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Biology

सीरियल सेक्शन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स में इंटरऑर्गेनेल संपर्क साइटों का त्रि-आयामी लक्षण वर्णन

Published: June 9, 2022 doi: 10.3791/63496
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, University College London

Summary

यकृत या अन्य ऊतकों में कोशिकाओं से हेपेटोसाइट्स में ऑर्गेनेल के बीच झिल्ली संपर्क स्थलों के तीन आयामी विवरण प्राप्त करने के लिए एक सरल और व्यापक प्रोटोकॉल।

Abstract

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को लंबे समय से सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सोने का मानक माना जाता है। हालांकि, विश्लेषण अक्सर दो आयामों तक सीमित होता है, जो ऑर्गेनेल के बीच तीन आयामी (3 डी) अल्ट्रास्ट्रक्चर और कार्यात्मक संबंधों का पूरी तरह से वर्णन करने की क्षमता को बाधित करता है। वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (वीईएम) तकनीकों के एक संग्रह का वर्णन करता है जो मेसोस्केल, माइक्रोस्केल और नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी में सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर की पूछताछ को सक्षम करता है।

यह प्रोटोकॉल सीरियल सेक्शन ट्रांसमिशन ईएम (टीईएम) का उपयोग करके वीईएम डेटा प्राप्त करने के लिए एक सुलभ और मजबूत विधि प्रदान करता है और एकल, सरल वर्कफ़्लो में डिजिटल 3 डी पुनर्निर्माण के माध्यम से नमूना प्रसंस्करण के तकनीकी पहलुओं को कवर करता है। इस तकनीक की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और माइटोकॉन्ड्रिया और यकृत हेपेटोसाइट्स में उनके संपर्क स्थलों के बीच 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल संबंध प्रस्तुत किया गया है। इंटरऑर्गेनेल संपर्क ऑर्गेनेल के बीच आयनों, लिपिड, पोषक तत्वों और अन्य छोटे अणुओं के हस्तांतरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, हेपेटोसाइट्स में उनकी प्रारंभिक खोज के बावजूद, उनकी शारीरिक विशेषताओं, गतिशीलता और कार्यों के बारे में जानने के लिए अभी भी बहुत कुछ है।

इंटरऑर्गेनेल संपर्क आकारिकी की एक श्रृंखला प्रदर्शित कर सकते हैं, जो दो ऑर्गेनेल की निकटता में एक दूसरे (आमतौर पर ~ 10-30 एनएम) और संपर्क साइट की सीमा (बड़े 3 डी कुंडीय जैसे संपर्कों तक) में भिन्न होते हैं। करीबी संपर्कों की परीक्षा के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की आवश्यकता होती है, और सीरियल सेक्शन टीईएम हेपेटोसाइट भेदभाव के दौरान इंटरऑर्गेनेल संपर्कों के 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल की कल्पना करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, साथ ही चयापचय रोगों से जुड़े हेपेटोसाइट आर्किटेक्चर में परिवर्तन भी।

Introduction

1 9 30 के दशक में उनके आविष्कार के बाद से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ने शोधकर्ताओं को कोशिकाओं और ऊतकों के संरचनात्मक घटकों को 1,2 की कल्पना करने की अनुमति दी है। अधिकांश जांचों ने 2 डी जानकारी प्रदान की है, क्योंकि 3 डी मॉडल बनाने के लिए श्रमसाध्य सीरियल सेक्शन संग्रह, मैनुअल फोटोग्राफी, नकारात्मक प्रसंस्करण, मैनुअल ट्रेसिंग, और ग्लास, प्लास्टिक, या स्टायरोफोम 3,4 की चादरों से3 डी मॉडल के निर्माण और असेंबली की आवश्यकता होती है। लगभग 70 साल बाद, प्रक्रिया के कई पहलुओं में काफी प्रगति हुई है, माइक्रोस्कोप प्रदर्शन, सीरियल सेक्शन संग्रह, स्वचालित डिजिटल इमेजिंग, परिष्कृत सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर से 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, विज़ुअलाइज़ेशन, और विश्लेषण के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण जो अब सामूहिक रूप से वॉल्यूम ईएम (वीईएम) कहा जाता है। इन वीईएम तकनीकों को आम तौर पर माइक्रोन तराजू में नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल जानकारी प्रदान करने के लिए माना जाता है और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) और नई स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) तकनीकों को शामिल किया जाता है; समीक्षाएँ देखें 5,6,7,8.

उदाहरण के लिए, केंद्रित आयन बीम SEM (FIB-SEM) ब्लॉक की सतह के अनुक्रमिक SEM इमेजिंग स्कैन के बीच ब्लॉक की सतह को दूर करने के लिए एक SEM के अंदर एक केंद्रित आयन बीम का उपयोग करता है, जिससे एक नमूने के दोहराए गए स्वचालित मिलिंग / इमेजिंग की अनुमति मिलती है और पुनर्निर्माण 9,10 के लिए 3 डी डेटासेट का निर्माण होता है। इसके विपरीत, सीरियल ब्लॉक फेस एसईएम (एसबीएफ-एसईएम)इमेजिंग 11,12 से पहले ब्लॉक फेस से सामग्री को हटाने के लिए एसईएम के अंदर एक अल्ट्रामाइक्रोबियल का उपयोग करता है, जबकि सरणी टोमोग्राफी एक गैर-विनाशकारी प्रक्रिया है जिसके लिए सीरियल सेक्शन के संग्रह की आवश्यकता होती है, कवरस्लिप्स, वेफर्स, या टेप पर, 3 डी डेटासेट13 उत्पन्न करने के लिए एसईएम में अनुक्रमिक वर्गों में रुचि के क्षेत्र को इमेजिंग करने के एक स्वचालित वर्कफ़्लो की स्थापना करने से पहले। . सरणी टोमोग्राफी के समान, सीरियल सेक्शन टीईएम (एसएसटीईएम) को इमेजिंग से पहले एकत्र किए जाने के लिए भौतिक वर्गों की आवश्यकता होती है; हालांकि, इन वर्गों को TEM ग्रिड पर एकत्र किया जाता है और TEM14,15,16 में चित्रित किया जाता है। ssTEM17,18,19 झुकाव टोमोग्राफी प्रदर्शन करके बढ़ाया जा सकता है. सीरियल टिल्ट टोमोग्राफी एक्स, वाई और जेड में सबसे अच्छा रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है, और जब इसका उपयोग पूरे कोशिकाओं20 के पुनर्निर्माण के लिए किया गया है, तो यह यथोचित रूप से चुनौतीपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल एसएसटीईएम के व्यावहारिक पहलुओं पर केंद्रित है क्योंकि कई ईएम प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध सबसे सुलभ वीईएम तकनीक है, जिनके पास वर्तमान में विशेष सेक्शनिंग या वीईएम उपकरणों तक पहुंच नहीं हो सकती है, लेकिन 3 डी वीईएम डेटा उत्पन्न करने से लाभ होगा।

3 डी पुनर्निर्माण के लिए सीरियल अल्ट्रामाइक्रोटॉमी को पहले चुनौतीपूर्ण माना जाता है। यहां तक कि अनुभाग मोटाई के सीधे रिबन को काटना मुश्किल था, सही आकार के रिबन को व्यवस्थित करने और लेने में सक्षम होना, सही क्रम में, पर्याप्त समर्थन के साथ ग्रिड पर, लेकिन ग्रिड सलाखों के बिना ब्याज के क्षेत्रों को अस्पष्ट करना, और सबसे महत्वपूर्ण बात, वर्गों को खोने के बिना, क्योंकि एक अधूरी श्रृंखला पूर्ण 3 डी पुनर्निर्माण21 को रोक सकती है। हालांकि, वाणिज्यिक ultramicrotomes, हीरे काटने और ट्रिमिंग चाकू22,23, ग्रिड 21,24 पर इलेक्ट्रॉन lucent समर्थन फिल्मों के लिए सुधार, और अनुभाग आसंजन और रिबन संरक्षण13,21 की सहायता के लिए चिपकने वाला सिर्फ कुछ वृद्धिशील अग्रिमों है कि कई प्रयोगशालाओं में तकनीक और अधिक नियमित बना दिया है में से कुछ हैं. एक बार धारावाहिक वर्गों को एकत्र किए जाने के बाद, टीईएम में सीरियल इमेजिंग सीधा है और एक्स और वाई में सबनैनोमीटर पीएक्स आकार के साथ ईएम छवियां प्रदान कर सकता है, जिससे उपकोशिकीय संरचनाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन पूछताछ की अनुमति मिलती है- कई शोध प्रश्नों के लिए एक संभावित आवश्यकता। यहां प्रस्तुत केस स्टडी यकृत हेपेटोसाइट्स में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) -ऑर्गेनेल संपर्कों के अध्ययन में एसएसटीईएम और 3 डी पुनर्निर्माण के उपयोग को दर्शाता है, जहां ईआर-ऑर्गेनेल संपर्कों को पहली बार25,26 देखा गया था।

परमाणु लिफाफे के साथ सन्निहित होने के दौरान, ईआर लाइसोसोम, माइटोकॉन्ड्रिया, लिपिड बूंदों और प्लाज्मा झिल्ली27 सहित कई अन्य सेल ऑर्गेनेल के साथ घनिष्ठ संपर्क भी बनाता है। ईआर-ऑर्गेनेल संपर्कों को लिपिड चयापचय28, फॉस्फोइनोसिटाइड और कैल्शियम सिग्नलिंग29, ऑटोफैगी विनियमन और तनाव प्रतिक्रिया30,31 में फंसाया गया है। ईआर-ऑर्गेनेल संपर्क और अन्य इंटरऑर्गेनेल संपर्क अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं जो सेलुलर चयापचय की जरूरतों और बाहरी संकेतों का जवाब देती हैं। उन्हें उनके आकार और आकार और ऑर्गेनेल झिल्ली के बीच की दूरी में रूपात्मक रूप से भिन्न दिखाया गया है32,33। यह माना जाता है कि ये अल्ट्रास्ट्रक्चरल अंतर उनके विभिन्न प्रोटीन / लिपिड रचनाओं और कार्य34,35 को प्रतिबिंबित करने की संभावना रखते हैं। हालांकि, इंटरऑर्गेनेल संपर्कों को परिभाषित करना और उनका विश्लेषण करना अभी भी एक चुनौतीपूर्ण कार्यहै। इसलिए, आगे की जांच के लिए इंटरऑर्गेनेल संपर्कों की जांच और विशेषता के लिए एक विश्वसनीय अभी तक सरल प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।

चूंकि ईआर-ऑर्गेनेल संपर्क झिल्ली-से-झिल्ली अलगाव में 10 से 30 एनएम तक हो सकते हैं, इसलिए पहचान के लिए सोने का मानक ऐतिहासिक रूप से टीईएम रहा है। थिन-सेक्शन टीईएम ने अलग-अलग झिल्ली संपर्कों37 पर निवासी ईआर प्रोटीन के लिए विशिष्ट उपडोमेन स्थानीयकरण का खुलासा किया है। परंपरागत रूप से, इसने एनएम रिज़ॉल्यूशन के साथ ईआर-ऑर्गेनेल संपर्कों का खुलासा किया है, लेकिन अक्सर इन इंटरैक्शन का केवल 2 डी दृश्य प्रस्तुत किया जाता है। हालांकि, वीईएम दृष्टिकोण 3 डी में इन संपर्क साइटों की अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्रस्तुति और संदर्भ को प्रकट करते हैं, जिससे संपर्कों का पूर्ण पुनर्निर्माण और संपर्कों का अधिक सटीक वर्गीकरण (बिंदु बनाम ट्यूबलर बनाम टंकी की तरह) और परिमाणीकरण38,39 हो जाता है। पहला सेल प्रकार होने के अलावा जहां ईआर-ऑर्गेनेलसंपर्कों को 25,26 देखा गया था, हेपेटोसाइट्स में अन्य इंटरऑर्गेनेल संपर्कों की एक व्यापक प्रणाली होती है जो उनकी वास्तुकला और शरीर विज्ञान28,40 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हालांकि, हेपेटोसाइट्स में ईआर-ऑर्गेनेल और अन्य इंटरऑर्गेनेल संपर्कों के पूरी तरह से रूपात्मक लक्षण वर्णन में अभी भी कमी है। तदनुसार, पुनर्जनन और मरम्मत के दौरान इंटरऑर्गेनेल संपर्क कैसे बनते हैं और फिर से तैयार होते हैं, हेपेटोसाइट जीव विज्ञान और यकृत समारोह के लिए विशेष प्रासंगिकता है।

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Protocol

सभी जानवरों को यूके होम ऑफिस के दिशानिर्देशों के अनुसार रखा गया था, और यूके एनिमल (वैज्ञानिक प्रक्रियाएं) अधिनियम 1986 के अनुसार ऊतक कटाई की गई थी।

1. नमूना निर्धारण और तैयारी

  1. जिगर के ऊतकों को उचित आकार के टुकड़ों में विच्छेदित करें, लगभग 8 मिमी x 8 मिमी x 3 मिमी, और टुकड़ों को गर्म फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस, 37 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
  2. जिगर के टुकड़ों में कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) फिक्सेटिव (1% सुक्रोज में 1.5% ग्लूटाराल्डिहाइड, 0.1 एम सोडियम कोकोडिलेट) इंजेक्ट करें और उन्हें पीबीएस से कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक फिक्सेटिव में स्थानांतरित करें। सूखने से बचने के लिए ऊतक को हमेशा समाधान में डूबा रखें।
    नोट: एल्डिहाइड्स अड़चन हैं जो संक्षारक और संभावित रूप से कार्सिनोजेनिक हैं। सोडियम कोकोडिलेट विषाक्त है यदि निगल लिया जाता है या साँस लिया जाता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते समय सभी फिक्सेटिव को संभाला जाना चाहिए, और प्रयोग को धुएं के हुड में किया जाना चाहिए। अच्छा निर्धारण एक मजबूत ऊतक में परिणाम होगा।
  3. एक ब्लेड, बर्फ स्नान, और एक ठंडे पीबीएस से भरे बफर ट्रे के साथ हिल माइक्रोटोम सेट करें। cyanoacrylate गोंद के साथ एक नमूना धारक पर निश्चित जिगर ऊतक के पहले टुकड़े माउंट और हिल माइक्रोटोम करने के लिए ब्लॉक हस्तांतरण।
  4. निर्माता की सिफारिशों के बाद, ऊतक से संपर्क करें और निश्चित जिगर को 100 μm-मोटी स्लाइस में स्लाइस करें।
  5. एक स्पैटुला या प्राकृतिक बाल पेंटब्रश का उपयोग करके स्लाइस एकत्र करें और उन्हें बर्फ पर बर्फ-कोल्ड फिक्स (1.5% ग्लूटाराल्डिहाइड, 0.1 एम सोडियम कोकोडिलेट) वाले 12- या 24-अच्छी तरह से पकवान में स्थानांतरित करें। स्लाइस को बर्फ पर तब तक छोड़ दें जब तक कि सभी नमूनों को कटा हुआ न कर दिया जाए और आगे संसाधित होने के लिए तैयार न हो जाएं।
  6. आगे प्रसंस्करण के लिए ब्याज के क्षेत्रों वाले स्लाइस का चयन करें और कोमल आंदोलन के साथ धोएं। कमरे के तापमान 0.1 एम सोडियम cacodylate के साथ एक 12- या 24-अच्छी तरह से पकवान में तीन, 5 मिनट धोने का प्रदर्शन करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि स्लाइस में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त बफर है।
    नोट: सामान्य तौर पर, रुचि के क्षेत्रों को अध्ययन के जैविक प्रश्न से संबंधित शारीरिक विशेषताओं के आधार पर चुना जाता है और ऊतक के क्षेत्रों द्वारा निर्देशित किया जाता है जो पूरी श्रृंखला में मौजूद होने की संभावना है, उदाहरण के लिए, अनुभाग के किनारे पर नहीं, और जो अच्छी तरह से संरक्षित हैं।
  7. एक धुएं हुड में, 0.1 एम सोडियम कैसोडिलेट को ताजा तैयार 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड / 1.5% पोटेशियम फेरिसाइनाइड के साथ बदलें। एक सीलबंद कंटेनर में 12- या 24-अच्छी तरह से पकवान रखें और कंटेनर को 1 घंटे के लिए खतरनाक-रसायनों के फ्रिज में स्थानांतरित करें।
    नोट: ऑस्मियम अंतर्ग्रहण, साँस लेने और त्वचा के संपर्क के मामले में बेहद खतरनाक है। पोटेशियम फेरिसाइनाइड एक अड़चन है और साँस लेने और त्वचा के संपर्क से हानिकारक है। हमेशा उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करके संभालें, और धुएं के हुड में प्रयोग करें।
  8. एक धुएं के हुड में, एक समर्पित ऑस्मियम अपशिष्ट बोतल में ऑस्मियम टेट्रोक्साइड / पोटेशियम फेरिसाइनाइड को हटा दें, और 0.1 एम सोडियम कोकोडिलेट के साथ 5 मिनट के लिए नमूनों को तीन बार धोएं। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक सील कंटेनर में छोड़ दें।
    नोट:: संभावित विराम बिंदु। नमूनों को 0.1 एम सोडियम कैसोडिलेट में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सीलबंद कंटेनर में संरक्षित करने के लिए थोड़ा नुकसान के साथ हफ्तों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि सूखने को रोकने के लिए पर्याप्त बफर है।
  9. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 45 मिनट के लिए 0.05 एम सोडियम cacodylate में ताजा तैयार 1% टैनिक एसिड के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: टैनिक एसिड एक अड़चन है और आंखों की क्षति का कारण बन सकता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और एक धुएं के हुड में प्रयोग करें।
  10. निर्जलीकरण और एम्बेडिंग से पहले डीडीएच2ओ के साथ तीन 5 मिनट धोने का प्रदर्शन करें।

2. नमूना निर्जलीकरण, Epon राल एम्बेडिंग, और बढ़ते

  1. वजन से निम्नलिखित अनुपात के अनुसार एपॉन राल तैयार करें (चरण 2.2 देखें)। एक हलचल पट्टी युक्त एक 100 mL डिस्पोजेबल प्लास्टिक बीकर के साथ एक संतुलन तारे. 5 डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट्स से सिरों को काटें और बीकर में चिपचिपा राल घटकों को स्थानांतरित करने के लिए इनका उपयोग करें।
  2. अनुक्रमिक रूप से राल-812 के 19.2 ग्राम, DDSA के 7.6 ग्राम, MNA के 13.2 ग्राम, और बीकर में DMP-30 त्वरक के 0.8 ग्राम जोड़ें। पांचवें साफ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, हाथ से राल घटकों को अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: बुलबुले पेश करने से बचें, लेकिन एक रंग परिवर्तन और घटक परतों के किसी न किसी मिश्रण को प्राप्त करने के लिए शीर्ष के साथ नीचे राल के पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करें। सभी राल घटकों में अड़चन होती है और साँस लेना और त्वचा के संपर्क से हानिकारक होती है। डीएमपी -30 संक्षारक है और त्वचा के क्षरण का कारण बन सकता है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  3. बीकर को चुंबकीय हलचल पर रखें और धीरे-धीरे हलचल करने के लिए छोड़ दें, समय-समय पर राल को मैन्युअल रूप से मिलाते हैं।
  4. 70% इथेनॉल के साथ 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ नमूनों को धोएं; एक बार दोहराएं।
  5. 90% इथेनॉल के साथ 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ नमूनों को धोएं; एक बार दोहराएं।
  6. 100% इथेनॉल के साथ 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ नमूनों को धोएं; एक बार दोहराएं।
  7. जबकि नमूने एक धुएं के हुड में 100% इथेनॉल धोने में हैं, एक 50: 50 (वी / वी) प्रोपलीन ऑक्साइड (पीओ): एक प्रोपलीन ऑक्साइड (पीओ) -प्रतिरोधी प्लास्टिक ढक्कन के साथ एक कांच की शीशी में एपोन मिश्रण तैयार करें। ध्यान से लेकिन सुरक्षित रूप से कांच की शीशी के ढक्कन पर क्लिप, और ढक्कन और शीशी दोनों को पकड़ते समय, मिश्रण करने के लिए शेक या भंवर।
    नोट: प्रोपलीन ऑक्साइड एक तीव्र विषाक्त, ज्वलनशील अड़चन है जो कुछ प्लास्टिक को भंग कर देता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और एक धुएं के हुड में प्रयोग करें।
  8. चरण 2.6 के बाद, पीओ के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें: एक पीओ-प्रतिरोधी कंटेनर (जैसे, एल्यूमीनियम ट्रे या ग्लास शीशियों) में 1 घंटे के लिए एपॉन, धुएं के हुड में कोमल रॉकिंग / आंदोलन के साथ।
  9. धुएं के हुड में, नमूनों को 100% एपॉन में स्थानांतरित करें। रॉकिंग / रोटेशन / आंदोलन के साथ धुएं के हुड में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पीओ: Epon मिश्रण एक समर्पित ग्लास Epon अपशिष्ट बोतल के लिए स्थानांतरण.
  10. चरण 2.9 को एक बार दोहराएं।
  11. एम्बेड करने के लिए नमूने माउंट करें. स्लाइस के आकार और ब्याज के क्षेत्र के आधार पर, सीधे स्लाइस को प्रीपॉलिमराइज्ड राल स्टब्स पर माउंट करें या विच्छेदन के लिए उन्हें फ्लैट-एम्बेड करें और बाद की तारीख में उन्हें फिर से एम्बेड करें।
    नोट:: फ्लैट-एम्बेडिंग के लिए, एक "कास्ट-ए स्लाइड" का उपयोग एक साथ कई स्लाइस एम्बेड करने के लिए किया जा सकता है। बचे हुए राल का उपयोग बीम कैप्सूल को भरने के लिए किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए प्रीपॉलिमराइज्ड स्टब्स या जमे हुए बनाने के लिए बेक किया जा सकता है।
  12. एक बार घुड़सवार और पर्याप्त राल में कवर करने के लिए "कास्ट-ए स्लाइड" गुहा को भरने के लिए, 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रात भर नमूनों को सेंकना।
    नोट:: संभावित विराम बिंदु। नमूनों को वर्षों तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  13. फिर से एम्बेड करने के लिए, फ्लैट एम्बेडेड ऊतक स्लाइस में रुचि के क्षेत्र की पहचान करें। एक जौहरी की आरी का उपयोग करते हुए, उपयुक्त आकार (1 मिमी 2 से 4 मिमी 2) के ऊतकके टुकड़े को काट लें और तैयार राल का उपयोग करके फिर से एम्बेड करें, जैसा कि चरण 2.2 में, एक प्रीपॉलिमराइज्ड ब्लॉक के शीर्ष पर और 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रात भर सेंकना।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ऊतक के टुकड़े को दो-भाग एपॉक्सी राल के साथ एक स्टब या पिन से चिपकाया जा सकता है। रात भर सेट करने के लिए छोड़ दें। संभावित विराम बिंदु.

3. Trimming और एम्बेडेड नमूनों के सीरियल सेक्शनिंग

नोट: सेक्शनिंग एक सीखा कौशल है; उपयोगकर्ताओं को सीरियल सेक्शनिंग का प्रयास करने से पहले अल्ट्राथिन सेक्शनिंग में कुशल होना चाहिए। जैसा कि सटीक माइक्रोटोम नियंत्रण निर्माताओं में भिन्न होते हैं, निर्माता के निर्देशों और दिशानिर्देशों का पालन करें।

  1. ट्रिमिंग एडेप्टर में बंद नमूने के साथ, निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करने के लिए राल एम्बेडेड ऊतक को सावधानीपूर्वक ट्रिम करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें ( चित्रा 1 ए, बी देखें):
    1. सुनिश्चित करें कि ब्याज के क्षेत्र के आसपास ऊतक को उजागर करने वाली एक सपाट, शीर्ष सतह है।
    2. ऊपर और नीचे किनारों के साथ एक trapezoid आकार सुनिश्चित करें साफ और समानांतर किया जा रहा है.
    3. x में 200-500 μm, y में 100-500 μm के समग्र आयाम सुनिश्चित करें।
    4. एक असममित ब्लॉक चेहरा सुनिश्चित करें, उदाहरण के लिए, ~ 90 ° के दाएं हाथ की ओर के कोने, शीर्ष बाएं कोने obtuse, और बाएं हाथ के नीचे कोने तीव्र।
      नोट: एक ट्रिमिंग क्रायोक्नाइफ एक रेजर ब्लेड के लिए एक वैकल्पिक उपकरण हो सकता है। अन्य सिफारिशें इमेजिंग करते समय अनुभागों को ऑर्डर करने के लिए उपयोगकर्ता की सुविधा के लिए हैं। वैकल्पिक: यदि अनुभाग स्थिर रिबन बनाने में विफल रहते हैं, तो रिबन गठन में सहायता के लिए ब्लॉक चेहरे के अग्रणी किनारे पर एक संपर्क सीमेंट लागू किया जा सकता है। रेजर ब्लेड तेज होते हैं; रेजर ब्लेड को पकड़ने के लिए ध्यान रखें जैसे कि आकस्मिक फिसलन के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत नुकसान होने की संभावना नहीं है।

Figure 1
चित्र 1: सीरियल अनुभाग TEM वर्कफ़्लो. (A) राल ब्लॉक में नमूने का आरेख. (बी) ज्ञात अभिविन्यास सुनिश्चित करने के लिए सीरियल सेक्शनिंग और असममित ब्लॉक फेस के लिए उपयुक्त किनारों के साथ एक ट्रेपोज़ॉइड आकार उत्पन्न करने के लिए ब्लॉक ट्रिम करें। (C) हीरे की चाकू नाव में पानी की सतह पर तैरते हुए सीरियल सेक्शन के रिबन को दर्शाने वाला आरेख। (डी) 3 मिमी व्यास टीईएम स्लॉट ग्रिड पर अनुभाग और रिबन संगठन, अनुभागों के क्रम को दर्शाने वाला आरेख। (ई) टीईएम इमेजिंग और नेविगेशन। रिबन और अनुभाग क्रम दिखा रहा है और स्क्रीन संदर्भित करने के लिए मॉनिटर पर "पीले स्टार स्टिकर" का उपयोग करके बाद के अनुभागों में रुचि के एक ही क्षेत्र का पुनर्निर्माण सुनिश्चित करने के लिए। (च) छवि संरेखण और फसल। (जी) विभाजन, 3 डी पुनर्निर्माण, और विज़ुअलाइज़ेशन। संक्षिप्त नाम: TEM = संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एक बार छंटनी करने के बाद, नमूना चाप को स्थानांतरित करें, चक और नमूने के साथ, माइक्रोटोम के नमूना हाथ में, नमूना चाप की स्थिति में ताकि चाप की यात्रा सीमा ऊपर से नीचे तक चले; जगह में नमूना चाप सुरक्षित.
  2. चाकू धारक में हीरे के चाकू को रखें और लॉक करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि काटने का कोण चाकू के लिए उचित रूप से सेट किया गया है। चाकू धारक को सुरक्षित रूप से मंच में बंद कर दें।
  3. मंच uplighting के साथ, चाकू अग्रिम का उपयोग करें, जबकि लगातार ब्लॉक चेहरे और चाकू के किनारे के बीच संबंध की जांच. सावधानी से नमूने की ओर चाकू को आगे बढ़ाएं, लगातार चाकू के पार्श्व कोण, नमूना झुकाव और नमूना रोटेशन को समायोजित करते हुए प्रासंगिक knobs को समायोजित करके जब तक कि ब्लॉक को चाकू के किनारे पर संरेखित नहीं किया जाता है।
  4. मंच uplighting बंद करें; मंच downlighting चालू; नमूना हाथ की काटने की खिड़की के ऊपर और नीचे सेट; और चाकू के किनारे के नीचे ही नमूने को छोड़ दें।
  5. चाकू नाव को साफ डीडीएच2ओ से भरें और सुनिश्चित करें कि पानी की सतह चाकू के किनारे और बस थोड़ा अवतल के साथ स्तर पर है।
  6. वैकल्पिक: 0.1% ट्राइटन एक्स -100 में एक बरौनी डुबकी और फिर चाकू नाव के पानी में क्लोरोफॉर्मिंग और रिबन पिकअप की सहायता के लिए पानी की सतह के तनाव को कम करने के लिए।
  7. eyelashes (एक कॉकटेल छड़ी से चिपके हुए eyelash), formvar-लेपित स्लॉट ग्रिड, क्रॉसओवर संदंश लेबल, क्लोरोफॉर्म, 0.1% Triton X-100 समाधान, आसुत पानी, फिल्टर कागज, और ग्रिड बॉक्स नोट्स के साथ ग्रिड बॉक्स के साथ वर्कस्टेशन तैयार करें।
  8. 1 मिमी / सेकंड पर काटने की गति और प्रारंभिक काटने की मोटाई को 100 एनएम पर सेट करें और काटने का चक्र शुरू करें।
  9. पहले अनुभाग में कटौती के बाद, काटने के मापदंडों को 0.8 मिमी / सेकंड पर काटने की गति और काटने की मोटाई को 70 एनएम तक बदलें, और काटना जारी रखें, जिससे वर्गों को पानी से भरी चाकू नाव (चित्रा 1 सी) की सतह के नीचे जाने वाले रिबन बनाने की अनुमति मिलती है।
    नोट: उत्पादित किए जा रहे अनुभागों के रंग के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह अक्सर राल वर्गों की मोटाई के लिए एक अधिक सटीक मार्गदर्शिका होती है। चांदी के खंड आमतौर पर लगभग 70 एनएम मोटे होते हैं, जबकि ग्रे सेक्शन पतले होते हैं और सोने के खंड मोटे होते हैं।
  10. माइक्रोटोम को अनुभागों को काटना जारी रखने की अनुमति दें और रिबन को लंबे समय तक प्राप्त करने के लिए।
    नोट: कमरे में बड़े कंपन और शारीरिक गड़बड़ी से बचना महत्वपूर्ण है। ड्राफ्ट चाकू नाव में पानी की सतह पर वर्गों को स्थानांतरित करने का कारण बन सकते हैं, और भौतिक कंपन माइक्रोटोम को असमान रूप से काटने का कारण बन सकते हैं।
  11. एक बार जब पर्याप्त वर्गों को एकत्र किया जाता है और इससे पहले कि रिबन नाव के अंत तक पहुंच जाए, काटने को रोकें (नमूने के चाकू के किनारे को पारित करने के तुरंत बाद)।
    नोट:: आवश्यक अनुभागों की संख्या ब्लॉक चेहरे के आकार और एकत्र किए जाने वाले डेटासेट के आकार पर निर्भर करती है। इस प्रकार, ब्लॉक के आकार और स्लॉट ग्रिड के बीच संबंधों के बारे में पता होना उपयोगी है क्योंकि कट अनुभाग बंद हो रहे हैं।
  12. प्रत्येक हाथ में एक बरौनी का उपयोग करके, धीरे से रिबन को छोटे रिबन में तोड़ दें जो स्लॉट ग्रिड की लंबाई में फिट हो सकते हैं, नमूने के भीतर से अपने सापेक्ष पदों का एक नोट बनाने के लिए ध्यान रखते हैं।
    नोट: यदि उनकी संयुक्त चौड़ाई फिट बैठती है, तो एकाधिक रिबन को धीरे-धीरे एक-दूसरे के बगल में रखा जा सकता है और एक स्लॉट ग्रिड में एक साथ उठाया जा सकता है। यदि एक स्लॉट ग्रिड पर एकाधिक रिबन उठाते हैं, तो रिबन के आदेश और सापेक्ष स्थिति पर ध्यान दें। उदाहरण के लिए, हमेशा रिबन को नमूने में पहले से ही नमूने (चित्रा 1 डी) में पहले से ही रिबन के दाईं ओर रखें।
  13. वैकल्पिक: एक ग्लास एप्लिकेटर रॉड का उपयोग करके, उन्हें समतल करने के लिए वर्गों पर क्लोरोफॉर्म की एक बूंद होवर करें।
    नोट: क्लोरोफॉर्म विषाक्त और एक अड़चन है। क्लोरोफॉर्म को पानी की सतह या वर्गों को छूने न दें। यदि यह गलती से होता है, तो पानी को हटाने की आवश्यकता होती है और सेक्शनिंग पर लौटने से पहले चाकू को धोया जाता है। क्लोरोफॉर्म वर्गों को नुकसान पहुंचा सकता है और गोंद को नीचा दिखा सकता है जो हीरे को चाकू की नाव में सुरक्षित करता है।
  14. पहले क्रमांकित संदंश का उपयोग करते हुए, पहले खाली स्लॉट ग्रिड को उठाएं (स्लॉट के दाईं ओर, फॉर्मवार साइड डाउन), धीरे से ट्राइटन एक्स -100 में डुबकी लगाएं, और फिर फ़िल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करके संदंश किनारे से अतिरिक्त पानी को हटाने से पहले आसुत पानी में दो बार।
  15. एक हाथ में एक बरौनी और दूसरे हाथ में संदंश के साथ, धीरे-धीरे चाकू नाव के पानी में फॉर्मवार-लेपित स्लॉट ग्रिड के लगभग 2/3rd को कम करें (वर्गों से दूर), ताकि फॉर्मवर पक्ष नीचे की ओर सामना कर रहा हो, और स्लॉट का दाहिना हाथ लंबा किनारा पानी की सतह पर और पानी के किनारे के समानांतर हो।
  16. धीरे से रिबन की ओर पानी में ग्रिड waft इतना है कि वापसी स्ट्रोक पर, वर्गों ग्रिड की ओर बहाव. छोटे और छोटे wafts में ऐसा करना जारी रखें जब तक कि रिबन के दाहिने हाथ के किनारे स्लॉट के दाहिने हाथ के किनारे के साथ लाइनों। फिर, अंतिम वाफ्ट के साथ, धीरे से ग्रिड को स्लॉट ग्रिड में वर्गों को लेने के लिए लाएं।
  17. ग्रिड बॉक्स में संग्रहीत करने से पहले ग्रिड को सूखने के लिए संदंश में छोड़ दें, ग्रिड बॉक्स संदर्भ पत्रक पर उचित रूप से एनोटेट किया गया है।
  18. चरण 3.16 को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी रिबन एकत्र नहीं किए जाते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि रिबन का क्रम बनाए रखा गया है।
  19. यदि आगे के वर्गों की आवश्यकता होती है, तो चाकू को 150 एनएम या तो वापस लें, नाव में पानी के स्तर की जांच करें, और यदि आवश्यक हो तो अधिक जोड़ें। 3.11-3.18 चरणों का पालन करते हुए, काटने की प्रक्रिया फिर से प्रारंभ करें।
  20. एक बार जब सभी वर्गों को एकत्र कर लिया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि चाकू का किनारा अनुभाग मलबे से मुक्त है, चाकू को ब्लॉक चेहरे से दूर निकालें, और चाकू को हटा दें और साफ करें।

4. ग्रिड धुंधला

  1. एक बार सूखने के बाद, रेनॉल्ड्स के लीड साइट्रेट के साथ वर्गों को या तो बेंच पर पैराफिल्म पर या पेट्री डिश में दाग दें। कार्बन डाइऑक्साइड मुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए पेट्री डिश ढक्कन के नीचे सोडियम हाइड्रॉक्साइड के कई छर्रों को रखें। फिर, ध्यान से, छर्रों से दूर, पैराफिल्म पर रेनॉल्ड्स के लीड साइट्रेट की पिपेट 40 μL बूँदें, प्रत्येक ग्रिड के लिए एक।
    नोट: एक बार में बहुत सारे ग्रिड दाग मत करो; उदाहरण के लिए, अधिकतम 6 होना चाहिए। स्टेनिंग डिश पर सीधे सांस लेने की कोशिश न करें। कार्बन डाइऑक्साइड लीड साइट्रेट के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है और ग्रिड पर अवांछित अवक्षेप का कारण बन सकता है।
  2. लीड साइट्रेट ड्रॉप पर प्रत्येक ग्रिड (अनुभाग पक्ष नीचे) को उलटें और 7 से 10 मिनट के लिए पेट्री डिश ढक्कन द्वारा संरक्षित छोड़ दें। जबकि ग्रिड धुंधला हो रहे हैं, प्रत्येक ग्रिड के लिए आसुत पानी की पांच 300 μL बूंदों के साथ बेंच पर पैराफिल्म का एक बड़ा दूसरा टुकड़ा तैयार करें।
  3. लीड साइट्रेट इनक्यूबेशन के अंत में, ग्रिड पर सीधे सांस लेने के बिना 1 मिनट के लिए धोने के लिए प्रत्येक ग्रिड को आसुत पानी की एक बूंद पर स्थानांतरित करें।
  4. चरण 4.3 को कुल पांच बार दोहराएं।
  5. गिने हुए क्रॉसओवर संदंश का उपयोग करके, पहले ग्रिड को उठाएं, अधिकांश पानी को दूर करने के लिए कागज को फ़िल्टर करने के लिए ग्रिड के किनारे को स्पर्श करें, और संदंश (कम से कम 20 मिनट के लिए) में सूखने की अनुमति दें। प्रत्येक ग्रिड के लिए दोहराएँ।

5. टीईएम द्वारा इमेजिंग अधिग्रहण

नोट:: के रूप में सटीक TEM नियंत्रण निर्माताओं भर में भिन्न होते हैं, निर्माता के निर्देशों और दिशानिर्देशों का पालन करें। निम्न चरणों को उन उपयोगकर्ताओं द्वारा किया जाना चाहिए जो पहले से ही TEM उपयोग में कुशल हैं।

  1. इमेजिंग से पहले, सामान्य जांच करें, उदाहरण के लिए, बीम संरेखण, लाभ संदर्भ, और नमूना eucentricity।
  2. नमूना धारक में सीरियल वर्गों के पहले ग्रिड को सावधानीपूर्वक लोड करें, स्लॉट (और इसलिए वर्गों) को माइक्रोस्कोप चरण के ऊर्ध्वाधर अक्ष पर संरेखित करने का ध्यान रखें।
    नोट:: यह सटीकता आवश्यक नहीं है, लेकिन अधिग्रहण और भविष्य के डेटा हैंडलिंग चरणों के दौरान समय बचाता है। ग्रिड डालते समय (अनुभाग पक्ष नीचे या अनुभाग पक्ष ऊपर), एक ही अभिविन्यास में सभी ग्रिड छवि करने के लिए ध्यान रखें।
  3. कम आवर्धन पर, क्रम, स्थान, और सीरियल अनुभागों की स्थिति का निरीक्षण करें (चित्रा 1E)। ग्रिड पर श्रृंखला के मध्य अनुभाग पर नेविगेट करें.
    नोट: सटीक अनुसंधान उद्देश्य के आधार पर, इमेजिंग के लिए दृष्टिकोण भिन्न हो सकते हैं; हालांकि, निम्नलिखित एक उपयोगी प्रारंभिक बिंदु है। अनुभागों का आकार और रिबन का संबंध (जैसा कि चरण 3.14 में उठाया गया है) यह निर्धारित करता है कि कौन सा अनुभाग पहले था और कौन सा अनुभाग ग्रिड पर अंतिम था।
  4. नमूना ब्राउज़ करें और रुचि के एक क्षेत्र की पहचान करें। वांछित आवर्धन पर नमूने का निरीक्षण करें, और श्रृंखला को थोड़ा कम आवर्धन पर इकट्ठा करने पर विचार करें, क्योंकि अनुभाग अक्सर पूरी तरह से संरेखित नहीं होते हैं, और छवियों को बाद में क्रॉप करने की आवश्यकता हो सकती है।
  5. ब्याज के क्षेत्र के संदर्भ की सराहना करने के लिए कम आवर्धन पर संदर्भ छवियों को लें, अनुभाग सीमाओं के संबंध में विभिन्न आवर्धन पर इसका मोटा स्थान, और नमूने के भीतर ऐतिहासिक विशेषताएं। अन्य अनुभागों में रुचि के क्षेत्र को साइन-पोस्ट करने के लिए इनका उपयोग करें।
  6. वैकल्पिक: स्क्रीन संदर्भित करने के लिए, पुन: प्रयोज्य चिपकने वाला पुट्टी, स्टिकर, या ओवरहेड प्रोजेक्टर (OHP) पेपर का एक टुकड़ा का उपयोग करें, स्क्रीन पर टेप किया गया, स्क्रीन पर अस्थायी मार्करों को रखने के लिए छवि के केंद्र में रुचि के क्षेत्र की समान विशेषताओं की नियमित पुनरावृत्ति की अनुमति देने के लिए, पूरे डेटासेट में ( चित्रा 1 ई में पीले सितारे देखें)।
  7. संदर्भ छवियों का उपयोग करके, ग्रिड के पहले खंड पर ब्याज के क्षेत्र में नेविगेट करें, और वांछित आवर्धन पर एक छवि प्राप्त करें।
    नोट:: छवियों को सहेजते समय, श्रृंखला की पहली छवि का पहला फ़ाइल नाम नोट करें, और अनुक्रमिक नामकरण नामकरण नामकरण का उपयोग करें ताकि सभी छवि नाम सीरियल अनुभागों के अनुक्रमिक क्रम का पालन करें।
  8. अगले अनुभाग पर नेविगेट करें और चरण 5.7 को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी अनुभागों को ब्याज के उस क्षेत्र के लिए चित्रित नहीं किया गया है।

6. छवि निर्यात और सीरियल अनुभाग संरेखण पंजीकरण

  1. एक ही स्टैक से संबंधित छवि फ़ाइलों को एक ही फ़ोल्डर में निर्यात करें। सुनिश्चित करें कि फ़ोल्डर फ़ाइल नाम से सॉर्ट किया गया है।
    नोट: छवियों को आदर्श रूप से एक ही रूट नाम होना चाहिए और उस क्रम का पालन करें जिसमें उन्हें अधिग्रहित किया गया है।
  2. फिजी खोलें और फाइल | पर क्लिक करें | आयात करें छवि अनुक्रम.
  3. फ़ोल्डर की पहली छवि पर क्लिक करें और खोलें पर क्लिक करें। दृश्य विकल्पों की पॉपअप विंडो के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें (चित्र 2A).

Figure 2
चित्र 2: फिजी का उपयोग करके एक सीरियल स्टैक और सीरियल अनुभाग संरेखण का निर्माण. (A) सीरियल स्टैक बनाने के लिए छवियों को लोड करते समय अनुक्रम विकल्प दिखाते हुए स्क्रीनशॉट। (बी) TrackEM2 प्लगइन और प्लगइन की कुंजी खिड़कियों का स्क्रीनशॉट. संरेखण के साथ आगे बढ़ने के लिए स्लाइस पृथक्करण में ठीक दबाएँ । (C) दृश्य फलक में सीरियल स्टैक को सफलतापूर्वक लोड करने के बाद स्क्रीनशॉट. संरेखण पैरामीटर की तीन अनुक्रमिक खिड़कियां एक बार संरेखित स्टैक स्लाइस का चयन किए जाने के बाद पॉप अप होंगी। संरेखण पूरा होने के बाद संरेखित स्टैक निर्यात करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. नामों को संख्यात्मक रूप से सॉर्ट करें क्लिक करें | 8-बिट विकल्प में कनवर्ट करें. ठीक दबाएँ.
    नोट:: 8-बिट के लिए रूपांतरण अमीरा में डेटा के आयात एड्स और फ़ाइल आकार को कम कर देता है, बाद के चरणों में त्वरित प्रसंस्करण गति की अनुमति देता है।
  2. बनाए गए स्टैक की पूर्णता, अनुक्रम और आवर्धन की जाँच करें. बनाए गए स्टैक को .tif फ़ाइल के रूप में सहेजें.
    नोट: छवियों को एक ही आवर्धन पर अधिग्रहित किया जाना चाहिए था।
  3. TrakEM2 प्लगइन41 निष्पादित करें. फ़ाइल | पर जाएँ नई | TrackEM2 (रिक्त).
    नोट:: प्लगइन TrackEM2 फ़ाइलों को सहेजने के लिए उपयोगकर्ता से पूछेगा। यदि आवश्यक हो, तो TrackEM2 फ़ाइलों को छवि फ़ोल्डर में सहेजें। तीन खिड़कियां दिखाई देनी चाहिए: एक प्रोजेक्ट विंडो, एक स्टैक नेविगेशन (बाएँ) विंडो, और एक स्टैक विज़ुअलाइज़ेशन फलक (चित्र2B).
  4. काले विज़ुअलाइज़ेशन फलक पर राइट-क्लिक करें. आयात | क्लिक करें स्टैक आयात करें और पहले बनाए गए स्टैक का चयन करें.
  5. स्टैक नेविगेशन विंडो पर स्टैक लोड करने के लिए ठीक क्लिक करें।
    नोट:: एक स्लाइस पृथक्करण विंडो पिक्सेल और आयाम संबंध के लिए पूछने के लिए पॉप अप होगा। केवल स्टैक संरेखण के लिए, इस चरण को छोड़ने के लिए ठीक क्लिक करें.
  6. स्टैक के सभी स्लाइस की जाँच करने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें. लोड किए गए स्लाइस की तलाश करें, जो नेविगेशन योजना में पैच के रूप में दिखाई देगा। उन पैचों का चयन करें जो निम्न संरेखण में शामिल किए जाएँगे.
    नोट: चयनित पैच नीले हो जाएंगे।
  7. माउस को देखने वाले फलक पर होवर करें. छवि पर राइट-क्लिक करें, संरेखित करें | का चयन करें स्टैक स्लाइस संरेखित करें (चित्र 2C-1).
  8. तीन अनुक्रमिक विंडो के एक सेट के माध्यम से संरेखण पैरामीटर निर्दिष्ट करें।
    नोट:: अधिकांश डेटा के लिए, एक कठोर संरेखण के साथ शुरू करें (रोटेशन और अनुवाद के लिए अनुमति देता है लेकिन परिवर्तन नहीं) और डिफ़ॉल्ट (चित्रा 2C-2) के रूप में अन्य पैरामीटर रखें।
  9. संरेखण को चलाने की अनुमति दें जब तक कि रीडआउट लॉग का कहना है कि असेंबल किया गया है।
    नोट:: रनटाइम voxels की संख्या और कंप्यूटर की गति पर निर्भर करता है।
  10. देखने वाले फलक में संरेखित स्टैक की जाँच करें. संरेखित स्टैक के ज़ूम-आउट दृश्य के लिए Alt और - कुंजियाँ (PC में) या Ctrl और - कुंजियाँ (Mac में) दबाएँ.
  11. संरेखित स्टैक से संतुष्ट होने पर, निर्यात | पर राइट-क्लिक करें संरेखित स्टैक को सहेजने के लिए सपाट छवि बनाएँ.
  12. स्टैक के प्रारंभ के रूप में पहली छवि का चयन करें और स्टैक के अंत के रूप में अंतिम छवि का चयन करें, ठीक (चित्र 2C-3) क्लिक करें. संरेखित स्टैक को .tif के रूप में सहेजें.
    नोट:: फ़ाइल का आकार कम करने के लिए, केवल ब्याज के आवश्यक क्षेत्र को शामिल करने के लिए डेटा क्रॉप करें।
  13. यदि आवश्यक हो, तो संरेखित स्टैक पर एक affine संरेखण निष्पादित करें। फिजी में संरेखित स्टैक खोलें, प्लगइन | का चयन करें पंजीकरण | स्टैकरेग।
  14. affine विकल्प चुनें और ठीक दबाएँ. प्रोग्राम पूरा होने तक प्रतीक्षा करें।
  15. किसी भिन्न फ़ाइल नाम के साथ affine-संरेखित स्टैक सहेजें।

7. विभाजन और 3 डी पुनर्निर्माण

  1. खुला अमीरा42. फ़ाइल | क्लिक करें संरेखित स्टैक लोड करने के लिए डेटा खोलें.
  2. नई पॉपअप विंडो (चित्र3A) में voxel माप निर्दिष्ट करें।

Figure 3
चित्र 3: अमीरा का उपयोग करके सीरियल स्टैक का विभाजन. (A) संरेखित स्टैक लोड करने से पहले Voxel परिभाषा पॉपअप विंडो. (बी) एक स्टैक के आयात के बाद परियोजना इंटरफ़ेस का स्क्रीनशॉट। सेगमेंटेशन संपादक पैनल में ऑब्जेक्ट ट्रेसिंग प्रारंभ करने के लिए सेगमेंटेशन टैब का चयन करें। (C) विभाजन टैब की प्रमुख विशेषताएं. सेगमेंटेशन टैब के सेगमेंटेशन संपादक अनुभाग में सेगमेंटेशन के लिए ऑब्जेक्ट्स निर्धारित करें. ऑब्जेक्ट्स की पहचान में सहायता करने के लिए ज़ूम फ़ंक्शन का उपयोग करें. ब्रश उपकरण का चयन करें और ऑब्जेक्ट की सीमा का पता लगाएं। ट्रेस असाइन करने के लिए चयन के अंतर्गत + प्रतीक क्लिक करें. एक असाइन की गई वस्तु ऑर्थोस्लाइस देखने वाले फलक में एक लाल सीमा के लिए प्रकट होगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नोट:: एक छवि स्टैक नोड प्रोजेक्ट इंटरफ़ेस में दिखाई देगा, और एक orthoslice दाईं ओर देखने फलक में दिखाई देगा (चित्रा 3B)।

  1. विभाजन प्रारंभ करने के लिए, सेगमेंटेशन टैब (चित्र 3B) का चयन करें.
    नोट:: यह विभाजन प्रगति से पहले और विभाजन के दौरान सहेजने के लिए अनुशंसित है। मॉडल | पर जाएँ किसी भी .am फ़ाइल है कि सूट के रूप में मॉडल सहेजें ।
  2. सामग्री सूची में नए ऑब्जेक्ट्स को परिभाषित करने के लिए विभाजन संपादक पैनल में नया क्लिक करें. ऑब्जेक्ट का रंग बदलने के लिए राइट-क्लिक करें और ऑब्जेक्ट का नाम बदलने के लिए डबल-क्लिक करें.
  3. मैन्युअल विभाजन के लिए, सामग्री सूची के नीचे विभाजन उपकरण चुनें. पिक्सेल (चित्रा 3C) को हाइलाइट करने के लिए डिफ़ॉल्ट ब्रश उपकरण का चयन करें.
    नोट:: वैकल्पिक रूप से, ऑब्जेक्ट की बाह्यरेखा का पता लगाने के लिए ब्रश उपकरण का उपयोग करें और ऑब्जेक्ट को भरने के लिए Shift + F दबाएँ।
  4. ब्रश उपकरण को इरेज़र में कनवर्ट करने के लिए, सुधार के लिए पिक्सेल का चयन करते समय Ctrl को लगातार दबाएँ. स्टैक में हर स्लाइस को एनोटेट करें।
  5. एक बार पुष्टि हो जाने के बाद, + चिह्न पर क्लिक करके चयन को लेबल पर असाइन करें. चयन को निकालने के लिए - चिह्न क्लिक करें.
  6. विभाजन पूरा होने के बाद प्रोजेक्ट इंटरफ़ेस पर वापस जाएं। छवि स्टैक से जुड़े ".label" एक्सटेंशन वाले नोड की तलाश करें.
  7. ".label" एक्सटेंशन पर राइट-क्लिक करें और Surface जनरेट करें | कोई .surf फ़ाइल बनाने के लिए लागू करें.
  8. किसी खंडित ऑब्जेक्ट का 3D मॉडल रेंडर करने के लिए, .surf फ़ाइल पर राइट-क्लिक करें और देखने वाले फलक में 3D मॉडल जनरेट करने के लिए Surface View का चयन करें.
  9. विज़ुअलाइज़ेशन या आगे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए 3 डी मॉडल सहेजें।

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Representative Results

इस तकनीक के लिए, रुचि के क्षेत्रों को जैविक अनुसंधान उद्देश्य के आधार पर चुना जाता है और एम्बेडेड ऊतक की ट्रिमिंग और सेक्शनिंग से पहले पहचाना जाता है। इसी तरह, ब्लॉक चेहरे का आकार अनुसंधान प्रश्न द्वारा निर्धारित किया जा सकता है; इस मामले में, नमूना लगभग 0.3 मिमी x 0.15 मिमी (चित्रा 4 ए) के ब्लॉक चेहरे को छोड़ने के लिए छंटनी की गई थी। इसने प्रति ग्रिड 9 सीरियल वर्गों के दो ग्रिड के लिए अनुमति दी, 18 सीरियल सेक्शन प्रदान किए और लगभग 62 μm 3 (316 μm x 150 μm x1.3 μm) की मात्रा के जिगर के ऊतकों की मात्रा को शामिल किया। यह मात्रा जिगर के ऊतकों में व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के पूर्ण 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त थी।

Figure 4
चित्रा 4: विभाजन और 3 डी पुनर्निर्माण ईआर और संबंधित ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्कों की आकृति विज्ञान की समीक्षा करते हुए। (ए) टीईएम में सीरियल अनुभागों के रिबन का अवलोकन। (बी) ब्याज के क्षेत्र का कम आवर्धन दृश्य और स्थानांतरण के लिए प्रासंगिक स्थलों। स्केल बार = 40 μm (i), 20 μm (ii), 5 μm (iii), 1 μm (iv). (सी) बाएं: दो apposed हेपेटोसाइट्स के ईएम tomogram. दाएँ: एक ही tomogram के खंडित संस्करण. ईआर (पीला), माइटोकॉन्ड्रिया (सियान), और विभिन्न अंतरिक्ष के ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच इंटरमेम्ब्रेन संपर्कों का पता लगाएं: 0-20 एनएम (मैजेंटा); 21-100 एनएम (नीला). (डी) पुनर्निर्मित मॉडल से अलग एक ऑर्थोस्लाइस केवल ईआर और विभिन्न झिल्ली संपर्कों को दर्शाता है, जो इनसेट में तीर एनोटेटेड क्षेत्र के अनुरूप है। (ई) विभिन्न कोणों पर खंडित ऑर्गेनेल और ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्कों का 3 डी पुनर्निर्माण। संक्षिप्त रूप: ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; TEM = संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; mt = माइटोकॉन्ड्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कम आवर्धन पर TEM द्वारा सीरियल अनुभागों का विज़ुअलाइज़ेशन शेष ऊतक (चित्रा 4 B) के भीतर ब्याज के निर्दिष्ट क्षेत्र और इसके संदर्भ की पहचान करने में मदद करता है। इन छवियों का उपयोग बाद के वर्गों में रुचि के एक ही क्षेत्र को खोजने के लिए किया जा सकता है। ब्याज का एक क्षेत्र जो दो apposed हेपेटोसाइट्स के बीच एक सीमा पर अच्छा संरक्षण दिखा रहा है, का चयन किया गया था और यहां प्रस्तुत किया गया था। उच्च आवर्धन इमेजिंग एनएम रिज़ॉल्यूशन के साथ विभिन्न ऑर्गेनेल (चित्रा 4 सी) के रूपात्मक विवरणों के अवलोकन की अनुमति देता है। दो प्रकार के ईआर-ऑर्गेनेल संघों को चित्रित करने के लिए, चयनित माइटोकॉन्ड्रिया और ईआर को विभाजित किया गया था, मैन्युअल रूप से बढ़े हुए इलेक्ट्रॉन घनत्व के साथ प्रस्तुत झिल्ली के किनारे का पता लगाया गया था। इसके बाद, ब्रश टूल को एक निश्चित एनएम / पीएक्स मोटाई (चित्रा 3 बी) पर सेट किया गया था और दो लक्षित ऑर्गेनेल के बीच के क्षेत्रों को उजागर करने के लिए ब्याज के ऑर्गेनेल की सीमा का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता था जो एक दूसरे के लिए एक निर्दिष्ट संपर्क दूरी के भीतर थे और ऑर्गेनेल संपर्कों के एक विशेष वर्ग के रूप में नामित किया जा सकता था। चित्रा 4 डी पूरे माइटोकॉन्ड्रियन के भीतर विभाजन के निशान और इसकी सापेक्ष स्थिति (इनलेट 3 डी मॉडल में एरोहेड) के साथ एक झुकाहुआ ऑर्थोस्लाइस को दिखाता है।

निशान को अलग-अलग रंगों को सौंपा गया था, विभाजन के बाद 3 डी मॉडल में पुनर्निर्मित किया गया था, और विभिन्न अभिविन्यासों (चित्रा 4 ई) पर प्रदर्शित किया गया था। ईआर (पीला) संरचना को मध्य पैनलों में आंशिक रूप से पारदर्शी दिखाया गया था ताकि ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्कों और माइटोकॉन्ड्रिया (सियान) को नीचे कल्पना की जा सके। मॉडल के सामने और पीछे के दृश्य विभिन्न इंटरमेम्ब्रेन स्पेसिंग के इंटरऑर्गेनेल संपर्कों के एक विषम वितरण को प्रकट करते हैं। 21 एनएम से छोटे इंटरमेम्ब्रेन स्पेस को ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्क (गुलाबी) के रूप में सौंपा गया था क्योंकि लिपिड ट्रांसफर जैसे कार्यों को इस दूरी पर संभव होने की सूचना दी गईहै। 21 और 100 एनएम के बीच इंटरमेम्ब्रेन स्पेस (नीला) भी एनोटेट किया गया था क्योंकि यह क्षेत्र हाल ही में रिपोर्ट किए गए माइटोकॉन्ड्रिया-रफ-ईआर संघों44 का प्रतिनिधित्व कर सकता है। इसी तरह की वक्रता की रैपिंग ईआर संरचनाओं को 3 डी मॉडल (चित्रा 4 ई) में देखा गया था। चित्रा 4 डी इंटरमेम्ब्रेन दूरी (~ 40 एनएम → ~ 20 एनएम → ~ 40 एनएम) को लपेटने वाले ईआर कुंड और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच बदलने का एक उदाहरण दिखाता है। विधि इन दो अलग-अलग इंटरमेम्ब्रेन रिक्त स्थान के अनुवर्ती पैच विश्लेषण की अनुमति देती है, जैसे कि उनकी बहुतायत, वितरण और टोपोलॉजी का मात्रात्मक विश्लेषण संभव है।

चिंताओं सीरियल टोमोग्राफी सीरियल अनुभाग TEM FIB-SEM SBF-SEM सरणी टोमोग्राफी
पार्श्व (x,y) रिज़ॉल्यूशन 0.5 nm 0.5 nm 2 nm 2 nm 2 nm
(न्यूनतम px आकार)
अक्षीय (z) रिज़ॉल्यूशन 1 nm 50 nm 4 nm 20 nm 50 nm
(न्यूनतम px गहराई) अनुभाग मोटाई तक सीमित अनुभाग मोटाई तक सीमित
विशिष्ट अनुप्रयोगों में डेटा की वॉल्यूम श्रेणियाँ 0.1 - 50 μm3 10 - 250 μm3 10 - 1 x 104 μm3 10 – 1 x 1012 μm3 10 - ∞ μm3
नमूनों की पुनरावृत्ति या पुनर्इमेज संभव संभव संभव नहीं है संभव नहीं है संभव
उपकरण की लागत ££ £ ££ ££ ££
(उपकरण उदाहरण) (200 kV TEM) (120 kV TEM) (FIB-SEM) (SBF-SEM) (SEM+AT)
उपकरण रखरखाव की लागत ££ £ ££ ££ £

तालिका 1: मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों का अवलोकन। संक्षिप्त रूप: EM = इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; TEM = संचरण EM; FIB-SEM = केंद्रित आयन बीम SEM; SBF-SEM = सीरियल ब्लॉक चेहरा SEM; एसईएम + एटी = सरणी टोमोग्राफी के साथ SEM.

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Discussion

3 डी में ऑर्गेनेल संरचना और इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए एक सुलभ वीईएम तकनीक का वर्णन इस प्रोटोकॉल में किया गया है। हेपेटोसाइट्स में इंटरऑर्गेनेल संपर्कों की आकृति विज्ञान को यहां एक मामले के अध्ययन के रूप में प्रस्तुत किया गया है। हालांकि, इस दृष्टिकोण को विभिन्न प्रकार के अन्य नमूनों और अनुसंधान क्षेत्रों की जांच करने के लिए भी लागू किया गया है, जिसमें परिधीय नसों में श्वान सेल-एंडोथेलियल इंटरैक्शन45, एंडोथेलियल कोशिकाओं में वीबेल पालाडे बॉडी बायोजेनेसिस46, गुर्दे की कोशिकाओं में कार्गो स्राव47, और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स48 में सिनैप्स आकृति विज्ञान शामिल हैं। . जिगर जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने के लिए, इस दृष्टिकोण का उपयोग 2 डी सेल संस्कृति, 3 डी हेपेटिक ऑर्गेनोइड मॉडल सिस्टम49 और यकृत ऊतक में हेपेटोसाइट आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इस मजबूत और लचीले दृष्टिकोण का उपयोग कई प्रयोगशालाओं द्वारा पारंपरिक 120 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप और अल्ट्रामाइक्रोबियल तक पहुंच के साथ किया जा सकता है और इसके लिए महंगे नमूना तैयारी तकनीकों की आवश्यकता नहीं होती है।

हालांकि यह एक सुलभ प्रोटोकॉल है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वैकल्पिक वीईएम तकनीकें हैं जो अनुसंधान प्रश्न के आधार पर शोधकर्ता को कुछ लाभ प्रदान कर सकती हैं; एक सिंहावलोकन 6,50,51 के लिए तालिका 1 देखें। अक्सर आवश्यक डेटा का रिज़ॉल्यूशन और मात्रा सीधे शोधकर्ताओं की वीईएम तकनीक की पसंद और आसानी और गति को प्रभावित करती है जिस पर परियोजना प्रगति कर सकती है। उदाहरण के लिए, FIB-SEM, इमेजिंग से पहले नमूने से बहुत पतली परतों को हटा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उत्कृष्ट z-रिज़ॉल्यूशन (z मोटाई 4 एनएम के रूप में कम) और संभावित रूप से आइसोट्रोपिक वोक्सेल के साथ वॉल्यूमेट्रिक 3 डी डेटा प्रदान करता है। यह प्रत्येक कोण से समान रिज़ॉल्यूशन के साथ डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, जो कभी-कभी अलग-अलग लाभ प्रदान कर सकता है जब संपर्कबिंदुओं को 52,53 को समझना मुश्किल होता है। FIB-SEM बड़ी मात्रा में उत्पन्न कर सकता है लेकिन अक्सर महंगा और समय लेने वाला होता है, जबकि SBF-SEM उपयोग करने के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक है जब बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, 100s से 1000s अनुभाग54 के। SBF-SEM और सरणी टोमोग्राफी FIB-SEM के समान xy रिज़ॉल्यूशन प्रदान करते हैं, लेकिन कम z-रिज़ॉल्यूशन के साथ। जैसा कि सरणी टोमोग्राफी में भौतिक वर्गों को इकट्ठा करना शामिल है, जेड-रिज़ॉल्यूशन शायद अपने प्रतियोगियों में से सबसे गरीब है (जेड मोटाई 50 + एनएम) लेकिन इसके कई अलग-अलग फायदे हैं। सबसे महत्वपूर्ण, क्योंकि यह एक nondestructive तकनीक है, नमूना अलग xy संकल्पों पर revisited किया जा सकता है, आसान montaging के साथ, विभिन्न समय पर, और कई क्षेत्रों में, एक ही नमूने में पूर्ण संदर्भ और विस्तार की सराहना की जा करने की अनुमति. सीरियल अनुभाग TEM भी इस लाभ को साझा करता है; हालांकि, जैसा कि वर्गों को टीईएम ग्रिड पर एकत्र करने की आवश्यकता होती है, यह छोटे वॉल्यूम के लिए बेहतर अनुकूल है जिन्हें इमेजिंग से पहले एकत्र करने के लिए कम वर्गों की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह टीईएम झुकाव टोमोग्राफी के साथ संगत है, एक ऐसी तकनीक जो बहुत कम मात्रा में बहुत उच्च जेड-रिज़ॉल्यूशन (जेड मोटाई 2 एनएम के रूप में कम) प्रदान करती है, यदि आवश्यक हो तो ब्याज की विशिष्ट संपर्क साइटों की आगे की पूछताछ को सक्षम करती है।

वीईएम दृष्टिकोण के बावजूद, नमूना संरक्षण परियोजना की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। निर्धारण माध्यम ऊतकों के लिए एक आइसोटोनिक मैच होना चाहिए, और ऊतकों के सूखने से बचने के लिए निर्धारण माध्यम में स्थानांतरण तेजी से किया जानाचाहिए। जिगर के ऊतकों को संरक्षित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और जब यह उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करता है, तो अतिरिक्त प्रयोगों के लिए यकृत ऊतक के प्रतिधारण की अनुमति देता है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए पूरे जिगर परफ्यूजन अक्सर संभव नहीं होता है। जिगर कील सुई परफ्यूजन एक उत्कृष्ट विकल्प56 है। क्रायोइममोबिलाइजेशन भी एक विकल्प है, लेकिन ताजा वाइब्रेटोम वर्गों के सजातीय विट्रीफिकेशन को प्राप्त करने के लिए तत्काल उच्च दबाव ठंड की आवश्यकता होती है; इस प्रकार, यह दृष्टिकोण काफी चुनौतीपूर्ण है। प्रारंभिक निर्धारण के बाद, विभिन्न प्रकार के ईएम नमूना तैयारी प्रोटोकॉल हैं जो संतोषजनक परिणाम देते हैं। एक नियमित टीईएम प्रोटोकॉल यहां57 प्रस्तुत किया गया है, लेकिन "एनब्लॉक मेगामेटल" प्रोटोकॉल को अन्य जैविक नमूनों45,58 के साथ भी सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। जबकि ये "enbloc megametal" प्रोटोकॉल नमूने में अधिक विपरीत प्रदान करते हैं, कुछ संरचनाओं को अधिक भारी दाग वाली उपस्थिति देते हैं, उनके पास वर्गों को दागने की आवश्यकता को हटाने का लाभ भी होता है, इस प्रकार नमूनों पर अवांछित दाग अवक्षेप जोड़ने और प्रक्रिया में ग्रिड को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को कम करता है।

इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम ultrathin sectioning और रिबन संग्रह है। काटने की नाव की पानी की सतह से सीरियल वर्गों को इकट्ठा करना एक मैनुअल प्रक्रिया है जो क्षतिग्रस्त और लापता वर्गों का कारण बन सकती है। उदाहरण के लिए, क्या अनुभाग एक-दूसरे का पालन करने और स्थिर रिबन बनाने में विफल रहते हैं, संपर्क सीमेंट को रिबन13 को स्थिर करने के लिए ब्लॉकफेस के अग्रणी किनारे पर लागू किया जा सकता है। इस चरण की अवधि और नियमित सफलता कौशल-निर्भर59 हैं। यद्यपि मॉडल-विशिष्ट अनुभाग-पिकिंग विधियों की अधिकता60,61 शुरुआती लोगों को भ्रमित कर सकती है, कुछ सरल, व्यावहारिक मार्गदर्शिकाएं नियमित सेक्शनिंग के लिए55,62, अभ्यास के साथ मिलकर, सेक्शनिंग कौशल में काफी सुधार कर सकती हैं। इस प्रोटोकॉल को न्यूनतम विशेषज्ञ उपकरणकी आवश्यकता होती है, और वीडियो फुटेज की सहायता से सेक्शनिंग, रिबन टुकड़ी, और रिबन हैंडलिंग और पिकअप के दौरान मैनुअल हेरफेर तकनीकों के व्यावहारिक पहलुओं को दिखाते हुए, सीरियल सेक्शनिंग के लिए एक उत्कृष्ट शुरुआती गाइड प्रदान करता है।

वॉल्यूम ईएम छवि विश्लेषण वर्तमान में उपलब्ध विभिन्न प्रकार के ओपन-सोर्स और वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर विकल्पों के साथ विकास का एक क्षेत्र बना हुआ है, और सूची लगातार बढ़ रही है। संरेखण (TrakEM241), 3 डी विभाजन, और पुनर्निर्माण (अमीरा42) के लिए सॉफ्टवेयर का एक चयन यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं; हालांकि, संरेखण के लिए कई विकल्प उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, फिजी, रजिस्टर वर्चुअल स्लाइस63, एटलस 5, और 3 डी पुनर्निर्माण (उदाहरण के लिए, एमआईबी64; पुनर्निर्माण 65; आईएमओडी66)। अपेक्षाकृत छोटे विश्लेषण परियोजनाओं के लिए, भले ही डेटा स्थानीय रूप से उत्पन्न हो या खुले तौर पर साझा किए गए डेटास्टोर (EMPIAR67, Open Organelle68) से सोर्स किया गया हो, यहां वर्णित मैनुअल विभाजन एक सुलभ और व्यवहार्य विकल्प है। हालांकि, बड़े डेटासेट के लिए, कई उपयोगकर्ता इन कार्यों के स्वचालन के लिए मशीन लर्निंग और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस की ओर रुख कर रहे हैं69,70, साथ ही भीड़-सोर्सिंगस्वयंसेवक71 या दोनों72 के संयोजन के लिए।

आखिरकार, संरेखण और 3 डी विभाजन के बाद, 3 डी पुनर्निर्माण न केवल प्रश्न में संरचनाओं की आकृति विज्ञान को प्रकट करता है, बल्कि, महत्वपूर्ण रूप से, अन्य ऑर्गेनेल के साथ उनके संबंधों को भी प्रकट करता है, जिसमें मौजूद किसी भी संपर्क साइटों की अद्वितीय विशेषताएं शामिल हैं। इन ऑर्गेनेल संपर्कों का आगे विश्लेषण किया जा सकता है, और संपर्कों की संख्या, संपर्क क्षेत्र, ऑर्गेनेल की मात्रा, और ऑर्गेनेल के मॉर्फोमेट्रिक मापदंडों जैसी सुविधाओं को निकाला जा सकता है और प्रयोगात्मक मॉडल70 के बीच तुलना की जा सकती है। क्वांटिटेशन विकल्प कई हैं, और सटीक शोध प्रश्न के आधार पर उनकी प्रासंगिकता बेहद भिन्न होती है। इसलिए, उन्हें इस प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में गहराई से कवर नहीं किया गया है।

ऑर्गेनेल संपर्कों को प्रभावित करने वाली पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं को दुर्लभ (जैसे, विल्सन की बीमारी) और आम (वायरल हेपेटाइटिस और गैर अल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस)विकारों 73,74,75 दोनों में फंसाया गया है। उदाहरण के लिए, ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया और माइटोकॉन्ड्रिया-लिपिड ड्रॉपलेट संपर्क साइटें हेपेटोसाइट्स में लिपिड चयापचय को विनियमित करने के लिए दिखाई देती हैं; इसलिए, इन संपर्कों का अध्ययन बहुत रुचि का है। अंत में, सीरियल सेक्शन टीईएम और बाद में 3 डी पुनर्निर्माण और विश्लेषण इंटरऑर्गेनेल संपर्कों से पूछताछ करने और जिगर के कार्यों और बीमारियों में उनके सापेक्ष महत्व की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम जोआना Hanley, रेबेका Fiadeiro, और विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Ania Straatman-Iwanowska धन्यवाद. हम स्टीफन प्रयोगशाला के सदस्यों और इयान जे व्हाइट को उपयोगी चर्चाओं के लिए भी धन्यवाद देते हैं। जे.जे. .B यूसीएल में आणविक सेल जीव विज्ञान की एमआरसी प्रयोगशाला को एमआरसी फंडिंग द्वारा समर्थित है, पुरस्कार कोड MC_U12266B। सी.जे.एस. यूसीएल में आणविक सेल जीव विज्ञान विश्वविद्यालय इकाई की एमआरसी प्रयोगशाला को एमआरसी वित्त पोषण द्वारा समर्थित है, पुरस्कार कोड MC_UU_00012/ P.G. यूरोपीय अनुसंधान परिषद, अनुदान कोड ERC-2013-StG-337057 द्वारा वित्त पोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4

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जीव विज्ञान अंक 184
सीरियल सेक्शन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स में इंटरऑर्गेनेल संपर्क साइटों का त्रि-आयामी लक्षण वर्णन
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Chun Chung, G. H., Gissen, P.,… More

Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).

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