M. J. Outer membrane vesicle production by Escherichia coli is independent of membrane instability. Journal of Bacteriology. 188 (15), 5385-5392 (2006).
  34. Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamicin: a novel mechanism of enzyme secretion. Journal of Bacteriology. 177 (14), 3998-4008 (1995).
  35. Nguyen, T. T., Saxena, A., Beveridge, T. J. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Journal of Electron Microscopy. 52 (5), 465-469 (2003).
  36. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  37. Norena-Caro, D. A., Malone, T. M., Benton, M. G. Nitrogen sources and iron availability affect pigment biosynthesis and nutrient consumption in Anabaena sp. UTEX 2576. Microorganisms. 9 (2), 431 (2021).
  38. Rippka, R. Isolation and purification of cyanobacteria. Methods in Enzymology. , Academic Press. 3-27 (1988).
  39. Van Alphen, P., Abedini Najafabadi, H., Branco dos Santos, F., Hellingwerf, K. J. Increasing the photoautotrophic growth rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by identifying the limitations of its cultivation. Biotechnology Journal. 13 (8), 1700764 (2018).
  40. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA. mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12 (383), (2021).
  41. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
  42. Soares, N. C., et al. Associating growth-phase-related changes in the proteome of Acinetobacter baumannii with increased resistance to oxidative stress. Journal of Proteome Research. 9 (4), 1951-1964 (2010).
  43. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  44. Dell'Annunziata, F., et al. Outer membrane vesicles derived from Klebsiella pneumoniae are a driving force for horizontal gene transfer. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8732 (2021).
  45. Linney, M. D., Schvarcz, C. R., Steward, G. F., DeLong, E. F., Karl, D. M. A method for characterizing dissolved DNA and its application to the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography: Methods. 19 (3), 210-221 (2021).
  46. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  47. Cimorelli, M., Nieuwland, R., Varga, Z., vander Pol, E. Standardized procedure to measure the size distribution of extracellular vesicles together with other particles in biofluids with microfluidic resistive pulse sensing. PLoS ONE. 16 (4), 0249603 (2021).

Tags

Biologi nummer 180
Isolering och karakterisering av cyanobakteriella extracellulära vesiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, S. J.,… More

Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter