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Biology

連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価

Published: June 09, 2022
doi:
10.3791/63496
, , ,
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology,University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre,University College London

Summary

肝臓または他の組織の細胞から肝細胞細胞小器官間の膜接触部位の三次元的詳細を取得するための簡単で包括的なプロトコル。

Abstract

透過型電子顕微鏡は、細胞の超構造を可視化するためのゴールドスタンダードであると長い間考えられてきました。しかし、分析はしばしば2次元に限定され、細胞小器官間の3次元(3D)超構造および機能的関係を完全に記述する能力を妨げる。体積電子顕微鏡(vEM)は、メソスケール、マイクロスケール、およびナノスケールの解像度で3Dで細胞超微細構造の尋問を可能にする技術のコレクションを記述する。

このプロトコルは、シリアルセクション伝送EM(TEM)を使用してvEMデータを取得するためのアクセス可能で堅牢な方法を提供し、サンプル処理からデジタル3D再構成までの技術的側面を単一の簡単なワークフローでカバーします。この技術の有用性を実証するために、肝肝細胞における小胞体とミトコンドリアおよびそれらの接触部位との間の3D超構造関係が提示される。細胞小器官間接触は、オルガネラ間のイオン、脂質、栄養素、およびその他の小分子の移動において重要な役割を果たします。しかし、肝細胞での最初の発見にもかかわらず、それらの物理的特徴、ダイナミクス、および機能についてはまだ学ぶべきことがたくさんあります。

細胞小器官間接触は、2つの細胞小器官の互いに近接する(典型的には〜10〜30nm)および接触部位の程度(点状接触からより大きな3D槽様接触まで)において変化する形態の範囲を示すことができる。密接な接触の検査には高解像度イメージングが必要であり、シリアルセクションTEMは、肝細胞分化中の細胞小器官間接触の3D超構造、ならびに代謝性疾患に関連する肝細胞構造の変化を視覚化するのによく適している。

Introduction

1930年代の発明以来、電子顕微鏡は研究者が細胞や組織の構造成分を視覚化することを可能にしました1,2。3Dモデルの構築には、骨の折れるシリアルセクションコレクション、手動写真、ネガ処理、手動トレース、およびガラス、プラスチック、または発泡スチロール3,4のシートからの3Dモデルの作成と組み立てが必要であるため、ほとんどの調査は2D情報を提供しました。約70年後、顕微鏡性能、シリアルセクションコレクション、自動デジタルイメージング、3D再構成、視覚化、および分析のための洗練されたソフトウェアとハードウェアから、現在総称してボリュームEM(vEM)と呼ばれるものの代替アプローチまで、プロセスの多くの側面でかなりの進歩がありました。これらのvEM技術は、一般に、ミクロンスケールにわたってナノメートルの分解能で3D超微細構造情報を提供すると考えられており、透過型電子顕微鏡(TEM)および新しい走査型電子顕微鏡(SEM)技術を包含する。レビュー5,6,7,8を参照してください。

例えば、集束イオンビームSEM(FIB-SEM)は、SEM内の集束イオンビームを使用して、ブロックの表面の連続SEMイメージングスキャンの間にブロックの表面を粉砕し、サンプルの自動フライス加工/イメージングを繰り返し、再構成のための3Dデータセットを構築することを可能にする9,10。対照的に、シリアルブロックフェースSEM(SBF−SEM)は、SEM内のウルトラミクロトームを使用して、イメージング11,12の前にブロックフェースから材料を除去する一方、アレイ断層撮影は、SEM内のシーケンシャルセクションの関心領域をイメージングして3Dデータセットを生成する自動ワークフローを設定する前に、カバースリップ、ウェーハ、またはテープ上にシリアルセクションの収集を必要とする非破壊プロセスである。.アレイ断層撮影と同様に、シリアルセクションTEM(ssTEM)では、イメージングの前に物理セクションを収集する必要があります。しかし、これらの切片はTEMグリッド上で収集され、TEM14、15、16で画像化される。ssTEMは、傾斜断層撮影17、18、19を行うことにより延長することができる。直列傾斜断層撮影法は、x、y、およびzにおいて最良の解像度を提供し、細胞20全体を再構成するために使用されてきたが、それは合理的に困難である。このプロトコルは、現在特殊なセクショニングやvEM計測器にアクセスできないが、3D vEMデータを生成することで恩恵を受ける多くのEMラボが利用できる最もアクセスしやすいvEM技術として、ssTEMの実用的な側面に焦点を当てています。

3D再構成のための連続超微小切除術は、以前は困難と考えられてきました。断面の厚さであってもまっすぐなリボンを切断し、正しいサイズのリボンを正しい順序で、十分なサポートを備えたグリッド上に配置して拾うことは困難であったが、グリッドバーが関心領域を覆い隠さず、そして最も重要なのは、不完全なシリーズが完全な3D再構成を妨げる可能性があるため、セクションを失うことなく21。しかしながら、市販のウルトラミクロトーム、ダイヤモンド切断およびトリミングナイフ22,23、グリッド21,24上の電子透過性支持フィルム、および断面接着およびリボン保存13,21を支援するための接着剤に対する改善は、多くの研究室においてこの技術をより日常的にした長年にわたる漸進的な進歩のほんの一部にすぎない。シリアル切片が収集されると、TEMでのシリアルイメージングは簡単で、xとyのサブナノメートルpxサイズのEM画像を提供できるため、細胞内構造の高解像度の問い合わせが可能になります。ここで紹介するケーススタディは、肝肝細胞における小胞体(ER)-オルガネラ接触の研究におけるssTEMおよび3D再構成の使用を実証しており、ER-オルガネラ接触が最初に観察された25,26。

核エンベロープと隣接している一方で、ERはまた、リソソーム、ミトコンドリア、脂肪滴、および原形質膜27を含む多数の他の細胞小器官と密接に接触する。ER−オルガネラ接触は、脂質代謝28、ホスホイノシチドおよびカルシウムシグナル伝達29、オートファジー調節、およびストレス応答30、31に関与している。ER-オルガネラ接触および他の細胞小器官間接触は、細胞代謝ニーズおよび細胞外合図に応答する非常に動的な構造である。それらは、そのサイズおよび形状ならびにオルガネラ膜32、33間の距離において形態学的に変化することが示されている。これらの超構造の違いは、それらの異なるタンパク質/脂質組成および機能を反映している可能性が高いと考えられている34,35。しかし、オルガネラ間接触を定義し、それらを分析することは依然として困難な作業である36。したがって、さらなる調査のためには、細胞小器官間接触を調べて特徴付けるための信頼性が高くて簡単なプロトコルが必要です。

ER-オルガネラ接触は膜間分離で10~30nmの範囲であるため、同定のゴールドスタンダードは歴史的にTEMでした。薄切片TEMは、別個の膜接触における常在ERタンパク質に対する特異的サブドメイン局在を明らかにした37。伝統的に、これはnm分解能を有するER-オルガネラ接触を明らかにしてきたが、しばしばこれらの相互作用の2Dビューのみを提示した。しかし、vEMアプローチは、これらの接触部位の超構造的提示および文脈を3Dで明らかにし、接触の完全な再構成および接触のより正確な分類(点対管状対槽状)および定量化を可能にする38、39。ER-オルガネラ接触が観察された最初の細胞型であることに加えて25,26、肝細胞は、そのアーキテクチャおよび生理学において重要な役割を果たす他のオルガネラ間接触の広範なシステムを有する28,40。しかし、肝細胞におけるER-オルガネラおよび他のオルガネラ間接触の徹底的な形態学的特徴付けは依然として欠けている。したがって、再生および修復中に細胞小器官間接触がどのように形成および再構築されるかは、肝細胞生物学および肝機能に特に関連している。

Protocol

すべての動物は英国内務省のガイドラインに従って飼育され、組織採取は1986年英国動物(科学的手順)法に従って実施された。 1. 試料の固定と準備 肝臓組織を適切なサイズの断片、約8 mm x 8 mm x 3 mmに解剖し、その断片を温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS、37°C)に入れる。 室温(20〜25°C)固定液(1%スクロース中の1.5%グルタルアルデヒド、0.1Mカコジ?…

Representative Results

この技術のために、関心のある領域は、生物学的研究目的に基づいて選択され、埋め込み組織のトリミングおよび切片化の前に同定される。同様に、ブロック面のサイズは、研究の質問によって決定されることがあります。この場合、サンプルは、約0.3 mm x 0.15 mmのブロック面を残すようにトリミングされました(図4A)。これにより、グリッドあたり9つのシリアル切片か?…

Discussion

オルガネラの構造と相互作用を3Dで視覚化するためのアクセス可能なvEM技術が、このプロトコルで説明されています。肝細胞における細胞小器官間接触の形態は、ここではケーススタディとして提示される。しかし、このアプローチは、末梢神経45におけるシュワン細胞-内皮相互作用、内皮細胞46におけるワイベル・パラデ・ボディ生合成、腎臓細胞47における貨物分泌、海?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ジョアンナ・ハンリー、レベッカ・フィアデイロ、アニア・ストラアートマン=イワノフスカに専門家の技術支援に感謝します。また、有益な議論をしてくれたStefan LabのメンバーとIan J. Whiteにも感謝します。J.J..B.は、UCLのMRC分子細胞生物学研究所へのMRCの資金提供によって支援されており、賞のコードMC_U12266Bです。C.J.S.は、UCLの分子細胞生物学大学ユニットのMRC研究所(賞コードMC_UU_00012/6)へのMRC資金によって支えられています。PGは、欧州研究評議会、助成金コードERC-2013-StG-337057によって資金提供されています。

Materials

0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4
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References

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Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).
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