JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

توصيف ثلاثي الأبعاد لمواقع التلامس بين الأعضاء في خلايا الكبد باستخدام المجهر الإلكتروني التسلسلي

Published: June 09, 2022
doi:
10.3791/63496
, , ,
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology,University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre,University College London

Summary

بروتوكول بسيط وشامل للحصول على تفاصيل ثلاثية الأبعاد لمواقع ملامسة الغشاء بين العضيات في خلايا الكبد من الكبد أو الخلايا في الأنسجة الأخرى.

Abstract

لطالما اعتبر المجهر الإلكتروني الناقل هو المعيار الذهبي لتصور البنية الفائقة الخلوية. ومع ذلك ، غالبا ما يقتصر التحليل على بعدين ، مما يعوق القدرة على الوصف الكامل للبنية الفائقة ثلاثية الأبعاد (3D) والعلاقة الوظيفية بين العضيات. يصف المجهر الإلكتروني الحجمي (vEM) مجموعة من التقنيات التي تمكن من استجواب البنية الفائقة الخلوية في 3D بدقة متوسطة الحجم ومجهرية ونانوية.

يوفر هذا البروتوكول طريقة سهلة الوصول وقوية للحصول على بيانات vEM باستخدام إرسال القسم التسلسلي EM (TEM) ويغطي الجوانب التقنية لمعالجة العينات من خلال إعادة الإعمار الرقمي 3D في سير عمل واحد ومباشر. لإثبات فائدة هذه التقنية ، يتم تقديم العلاقة فوق الهيكلية 3D بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا ومواقع الاتصال الخاصة بها في خلايا الكبد الكبدية. تؤدي الاتصالات بين الأعضاء أدوارا حيوية في نقل الأيونات والدهون والمواد المغذية والجزيئات الصغيرة الأخرى بين العضيات. ومع ذلك ، على الرغم من اكتشافها الأولي في خلايا الكبد ، لا يزال هناك الكثير لتعلمه عن ميزاتها الفيزيائية وديناميكياتها ووظائفها.

يمكن أن تعرض جهات الاتصال بين الأعضاء مجموعة من المورفولوجيات ، تختلف في قرب العضيتين من بعضهما البعض (عادة ~ 10-30 نانومتر) ومدى موقع الاتصال (من جهات الاتصال المثقوبة إلى جهات الاتصال الأكبر الشبيهة بالصهريج ثلاثي الأبعاد). يتطلب فحص المخالطين المقربين تصويرا عالي الدقة ، والقسم التسلسلي TEM مناسب تماما لتصور البنية الفائقة 3D للاتصالات بين الأعضاء أثناء تمايز خلايا الكبد ، وكذلك التغييرات في بنية خلايا الكبد المرتبطة بأمراض التمثيل الغذائي.

Introduction

منذ اختراعها في 1930s ، سمحت المجاهر الإلكترونية للباحثين بتصور المكونات الهيكلية للخلايا والأنسجة 1,2. قدمت معظم التحقيقات معلومات ثنائية الأبعاد ، حيث يتطلب بناء نماذج ثلاثية الأبعاد جمع قسم تسلسلي مضني ، والتصوير اليدوي ، والمعالجة السلبية ، والتتبع اليدوي ، وإنشاء وتجميع نماذج ثلاثية الأبعاد من صفائح الزجاج أو البلاستيك أو الستايروفوم 3,4. بعد ما يقرب من 70 عاما ، كان هناك تقدم كبير في العديد من جوانب العملية ، من أداء المجهر ، وجمع القسم التسلسلي ، والتصوير الرقمي الآلي ، والبرامج والأجهزة المتطورة لإعادة الإعمار 3D ، والتصور ، والتحليل إلى النهج البديلة لما يسمى الآن بشكل جماعي حجم EM (vEM). تعتبر تقنيات vEM هذه بشكل عام لتوفير معلومات فوق هيكلية 3D بدقة نانومتر عبر مقاييس ميكرون وتشمل المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) وتقنيات المجهر الإلكتروني الماسح الأحدث (SEM) ؛ انظر المراجعات5،6،7،8.

على سبيل المثال ، يستخدم شعاع الأيونات المركز SEM (FIB-SEM) شعاعا أيونيا مركزا داخل SEM لطحن سطح الكتلة بين عمليات مسح تصوير SEM المتسلسلة لسطح الكتلة ، مما يسمح بالطحن / التصوير الآلي المتكرر لعينة وبناء مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد لإعادة الإعمار 9,10. في المقابل ، يستخدم وجه الكتلة التسلسلي SEM (SBF-SEM) ميكروتوم فائق الميكروتوم داخل SEM لإزالة المواد من وجه الكتلة قبل التصوير 11,12 ، في حين أن التصوير المقطعي للصفيف هو عملية غير مدمرة تتطلب جمع المقاطع التسلسلية ، على أغطية أو رقائق أو شريط ، قبل إعداد سير عمل آلي لتصوير المنطقة ذات الأهمية في الأقسام المتسلسلة في SEM لإنشاء مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد 13 . على غرار التصوير المقطعي بالمصفوفة ، يتطلب القسم التسلسلي TEM (ssTEM) جمع الأقسام المادية قبل التصوير ؛ ومع ذلك ، يتم جمع هذه الأقسام على شبكات TEM وتصويرها في TEM14،15،16. يمكن تمديد ssTEM عن طريق إجراء التصوير المقطعي بالإمالة17،18،19. يوفر التصوير المقطعي التسلسلي للإمالة أفضل دقة في x و y و z ، وعلى الرغم من استخدامه لإعادة بناء الخلايا الكاملة20 ، إلا أنه يمثل تحديا معقولا. يركز هذا البروتوكول على الجوانب العملية ل ssTEM باعتبارها تقنية vEM الأكثر سهولة المتاحة للعديد من مختبرات EM التي قد لا تتمكن حاليا من الوصول إلى أدوات التقسيم المتخصصة أو vEM ولكنها ستستفيد من توليد بيانات 3D vEM.

وقد سبق أن اعتبر الاستئصال التسلسلي للميكروتومي لإعادة بناء 3D تحديا. كان من الصعب قص شرائط مستقيمة بسماكة مقطع ، والقدرة على ترتيب والتقاط شرائط بالحجم الصحيح ، بالترتيب الصحيح ، على الشبكات مع الدعم الكافي ، ولكن بدون قضبان الشبكة التي تحجب مناطق الاهتمام ، والأهم من ذلك ، دون فقدان الأقسام ، لأن سلسلة غير مكتملة قد تمنع إعادة الإعمار 3D الكاملة21. ومع ذلك ، فإن التحسينات التي أدخلت على الميكروتومات الفائقة التجارية ، وسكاكين قطع الماس وتقليمه 22،23 ، وأفلام دعم الإلكترون لوسنت على الشبكات 21،24 ، والمواد اللاصقة للمساعدة في التصاق القسم والحفاظ على الشريط13،21 ليست سوى بعض من التطورات التدريجية على مر السنين التي جعلت هذه التقنية أكثر روتينية في العديد منالمختبرات. بمجرد جمع الأقسام التسلسلية ، يكون التصوير التسلسلي في TEM مباشرا ويمكن أن يوفر صورا EM بأحجام px تحت النانومتر في x و y ، مما يسمح باستجواب عالي الدقة للهياكل دون الخلوية – وهو شرط محتمل للعديد من الأسئلة البحثية. توضح دراسة الحالة المقدمة هنا استخدام ssTEM وإعادة بناء 3D في دراسة اتصالات الخلايا الإندوبلازمية (ER) في خلايا الكبد الكبدية ، حيث لوحظت اتصالات ER-organelle لأول مرة25,26.

في حين أن ER متجاور مع الغلاف النووي ، فإنه يقوم أيضا بإجراء اتصالات وثيقة مع العديد من عضيات الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الليزوسومات والميتوكوندريا وقطرات الدهون وغشاء البلازما27. تورطت جهات الاتصال العضوية ER في استقلاب الدهون28 ، وإشارات الفوسفوينوسيتيد والكالسيوم29 ، وتنظيم الالتهام الذاتي ، والاستجابة للإجهاد30,31. اتصالات العضيات ER وغيرها من الاتصالات بين الأعضاء هي هياكل ديناميكية للغاية تستجيب لاحتياجات التمثيل الغذائي الخلوي والإشارات خارج الخلية. وقد تبين أنها تختلف من الناحية المورفولوجية في حجمها وشكلها والمسافات بين أغشية العضيات32,33. ويعتقد أن هذه الاختلافات فوق الهيكلية من المرجح أن تعكس تركيباتها المختلفة للبروتين / الدهون ووظيفتها34,35. ومع ذلك ، لا تزال مهمة صعبة لتحديد جهات الاتصال بين الأعضاء وتحليلها36. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكول موثوق به ولكنه بسيط لفحص وتوصيف الاتصالات بين الأعضاء لإجراء مزيد من التحقيقات.

نظرا لأن جهات اتصال ER organelle يمكن أن تتراوح من 10 إلى 30 نانومتر في الفصل بين الغشاء والغشاء ، فإن المعيار الذهبي لتحديد الهوية كان تاريخيا TEM. كشف قسم رفيع TEM عن توطين نطاق فرعي محدد لبروتينات ER المقيمة في جهات اتصال غشائية متميزة37. تقليديا ، كشف هذا عن اتصالات ER-organelle بدقة nm ولكن في كثير من الأحيان لم يقدم سوى عرض 2D لهذه التفاعلات. ومع ذلك ، تكشف مناهج vEM عن العرض والسياق الهيكلي لمواقع الاتصال هذه في 3D ، مما يتيح إعادة البناء الكامل لجهات الاتصال وتصنيف أكثر دقة لجهات الاتصال (النقطة مقابل الأنبوبي مقابل الشبيه بالصخر) والقياس الكمي38,39. بالإضافة إلى كونها أول نوع من الخلايا حيث لوحظت اتصالات ER-organelle25,26 ، فإن خلايا الكبد لديها نظام واسع من الاتصالات الأخرى بين الأعضاء التي تخدم أدوارا حيوية في هندستها المعمارية وعلم وظائف الأعضاء 28,40. ومع ذلك ، لا يزال التوصيف المورفولوجي الشامل للعضيات ER-organelle وغيرها من الاتصالات بين العضيات في خلايا الكبد غير موجود. وفقا لذلك ، فإن كيفية تشكل الاتصالات بين الأعضاء وإعادة تشكيلها أثناء التجديد والإصلاح لها أهمية خاصة لبيولوجيا خلايا الكبد ووظائف الكبد.

Protocol

تم إيواء جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لوزارة الداخلية في المملكة المتحدة ، وتم حصاد الأنسجة وفقا لقانون المملكة المتحدة للحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986. 1. تثبيت العينات وإعدادها قم بتشريح أنسجة الكبد إلى قطع مناسبة الحجم ، حوالي 8 مم × 8 مم × 3 م?…

Representative Results

بالنسبة لهذه التقنية ، يتم اختيار المناطق ذات الأهمية بناء على هدف البحث البيولوجي وتحديدها قبل تقليم وتقسيم الأنسجة المدمجة. وبالمثل ، قد يملي سؤال البحث حجم وجه الكتلة ؛ في هذه الحالة ، تم قص العينة لترك وجه كتلة يبلغ حوالي 0.3 مم × 0.15 مم (الشكل 4A). سمح ذلك بشبكتين من 9 أقسام ?…

Discussion

يتم وصف تقنية vEM التي يمكن الوصول إليها لتصور بنية العضية والتفاعلات في 3D في هذا البروتوكول. يتم تقديم مورفولوجيا الاتصالات بين الأعضاء في خلايا الكبد كدراسة حالة هنا. ومع ذلك ، تم تطبيق هذا النهج أيضا للتحقيق في مجموعة متنوعة من العينات والمجالات البحثية الأخرى ، بما في ذلك التفاعلات بين ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر جوانا هانلي وريبيكا فياديرو وأنيا ستراتمان – إيوانوفسكا على المساعدة التقنية الخبيرة. كما نشكر أعضاء مختبر ستيفان وإيان ج. وايت على المناقشات المفيدة. J.J.B. مدعوم من تمويل MRC لمختبر MRC لبيولوجيا الخلايا الجزيئية في UCL ، رمز الجائزة MC_U12266B. يتم دعم C.J.S. من خلال تمويل MRC لمختبر MRC لوحدة جامعة البيولوجيا الخلوية الجزيئية في UCL ، رمز الجائزة MC_UU_00012/6. يتم تمويل P.G. من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، رمز المنحة ERC-2013-StG-337057.

Materials

0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325 (1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. . Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O’Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24 (2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675 (2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102 (2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287 (2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180 (2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091 (2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -. C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873 (2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111 (2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043 (2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003 (2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480 (2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. . Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., Beichel, R. R., Sonka, M. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605 (2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196 (2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273 (2021).

Tags

3D ReconstructionInterorganelle Contact SitesHepatocytesSerial Section Electron MicroscopyOrganelle MorphologyCellular TraffickingUltra-thin SectioningMicrotomeDiamond KnifeCutting WindowRibbon SectioningSlot Grid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image