JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Published: June 09, 2022
doi:
10.3791/63496
, , ,
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology,University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre,University College London

Summary

Een eenvoudig en uitgebreid protocol om driedimensionale details van membraancontactplaatsen tussen organellen in hepatocyten uit de lever of cellen in andere weefsels te verkrijgen.

Abstract

Transmissie-elektronenmicroscopie wordt al lang beschouwd als de gouden standaard voor de visualisatie van cellulaire ultrastructuren. Analyse is echter vaak beperkt tot twee dimensies, wat het vermogen belemmert om de driedimensionale (3D) ultrastructuur en functionele relatie tussen organellen volledig te beschrijven. Volume-elektronenmicroscopie (vEM) beschrijft een verzameling technieken die het mogelijk maken cellulaire ultrastructuur in 3D te ondervragen op mesoschaal, microschaal en nanoschaalresoluties.

Dit protocol biedt een toegankelijke en robuuste methode om vEM-gegevens te verkrijgen met behulp van SERIAL SECTION TRANSMISSION EM (TEM) en behandelt de technische aspecten van monsterverwerking tot digitale 3D-reconstructie in één eenvoudige workflow. Om het nut van deze techniek aan te tonen, wordt de 3D ultrastructurele relatie tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën en hun contactplaatsen in leverhepatocyten gepresenteerd. Interorganelle-contacten spelen een vitale rol bij de overdracht van ionen, lipiden, voedingsstoffen en andere kleine moleculen tussen organellen. Ondanks hun eerste ontdekking in hepatocyten, is er echter nog veel te leren over hun fysieke kenmerken, dynamiek en functies.

Interorganelle-contacten kunnen een reeks morfologieën weergeven, variërend in de nabijheid van de twee organellen tot elkaar (meestal ~ 10-30 nm) en de omvang van de contactlocatie (van punctate-contacten tot grotere 3D-reservoirachtige contacten). Het onderzoek van nauwe contacten vereist beeldvorming met hoge resolutie en seriële sectie TEM is zeer geschikt om de 3D-ultrastructurele interorganelle contacten tijdens hepatocytendifferentiatie te visualiseren, evenals veranderingen in hepatocytenarchitectuur geassocieerd met metabole ziekten.

Introduction

Sinds hun uitvinding in de jaren 1930 hebben elektronenmicroscopen onderzoekers in staat gesteld om de structurele componenten van cellen en weefsels te visualiseren 1,2. De meeste onderzoeken hebben 2D-informatie opgeleverd, omdat het bouwen van 3D-modellen nauwgezette seriële sectieverzameling, handmatige fotografie, negatieve verwerking, handmatige tracering en het maken en assembleren van 3D-modellen van glasplaten, plastic of piepschuim 3,4 vereist. Bijna 70 jaar later zijn er aanzienlijke vorderingen gemaakt in tal van aspecten van het proces, van microscoopprestaties, seriële sectieverzameling, geautomatiseerde digitale beeldvorming, geavanceerde software en hardware voor 3D-reconstructie, visualisatie en analyse tot alternatieve benaderingen voor wat nu collectief volume EM (vEM) wordt genoemd. Deze vEM-technieken worden over het algemeen beschouwd als het leveren van 3D-ultrastructurele informatie met nanometerresoluties op micronschaal en omvatten transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en nieuwere scanning elektronenmicroscopie (SEM) technieken; zie beoordelingen 5,6,7,8.

Gefocusseerde ionenbundel SEM (FIB-SEM) maakt bijvoorbeeld gebruik van een gerichte ionenbundel in een SEM om het oppervlak van het blok weg te frezen tussen sequentiële SEM-beeldvormingsscans van het oppervlak van het blok, waardoor het herhaalde geautomatiseerd frezen / beeldvormen van een monster mogelijk is en een 3D-dataset kan worden opgebouwd voor reconstructie 9,10. Serial block face SEM (SBF-SEM) daarentegen gebruikt een ultramicrotoom in de SEM om materiaal van het blokvlak te verwijderen voorafgaand aan beeldvorming 11,12, terwijl arraytomografie een niet-destructief proces is dat de verzameling van seriële secties vereist, op coverslips, wafers of tape, voordat een geautomatiseerde workflow wordt opgezet voor het in beeld brengen van het gebied van belang in sequentiële secties in de SEM om de 3D-dataset te genereren13 . Net als bij arraytomografie vereist seriële sectie TEM (ssTEM) dat fysieke secties worden verzameld voorafgaand aan beeldvorming; deze secties worden echter verzameld op TEM-rasters en afgebeeld in een TEM 14,15,16. ssTEM kan worden uitgebreid door tilttomografie 17,18,19 uit te voeren. Seriële tilttomografie biedt de beste resolutie in x, y en z, en hoewel het is gebruikt om hele cellen20 te reconstrueren, is het redelijk uitdagend. Dit protocol richt zich op de praktische aspecten van ssTEM als de meest toegankelijke vEM-techniek die beschikbaar is voor veel EM-laboratoria die momenteel misschien geen toegang hebben tot gespecialiseerde sectioning- of vEM-instrumenten, maar baat zouden hebben bij het genereren van 3D vEM-gegevens.

Seriële ultramicrotomie voor 3D-reconstructie werd eerder als een uitdaging beschouwd. Het was moeilijk om rechte linten van gelijkmatige sectiedikte te knippen, linten van de juiste grootte, in de juiste volgorde, op roosters te plaatsen en op te pakken met voldoende ondersteuning, maar zonder rasterstaven die interessante gebieden verduisteren, en vooral, zonder secties te verliezen, omdat een onvolledige reeks volledige 3D-reconstructie21 kan voorkomen. Verbeteringen aan commerciële ultramicrotomen, diamantslijp- en trimmessen22,23, elektron lucent-ondersteuningsfilms op rasters21,24 en lijmen voor het helpen van sectiehechting en lintconservering13,21 zijn echter slechts enkele van de incrementele vooruitgangen in de loop der jaren die de techniek in veel laboratoria meer routine hebben gemaakt. Zodra seriële secties zijn verzameld, is seriële beeldvorming in TEM eenvoudig en kan EM-afbeeldingen worden geleverd met subnanometer px-formaten in x en y, waardoor hoge resolutie ondervraging van de subcellulaire structuren mogelijk is – een potentiële vereiste voor veel onderzoeksvragen. De hier gepresenteerde casestudy toont het gebruik van ssTEM en 3D-reconstructie in de studie van endoplasmatisch reticulum (ER)-organelcontacten in leverhepatocyten, waar ER-organelcontacten voor het eerst werden waargenomen25,26.

Hoewel het aaneengesloten ligt met de nucleaire envelop, maakt het ER ook nauwe contacten met tal van andere celorganellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, lipidedruppels en het plasmamembraan27. ER-organelcontacten zijn betrokken bij lipidemetabolisme28, fosfoinositide en calciumsignalering29, autofagieregulatie en stressrespons30,31. De ER-organelcontacten en andere interorganelle-contacten zijn zeer dynamische structuren die reageren op cellulaire metabole behoeften en extracellulaire signalen. Het is aangetoond dat ze morfologisch variëren in hun grootte en vorm en de afstanden tussen organelmembranen 32,33. Er wordt gedacht dat deze ultrastructurele verschillen waarschijnlijk hun verschillende eiwit / lipidesamenstellingen en functie weerspiegelen34,35. Het is echter nog steeds een uitdagende taak om interorganelle-contacten te definiëren en te analyseren36. Daarom is een betrouwbaar maar eenvoudig protocol voor het onderzoeken en karakteriseren van interorganelle contacten vereist voor verder onderzoek.

Omdat ER-organelcontacten kunnen variëren van 10 tot 30 nm in membraan-tot-membraanscheiding, is de gouden standaard voor identificatie historisch gezien TEM geweest. Thin-section TEM heeft specifieke subdomeinlokalisatie onthuld voor residente ER-eiwitten bij verschillende membraancontacten37. Traditioneel heeft dit ER-organelcontacten met nm-resolutie onthuld, maar vaak alleen een 2D-weergave van deze interacties gepresenteerd. VEM-benaderingen onthullen echter de ultrastructurele presentatie en context van deze contactsites in 3D, waardoor volledige reconstructie van contacten en nauwkeurigere classificatie van contacten (punt versus buisvormig versus cisteraalachtig) en kwantificering38,39 mogelijk is. Naast het feit dat het het eerste celtype is waar ER-organelcontacten25,26 werden waargenomen, hebben hepatocyten een uitgebreid systeem van andere interorganelle contacten die een vitale rol spelen in hun architectuur en fysiologie28,40. Een grondige morfologische karakterisering van ER-organel en andere interorganellecontacten in hepatocyten ontbreekt echter nog steeds. Dienovereenkomstig is de manier waarop interorganelle-contacten zich vormen en hermodelleren tijdens regeneratie en reparatie van bijzonder belang voor de hepatocytenbiologie en de leverfunctie.

Protocol

Alle dieren werden gehuisvest in overeenstemming met de richtlijnen van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en het verzamelen van weefsel werd uitgevoerd in overeenstemming met de UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Fixatie en bereiding van het monster Ontleed het leverweefsel in stukken van de juiste grootte, ongeveer 8 mm x 8 mm x 3 mm, en plaats de stukken in warme fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS, 37 °C). Injecteer kamertemperatuu…

Representative Results

Voor deze techniek worden interessante regio’s geselecteerd op basis van het biologische onderzoeksdoel en geïdentificeerd voorafgaand aan het trimmen en doorsnijden van ingebed weefsel. Evenzo kan de grootte van het blokvlak worden bepaald door de onderzoeksvraag; in dit geval werd het monster bijgesneden om een blokvlak van ongeveer 0,3 mm x 0,15 mm achter te laten (figuur 4A). Dit maakte twee rasters van 9 seriële secties per raster mogelijk, die 18 seriële secties leverden en een volu…

Discussion

Een toegankelijke vEM-techniek voor het visualiseren van organelstructuur en interacties in 3D wordt in dit protocol beschreven. De morfologie van interorganelle contacten in hepatocyten wordt hier gepresenteerd als een casestudy. Deze aanpak is echter ook toegepast om een verscheidenheid aan andere monsters en onderzoeksgebieden te onderzoeken, waaronder Schwann cel-endotheelinteracties in perifere zenuwen45, Weibel Palade Body biogenese in endotheelcellen46, ladingsecreti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro en Ania Straatman-Iwanowska voor de deskundige technische bijstand. We bedanken ook Stefan lableden en Ian J. White voor de nuttige discussies. J.J.B. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology aan de UCL, toekenningscode MC_U12266B. C.J.S. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit aan de UCL, toekenningscode MC_UU_00012/6. P.G. wordt gefinancierd door de European Research Council, subsidiecode ERC-2013-StG-337057.

Materials

0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325 (1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. . Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O’Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24 (2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675 (2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102 (2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287 (2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180 (2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091 (2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -. C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873 (2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111 (2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043 (2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003 (2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480 (2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. . Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., Beichel, R. R., Sonka, M. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605 (2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196 (2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273 (2021).

Tags

3D ReconstructionInterorganelle Contact SitesHepatocytesSerial Section Electron MicroscopyOrganelle MorphologyCellular TraffickingUltra-thin SectioningMicrotomeDiamond KnifeCutting WindowRibbon SectioningSlot Grid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image