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Biology

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires cyanobactériennes

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement, la concentration et la caractérisation des vésicules extracellulaires provenant de cultures cyanobactériennes. Les approches pour purifier les vésicules de cultures à différentes échelles, les compromis entre les méthodologies et les considérations pour travailler avec des échantillons de terrain sont également discutés.

Abstract

Les cyanobactéries sont un groupe diversifié de bactéries photosynthétiques à Gram négatif qui jouent un rôle essentiel dans les écosystèmes mondiaux et servent de modèles biotechnologiques essentiels. Des travaux récents ont démontré que les cyanobactéries marines et d’eau douce produisent des vésicules extracellulaires - de petites structures membranaires libérées par la surface externe des microbes. Bien que les vésicules contribuent probablement à divers processus biologiques, leurs rôles fonctionnels spécifiques en biologie cyanobactérienne restent largement inconnus. Pour encourager et faire progresser la recherche dans ce domaine, un protocole détaillé est présenté pour isoler, concentrer et purifier les vésicules extracellulaires cyanobactériennes. Les travaux actuels portent sur les méthodologies qui ont permis d’isoler avec succès des vésicules de grandes cultures de Prochlorococcus, Synechococcus et Synechocystis. Les méthodes de quantification et de caractérisation des échantillons de vésicules de ces souches sont présentées. Des approches pour isoler les vésicules à partir d’échantillons de terrain aquatique sont également décrites. Enfin, les défis typiques rencontrés avec la purification des vésicules cyanobactériennes, les considérations méthodologiques pour différentes applications en aval et les compromis entre les approches sont également discutés.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures sphériques, allant de ~ 20 à 400 nm de diamètre, libérées par pratiquement tous les organismes dans leur environnementenvironnant 1,2,3. Les vésicules sont délimitées par une bicouche lipidique et ne peuvent pas se répliquer. Chez les bactéries à Gram négatif, on pense que ces structures proviennent principalement du « blebbing » de petites portions de la membrane externe. Pourtant, d’autres processus, y compris le mouvement flagellaire, la lyse cellulaire et la sécrétion de matériau membranaire interne et externe, peuvent également produire des vésicules 4,5. Les VE peuvent contenir diverses biomolécules, y compris des lipides, des protéines solubles et membranaires, des acides nucléiques et des métabolites, et peuvent transporter ce matériau entre les cellules 4,5,6. Compte tenu de ces caractéristiques, les VE sont à l’étude pour comprendre leurs rôles possibles dans un large éventail de processus biologiques, y compris la communication cellulaire, la formation de biofilm, le transfert horizontal de gènes, la dynamique hôte-phage et l’échange de nutriments 4,6.

Les cyanobactéries sont un groupe important et diversifié de bactéries à Gram négatif, y compris les organismes unicellulaires et filamenteux. Ils sont intéressants à bien des égards, y compris la compréhension de leur physiologie et de leur diversité 7,8, les fonctions écosystémiques critiques qu’ils servent 9,10 et leur utilité pour la biotechnologie11,12. Les cyanobactéries se trouvent dans une grande variété d’habitats, soit en tant qu’organismes libres dans les environnements marins, d’eau douce et terrestres, soit en association symbiotique avec des mousses, des fougères, des plantes ou dans des lichens et des éponges13. Ils servent de producteurs primaires cruciaux dans les écosystèmes aquatiques, produisant de l’oxygène et du carbone organique par photosynthèse oxygénée 9,10, et certains sont capables de fixer l’azote atmosphérique ainsique 7. Les cyanobactéries marines et d’eau douce, y compris Prochlorococcus, Synechococcus et Synechocystis, produisent des VE dans des conditions de laboratoire 14,15,16, et des vésicules cyanobactériennes peuvent également être trouvées dans des environnements naturels14,17. Les fonctions biologiques et écologiques des vésicules cyanobactériennes sont inconnues, mais d’autres recherches dans ce domaine sont susceptibles de fournir de nouvelles informations sur les questions sur la physiologie cyanobactérienne, la différenciation, les stratégies de communication, l’évolution et les interactions trophiques. En outre, la capacité des véhicules électriques cyanobactériens à transporter diverses catégories de biomolécules peut avoir des applications commerciales18,19.

Le présent protocole décrit les méthodes d’isolement et de caractérisation des vésicules à partir de cultures cyanobactériennes et d’échantillons de terrain afin de permettre et d’encourager un examen plus large de la biologie des vésicules extracellulaires cyanobactériennes. Bien que le flux de travail décrit ici soit analogue aux protocoles d’isolement et de caractérisation des VE d’autres bactéries, les cultures cyanobactériennes et les échantillons de terrain contiennent généralement des concentrations de cellules et de vésicules plus faibles que celles couramment observées avec les systèmes de modèles associés à l’hôte ou pathogènes 20,21,22. Ainsi, les études sur les VE cyanobactériens nécessitent des considérations et des optimisations particulières pour la culture et l’isolement des vésicules, qui varient davantage entre les souches et les milieux. Comme aucun protocole unique ne fonctionnera aussi bien pour toutes les souches, conditions de croissance et applications en aval, nous proposons de multiples options et discutons des compromis impliqués afin que les chercheurs puissent déterminer les approches les plus appropriées pour répondre à leurs questions expérimentales.

Protocol

Les souches cyanobactériennes sont obtenues à partir de plusieurs collections de culture (voir Discussion pour plus de détails).

1. Culture de cyanobactéries

  1. Cultivez les cyanobactéries marines Prochlorococcus et Synechococcus en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Cultivez les souches de Prochlorococcus et de Synechococcus dans des flacons en polycarbonate en utilisant un milieu approprié tel que Pro99 ou SN (voir tableau des matériaux). Pour plus de détails, veuillez consulter les références23,24 publiées précédemment.
    2. Acclimater les cultures en les cultivant sur deux à trois transferts (dilutions de culture 1:20 dans des milieux frais pour chaque passage) dans les conditions de température et d’irradiance souhaitées requises pour l’expérience.
      REMARQUE: Les conditions de croissancetypiques 23,25 comprennent des températures comprises entre 15 et 30 ° C à un irradiance compris entre 8 et 150 photons μmol m-2 s-1, mais les tolérances de déformation individuelles et les optima varient considérablement26 et doivent être définis en fonction des instructions ou de la littérature pertinentes en matière de collecte de culture. Surveillez le taux de croissance à l’aide de la fluorescence de culture ou de la cytométrie en fluxcompte 23 et assurez-vous que les cultures se développent à un taux exponentiel constant à l’état d’équilibre avant de commencer l’expérience.
    3. Effectuer un ensemble de transferts progressifs successifs de volumes plus petits à plus grands une fois que les cellules atteignent la phase exponentielle tardive (par exemple, 20 mL < 250 mL < 2 L < 10 L < 20 L).
      REMARQUE: Les cultures à grand volume ne peuvent pas être directement inoculées à partir de petites quantités de culture de départ. Notez que les cultures plus grandes peuvent nécessiter l’ajout de tampons (tels que 1 mM HEPES, pH 7,5 ou 3,75 mM TAPS, pH 8), ainsi que du bicarbonate de sodium supplémentaire ou bouillonnant avec de l’air stérile24.
  2. Cultiver la cyanobactérie d’eau douce Synechocystis sp. PCC 6803.
    1. Préparer une culture de Synechocystis sp. PCC 6803 à utiliser comme inoculum en le cultivant avec aération (air bouillonnant à 1 L/min), à 30 °C, sous une lumière de 16 h (nombre de photons de 50 μmol m-2 s-1) / régime sombre de 8 h, jusqu’à une densité optique à 730 nm (OD730) de 1,0 (phase exponentielle) en milieu BG1127.
    2. Inoculer 30 mL de cette culture Synechocystis sp. PCC 6803 dans 570 mL de milieu BG11 à un OD730 de 0,05 dans des bouteilles de lavage au gaz en verre de 1 L.
    3. Permettre aux cellules de croître avec aération, à 30 °C, sous une lumière de 16 h (nombre de photons de 50 μmol m-2 s-1) / régime d’obscurité de 8 h, jusqu’à un OD730 final de 1,0-1,5.

2. Séparation de la biomasse cyanobactérienne de la fraction de petites particules (vésicules)

REMARQUE: Tout d’abord, il est recommandé de séparer les cellules du surnageant par granulation centrifuge des cellules. Cependant, lorsque les volumes de culture sont trop importants pour que cela soit possible, il est possible de sauter la centrifugation et de procéder directement au filtrage des cultures entières à l’aide de la filtration en capsule (étape 2.4).

  1. Effectuer la centrifugation pour séparer les cellules (idéal pour des volumes allant jusqu’à ~ 4 L, en fonction de la capacité de centrifugeuse disponible).
    1. Autoclavez ou lavez soigneusement et nettoyez les bouteilles de centrifugeuse à l’aide d’eau ultrapure de type I (voir tableau des matériaux), en veillant à ce qu’il ne reste pas de savon résiduel ou d’autres matières.
    2. Chargez les échantillons de culture dans un nombre approprié de bouteilles de centrifugeuse et équilibrez-les.
    3. Faire tourner les cultures pendant >10 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Si le surnageant reste visiblement trouble, augmentez les conditions de centrifugation à 20 min à la vitesse maximale et réessayez.
    4. Décantez ou pipetez soigneusement le surnageant dans un récipient propre et passez à l’une des options de filtration suivantes mentionnées aux étapes 2.2-2.4.
  2. Option 1 : effectuer la filtration de la seringue à l’aide de filtres de 0,2 μm (pour des volumes d’échantillons allant jusqu’à ~50 mL).
    1. Remplissez une seringue stérile de 50 mL avec un milieu de culture en grande partie exempt de cellules et filtrez-la à travers un filtre en polyéthersulfone (PES) de 0,2 (ou 0,45) μm (voir tableau des matériaux). Recueillir le filtrat dans un récipient propre et stérilisé.
    2. Répétez cette étape jusqu’à ce que le filtre soit bouché (par exemple, il devient difficile de pousser avec la seringue). Remplacez par un nouveau filtre et continuez jusqu’à ce que l’échantillon soit bien filtré.
  3. Option 2: effectuer une filtration sous vide de 0,2 μm (jusqu’à ~ 4 L).
    1. Lavez et nettoyez soigneusement l’appareil d’aspiration à l’aide d’eau de qualité ultrapure de type I, en le connectant à un piège à vide et à une pompe (voir tableau des matériaux).
    2. Insérez un filtre de 0,2 μm d’un diamètre approprié et serrez l’appareil à vide.
    3. Ajouter une petite quantité d’échantillon de culture, en s’assurant que la pression de vide reste <10 psi.
    4. Continuez à filtrer la culture par petits incréments jusqu’à ce que vous ayez terminé. Si le taux de filtration ralentit considérablement, arrêtez le vide et remplacez le filtre.
    5. Recueillir la fraction <0,2 μm contenant des vésicules dans un récipient propre.
  4. Option 3: effectuer une filtration de capsule de 0,2 μm (pour des volumes d’échantillon > ~ 4 L)
    1. Nettoyez les tubes flexibles et le récipient de collecte de taille appropriée en les lavant à l’eau et au détergent doux. Rincer le matériau à l’eau distillée et désionisée.
      REMARQUE: Avant utilisation, le matériau doit être rincé avec de l’eau de type I - de qualité ultrapure.
    2. Placez la culture à filtrer dans un endroit sûr et surélevé avec le récipient de collecte final ci-dessous. Connectez un filtre à capsules de 0,2 μm (voir Tableau des matériaux) à un tuyau et placez-le dans un récipient de collecte.
    3. Placez un autre tube dans l’échantillon, commencez un siphon gravitaire en tirant un échantillon dans le tube avec une seringue et connectez le tube au filtre à capsules. Utilisez l’évent pour libérer l’excès d’air et remplir la chambre de surnageant.
    4. Laissez le matériau se déplacer à travers la capsule jusqu’à ce que l’échantillon soit bien filtré. Si le débit devient trop lent (< ~ 1/10ème du débit de départ, ou sortant goutte à goutte par opposition à un flux continu), attendez ou appliquez une force douce avec une pompe péristaltique jusqu’à ce que la contre-pression augmente. Alternativement, rétablissez partiellement les débits en déconnectant temporairement le filtre, en reconditionnant la biomasse accumulée du côté de l’entrée avec de l’eau ultrapropre jusqu’à ce que le matériau ne soit plus visiblement trouble, puis redémarrez le processus de filtration.

3. Concentration de l’échantillon de vésicule

  1. Option 1 : effectuer une ultrafiltration centrifuge pour concentrer un petit volume (<500 mL) d’échantillons.
    1. Rincez les concentrateurs centrifuges à ultrafiltration de 15 à 20 mL de votre choix avec de l’eau de qualité ultrapure de type I.
    2. Chargez les concentrateurs dans la centrifugeuse et faites tourner à 4 400 x g à 4 °C. Ignorez l’exécution et répétez cette étape au moins deux fois de plus.
    3. Chargez l’échantillon de surnageant dans des concentrateurs rincés à l’eau et faites tourner dans les mêmes conditions. Selon les objectifs expérimentaux, le filtrat de l’échantillon peut être jeté ou collecté pour une concentration ultérieure (avec des concentrateurs avec une limite de poids moléculaire nominal de 3 kDa) et une analyse.
    4. Répétez cette étape jusqu’à ce que l’échantillon soit concentré sur un volume final d’environ 15 à 30 mL.
  2. Option 2 : effectuer une filtration à flux tangentiel (TFF) pour concentrer un grand volume d’échantillon (>500 mL).
    1. Configurez l’appareil TFF conformément aux directives du fabricant (voir tableau des matériaux). Fixez une pompe péristaltique à la ligne d’admission et placez des pinces réglables sur la ligne de rétentat. Désinfectez le TFF comme recommandé par le fabricant, puis rincez l’appareil avec 1 L d’eau de type I - de qualité ultrapure.
      REMARQUE: Les conduites d’admission et de rétentat doivent être placées dans un réservoir d’échantillon propre (bouteille en verre). Les conduites de filtrat doivent être dirigées vers une cuve ou un évier à déchets.
    2. Ajouter < 0,2 μm de filtrat dans le réservoir d’échantillonnage. Augmentez lentement la vitesse de la pompe et les niveaux de contre-pression sur la ligne de rétentat pour augmenter le rendement des conduites de filtrat.
    3. Continuez à faire fonctionner le TFF, en remplissant le réservoir de surnageant de culture au fur et à mesure que le matériau est retiré. Évitez de laisser la conduite d’admission sortir de l’échantillon pendant le traitement pour éviter d’introduire des bulles d’air. Assurez-vous que la pression d’alimentation ne dépasse pas ~10 psi et que le rétentat s’écoule hors du TFF à un rythme constant dans le réservoir.
    4. Arrêtez de concentrer l’échantillon une fois que le volume dans le réservoir atteint la quantité la plus faible possible nécessaire pour maintenir le débit dans la conduite d’admission sans introduire de bulles d’air.
    5. Fermez la ligne de sortie avec une pince. Retirez la contre-pression sur la ligne de rétentat et faites recirculer le surnageant concentré à travers le filtre pendant environ 10 minutes, réduisant ainsi le taux de recirculation à 20-40 mL / min pour maximiser la récupération.
    6. Déplacez la ligne de rétentat dans un récipient propre, retirez la ligne d’admission de l’échantillon et prélevez le matériau concentré. Récupérez tout matériau restant dans le réservoir d’échantillon à l’aide d’une pipette.
    7. Filtrer le surnageant concentré à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm (étape 2.2) pour s’assurer qu’il ne reste pas de cellules.
      REMARQUE: L’étape 3.2.7 est facultative.
    8. Si nécessaire, conservez le concentré final à 4 °C pendant environ 3 semaines avant de passer à la purification des vésicules (étape 4).

4. Isolement et purification des vésicules

  1. Granulé directement par ultracentrifugation en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Placer l’échantillon de culture concentré <0,2 μm dans un tube ultracentrifuge propre. Ajoutez un média propre ou un tampon si nécessaire pour vous assurer que le tube est complètement rempli.
      REMARQUE: Si l’échantillon de culture final est trop grand pour tenir dans un tube, soit en granulés le matériau dans plusieurs tubes à combiner avant les étapes de lavage, soit en granulés en série dans le même tube.
    2. Si nécessaire, créez un équilibre et faites tourner à ~100 000 x g pendant 3 h à 4 °C.
    3. Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Bien que les granulés de vésicules cyanobactériens puissent montrer une certaine coloration, ils sont souvent invisibles.
    4. Laver le matériau granulé en ajoutant un milieu de culture frais ou un tampon de lavage tel que 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir Discussion) au tube ultracentrifuge, mélanger par pipetage doux et tourner à nouveau comme à l’étape 4.1.2. Répétez le processus de lavage une deuxième fois.
    5. Remettre en suspension la pastille finale en culture fraîche en pipetant de haut en bas autour du fond du tube de plusieurs fois mais doucement avec une pipette de 1 mL. Transfert dans un récipient propre.
  2. Effectuer une ultracentrifugation du gradient de densité.
    1. Préparer les stocks d’iodixanol (voir Tableau des matériaux) en faisant une version concentrée 4x de l’arrière-plan tampon souhaité pour l’échantillon (voir Discussion).
    2. Mélanger une partie du tampon 4x avec trois parties de bouillon d’iodixanol à 60% pour obtenir une solution d’iodixanol à 45%.
    3. Diluer 45 % d’iodixanol avec des volumes de 1x tampon pour créer des stocks de milieux de gradient à des concentrations finales d’iodixanol de 40 %, 35 %, 25 %, 20 %, 15 % et 10 %.
      REMARQUE: La quantité totale nécessaire varie en fonction de la capacité du rotor / des tubes ultracentrifuges.
    4. Mettez en place un gradient de densité d’ultracentrifugation en superposant soigneusement des quantités égales de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% et 0% d’ioxidinol dans un tube ultracentrifuge de sorte que tout le volume du tube est utilisé.
      REMARQUE: L’échantillon de vésicule extracellulaire à purifier doit être placé au sommet du gradient dans le cadre de la couche d’iodixanol à 0%. Si le volume final de l’échantillon de vésicule dépasse la taille de la couche à 0 %, mélanger tout échantillon de vésicule en excès avec suffisamment d’iodixanol à 45 % et/ou de tampon pour générer le volume requis des stocks d’optiprep à concentration de 10 % ou plus, et les utiliser à l’emplacement correspondant dans le gradient.
    5. Faire tourner le gradient à ~100 000 x g à 4 °C pendant 6 h.
    6. Recueillir des fractions (généralement 0,5 mL chacune pour un gradient d’environ 4,5 mL) par pipetage minutieux ou à l’aide d’un collecteur de fractions (voir tableau des matériaux).
    7. Déterminer la densité de chaque fraction (en g/mL) à l’aide d’une balance analytique et d’une pipette étalonnée pour mesurer le poids d’un volume d’échantillon connu. Retirez l’échantillon du tube, déterminez le poids et retournez l’échantillon directement.
    8. Diluer les fractions individuelles dans un nouveau tube ultracentrifuge avec un tampon propre et laver le matériau comme mentionné aux étapes 4.1.2-4.1.4. Vous pouvez également utiliser des colonnes de dialyse ou d’ultrafiltration pour récupérer les particules.
      REMARQUE: Les vésicules extracellulaires cyanobactériennes migrent généralement vers des densités flottantes d’environ 1,14 à 1,19 g / mL dans l’iodixanol.
  3. Conservez les vésicules à 4 °C si elles doivent être utilisées dans les 1 à 3 semaines. Congelez les vésicules à -20 °C ou -80 °C si elles ne sont pas utilisées plus longtemps que cette période.

5. Caractérisation des vésicules isolées

  1. Effectuer une microscopie électronique à transmission de taches négatives (voir tableau des matériaux) (TEM; taille, structure, pureté des particules).
    1. Pour améliorer la qualité de l’image, la lueur décharge la surface d’une grille TEM revêtue d’un ancien revêtement à l’aide d’un système de décharge lumineuse conformément aux directives du fabricant (voir tableau des matériaux).
    2. Appliquer soigneusement ~5 μL de l’échantillon de vésicule et laisser reposer pendant 5 min.
      REMARQUE: Les échantillons avec des concentrations de vésicules >109 mL-1 donneront généralement les meilleurs résultats; les échantillons plus dilués auront peu de vésicules par image.
    3. Retirez l’échantillon en touchant le bord d’une grille à un morceau de papier filtre propre.
    4. Pipeter une goutte de 20 à 50 μL d’acétate d’uranyle à 2% (voir Tableau des matériaux) sur une surface plane recouverte d’un film plastique et placer la grille flottant dessus pendant 2 min.
    5. Retirez l’acétate d’uranyle à l’aide de papier filtre et flottez brièvement sur une goutte d’eau ultrapure pour le laver. Répétez le lavage à l’eau une deuxième fois.
      REMARQUE: La grille sèche finale est prête pour la visualisation après l’étape 5.1.5.
  2. Effectuer une coloration de section ultra-mince pour TEM (taille des particules, structure interne).
    1. Remettre en suspension la pastille de l’étape 4.1.5 avec 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7) (voir tableau des matériaux) et fixer l’échantillon pendant 2 h à 4 °C.
    2. Tourner à ~100 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
    3. Lavez soigneusement la pastille avec un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7), puis tournez à ~100 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
    4. Fixer la pastille avec 1 mL de 1 % de tétroxyde d’osmium (voir tableau des matériaux) (préparée dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M) pendant 1 h, puis laver comme à l’étape 5.2.3.
    5. Déshydrater l’échantillon avec 1 mL d’une série ascendante d’éthanol (50 %, 70 %, 90 % et deux fois dans l’éthanol absolu) par paliers de 10 min chacun à 4 °C.
    6. Ajouter 250 μL de résine époxy (voir tableau des matériaux) mélangé à de l’éthanol absolu (1:1) à la pastille et incuber pendant la nuit à 4 °C.
    7. Transférer la pastille à 500 μL de résine pure pendant 24 h. Ensuite, incuber la résine à 65 °C pendant 48 h.
      REMARQUE: La résine est maintenant prête pour le sectionnement par ultramicrotome, en suivant les instructions du fabricant (voir la table des matériaux).
    8. Tacher les grilles contenant des sections avec 2% d’acétate d’uranyle (dans 50% d’éthanol) pendant 5 min. Lavez doucement les glissières sous l’eau désionisée courante pendant 10 à 15 s chacune. Placez une goutte de citrate de plomb (voir tableau des matériaux) et tachez encore 5 min.
    9. Lavez comme avant, retirez l’eau en épongeant la grille sur un papier filtre et séchez les grilles à l’air. Visualisez par TEM selon les directives du fabricant (voir Tableau des matériaux).
  3. Effectuer une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) (taille des particules, concentration).
    1. À l’aide de papier à lentille, essuyez soigneusement toute poussière ou tout matériau visible du plat optique. Vérifiez si tous les joints toriques et autres joints sont propres et intacts. Allumez l’instrument et démarrez le logiciel.
    2. À l’aide d’une seringue propre, remplissez la chambre d’eau ultra-pure. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente.
    3. Cliquez sur Démarrer la caméra et visualisez la région optimale de la chambre à propos de l’empreinte du pouce. Ajustez l’étage du microscope horizontalement ou verticalement selon vos besoins afin que l’intensité du signal soit uniforme dans la région imagée. Déplacez la région d’imagerie horizontalement par rapport à l’empreinte numérique (vers la droite, vers la ligne verticale), en trouvant une région à proximité avec un signal d’arrière-plan faible.
    4. Faites glisser les curseurs Gain d’écran et Niveau de la caméra au maximum, puis diminuez au niveau le plus bas pour voir les particules les plus faibles.
      REMARQUE: Les paramètres typiques des vésicules cyanobactériennes utilisent un gain d’écran de 7 et un niveau de caméra compris entre 10 et 12.
    5. Ajustez la mise au point si nécessaire pour vous assurer que les particules sont à peu près également visibles dans le champ de vision. Continuez à pousser de l’eau ultra-propre à travers la chambre jusqu’à ce que vous ayez visuellement confirmé que la chambre est propre.
    6. Retirez l’eau résiduelle de la chambre à l’aide d’une seringue différente.
    7. Examinez un échantillon du milieu/tampon dans lequel se trouve votre échantillon pour déterminer la concentration de particules de fond en remplissant la chambre de milieu/tampon à l’aide d’une seringue propre de 1 mL.
    8. Sélectionnez Mesure standard dans la liste déroulante SOP . Modifiez les paramètres pour collecter au moins trois répliques techniques de vidéos de 60 s chacune. Appuyez sur Créer et exécuter un script et suivez les invites. Poussez ~100 μL d’échantillon dans la chambre entre les répétitions.
    9. Une fois l’acquisition terminée, retirez le tampon résiduel avec une seringue, rincez 3 à 5 mL d’eau ultra-pure dans la chambre et retirez l’eau restante.
    10. Ajouter l’échantillon de vésicule à la chambre à l’aide d’une seringue de 1 mL et confirmer les paramètres d’acquisition. Si le nombre de particules n’est pas dans la plage linéaire de l’instrument (généralement entre 20 et 80 particules/cadre), l’échantillon devra être dilué ou concentré. Poussez au moins 500 μL d’échantillon dans la chambre avant de recueillir les données.
    11. Collectez des données vidéo comme à l’étape 5.3.8, en vous assurant de nettoyer la chambre avec de l’eau ultra-pure entre différents échantillons.
    12. Prélever tous les échantillons subséquents du même organisme ou de la même expérience à l’aide de paramètres de caméra identiques pour assurer la comparabilité des données; les modifications apportées au paramètre Niveau de la caméra peuvent avoir un effet notable sur les valeurs finales obtenues.
    13. Déterminez les paramètres des particules à l’aide de la section d’analyse du logiciel. Sélectionnez Analyse > Expérience ouverte, puis chargez l’exemple de fichier. Sélectionnez Traiter les fichiers sélectionnés et attendez la fin de l’analyse. Assurez-vous d’utiliser le même seuil de détection pour tous les échantillons suivants de la même expérience.
      REMARQUE: Comme les vésicules cyanobactériennes sont fréquemment sombres, le seuil de détection devra généralement être ajusté à la valeur la plus sensible (la plus basse).
  4. Effectuer une diffusion dynamique de la lumière (DLS) (taille des particules, potentiel zêta).
    1. Filtrez à travers un filtre de taille de pore de 0,2 μm pour tout échantillon qui entre dans le DLS afin de filtrer les grosses particules qui interfèrent avec les mesures.
    2. Ajouter 1 mL du milieu/tampon dans une cuvette propre pour examiner les agrégations possibles ou d’autres nanoparticules provenant du milieu. Mettez la cuvette avec le côté givré à gauche dans le micro-échantillonneur et fermez le couvercle. Laissez l’échantillon s’équilibrer pendant au moins 5 min.
    3. Entrez l’indice de réfraction du matériau et l’absorption du matériau s’ils diffèrent considérablement des valeurs par défaut pour l’eau.
      REMARQUE: Les propriétés du matériau auraient très peu d’influence si les vésicules sont inférieures à 100 nm. Lors de la mesure du potentiel de surface (potentiel zêta) des véhicules électriques, les vésicules doivent être remises en suspension dans le milieu de croissance d’origine.
    4. Cliquez sur le Panneau de commande de l’instrument pour vérifier les lectures et démarrer l’acquisition de données en cliquant sur l’icône verte. Si les valeurs semblent correctes et que votre média/tampon ne contient pas d’agrégations ou d’autres particules, vous êtes maintenant prêt à mesurer votre échantillon.
    5. Ajouter 1 mL d’échantillon de vésicule dans une cuvette propre et recueillir les données mentionnées à l’étape 5.4.4. Collectez au moins trois répliques techniques pendant 10 minutes chacune.
  5. Effectuer une analyse des lipopolysaccharides (LPS) pour confirmer que les VE à Gram négatif sont présents dans l’échantillon.
    1. Dénaturer thermiquement l’échantillon de vésicules à 95 °C pendant 10 min dans un tampon d’échantillon Laemmli standard 1x (voir tableau des matériaux).
    2. Incuber avec 0,2 U de protéase de type XIV de Streptomyces griseus (voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 30 min pour éliminer les glycoprotéines contaminantes.
    3. Séparer les échantillons traités par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide SDS à 16 % (p/v) de dénaturation conformément au protocole16 précédemment publié.
    4. Pour détecter le LPS, colorez le gel soit avec des kits de coloration disponibles dans le commerce, soit avec une technique de coloration à l’argent modifiée28. Quantifier l’abondance relative de LPS par analyse densitométrie des gels colorés conformément aux références29,30 publiées précédemment.

6. Mesures du taux de production de vésicules

  1. En utilisant l’analyse de suivi des nanoparticules comme à l’étape 5.3, ou une technologie équivalente, mesurez la concentration de particules dans le milieu de croissance pour l’expérience. Si un nombre élevé de particules est trouvé, filtrez à travers un filtre à pores de 0,1 μm et revérifiez.
    REMARQUE: Pour minimiser l’erreur, la concentration de particules de fond du milieu doit être inférieure à 10% de la concentration de particules trouvée dans les cultures à la densité la plus faible.
  2. Acclimater la culture en cultivant des cellules pour au moins deux transferts en série successifs dans les milieux et les conditions environnementales souhaités pour les expériences comme à l’étape 1.1.2. Les cultures doivent être transférées alors qu’elles sont encore dans la phase de croissance exponentielle. S’assurer que les taux de croissance de la culture mesurés sont uniformes d’un transfert à l’autre; sinon, continuer à transférer les cultures jusqu’à ce que les taux de croissance soient reproductibles.
  3. Prélever des échantillons de cours temporels lors de l’inoculation et des intervalles régulièrement chronométrés à travers la courbe de croissance jusqu’à la phase stationnaire précoce. Échelonnez les points de temps pour avoir un minimum de 3-4 échantillons collectés sur toute la gamme de croissance exponentielle. Pour échantillonner à chaque point temporel, effectuez les opérations suivantes.
    1. Filtrer 1 mL ou plus de culture directement à travers un filtre à seringue propre et stérile de 0,2 μm et enregistrer le filtrat pour mesurer la concentration des vésicules comme à l’étape 5.3. Congelez les échantillons de cours temporels si vous le souhaitez. Utilisez la fluorescence relative pour suivre la dynamique de croissance de la culture.
    2. Conservez un échantillon de l’ensemble de la culture pour déterminer la taille de la population à l’aide d’une méthode appropriée à l’organisme (cytométrie en flux; placage de colonie; ou autre).
  4. Obtenir des mesures de cellules et de particules ressemblant à des vésicules (par mL) à chaque point temporel.
  5. Identifiez les points temporels qui se sont produits pendant la phase de croissance exponentielle. Pour calculer r, le nombre de vésicules produites par cellule et par génération, entre deux points au cours de la croissance exponentielle (généralement le début et la fin du cours du temps), utilisez l’équation fournie dans le fichier supplémentaire 1.
    REMARQUE: Cette méthode n’est valable que dans des conditions de croissance à l’état d’équilibre; les hypothèses sous-jacentes et la dérivation du calcul sont détaillées dans la référence14.

Representative Results

La figure 1 présente un aperçu du processus d’isolement des vésicules cyanobactériennes, mettant en évidence les aspects clés du protocole décrit ici. Il convient de noter en particulier les étapes détaillant la séparation de la biomasse cyanobactérienne de la fraction de petites particules (vésicule), la concentration de l’échantillon de vésicule et l’isolement et la purification des vésicules (figure 1, étapes 2 à 4), qui sont essentielles à l’obtention de préparations reproductibles de vésicules. La figure 2 présente les résultats représentatifs de l’isolement et de la caractérisation des vésicules extracellulaires de la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803. Il a été démontré que la membrane externe de cette cyanobactérie contient des caroténoïdes31, qui confèrent une coloration orange caractéristique aux échantillons de vésicules prélevés par granulation directe par ultracentrifugation (figure 2A). Une fois la pastille de vésicule remise en suspension, les vésicules peuvent être examinées par microscopie électronique à transmission (TEM), soit en colorant négativement des échantillons avec de l’acétate d’uranyle (figure 2B), soit par observation de coupes ultraminces (figure 2C). La distribution de la taille des vésicules et la concentration peuvent être évaluées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Figure 2D) et d’analyses de suivi des nanoparticules (NTA) (Figure 2E). Avec le protocole décrit, généralement ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanoparticules par mL ont été obtenues dans une culture en croissance exponentielle de Synechocystis sp. PCC 6803 à un OD730 de 1,0. Des analyses biochimiques des VE isolés peuvent être effectuées pour compléter la caractérisation physique des vésicules isolées. À titre d’exemple, les vésicules purifiées de Synechocystis sp. PCC 6803 ont été séparées sur un gel de SDS-polyacrylamide et colorées pour les lipopolysaccharides (LPS; Figure 2F). Comme les LPS sont spécifiques à la membrane externe32, la détection des LPS peut valider la présence de vésicules liées à la membrane et servir de marqueur pour analyser la teneur relative des vésicules entre les préparations de la même souche33. L’inspection de l’abondance relative du LPS de faible ou de haut poids moléculaire peut indiquer des changements dans la composition des vésicules entre les échantillons34,35.

Figure 1
Figure 1 : Procédures expérimentales utilisées pour l’isolement et la caractérisation des cyanobactéries EV. Représentations schématiques des cultures en croissance (1) et séparation de la biomasse cyanobactérienne du milieu de croissance (2). Les échantillons sans cellules contenant des vésicules sont concentrés (3), puis les VE sont isolés et purifiés (4). Selon l’application, les préparations de vésicules peuvent être caractérisées à l’aide d’une ou d’une combinaison de microscopie électronique à transmission (TEM), d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de profilage des lipopolysaccharides (LPS) (5). RT, température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs de l’isolement et de la caractérisation des vésicules extracellulaires pour la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Photographie de la pastille de vésicule extracellulaire (pastille DE VE) obtenue après ultracentrifugation du milieu extracellulaire concentré sans cellule à partir d’une culture de 600 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 cultivée jusqu’à une OD730 de 1,0-1,5. Notez la coloration orange typique de la pastille de vésicule dérivée des caroténoïdes présents dans la membrane externe. (B,C) Photographies par microscopie électronique à transmission (TEM) de sections colorées négativement (B) et ultraminces (C) d’échantillons de vésicules de Synechocystis sp. PCC 6803. Barres d’échelle: 200 nm et 50 nm, respectivement. Les échantillons ont été visualisés sur un microscope électronique à transmission fonctionnant à 80 kV. (D) Diagramme typique de diffusion dynamique de la lumière (DLS) illustrant la distribution du volume de la vésicule en fonction du diamètre de la vésicule (en nm). Les lignes colorées indiquent les données de trois mesures techniques répliquées du même échantillon. (E) Données représentatives d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) de la distribution de la taille des vésicules extracellulaires de Synechocystis (en nm). La ligne noire indique la moyenne de trois répétitions techniques, et les lignes rouges représentent l’erreur-type de la moyenne. (F) Le profil des lipopolysaccharides (LPS) a été détecté après avoir séparé la préparation des vésicules par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide SDS à 16 % (p/v) et la coloration avec un kit de coloration LPS commercial. Les LPS de faible et de haut poids moléculaire, correspondant respectivement à des formes de LPS rugueuses et lisses, sont détectables. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Équation pour calculer r. Le nombre de vésicules produites par cellule et par génération entre deux points au cours de la croissance exponentielle (généralement le début et la fin du cours du temps) est déterminé à l’aide de cette équation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Considérations générales
Le protocole (Figure 1) est présenté comme un ensemble d’options pour souligner qu’il n’existe pas de méthode unique pour travailler avec les vésicules extracellulaires cyanobactériennes. Les chercheurs intéressés peuvent utiliser les sections de ce protocole qui sont compatibles et appropriées pour leur organisme modèle particulier, les questions / objectifs expérimentaux et la disponibilité de l’équipement. Toutes les approches d’isolement des vésicules impliquent des compromis et entraîneront inévitablement un certain degré de biais. Bien qu’il faille chercher à minimiser cela dans la mesure du possible, la considération la plus cruciale est de s’assurer que la méthodologie détaillée utilisée est rapportée conformément aux lignes directrices APPROPRIÉES DE MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.

Croissance de la culture
Les cultures cyanobactériennes peuvent être facilement obtenues à partir de l’une des nombreuses collections de cultures disponibles dans le monde entier. Quelques exemples sont la Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, France), la Pasteur Culture Collection (Institut Pasteur, Paris, France), et le Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). La souche cyanobactérienne de choix doit être cultivée dans le milieu et les conditions environnementales appropriés, variant considérablement d’une souche à l’autre. Une liste des milieux couramment utilisés pour la culture de cyanobactéries se trouve sur les sites Web des collections de cultures ou dans d’autres publications 37,38,39.

Travailler avec des vésicules extracellulaires cyanobactériennes présente des défis uniques par rapport aux méthodologies rapportées pour de nombreux hétérotrophes de laboratoire modèles typiques. Les cultures de cyanobactéries ont des concentrations de vésicules d’ordres de grandeur inférieures à celles trouvées dans d’autres microbes tels que Escherichia coli 14,16,40. Ces différences, qui découlent vraisemblablement de densités cellulaires plus faibles et/ou de taux de production de vésicules, signifient que des cultures relativement grandes (~1-20 L ou plus) peuvent être nécessaires pour produire suffisamment de matière pour les analyses en vrac. Ainsi, les chercheurs sont encouragés à tester les rendements de vésicules provenant de cultures à plus petite échelle afin de déterminer la quantité de matériau nécessaire pour atteindre les objectifs finaux souhaités. L’importance d’établir si le milieu utilisé pour l’expérience a un fond particulaire détectable doit également être soulignée avant de commencer toute expérience, car ce matériau peut potentiellement confondre la quantification de la population de vésicules, réduire la sensibilité des mesures de concentration/taille des vésicules ou contaminer les préparations finales de vésicules.

Un autre défi pour le domaine est que toutes les cyanobactéries ne se développent pas bien, ou pas du tout, en culture pure. Jusqu’à ce qu’elles soient rendues axeniques, les interprétations des caractéristiques physiques des vésicules, des taux de production ou du contenu ne peuvent pas nécessairement conduire à des conclusions claires sur les vésicules produites par une souche donnée dans la communauté. Il est également conseillé aux chercheurs de réfléchir aux autres types de particules qui pourraient être présents et potentiellement confondus avec des vésicules par des outils d’analyse de nanoparticules spécifiques, qui ne peuvent pas nécessairement faire de distinction entre différents types de particules. Par exemple, il peut être essentiel de vérifier que la souche utilisée n’a pas de prophage, que ce soit par séquençage du génome, par des essais d’induction ou par d’autres moyens, ou qu’elle ne libère pas d’autres types de particules. D’après notre expérience, la plupart des vésicules cyanobactériennes ont un diamètre de <0,2 μm, mais lorsque l’on examine une nouvelle souche ou une nouvelle condition de croissance, il faut confirmer si l’utilisation d’un filtre de 0,45 μm de la taille modifie la distribution granulométrique des particules purifiées.

De nombreux aspects des conditions de culture peuvent influencer la production de vésicules et son contenu41,42. Ainsi, les conditions physiques et chimiques utilisées pour la croissance de la culture (y compris l’irradiance lumineuse, la température et la composition du milieu) doivent être documentées et contrôlées dans la mesure du possible pour assurer la reproductibilité des résultats. Toute analyse chimique du contenu des vésicules doit tenir compte de la composition de fond, en particulier lors de la réalisation d’analyses à haut débit de type « -omique ». Cela peut être particulièrement critique lors de l’utilisation de milieux non définis, tels que ceux basés sur un fond d’eau de mer naturel ou complétés par de l’extrait de levure ou de la tryptone. L’utilisation d’un milieu de croissance défini peut être préférable en fonction des objectifs expérimentaux.

Les chercheurs doivent surveiller attentivement la dynamique de croissance de la culture à intervalles réguliers pour s’assurer qu’ils savent où se trouve une culture par lots donnée dans la phase de croissance et ne pas simplement prélever des échantillons après un laps de temps arbitraire. La composition des vésicules peut varier d’une phase de croissance à l’autre, en particulier entre les phases exponentielles et stationnaires41,42. Par exemple, au moins une fraction des vésicules échantillonnées dans la phase stationnaire peut provenir d’un mécanisme cellulaire différent, tel que la lyse cellulaire, qui ne se produira pas pendant la croissance exponentielle. Bien que cela puisse encore être d’un grand intérêt biologique, il est essentiel de connaître l’échantillon. Si une culture cyanobactérienne atteint la phase de croissance souhaitée à un moment où il n’est pas possible de procéder directement à la concentration de l’échantillon, il est recommandé de séparer immédiatement les cellules de la fraction <0,2 μm (avec centrifugation et/ou filtration directe de 0,2 μm), puis de stocker le filtrat sans cellule à 4 °C. Le matériau peut être stocké de cette manière pendant des jours avec peu ou pas d’impact notable sur la concentration ou la distribution de la taille des vésicules.

Purifications de vésicules
Le besoin fréquent d’isoler les vésicules de cultures volumineuses importantes est vital dans le flux de travail d’isolement des vésicules cyanobactériennes. Lorsque vous travaillez avec de plus grands volumes de matériaux, les vésicules devront être concentrées avant les flux de travail de séparation en aval. Les concentrateurs (membranes filtrantes à flux tangentiel ou colonnes centrifuges) avec une limite de poids moléculaire nominal de 100 kDa sont généralement conseillés, car ils permettent la séparation des matériaux solubles de faible poids moléculaire tout en maintenant des temps de concentration raisonnables, mais les filtres de 30 kDa sont également fréquemment utilisés avec succès. Bien que plusieurs méthodes non ultracentrifugées de purification des vésicules (p. ex., chromatographie d’exclusion de taille, systèmes microfluidiques, techniques de capture d’affinité et approches basées sur les précipitations) deviennent populaires dans le domaine des vésicules extracellulaires, d’après notre expérience, ces approches peuvent entraîner une diminution des rendements et sont généralement incompatibles avec les volumes de culture nécessaires.

Les chercheurs doivent tenir compte de la composition du fond d’iodixanol et des tampons de lavage/remise en suspension utilisés lors de la purification des vésicules pour s’assurer qu’ils sont compatibles avec les applications en aval souhaitées. Dans de nombreux cas, l’échantillon final de vésicules peut être remis en suspension dans un milieu de croissance ou dans un tampon défini dont la composition est comparable à celle du milieu de croissance (p. ex., eau de mer naturelle ou artificielle). Cependant, cela peut ne pas être possible avec les vésicules cyanobactériennes marines, qui nécessiteront une manipulation expérimentale supplémentaire pour l’analyse, car des concentrations élevées de sel similaires au niveau de l’eau de mer peuvent inhiber de nombreuses réactions enzymatiques. Dans de tels cas, les tampons de laboratoire standard tels que 0,2 μm filtré, 1x PBS fonctionnent généralement bien pour maintenir la stabilité des vésicules cyanobactériennes marines et peuvent être plus compatibles avec les processus expérimentaux en aval.

La purification par gradient de densité peut être considérée comme facultative en fonction des objectifs expérimentaux et de la composition de la culture, mais elle est fortement recommandée pour produire un échantillon plus rigoureusement pur et reproductible. Les populations de VE sont hétérogènes et peuvent être trouvées dans une gamme de densités flottantes, qui varient encore en fonction de la souche, des conditions de croissance et d’autres facteurs 4,5,6. Les densités énumérées ci-dessus représentent celles que l’on trouve généralement pour les vésicules provenant de cultures cyanobactériennes et d’échantillons de terrain dans l’iodixanol, mais les résultats d’autres souches peuvent varier. D’autres matériaux de gradient de densité tels que le saccharose et le CsCl peuvent être utilisés pour les vésicules, mais ils migreront vers différentes densités de flottabilité dans ces arrière-plans. Différents milieux de gradient peuvent biaiser la récupération des virus43 enfermés dans les lipides et pourraient potentiellement influencer la récupération des vésicules de différentes souches.

Les vésicules peuvent être perdues en plusieurs points grâce à l’isolement des vésicules et au processus de purification par gradient décrit ici, réduisant les rendements et augmentant la quantité de matière première nécessaire pour obtenir un rendement final donné des vésicules pour les applications en aval. Des précautions particulières doivent être prises lors du travail avec des granulés de vésicules après ultracentrifugation. Bien que certaines vésicules cyanobactériennes puissent contenir des caroténoïdes ou d’autres composés qui peuvent conférer aux échantillons de vésicules une certaine quantité de pigmentation (Figure 2), selon la souche ou la quantité de matériau, on ne s’attend pas nécessairement à ce qu’il soit en mesure de visualiser directement la pastille de vésicules. Sachez où la pastille devrait recevoir le type de rotor de centrifugeuse utilisé. Dans la mesure du possible, il est suggéré d’examiner par microscopie électronique des échantillons de vésicules purifiés afin de vérifier la composition du matériau final récupéré.

L’impact des conditions de stockage sur les vésicules et leur contenu reste une question ouverte. Bien qu’il soit constaté que le stockage n’a pas d’effet notable sur la taille ou la concentration des vésicules cyanobactériennes14, la fonctionnalité des préparations de vésicules isolées peut changer au fil du temps44. Bien que les cycles de congélation et de dégel doivent être évités dans la mesure du possible, l’impact de la congélation des échantillons sur le nombre et la taille globaux des vésicules semble être minime. Il faut être conscient du potentiel des cycles de gel-dégel pour influencer la composition du contenu des vésicules, comme la longueur des acides nucléiques associés aux vésicules ou la stabilité des protéines.

Vésicules de field samples
Les méthodes actuelles d’isolement des vésicules extracellulaires des milieux aquatiques naturels sont conceptuellement et opérationnellement similaires à celles décrites ici pour les cultures à grand volume. Pourtant, ils peuvent nécessiter des volumes de matériel encore plus importants. De tels échantillons de terrain peuvent impliquer la collecte, la filtration et la concentration de centaines à des milliers de litres d’eau pour obtenir suffisamment de matériel pour l’analyse. Selon la turbidité de l’échantillon utilisé, l’incorporation d’une ou plusieurs étapes de préfiltration avant le filtre de 0,2 μm peut être nécessaire. Le dispositif TFF spécifique utilisé doit être approprié pour travailler avec des volumes aussi importants dans un laps de temps raisonnable (idéalement de l’ordre de l’heure) et sans exercer de pression excessive sur l’échantillon. Dans la pratique, cela implique souvent d’utiliser une surface totale beaucoup plus grande que celle qui pourrait être appliquée aux échantillons de culture, ainsi que des tubes de plus grand diamètre pour faciliter l’augmentation des débits. Cette augmentation de la surface du filtre entraînera probablement une augmentation marginale des pertes de particules par rapport à des arrangements TFF plus petits et à un volume final de concentré plus important; toutefois, ces préoccupations doivent être mises en balance avec des considérations relatives au temps total de traitement. Pour des situations telles qu’une croisière océanographique prolongée où les échantillons ne retourneront pas au laboratoire pendant plusieurs jours après l’échantillonnage, nous recommandons d’effectuer des étapes initiales de filtration de 0,2 μm et de TFF sur le terrain. Ce plus petit volume de matière concentrée peut ensuite être stocké à 4 °C ou -80 °C à bord (selon la disponibilité et les considérations analytiques en aval) jusqu’à ce qu’il soit retourné au laboratoire pour le traitement final.

L’isolement et la séparation des vésicules extracellulaires d’autres petites particules, organiques et inorganiques, peuvent être difficiles, et les méthodes de séparation des différentes particules ne sont pas encore parfaites. Par exemple, les gradients de densité de l’iodixanol peuvent ne pas séparer facilement toutes les classes de vésicules et de virus présents dans un échantillon donné. Étant donné que les types de particules confondantes et leurs propriétés physiques varient d’un site d’échantillonnage à l’autre, il est actuellement impossible de fournir un protocole qui répartira de manière robuste toutes les classes de petites particules aquatiques. Les essais et les erreurs sont essentiels, et l’expérimentation de la gamme d’iodixanol utilisée dans les conditions de gradient et d’ultracentrifugation sera nécessaire pour maximiser la séparation; une collection de fractions de densité plus petites et plus finement résolues peut également être nécessaire. Selon le contexte, l’utilisation de gradients CsCl au lieu d’iodixanol peut aider à séparer les particules environnementales45. Néanmoins, le changement des conditions osmotiques pourrait entraîner des biais dans les produits finaux récupérés, comme indiqué ci-dessus.

Caractérisation des vésicules
Les instruments d’analyse de nanoparticules ne sont pas encore couramment disponibles dans les laboratoires de microbiologie, mais ils sont de plus en plus disponibles. Toutes les méthodologies ont des avantages et des inconvénients, et nous ne faisons aucune approbation spécifique d’une plate-forme comme étant meilleure que toutes les autres pour le travail des vésicules cyanobactériennes; en effet, tous ont des compromis particuliers concernant les coûts, la résolution, la facilité d’utilisation, les limites de détection, la compatibilité avec différents milieux de milieu de croissance / tampon et la reproductibilité des données. En plus des instruments basés sur l’analyse de suivi des nanoparticules décrite ci-dessus, d’autres approches, y compris la cytométrie nanoflux, la détection d’impulsions résistives microfluidiques et la détection d’impulsions résistives accordables, peuvent êtreappliquées 46,47. Les utilisateurs doivent veiller à connaître les détails de leur instrumentation disponible et à vérifier qu’elle fonctionne bien avec leur système, car nous avons rencontré des difficultés lors de l’utilisation de certaines plates-formes avec des supports à base d’eau de mer. Nous encourageons le domaine à s’orienter vers la caractérisation quantitative de la taille des vésicules, des concentrations et des taux de production. La mesure des concentrations de vésicules sur une base de particules fondamentales par mL, et non en termes de teneur en protéines ou d’autres mesures, permettra l’intégration des vésicules dans des cadres plus quantitatifs et permettra des intercomparaisons entre les souches et les conditions. D’autres efforts sont nécessaires pour améliorer la capacité d’étalonnage des mesures de concentration pour les particules de <100 nm.

Le fait que les mesures du taux de production de vésicules soient effectuées directement à partir d’un surnageant de culture filtré de 0,2 μm afin de minimiser les pertes de particules serait associé à d’autres étapes de purification décrites ci-dessus. Cependant, cela signifie que l’approche ne fait pas nécessairement de distinction entre les vésicules extracellulaires réelles et les autres petites particules trouvées dans les cultures. Seul le comptage des particules dans des plages de taille spécifiques (par exemple, 50-250 nm de diamètre) peut aider à exclure certaines valeurs aberrantes, mais la confirmation visuelle que le contenu de la culture en granulés <0,2 μm semble être des vésicules liées à la membrane (par TEM ou d’autres approches) est nécessaire pour pouvoir affirmer spécifiquement que l’on mesure la production de vésicules par opposition à la production de particules ressemblant à des vésicules.

Un facteur essentiel dans la caractérisation des vésicules est de s’assurer que l’échantillon de vésicule est analysé dans la plage de sensibilité linéaire appropriée du dispositif d’analyse des nanoparticules. Lorsqu’un échantillon est trop concentré, il est facile de diluer ce matériau avec un tampon propre et de le réanalyser. D’autre part, la densité relativement faible de cellules et/ou de vésicules de certaines cultures cyanobactériennes peut parfois donner des préparations de vésicules inférieures aux limites de détection de certains instruments. Dans les cas où cela se produit avec des purifications de vésicules en vrac, on peut envisager de cultiver des cultures de plus grand volume, de réagglomérer et de réutiliser le matériau final dans un volume plus petit, ou d’évaluer s’il y a une étape dans le processus d’isolement où des pertes excessives se produisent et pourraient être atténuées. Lors de la mesure des taux de production de vésicules, les solutions ne sont pas nécessairement aussi simples. Les échantillons peuvent être concentrés si nécessaire, mais le premier devrait voir si des ajustements au milieu pourraient entraîner des densités cellulaires plus élevées ou si des échantillons suffisamment concentrés pourraient être obtenus à partir de points temporels ultérieurs au cours de la phase exponentielle où les concentrations seront plus élevées.

Limitations
Comme pour tout protocole, l’isolement des vésicules à l’aide de ces approches présente des limites claires. Ces approches ne reposent pas sur leur garantie qu’une préparation totalement pure des vésicules sera isolée. Les cultures et les échantillons de terrain peuvent contenir d’autres matériaux, qui migrent de la même manière que les vésicules dans les gradients de densité. Néanmoins, au minimum, ces types de méthodologies de purification supplémentaires sont essentiels pour assurer la rigueur et la reproductibilité de l’analyse des vésicules. Bien que nous décrivions les approches d’isolement des vésicules dans le contexte des cyanobactéries, les cultures de nombreux autres microbes contiendront également des vésicules à des concentrations relativement faibles, et les procédures décrites ici devraient être généralement applicables. On s’attend à ce que ces méthodes ne servent pas de protocole permanent, mais plutôt de point de départ pour stimuler les progrès futurs dans le travail avec les vésicules extracellulaires de divers microbes. Des efforts futurs sont nécessaires pour fusionner ces méthodes avec d’autres approches telles que les colonnes d’exclusion de taille ou le fractionnement asymétrique de l’écoulement de champ afin d’améliorer la discrimination et la séparation des différentes catégories de petites particules des cultures et des échantillons environnementaux. Nous espérons également que ces techniques pourront continuer à évoluer parallèlement aux améliorations apportées aux technologies de caractérisation des nanoparticules afin d’améliorer la capacité d’examiner l’hétérogénéité au sein des populations de vésicules, leur contenu et leurs rôles fonctionnels exacts dans l’environnement.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le soutien des plateformes scientifiques i3S « Biointerfaces et nanotechnologie », et « Histologie et microscopie électronique », membre de l’infrastructure nationale portugaise Plate-forme de bioimagerie (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Nous remercions également le professeur J. A. Gonzalez-Reyes (Université de Córdoba, Espagne) d’avoir aidé à optimiser le protocole de coloration de section ultra-mince pour la TEM, ainsi que le Dr Cecília Durães et le Dr Ana Rita Pinto (Université de Porto, Portugal) pour l’analyse de suivi des nanoparticules.

Ce travail a été financé par la National Science Foundation des États-Unis (OCE-2049004 à SJB), par les fonds Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) par le biais du programme opérationnel COMPETE 2020 pour la compétitivité et l’internationalisation (POCI), Portugal, 2020, et par des fonds portugais par le biais de fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior dans le cadre du projet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 à PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia est également très reconnu pour la bourse de doctorat SFRH / BD / 130478/2017 (SL) et la subvention fct Investigator IF / 00256/2015 (PO). M.C.M.-M. a été soutenu par une bourse individuelle Marie Skłodowska-Curie (panel de réintégration) dans le cadre du programme-cadre Horizon 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument

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References

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Biologie numéro 180
Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires cyanobactériennes
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Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

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