Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tredimensionel karakterisering af interorganelle kontaktsteder i hepatocytter ved hjælp af seriel sektionselektronmikroskopi

Published: June 9, 2022 doi: 10.3791/63496
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, University College London

Summary

En enkel og omfattende protokol til at erhverve tredimensionelle detaljer om membrankontaktsteder mellem organeller i hepatocytter fra leveren eller celler i andre væv.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi har længe været anset for at være guldstandarden for visualisering af cellulær ultrastruktur. Imidlertid er analysen ofte begrænset til to dimensioner, hvilket hæmmer evnen til fuldt ud at beskrive den tredimensionelle (3D) ultrastruktur og det funktionelle forhold mellem organeller. Volumenelektronmikroskopi (vEM) beskriver en samling teknikker, der muliggør forhør af cellulær ultrastruktur i 3D ved mesoskala, mikroskala og nanoskalaopløsninger.

Denne protokol giver en tilgængelig og robust metode til at erhverve vEM-data ved hjælp af seriel sektionstransmission EM (TEM) og dækker de tekniske aspekter af prøvebehandling til digital 3D-rekonstruktion i en enkelt, ligetil arbejdsgang. For at demonstrere nytten af denne teknik præsenteres det ultrastrukturelle 3D-forhold mellem det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier og deres kontaktsteder i leverhenpatocytter. Interorganelle kontakter tjener vitale roller i overførslen af ioner, lipider, næringsstoffer og andre små molekyler mellem organeller. På trods af deres første opdagelse i hepatocytter er der dog stadig meget at lære om deres fysiske egenskaber, dynamik og funktioner.

Interorganelle kontakter kan vise en række morfologier, der varierer i nærheden af de to organeller til hinanden (typisk ~ 10-30 nm) og omfanget af kontaktstedet (fra punkterede kontakter til større 3D-cisternallignende kontakter). Undersøgelsen af nære kontakter kræver billeddannelse i høj opløsning, og seriel sektion TEM er velegnet til at visualisere 3D ultrastrukturelle af interorganelle kontakter under hepatocytdifferentiering samt ændringer i hepatocytarkitektur forbundet med metaboliske sygdomme.

Introduction

Siden deres opfindelse i 1930'erne har elektronmikroskoper gjort det muligt for forskere at visualisere de strukturelle komponenter i celler og væv 1,2. De fleste undersøgelser har givet 2D-oplysninger, da bygning af 3D-modeller kræver omhyggelig seriel sektionsindsamling, manuel fotografering, negativ behandling, manuel sporing og oprettelse og samling af 3D-modeller fra plader af glas, plast eller Styrofoam 3,4. Næsten 70 år senere har der været betydelige fremskridt inden for adskillige aspekter af processen, fra mikroskopydelse, seriel sektionsindsamling, automatiseret digital billeddannelse, sofistikeret software og hardware til 3D-rekonstruktion, visualisering og analyse til alternative tilgange til det, der nu kollektivt kaldes volumen EM (vEM). Disse vEM-teknikker anses generelt for at give 3D ultrastrukturel information ved nanometeropløsninger på tværs af mikronskalaer og omfatter transmissionselektronmikroskopi (TEM) og nyere scanningselektronmikroskopi (SEM) teknikker; se anmeldelser 5,6,7,8.

For eksempel bruger fokuseret ionstråle SEM (FIB-SEM) en fokuseret ionstråle inde i en SEM til at fræse overfladen af blokken væk mellem sekventielle SEM-billeddannelsesscanninger af blokkens overflade, hvilket muliggør gentagen automatiseret fræsning / billeddannelse af en prøve og opbygning af et 3D-datasæt til rekonstruktion 9,10. I modsætning hertil bruger seriel blokfladen SEM (SBF-SEM) et ultramikrotom inde i SEM til at fjerne materiale fra blokfladen inden billeddannelse 11,12, mens arraytomografi er en ikke-destruktiv proces, der kræver indsamling af serielle sektioner på dæksedler, wafers eller tape, inden der oprettes en automatiseret arbejdsgang til billeddannelse af det område, der er af interesse i sekventielle sektioner i SEM for at generere 3D-datasættet13 . I lighed med arraytomografi kræver seriel sektion TEM (ssTEM), at fysiske sektioner indsamles forud for billeddannelse; Disse sektioner er dog samlet på TEM-gitre og afbildet i en TEM 14,15,16. ssTEM kan udvides ved at udføre vippetomografi 17,18,19. Seriel vippetomografi giver den bedste opløsning i x, y og z, og selvom den er blevet brugt til at rekonstruere hele celler20, er det rimeligt udfordrende. Denne protokol fokuserer på de praktiske aspekter af ssTEM som den mest tilgængelige vEM-teknik, der er tilgængelig for mange EM-laboratorier, der muligvis ikke i øjeblikket har adgang til specialiserede sektionerings- eller vEM-instrumenter, men ville drage fordel af at generere 3D vEM-data.

Seriel ultramikrotomi til 3D-rekonstruktion er tidligere blevet betragtet som udfordrende. Det var vanskeligt at klippe lige bånd af jævn sektionstykkelse, være i stand til at arrangere og afhente bånd af den rigtige størrelse i den rigtige rækkefølge på gitter med tilstrækkelig støtte, men uden gitterstænger, der skjuler områder af interesse, og vigtigst af alt uden at miste sektioner, da en ufuldstændig serie kan forhindre fuld 3D-rekonstruktion21. Forbedringer af kommercielle ultramikrotomer, diamantskæring og trimning af knive22,23, elektronlumcent støttefilm på gitter21,24 og klæbemidler til hjælp til sektionsvedhævning og båndbevarelse13,21 er blot nogle af de trinvise fremskridt gennem årene, der har gjort teknikken mere rutinemæssig i mange laboratorier. Når serielle sektioner er indsamlet, er seriel billeddannelse i TEM ligetil og kan give EM-billeder med subnanometer px-størrelser i x og y, hvilket muliggør forhør i høj opløsning af de subcellulære strukturer - et potentielt krav til mange forskningsspørgsmål. Casestudiet, der præsenteres her, viser brugen af ssTEM og 3D-rekonstruktion i studiet af endoplasmatiske retikulum (ER)-organelkontakter i leverhæpatocytter, hvor ER-organelkontakter først blev observeret25,26.

Mens den er sammenhængende med den nukleare kuvert, har ER også tætte kontakter med adskillige andre celleorganeller, herunder lysosomer, mitokondrier, lipiddråber og plasmamembranen27. ER-organellekontakter har været impliceret i lipidmetabolisme28, phosphoinositid og calciumsignalering29, autofagiregulering og stressrespons30,31. ER-organellekontakterne og andre interorganelle kontakter er meget dynamiske strukturer, der reagerer på cellulære metaboliske behov og ekstracellulære signaler. De har vist sig at variere morfologisk i deres størrelse og form og afstanden mellem organelmembraner32,33. Det menes, at disse ultrastrukturelle forskelle sandsynligvis afspejler deres forskellige protein / lipidsammensætninger og funktion34,35. Det er dog stadig en udfordrende opgave at definere interorganelle kontakter og analysere dem36. Derfor kræves en pålidelig, men enkel protokol til undersøgelse og karakterisering af interorganelle kontakter til yderligere undersøgelser.

Da ER-organellekontakter kan variere fra 10 til 30 nm i membran-til-membran-adskillelse, har guldstandarden for identifikation historisk været TEM. Tynd sektion TEM har afsløret specifik underdomænelokalisering for residente ER-proteiner ved forskellige membrankontakter37. Traditionelt har dette afsløret ER-organellekontakter med nm-opløsning, men ofte kun præsenteret et 2D-billede af disse interaktioner. VEM-tilgange afslører imidlertid den ultrastrukturelle præsentation og kontekst af disse kontaktsteder i 3D, hvilket muliggør fuld rekonstruktion af kontakter og mere nøjagtig klassificering af kontakter (punkt vs. rørformet vs. cisternallignende) og kvantificering 38,39. Ud over at være den første celletype, hvor ER-organelkontakter blev observeret25,26, har hepatocytter et omfattende system af andre interorganelle kontakter, der tjener vitale roller i deres arkitektur og fysiologi 28,40. Imidlertid mangler der stadig en grundig morfologisk karakterisering af ER-organelle og andre interorganelle kontakter i hepatocytter. Følgelig er det af særlig relevans for hepatocytbiologi og leverfunktion, hvordan interorganelle kontakter dannes og ombygges under regenerering og reparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr blev opholdt i overensstemmelse med det britiske indenrigsministeriums retningslinjer, og vævshøsten blev udført i overensstemmelse med UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Prøvefiksering og tilberedning

  1. Levervævet dissekeres i stykker af passende størrelse, ca. 8 mm x 8 mm x 3 mm, og stykkerne anbringes i varmt fosfatbufret saltvand (PBS, 37 °C).
  2. Injicer stuetemperatur (20-25 °C) fikseringsmiddel (1,5% glutaraldehyd i 1% saccharose, 0,1 M natriumkacodylat) i leverstykkerne og overfør dem fra PBS til fikseringsmiddel i op til 20 minutter ved stuetemperatur. Hold altid vævet nedsænket i opløsninger for at undgå tørring.
    BEMÆRK: Aldehyder er irriterende stoffer, der er ætsende og potentielt kræftfremkaldende. Natriumkacodylat er giftigt, hvis det sluges eller indåndes. Alle fikseringsmidler skal håndteres, mens der bæres passende personlige værnemidler, og forsøget skal udføres i en stinkhætte. God fiksering vil resultere i et fastere væv.
  3. Opsæt det vibrerende mikrotom med et blad, isbad og en kold PBS-fyldt bufferbakke. Monter det første stykke fast levervæv på en prøveholder med cyanoacrylatlim, og overfør blokken til det vibrerende mikrotom.
  4. Efter producentens anbefalinger skal du nærme dig vævet og skære den faste lever i 100 μm tykke skiver.
  5. Saml skiverne ved hjælp af en spatel eller naturlig hårpensel og overfør dem til en 12- eller 24-brønds skål indeholdende iskold fix (1,5% glutaraldehyd, 0,1 M natriumkacodylat) på is. Lad skiverne ligge på is, indtil alle prøver er skåret i skiver og er klar til at blive behandlet yderligere.
  6. Vælg de skiver, der indeholder de områder, der er af interesse for videre behandling og vask med skånsom omrøring. Udfør tre, 5 minutters vask med stuetemperatur 0,1 M natriumkacodylat i en 12- eller 24-brønds skål, og sikre, at skiverne har tilstrækkelig buffer til at bevæge sig frit.
    BEMÆRK: Generelt udvælges regioner af interesse ud fra anatomiske træk relateret til det biologiske spørgsmål i undersøgelsen og styres af områder af vævet, der sandsynligvis vil være til stede i hele serien, f.eks. Ikke på kanten af sektionen, og som er velbevarede.
  7. I en stinkhætte udskiftes 0,1 M natriumkacodylat med frisklavet 1% osmiumtetroxid/1,5% kaliumferricyanid. Anbring fadet med 12 eller 24 brønde i en forseglet beholder, og overfør beholderen til et køleskab med farlige kemikalier i 1 time.
    BEMÆRK: Osmium er ekstremt farligt i tilfælde af indtagelse, indånding og hudkontakt. Kaliumferricyanid er irriterende og er skadeligt ved indånding og hudkontakt. Håndter altid brug af passende personlige værnemidler, og udfør eksperimentet i en stinkhætte.
  8. I en stinkhætte fjernes osmiumtetroxid/kaliumferricyanidet til en dedikeret osmiumaffaldsflaske, og prøverne vaskes i 5 minutter med 0,1 M natriumkacodylat tre gange. Lad prøverne stå i en forseglet beholder natten over ved 4 °C.
    BEMÆRK: Potentielt pausepunkt. Prøverne kan opbevares i 0,1 M natriumkacodylat i en forseglet beholder ved 4 °C i ugevis med ringe skade for konserveringen. Sørg for, at der er tilstrækkelig buffer til at forhindre tørring.
  9. Prøverne inkuberes med frisklavet 1 % garvesyre i 0,05 M natriumkacodylat i 45 minutter i mørke ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Garvesyre er irriterende og kan forårsage øjenskader. Brug passende personlige værnemidler og udfør eksperimentet i en stinkhætte.
  10. Udfør tre 5 minutters vaske med ddH2O inden dehydrering og indlejring.

2. Prøvedehydrering, Indlejring af Epon-harpiks og montering

  1. Eponharpiks fremstilles i henhold til følgende vægtforhold (se trin 2.2). Tare en balance med et 100 ml engangsplastbægerglas, der indeholder en omrøringsstang. Skær enderne af 5 engangsplastiske Pasteur-pipetter, og brug disse til at overføre viskøse harpikskomponenter til bægerglasset.
  2. Der tilsættes sekventielt 19,2 g harpiks-812, 7,6 g DDSA, 13,2 g MNA og 0,8 g DMP-30-accelerator i bægerglasset. Brug den femte rene plastpastepastepipette til at blande harpikskomponenterne grundigt manuelt.
    BEMÆRK: Undgå at indføre bobler, men sørg for tilstrækkelig blanding af bundharpiksen med toppen for at opnå en farveændring og grov blanding af komponentlagene. Alle harpikskomponenter er irriterende og er skadelige ved indånding og hudkontakt. DMP-30 er ætsende og kan forårsage hudætsning. Brug passende personlige værnemidler.
  3. Anbring bægerglasset på en magnetisk omrører, og lad det røre forsigtigt, og bland harpiksen manuelt med jævne mellemrum.
  4. Vask prøverne med blid omrøring i 5 minutter med 70% ethanol; gentag en gang.
  5. Vask prøverne med blid omrøring i 5 minutter med 90% ethanol; gentag en gang.
  6. Vask prøverne med blid omrøring i 5 minutter med 100% ethanol; gentag en gang.
  7. Mens prøverne er i 100% ethanolvask i en stinkhætte, skal du forberede et 50:50 (v / v) propylenoxid (PO):Epon-blanding i et glashætteglas med et propylenoxid (PO) -resistent plastlåg. Klip forsigtigt, men sikkert på glashætteglassets låg, og mens du holder fat i både låg og hætteglas, skal du ryste eller hvirvel for at blande.
    BEMÆRK: Propylenoxid er et akut giftigt, brandfarligt irriterende stof, der opløser noget plast. Brug passende personlige værnemidler og udfør eksperimentet i en stinkhætte.
  8. Efter trin 2.6 inkuberes prøverne med PO:Epon i 1 time i en PO-resistent beholder (f.eks . aluminiumsbakker eller glashætteglas) med blid gyngen/omrøring i stinkhætten.
  9. I stinkhætten overføres prøverne til 100% Epon. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur i stinkhætten med gynge/rotation/omrøring. Overfør PO:Epon-blandingen til en dedikeret Epon-affaldsflaske af glas.
  10. Gentag trin 2.9 én gang.
  11. Monter prøverne til indlejring. Afhængigt af skivernes størrelse og interesseområdet monteres skiverne direkte på præmolymeriserede harpiksstubbe eller fladindlejres dem til dissektion og genindlejres dem på et senere tidspunkt.
    BEMÆRK: Til flad indlejring kan et "cast-a slide" bruges til at integrere mange udsnit på én gang. Resterende harpiks kan bruges til at fylde strålekapsler og bages til at fremstille præmolymeriserede stubbe eller fryses til senere brug.
  12. Når de er monteret og dækket af tilstrækkelig harpiks til at fylde hulrummet "cast-a slide", bages prøverne natten over i en ovn på 60 °C.
    BEMÆRK: Potentielt pausepunkt. Prøver kan opbevares ved stuetemperatur i årevis.
  13. Til genindlejring skal du identificere det område, der er af interesse for de flade indlejrede vævsskiver. Brug en guldsmedesave til at skære vævet af passende størrelse (1 mm2 til 4 mm2) ud og genindlejre ved hjælp af harpiks, der er fremstillet som i trin 2.2, på toppen af en prækolymeriseret blok og bages natten over i en ovn på 60 °C.
    BEMÆRK: Alternativt kan vævsstykket limes på en stub eller stift med todelt epoxyharpiks. Lad det stå natten over. Potentielt pausepunkt.

3. Trimning og seriel sektionering af indlejrede prøver

BEMÆRK: Sektionering er en lært færdighed; brugere skal være dygtige til ultratynd sektionering, før de forsøger seriel sektionering. Da de nøjagtige mikrotomkontroller varierer fra producent til producent, skal du følge producentens anvisninger og retningslinjer.

  1. Når prøven er låst i trimmeadapteren, skal du bruge et barberblad til omhyggeligt at trimme det harpiksindlejrede væv for at opfylde følgende kriterier (se figur 1A,B):
    1. Sørg for, at der er en flad, øverste overflade, der udsætter vævet omkring det område, der er af interesse.
    2. Sørg for en trapezformet form, hvor de øverste og nederste kanter er rene og parallelle.
    3. Sørg for overordnede dimensioner på 200-500 μm i x, 100-500 μm i y.
    4. Sørg for en asymmetrisk blokside, f.eks. højre sidehjørner på ~ 90 °, øverste venstre hjørne stump og venstre nederste hjørne akut.
      BEMÆRK: En trimmende cryoknife kan være et alternativt værktøj til et barberblad. De andre anbefalinger er til brugervenlighed til bestilling af sektioner ved billeddannelse. Valgfrit: Hvis sektioner ikke danner stabile bånd, kan en kontaktcement påføres forkanten af blokfladen for at hjælpe bånddannelsen. Barberblade er skarpe; Pas på at holde barberbladet, så utilsigtede glidninger sandsynligvis ikke vil resultere i personlig skade.

Figure 1
Figur 1: Seriel sektion TEM-arbejdsgang. (A) Diagram over prøven i harpiksblokken. (B) Trim blok for at generere en trapezform med kanter, der er egnede til seriel sektionering og asymmetrisk blokside for at sikre kendt orientering. (C) Diagram, der viser bånd af serielle sektioner, der flyder på vandoverfladen i diamantknivbåden. (D) Diagram, der viser sektionen og båndorganisationen, dikterende rækkefølge af sektioner, på et TEM-slotgitter med en diameter på 3 mm. (E) TEM-billeddannelse og navigation. Viser bånd- og sektionsrækkefølge og bruger "gule stjerneklistermærker" på skærmen til skærmhenvisninger for at sikre genafbildning af det samme område af interesse i efterfølgende afsnit. (F) Billedjustering og beskæring. (G) Segmentering, 3D-rekonstruktion og visualisering. Forkortelse: TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Når prøvebuen er trimmet, overføres den sammen med borepatronen og prøven til mikrotomets prøvearm, idet prøvebuen placeres, således at buens vandringsområde løber fra top til bund; fastgør prøvebuen på plads.
  2. Anbring og lås diamantkniven i knivholderen, og det sikres, at skærevinklen er indstillet korrekt til kniven. Lås knivholderen sikkert ind i scenen.
  3. Når scenen lyser op, skal du bruge kniven forskud, mens du konstant kontrollerer forholdet mellem blokansigtet og knivens kant. Fremryk forsigtigt kniven mod prøven, og juster løbende knivens sidevinkel, prøvehældning og prøverotation ved at justere de relevante knapper, indtil blokken er justeret til knivens kant.
  4. Sluk for scenebelysningen; tænd scenen downlighting; sæt toppen og bunden af prøvearmens skærevindue; og lad prøven stå lige under knivsægget.
  5. Fyld knivbåden med ren ddH2O og sørg for, at vandoverfladen er i niveau med knivens kant og kun lidt konkav.
  6. Valgfrit: Dyp en øjenvipper i 0,1% Triton X-100 og derefter i knivbådens vand for at reducere vandets overfladespænding for at hjælpe kloroformning og båndopsamling.
  7. Forbered arbejdsstationen med øjenvipper (øjenvipper limet på en cocktailpind), formvarbelagte slidsgitter, mærket crossover-tang, chloroform, 0,1% Triton X-100-opløsning, destilleret vand, filterpapir og gitterkasse med gitterboksnoter.
  8. Indstil skærehastigheden til 1 mm/s og den indledende skæretykkelse til 100 nm, og start skærecyklussen.
  9. Når den første sektion er skåret, skal du ændre skæreparametrene til en skærehastighed på 0,8 mm/s og skæretykkelsen til 70 nm og fortsætte med at skære, så sektioner kan danne et bånd, der bevæger sig ned ad overfladen på den vandfyldte knivbåd (figur 1C).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at være opmærksom på farven på de sektioner, der produceres, da dette ofte er en mere præcis vejledning til tykkelsen af harpikssektionerne. Sølvsektioner er normalt omkring 70 nm tykke, mens grå sektioner er tyndere og guldsektioner er tykkere.
  10. Lad mikrotomet fortsætte med at klippe sektioner og båndet blive længere.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå store vibrationer og fysiske forstyrrelser i rummet. Udkast kan få sektionerne til at bevæge sig på overfladen af vandet i knivbåden, og fysiske vibrationer kan få mikrotomet til at skære ujævnt.
  11. Når der er samlet nok sektioner, og inden båndet kommer til enden af båden, skal du stoppe skæringen (lige efter at prøven har passeret knivens kant).
    BEMÆRK: Antallet af sektioner, der er nødvendige, afhænger af størrelsen på blokansigtet og størrelsen på det datasæt, der skal indsamles. Det er således nyttigt at være opmærksom på forholdet mellem blokkens størrelse og slotgitteret, da de afskårne sektioner kommer ud.
  12. Brug en øjenvipper i hver hånd til forsigtigt at bryde båndet i mindre bånd, der kan passe ind i længden af spaltegitteret, og pas på at notere deres relative positioner inde fra prøven.
    BEMÆRK: Hvis deres kombinerede bredde passer, kan flere bånd forsigtigt placeres ved siden af hinanden og samles sammen i et enkelt slotgitter. Hvis du henter flere bånd på et enkelt slotgitter, skal du være opmærksom på rækkefølgen og den relative placering af båndene. Placer f.eks . altid båndene længere inde i prøven til højre for et bånd, der allerede er i prøven (figur 1D).
  13. Valgfrit: Brug en glasapplikatorstang til at holde en dråbe chloroform over sektionerne for at flade dem ud.
    BEMÆRK: Chloroform er giftigt og irriterende. Lad ikke chloroform røre ved vandoverfladen eller sektionerne. Hvis det ved et uheld gør det, skal vandet fjernes og kniven vaskes, inden den vender tilbage til sektionering. Kloroformen kan beskadige sektionerne og nedbryde limen, der fastgør diamanten i knivbåden.
  14. Brug den første nummererede tang til at hente det første tomme spaltegitter (på højre side af spalten, formvar med siden nedad), dypp forsigtigt i Triton X-100 og derefter to gange i det destillerede vand, før du fjerner overskydende vand fra tangkanten ved hjælp af et stykke filterpapir.
  15. Med en øjenvippe i den ene hånd og tangen i den anden hånd sænkes forsigtigt ca. 2/3rd af det formvarbelagte spaltegitter ned i knivbådens vand (væk fra sektionerne), så formvar-siden vender nedad, og den højre lange kant af spalten er ved vandoverfladen og parallelt med vandkanten.
  16. Vift forsigtigt gitteret i vandet mod båndene, så sektionerne ved returslaget driver mod gitteret. Fortsæt med at gøre dette i mindre og mindre wafts, indtil højre kant af båndet står op med højre kant af spalten. Derefter, med den sidste waft, skal du forsigtigt bringe gitteret op for at samle sektionerne op i slotgitteret.
  17. Lad gitteret i tangen tørre, før det opbevares i gitterboksen, der er korrekt kommenteret på gitterboksens referenceark.
  18. Gentag trin 3.16, indtil alle bånd er samlet, og sikre, at rækkefølgen af bånd opretholdes.
  19. Hvis der kræves yderligere sektioner, skal du trække kniven 150 nm eller deromkring, kontrollere vandstanden i båden og tilføje mere, hvis det kræves. Start skæreprocessen igen ved at følge trin 3.11-3.18.
  20. Når alle sektioner er samlet, skal du sørge for, at knivkanten er fri for sektionsrester, trække kniven væk fra bloksiden og fjerne og rengøre kniven.

4. Gitterfarvning

  1. Når de er tørre, pletter sektionerne med Reynolds 'blycitrat enten på parafilm på bænken eller i en petriskål. Placer flere pellets af natriumhydroxid under et petriskålslåg for at give et kuldioxidfrit miljø. Derefter pipetter forsigtigt væk fra pellets 40 μL dråber Reynolds 'blycitrat på parafilmen, en for hvert gitter.
    BEMÆRK: Pletter ikke for mange gitter på én gang; f.eks. bør maksimum være 6. Prøv ikke at trække vejret direkte på farvningsskålen. Kuldioxid kan reagere med blycitrat og forårsage uønsket bundfald på gitterene.
  2. Omvendt hvert gitter (sektion med siden nedad) på blycitratfaldet og lad det være beskyttet af petriskålslåget i 7 til 10 minutter. Mens gitterene pletter, skal du forberede et større andet stykke parafilm på bænken med fem 300 μL dråber destilleret vand til hvert gitter.
  3. Ved afslutningen af blycitratinkubationen overføres hvert gitter til en dråbe destilleret vand for at vaske i 1 minut uden at trække vejret direkte på gitterene.
  4. Gentag trin 4.3 i alt fem gange.
  5. Brug nummererede crossover-tang til at samle det første gitter op, røre ved kanten af gitteret for at filtrere papir for at transportere det meste af vandet væk og lade det tørre i tangen (i mindst 20 minutter). Gentag for hvert gitter.

5. Billeddannelse erhvervelse af TEM

BEMÆRK: Da de nøjagtige TEM-kontroller varierer fra producent til producent, skal du følge producentens anvisninger og retningslinjer. Følgende trin skal udføres af brugere, der allerede er dygtige til TEM-brug.

  1. Før billeddannelse skal du udføre de sædvanlige kontroller, f.eks. strålejustering, forstærkningsreferencer og prøve eucentricitet.
  2. Læg forsigtigt det første gitter af serielle sektioner i prøveholderen, og pas på at justere spalten (og derfor sektionerne) til mikroskoptrinnets lodrette akse.
    BEMÆRK: Denne nøjagtighed er ikke afgørende, men sparer tid under erhvervelse og fremtidige datahåndteringsfaser. Når du indsætter gitteret (sektionssiden nedad eller sektionssiden nedad), skal du sørge for at afbilde alle gitre i samme retning.
  3. Ved lav forstørrelse skal du observere rækkefølgen, placeringen og placeringen af de serielle sektioner (figur 1E). Naviger til den midterste del af serien på gitteret.
    BEMÆRK: Afhængigt af det nøjagtige forskningsmål kan tilgange til billeddannelse variere; Følgende er dog et nyttigt udgangspunkt. Sektionernes form og båndenes forhold (som hentet i trin 3.14) dikterer, hvilken sektion der var først, og hvilken sektion der var sidst på gitteret.
  4. Gennemse eksemplet, og identificer et område af interesse. Overhold prøven ved den ønskede forstørrelse, og overvej at indsamle serien ved en lidt lavere forstørrelse, da sektioner ofte ikke er perfekt justeret, og billeder muligvis skal beskæres senere.
  5. Tag referencebilleder ved lavere forstørrelser for at værdsætte konteksten for det område, der er af interesse, dets grove placering ved forskellige forstørrelser i forhold til sektionsgrænser og landemærkefunktioner i prøven. Brug disse til at underskrive det område, der er af interesse, i andre sektioner.
  6. Valgfrit: Til skærmhenvisninger skal du bruge genanvendeligt klæbende kitt, klistermærker eller et stykke OHP-papir (overhead projector), tapet til skærmen, til at placere midlertidige markører på skærmen for at muliggøre rutinemæssig genafbildning af de samme funktioner i det område, der er af interesse i midten af billedet, i hele datasættet (se gule stjerner i figur 1E).
  7. Brug referencebillederne til at navigere til det område, der er af interesse på den første del af gitteret, og få et billede ved den ønskede forstørrelse.
    BEMÆRK: Når du gemmer billeder, skal du notere det første filnavn på det første billede i serien og bruge sekventiel navngivningsnomenklatur, så alle billednavne følger rækkefølgen af de serielle sektioner.
  8. Naviger til næste afsnit, og gentag trin 5.7, indtil alle sektioner er afbildet for det pågældende område af interesse.

6. Registrering af billedeksport og seriel sektionsjustering

  1. Eksporter billedfilerne, der tilhører den samme stak, til en enkelt mappe. Sørg for, at mappen er sorteret efter filnavn.
    BEMÆRK: Billederne skal ideelt set have det samme rodnavn og følge den rækkefølge, de er erhvervet i.
  2. Åbn Fiji, og klik på File | Import | Billedsekvens.
  3. Klik på det første billede af mappen, og klik på Åbn. Vent på, at et pop op-vindue med Sekvensindstillinger vises (figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Oprettelse af en seriel stak og seriel sektionsjustering ved hjælp af Fiji. (A) Skærmbillede, der viser sekvensindstillingerne, når billederne indlæses for at lave en seriel stak. (B) Skærmbillede af TrackEM2-pluginet og nøglevinduerne i pluginet. Tryk på OK i udsnitsadskillelsen for at fortsætte med justeringen. (C) Skærmbillede efter vellykket indlæsning af den serielle stak i visualiseringsruden. Tre sekventielle vinduer med justeringsparametre vises, når Juster stakudsnit er valgt. Eksportér den justerede stak, når justeringen er fuldført. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Klik på Sortér navne numerisk | Konverter til 8-bit mulighed. Tryk på OK.
    BEMÆRK: Konvertering til 8-bit hjælper importen af dataene til Amira og reducerer filstørrelsen, hvilket muliggør hurtigere behandlingshastigheder i senere trin.
  2. Kontroller fuldstændigheden, rækkefølgen og forstørrelsen af den oprettede stak. Gem den oprettede stak som en .tif fil.
    BEMÆRK: Billeder skulle have været erhvervet med samme forstørrelse.
  3. Udfør TrakEM2-pluginet41. Gå til Fil | Nyt | TrackEM2 (tom).
    BEMÆRK: Pluginet beder brugeren om at gemme TrackEM2-filerne. Gem om nødvendigt TrackEM2-filerne i billedmappen. Der skal vises tre vinduer: et projektvindue, et vindue til staknavigation (venstre) og en stakvisualiseringsrude (figur 2B).
  4. Højreklik på den sorte visualiseringsrude. Klik på Importer | Importer stakken , og vælg den tidligere oprettede stak.
  5. Klik på OK for at indlæse stakken i staknavigationsvinduet.
    BEMÆRK: Et skiveseparationsvindue vises for at bede om pixel- og dimensionsforhold. Klik på OK for kun at springe dette trin over for at springe dette trin over.
  6. Brug skyderen til at kontrollere alle skiverne i stakken. Kig efter det indlæste udsnit, der vises som et element i navigationsplanen. Vælg de programrettelser, der skal inkluderes i følgende justering.
    BEMÆRK: Udvalgte patches bliver blå.
  7. Hold musen over visningsruden. Højreklik på billedet, vælg Juster | Juster stakudsnit (figur 2C-1).
  8. Angiv justeringsparametrene gennem et sæt af tre sekventielle vinduer.
    BEMÆRK: For de fleste data skal du starte med en stiv justering (giver mulighed for rotation og oversættelse, men ikke transformation) og beholde andre parametre som standard (figur 2C-2).
  9. Lad justeringen køre, indtil udlæsningsloggen siger Montage udført.
    BEMÆRK: Runtime afhænger af antallet af voxels og computerens hastighed.
  10. Kontroller den justerede stak i visningsruden. Tryk på Alt og - tasterne (på pc) eller Ctrl og - tasterne (i Mac) for at få en zoom-ud visning af den justerede stak.
  11. Hvis du er tilfreds med den justerede stak, skal du højreklikke på Eksportér | Lav fladt billede for at gemme den justerede stak.
  12. Vælg det første billede som starten af stakken og det sidste billede som slutningen af stakken, klik på OK (figur 2C-3). Gem den justerede stak som .tif.
    BEMÆRK: For at reducere filstørrelsen skal du beskære dataene, så de kun indeholder det nødvendige område af interesse.
  13. Udfør om nødvendigt en affin justering på den justerede stak. Åbn den justerede stak i Fiji, vælg Plugin | | StackReg.
  14. Vælg indstillingen affiner, og tryk på OK. Vent, indtil programmet er færdigt.
  15. Gem den affine-justerede stak med et andet filnavn.

7. Segmentering og 3D-rekonstruktion

  1. Åbn Amira42. Klik på | Åbn Data for at indlæse den justerede stak.
  2. Angiv voxelmålingerne i det nye popup-vindue (figur 3A).

Figure 3
Figur 3: Segmentering af seriel stak ved hjælp af Amira. (A) Popup-vinduet Voxel-definition, før du indlæser en justeret stak. (B) Skærmbillede af projektgrænsefladen efter import af en stak. Vælg fanen Segmentering for at starte objektsporing i panelet Segmenteringseditor. (C) Nøglefunktioner under fanen Segmentering. Definer objekterne til segmentering i afsnittet Segmenteringseditor under fanen Segmentering. Brug zoomfunktionen til at hjælpe med at identificere objekter. Vælg penselværktøjet, og spor objektets grænse. Klik på symbolet + under Markering for at tildele sporingen. Et tildelt objekt ser ud til at have en rød grænse i ruden ortoslicevisning. Klik her for at se en større version af denne figur.

BEMÆRK: En billedstakknude vises i projektgrænsefladen, og en orthoslice vises i visningsruden til højre (figur 3B).

  1. For at starte segmentering skal du vælge fanen Segmentering (figur 3B).
    BEMÆRK: Det anbefales at gemme segmenteringsforløbet før og under segmenteringen. Gå til Model | Gem model som enhver .am-fil, der passer.
  2. Klik på Ny i panelet til segmenteringseditor for at definere nye objekter på materialelisten. Højreklik for at ændre objektets farve, og dobbeltklik for at omdøbe objektet.
  3. For manuel segmentering skal du vælge segmenteringsværktøjet under materialelisten. Vælg standardværktøjet Pensel for at fremhæve pixels (figur 3C).
    BEMÆRK: Alternativt kan du bruge penselværktøjet til at spore objektets omrids og trykke på Skift + F for at udfylde objektet.
  4. Hvis du vil konvertere penselværktøjet til et viskelæder, skal du løbende trykke på Ctrl , mens du vælger pixels til korrektion. Kommenter hver skive i stakken.
  5. Når det er bekræftet, skal du tildele markeringen til en etiket ved at klikke på tegnet + . Klik på tegnet - for at fjerne markeringen.
  6. Gå tilbage til projektgrænsefladen, når segmenteringen er afsluttet. Kig efter en node med en ".label" -udvidelse, der er forbundet til billedstakken.
  7. Højreklik på udvidelsen ".label", og vælg Generer Surface | Ansøg om at oprette en .surf-fil.
  8. Hvis du vil gengive 3D-modellen for et segmenteret objekt, skal du højreklikke på .surf-filen og vælge Surface-visning for at generere en 3D-model i visningsruden.
  9. Gem 3D-modellen til visualisering eller yderligere kvantitative analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til denne teknik udvælges regioner af interesse baseret på det biologiske forskningsmål og identificeres inden trimning og sektionering af indlejret væv. Tilsvarende kan størrelsen på blokfladen dikteres af forskningsspørgsmålet; i dette tilfælde blev prøven trimmet for at efterlade en blokside på ca. 0,3 mm x 0,15 mm (figur 4A). Dette tillod to gitter med 9 serielle sektioner pr. gitter, der gav 18 serielle sektioner og inkorporerede et volumen levervæv med et volumen på ca. 62 μm3 (316 μm x 150 μm x 1,3 μm). Dette volumen var tilstrækkeligt til at muliggøre en fuldstændig 3D-rekonstruktion af individuelle mitokondrier i levervæv.

Figure 4
Figur 4: Segmentering og 3D-rekonstruktion, der gennemgår morfologien for ER og tilhørende ER-mitokondrier-kontakter. (A) Oversigt over bånd af serielle sektioner i TEM. (B) Visning med lav forstørrelse af interesseområde og kontekstuelle landemærker for flytning. Skalastænger = 40 μm (i), 20 μm (ii), 5 μm (iii), 1 μm (iv). C) Til venstre: EM-tomogram af to apposerede hepatocytter. Til højre: segmenteret version af det samme tomogram. Spor af ER (gul), mitokondrier (cyan) og intermembrankontakter mellem ER og mitokondrier i forskelligt rum: 0-20 nm (magenta); 21-100 nm (blå). D) En ortokse, der er isoleret fra den rekonstruerede model, og som kun viser ER og de forskellige membrankontakter, svarende til det pilkommenterede område i indlægdet. E) 3D-rekonstruktion af de segmenterede organeller og ER-mitokondrier-kontakter i forskellige vinkler. Forkortelser: ER = endoplasmatisk retikulum; TEM = transmissionselektronmikroskopi; mt = mitokondrier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Visualisering af de serielle sektioner ved TEM ved lav forstørrelse hjælper med at identificere det udpegede interesseområde og dets kontekst inden for resten af vævet (figur 4B). Disse billeder kan bruges til at finde den samme region af interesse i efterfølgende sektioner. En region af interesse, der viser god bevarelse ved en grænse mellem to apposed hepatocytter, blev udvalgt og præsenteret her. Højere forstørrelsesbilleddannelse gør det muligt at observere de morfologiske detaljer i de forskellige organeller (figur 4C) med nm-opløsning. For at illustrere to typer ER-organelleforeninger blev udvalgte mitokondrier og ER segmenteret, der manuelt sporer kanten af membranerne, der præsenterer med forbedret elektrondensitet. Derefter blev børsteværktøjet indstillet til en fast nm/px-tykkelse (figur 3B) og brugt til at følge grænsen for den organel, der var af interesse, for at fremhæve regionerne mellem de to målrettede organeller, der var inden for en bestemt kontaktafstand til hinanden og kunne betegnes som en bestemt klasse af organelkontakter. Figur 4D viser en vippet ortoslice overlejret med segmenteringsspor og dens relative position (pilespids i indløbs-3D-modellen) inden for hele mitokondrier.

Sporene blev tildelt forskellige farver, rekonstrueret til en 3D-model efter segmentering og vist i forskellige retninger (figur 4E). ER (gul) strukturen viste sig at være delvist gennemsigtig i de midterste paneler for at visualisere ER-mitokondrier kontakterne og mitokondrier (cyan) nedenunder. Modellens forreste og bageste visninger afslører en asymmetrisk fordeling af interorganelle kontakter med forskellige intermembranafstande. Intermembranrum mindre end 21 nm blev tildelt som ER-mitokondrier kontakt (pink), fordi funktioner såsom lipidoverførsel er blevet rapporteret at være mulige i denne afstand43. Intermembranrummet (blåt) mellem 21 og 100 nm blev også kommenteret, fordi denne region kan repræsentere de nyligt rapporterede mitokondrier-ru-ER-foreninger44. Indpakning af ER-strukturer med lignende krumning blev observeret i 3D-modellen (figur 4E). Figur 4D viser et eksempel på ændring af intermembranafstand (~ 40 nm → ~ 20 nm → ~ 40 nm) mellem indpakningen ER cisternae og mitokondrierne. Metoden muliggør opfølgende patchanalyse af disse to forskellige intermembranrum, således at kvantitativ analyse af deres overflod, fordeling og topologi er mulig.

Bekymringer Seriel tomografi Seriel sektion TEM FIB-SEM SBF-SEM Array Tomografi
Lateral (x,y) opløsning 0,5 nm 0,5 nm 2 nm 2 nm 2 nm
(Mindste px-størrelse)
Aksial (z) opløsning 1 nm 50 nm 4 nm 20 nm 50 nm
(Mindste px dybde) Begrænset til sektionstykkelse Begrænset til sektionstykkelse
Volumenområder af data i typiske applikationer 0,1 - 50 μm3 10 - 250 μm3 10 - 1 x 104 μm3 10 – 1 x 1012 μm3 10 - ∞ μm3
Gensyn eller genafbildning af prøverne Mulig Mulig Ikke muligt Ikke muligt Mulig
Omkostninger til udstyret ££ £ ££ ££ ££
(eksempler på instrumenter) (200 kV TEM) (120 kV TEM) (FIB-SEM) (SBF-SEM) (SEM+AT)
Omkostninger til vedligeholdelse af udstyr ££ £ ££ ££ £

Tabel 1: Oversigt over volumenelektronmikroskopiteknikker. Forkortelser: EM = elektronmikroskopi; TEM = transmission EM; FIB-SEM = fokuseret ionstråle SEM; SBF-SEM = seriel blok ansigt SEM; SEM + AT = SEM med arraytomografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En tilgængelig vEM-teknik til visualisering af organelstruktur og interaktioner i 3D er beskrevet i denne protokol. Morfologien af interorganelle kontakter i hepatocytter præsenteres som et casestudie her. Denne tilgang er imidlertid også blevet anvendt til at undersøge en række andre prøver og forskningsområder, herunder Schwann-celle-endotelinteraktioner i perifere nerver45, Weibel Palade Body biogenese i endotelceller46, lastsekretion i nyreceller47 og synapsmorfologi i hippocampale neuroner48 . For bedre at forstå leverbiologi kan denne tilgang bruges til at undersøge hepatocytmorfologi i 2D-cellekultur, 3D-leverorganoidmodelsystemer49 og levervæv. Denne robuste og fleksible tilgang kan bruges af mange laboratorier med adgang til et konventionelt 120 kV transmissionselektronmikroskop og ultramikrotom og kræver ikke dyre prøveforberedelsesteknikker.

Selvom dette er en tilgængelig protokol, er det vigtigt at bemærke, at der er alternative vEM-teknikker, der kan give forskeren visse fordele afhængigt af forskningsspørgsmålet; Se tabel 1 for en oversigt 6,50,51. Ofte har opløsningen og mængden af de nødvendige data direkte indflydelse på forskernes valg af vEM-teknikken og den lethed og hastighed, hvormed projektet kan skride frem. FIB-SEM kan for eksempel fjerne meget tynde lag fra prøven inden billeddannelse, hvilket resulterer i fremragende z-opløsning (z-tykkelse så lav som 4 nm) og potentielt giver volumetriske 3D-data med isotrope voxeller. Dette muliggør visualisering af dataene med samme opløsning fra alle vinkler, hvilket nogle gange kan give forskellige fordele, når kontaktpunkter er vanskelige at skelne52,53. FIB-SEM kan generere store mængder, men er ofte dyrt og tidskrævende, mens SBF-SEM er en glimrende teknik at bruge, når der kræves større mængder, f.eks. 100'erne til 1000'erne i sektion54. SBF-SEM og arraytomografi giver samme xy-opløsning som FIB-SEM, men med reduceret z-opløsning. Da arraytomografi involverer indsamling af fysiske sektioner, er z-opløsningen måske den fattigste af sine konkurrenter (z tykkelse 50+ nm), men har flere forskellige fordele. Først og fremmest, fordi det er en ikke-destruktiv teknik, kan prøven revideres i forskellige xy-opløsninger med let montaging på forskellige tidspunkter og på tværs af adskillige regioner, hvilket gør det muligt at værdsætte fuld kontekst og detaljer i en enkelt prøve. Seriel sektion TEM deler også denne fordel; Men da sektioner skal indsamles på TEM-net, er det bedre egnet til mindre mængder, der kræver, at der indsamles færre sektioner inden billeddannelse. Det er dog kompatibelt med TEM vippetomografi, en teknik, der giver meget høj z-opløsning (z-tykkelse så lav som 2 nm) på meget små mængder, hvilket muliggør yderligere forhør af specifikke kontaktsteder af interesse, hvis det er nødvendigt.

Uanset hvilken vEM-tilgang der er taget, er prøvebevarelse afgørende for projektets succes. Fikseringsmediet skal være en isotonisk match til vævene, og overførslen til fikseringsmediet skal ske hurtigt for at undgå tørring af vævene55. Levervæv kan være udfordrende at bevare, og selvom det giver fremragende konservering, hvilket muliggør tilbageholdelse af levervæv til yderligere eksperimenter, er hel leverperfusion til elektronmikroskopi ofte ikke mulig. Lever-kile nål perfusion er et glimrende alternativ56. Kryoimmobilisering er også en mulighed, men kræver øjeblikkelig højtryksfrysning for at opnå homogen forglasning af friske vibratomsektioner; således er denne tilgang ret udfordrende. Efter den første fiksering er der en række EM-prøveforberedelsesprotokoller, der giver tilfredsstillende resultater. En rutinemæssig TEM-protokol præsenteres her57, men "enbloc megametal" -protokoller er også med succes blevet anvendt med andre biologiske prøver45,58. Mens disse "enbloc megametal" -protokoller giver mere kontrast i prøven, hvilket giver nogle strukturer et mere stærkt farvet udseende, har de også den fordel, at de fjerner kravet om at plette sektioner, hvilket reducerer risikoen for at tilføje uønsket pletfældning på prøver og beskadige gitter i processen.

Et andet kritisk trin i denne protokol er ultratynd sektionering og båndindsamling. Indsamling af serielle sektioner fra skærebådens vandoverflade er en manuel proces, der kan føre til beskadigede og manglende sektioner. Hvis sektioner for eksempel ikke klæber til hinanden og danner stabile bånd, kan kontaktcement påføres forkanten af blokfladen for at stabilisere båndene13. Varigheden og den rutinemæssige succes af dette trin er færdighedsafhængig59. Selvom en overflod af modelspecifikke sektionsplukningsmetoder60,61 kan forvirre begyndere, kan nogle enkle, praktiske vejledninger55,62 til rutinemæssig sektionering sammen med praksis forbedre sektionsfærdighederne betydeligt. Denne protokol kræver minimalt specialudstyr, og ved hjælp af videooptagelser, der viser de praktiske aspekter af manuelle manipulationsteknikker under sektionering, båndløsning og båndhåndtering og afhentning, giver en fremragende begyndervejledning til seriel sektionering.

Volume EM-billedanalyse er fortsat et udviklingsområde med en række open source- og kommercielle softwaremuligheder, der i øjeblikket er tilgængelige, og listen vokser stadigt. Et udvalg af software til justering (TrakEM241), 3D-segmentering og rekonstruktion (Amira42) præsenteres her; der findes dog mange alternativer til justering (f.eks. Fiji, Register Virtual Slices63, Atlas5 og 3D-rekonstruktion (f.eks. MIB64; Rekonstruer65; IMOD66). For relativt små analyseprojekter, uanset om dataene genereres lokalt eller hentes fra åbent delte datalagre (EMPIAR67, Open Organelle68), er manuel segmentering beskrevet her en tilgængelig og gennemførlig mulighed. For større datasæt henvender mange brugere sig imidlertid til maskinindlæring og kunstig intelligens til automatisering af disse opgaver69,70 samt crowd-sourcing frivillige71 eller kombinerer begge72.

I sidste ende, efter justering og 3D-segmentering, afslører 3D-rekonstruktion ikke kun morfologien af de pågældende strukturer, men vigtigst af alt også deres forhold til andre organeller, herunder de unikke egenskaber ved eventuelle tilstedeværende kontaktsteder. Disse organelkontakter kan analyseres yderligere, og funktioner som antallet af kontakter, kontaktområde, volumener af organeller og morfometriske parametre for organellerne kan ekstraheres og sammenlignes mellem eksperimentelle modeller70. Kvantationsmuligheder er mange, og deres relevans varierer enormt afhængigt af det nøjagtige forskningsspørgsmål. De er derfor ikke blevet dækket indgående som en del af denne protokol.

Patologiske processer, der påvirker organelkontakter, har været impliceret i både de sjældne (f.eks. Wilsons sygdom) og almindelige (viral hepatitis og ikke-alkoholisk steatohepatitis) lidelser 73,74,75. For eksempel synes ER-mitokondrier og mitokondrier-lipid dråbekontaktsteder at regulere lipidmetabolisme i hepatocytter; derfor er undersøgelsen af disse kontakter af stor interesse. Afslutningsvis er seriel sektion TEM og efterfølgende 3D-rekonstruktion og analyse en kraftfuld teknik til at forhøre interorganelle kontakter og undersøge deres relative betydning i leverfunktioner og sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro og Ania Straatman-Iwanowska for teknisk ekspertbistand. Vi takker også Stefan lab medlemmer og Ian J. White for nyttige diskussioner. J.J.B. er støttet af MRC-finansiering til MRC Laboratory of Molecular Cell Biology ved UCL, tildelingskode MC_U12266B. C.J.S. støttes af MRC-finansiering til MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit ved UCL, tildelingskode MC_UU_00012/6. P.G. er finansieret af Det Europæiske Forskningsråd, bevillingskode ERC-2013-StG-337057.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325 (1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , Springer. New York, NY. (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24 (2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675 (2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102 (2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287 (2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180 (2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091 (2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873 (2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111 (2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043 (2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003 (2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480 (2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., et al. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. Beichel, R. R., Sonka, M., et al. 4241, Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605 (2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196 (2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273 (2021).

Tags

Biologi udgave 184
Tredimensionel karakterisering af interorganelle kontaktsteder i hepatocytter ved hjælp af seriel sektionselektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chun Chung, G. H., Gissen, P.,… More

Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter