Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Published: June 9, 2022 doi: 10.3791/63496
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, University College London

Summary

Een eenvoudig en uitgebreid protocol om driedimensionale details van membraancontactplaatsen tussen organellen in hepatocyten uit de lever of cellen in andere weefsels te verkrijgen.

Abstract

Transmissie-elektronenmicroscopie wordt al lang beschouwd als de gouden standaard voor de visualisatie van cellulaire ultrastructuren. Analyse is echter vaak beperkt tot twee dimensies, wat het vermogen belemmert om de driedimensionale (3D) ultrastructuur en functionele relatie tussen organellen volledig te beschrijven. Volume-elektronenmicroscopie (vEM) beschrijft een verzameling technieken die het mogelijk maken cellulaire ultrastructuur in 3D te ondervragen op mesoschaal, microschaal en nanoschaalresoluties.

Dit protocol biedt een toegankelijke en robuuste methode om vEM-gegevens te verkrijgen met behulp van SERIAL SECTION TRANSMISSION EM (TEM) en behandelt de technische aspecten van monsterverwerking tot digitale 3D-reconstructie in één eenvoudige workflow. Om het nut van deze techniek aan te tonen, wordt de 3D ultrastructurele relatie tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën en hun contactplaatsen in leverhepatocyten gepresenteerd. Interorganelle-contacten spelen een vitale rol bij de overdracht van ionen, lipiden, voedingsstoffen en andere kleine moleculen tussen organellen. Ondanks hun eerste ontdekking in hepatocyten, is er echter nog veel te leren over hun fysieke kenmerken, dynamiek en functies.

Interorganelle-contacten kunnen een reeks morfologieën weergeven, variërend in de nabijheid van de twee organellen tot elkaar (meestal ~ 10-30 nm) en de omvang van de contactlocatie (van punctate-contacten tot grotere 3D-reservoirachtige contacten). Het onderzoek van nauwe contacten vereist beeldvorming met hoge resolutie en seriële sectie TEM is zeer geschikt om de 3D-ultrastructurele interorganelle contacten tijdens hepatocytendifferentiatie te visualiseren, evenals veranderingen in hepatocytenarchitectuur geassocieerd met metabole ziekten.

Introduction

Sinds hun uitvinding in de jaren 1930 hebben elektronenmicroscopen onderzoekers in staat gesteld om de structurele componenten van cellen en weefsels te visualiseren 1,2. De meeste onderzoeken hebben 2D-informatie opgeleverd, omdat het bouwen van 3D-modellen nauwgezette seriële sectieverzameling, handmatige fotografie, negatieve verwerking, handmatige tracering en het maken en assembleren van 3D-modellen van glasplaten, plastic of piepschuim 3,4 vereist. Bijna 70 jaar later zijn er aanzienlijke vorderingen gemaakt in tal van aspecten van het proces, van microscoopprestaties, seriële sectieverzameling, geautomatiseerde digitale beeldvorming, geavanceerde software en hardware voor 3D-reconstructie, visualisatie en analyse tot alternatieve benaderingen voor wat nu collectief volume EM (vEM) wordt genoemd. Deze vEM-technieken worden over het algemeen beschouwd als het leveren van 3D-ultrastructurele informatie met nanometerresoluties op micronschaal en omvatten transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en nieuwere scanning elektronenmicroscopie (SEM) technieken; zie beoordelingen 5,6,7,8.

Gefocusseerde ionenbundel SEM (FIB-SEM) maakt bijvoorbeeld gebruik van een gerichte ionenbundel in een SEM om het oppervlak van het blok weg te frezen tussen sequentiële SEM-beeldvormingsscans van het oppervlak van het blok, waardoor het herhaalde geautomatiseerd frezen / beeldvormen van een monster mogelijk is en een 3D-dataset kan worden opgebouwd voor reconstructie 9,10. Serial block face SEM (SBF-SEM) daarentegen gebruikt een ultramicrotoom in de SEM om materiaal van het blokvlak te verwijderen voorafgaand aan beeldvorming 11,12, terwijl arraytomografie een niet-destructief proces is dat de verzameling van seriële secties vereist, op coverslips, wafers of tape, voordat een geautomatiseerde workflow wordt opgezet voor het in beeld brengen van het gebied van belang in sequentiële secties in de SEM om de 3D-dataset te genereren13 . Net als bij arraytomografie vereist seriële sectie TEM (ssTEM) dat fysieke secties worden verzameld voorafgaand aan beeldvorming; deze secties worden echter verzameld op TEM-rasters en afgebeeld in een TEM 14,15,16. ssTEM kan worden uitgebreid door tilttomografie 17,18,19 uit te voeren. Seriële tilttomografie biedt de beste resolutie in x, y en z, en hoewel het is gebruikt om hele cellen20 te reconstrueren, is het redelijk uitdagend. Dit protocol richt zich op de praktische aspecten van ssTEM als de meest toegankelijke vEM-techniek die beschikbaar is voor veel EM-laboratoria die momenteel misschien geen toegang hebben tot gespecialiseerde sectioning- of vEM-instrumenten, maar baat zouden hebben bij het genereren van 3D vEM-gegevens.

Seriële ultramicrotomie voor 3D-reconstructie werd eerder als een uitdaging beschouwd. Het was moeilijk om rechte linten van gelijkmatige sectiedikte te knippen, linten van de juiste grootte, in de juiste volgorde, op roosters te plaatsen en op te pakken met voldoende ondersteuning, maar zonder rasterstaven die interessante gebieden verduisteren, en vooral, zonder secties te verliezen, omdat een onvolledige reeks volledige 3D-reconstructie21 kan voorkomen. Verbeteringen aan commerciële ultramicrotomen, diamantslijp- en trimmessen22,23, elektron lucent-ondersteuningsfilms op rasters21,24 en lijmen voor het helpen van sectiehechting en lintconservering13,21 zijn echter slechts enkele van de incrementele vooruitgangen in de loop der jaren die de techniek in veel laboratoria meer routine hebben gemaakt. Zodra seriële secties zijn verzameld, is seriële beeldvorming in TEM eenvoudig en kan EM-afbeeldingen worden geleverd met subnanometer px-formaten in x en y, waardoor hoge resolutie ondervraging van de subcellulaire structuren mogelijk is - een potentiële vereiste voor veel onderzoeksvragen. De hier gepresenteerde casestudy toont het gebruik van ssTEM en 3D-reconstructie in de studie van endoplasmatisch reticulum (ER)-organelcontacten in leverhepatocyten, waar ER-organelcontacten voor het eerst werden waargenomen25,26.

Hoewel het aaneengesloten ligt met de nucleaire envelop, maakt het ER ook nauwe contacten met tal van andere celorganellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, lipidedruppels en het plasmamembraan27. ER-organelcontacten zijn betrokken bij lipidemetabolisme28, fosfoinositide en calciumsignalering29, autofagieregulatie en stressrespons30,31. De ER-organelcontacten en andere interorganelle-contacten zijn zeer dynamische structuren die reageren op cellulaire metabole behoeften en extracellulaire signalen. Het is aangetoond dat ze morfologisch variëren in hun grootte en vorm en de afstanden tussen organelmembranen 32,33. Er wordt gedacht dat deze ultrastructurele verschillen waarschijnlijk hun verschillende eiwit / lipidesamenstellingen en functie weerspiegelen34,35. Het is echter nog steeds een uitdagende taak om interorganelle-contacten te definiëren en te analyseren36. Daarom is een betrouwbaar maar eenvoudig protocol voor het onderzoeken en karakteriseren van interorganelle contacten vereist voor verder onderzoek.

Omdat ER-organelcontacten kunnen variëren van 10 tot 30 nm in membraan-tot-membraanscheiding, is de gouden standaard voor identificatie historisch gezien TEM geweest. Thin-section TEM heeft specifieke subdomeinlokalisatie onthuld voor residente ER-eiwitten bij verschillende membraancontacten37. Traditioneel heeft dit ER-organelcontacten met nm-resolutie onthuld, maar vaak alleen een 2D-weergave van deze interacties gepresenteerd. VEM-benaderingen onthullen echter de ultrastructurele presentatie en context van deze contactsites in 3D, waardoor volledige reconstructie van contacten en nauwkeurigere classificatie van contacten (punt versus buisvormig versus cisteraalachtig) en kwantificering38,39 mogelijk is. Naast het feit dat het het eerste celtype is waar ER-organelcontacten25,26 werden waargenomen, hebben hepatocyten een uitgebreid systeem van andere interorganelle contacten die een vitale rol spelen in hun architectuur en fysiologie28,40. Een grondige morfologische karakterisering van ER-organel en andere interorganellecontacten in hepatocyten ontbreekt echter nog steeds. Dienovereenkomstig is de manier waarop interorganelle-contacten zich vormen en hermodelleren tijdens regeneratie en reparatie van bijzonder belang voor de hepatocytenbiologie en de leverfunctie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren werden gehuisvest in overeenstemming met de richtlijnen van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en het verzamelen van weefsel werd uitgevoerd in overeenstemming met de UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Fixatie en bereiding van het monster

  1. Ontleed het leverweefsel in stukken van de juiste grootte, ongeveer 8 mm x 8 mm x 3 mm, en plaats de stukken in warme fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS, 37 °C).
  2. Injecteer kamertemperatuur (20-25 °C) fixatief (1,5% glutaaraldehyde in 1% sucrose, 0,1 M natriumcactrodine) in de leverstukken en breng ze over van PBS naar fixatief gedurende maximaal 20 minuten bij kamertemperatuur. Houd het weefsel altijd ondergedompeld in oplossingen om uitdroging te voorkomen.
    OPMERKING: Aldehyden zijn irriterende stoffen die corrosief en potentieel kankerverwekkend zijn. Natriumcacodylaat is giftig als het wordt ingeslikt of ingeademd. Alle fixatieven moeten worden gehanteerd met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en het experiment moet worden uitgevoerd in een zuurkast. Een goede fixatie zal resulteren in een steviger weefsel.
  3. Stel de vibrerende microtoom in met een mes, ijsbad en een koude PBS-gevulde bufferbak. Monteer het eerste stuk vast leverweefsel op een monsterhouder met cyanoacrylaatlijm en breng het blok over naar het trillende microtoom.
  4. Volg de aanbevelingen van de fabrikant, benader het weefsel en snijd de vaste lever in plakken van 100 μm dik.
  5. Verzamel de plakjes met een spatel of natuurlijke haarkwast en breng ze over in een 12- of 24-well gerecht met ijskoude fix (1,5% glutaaraldehyde, 0,1 M natriumcacodylaat) op ijs. Laat de plakjes op ijs liggen totdat alle monsters in plakjes zijn gesneden en klaar zijn om verder verwerkt te worden.
  6. Selecteer de plakjes met de interessante gebieden voor verdere verwerking en was met voorzichtig roeren. Voer drie wasbeurten van 5 minuten uit met kamertemperatuur 0,1 M natriumcacodylaat in een gerecht met 12 of 24 putten, zodat de plakjes voldoende buffer hebben om vrij te bewegen.
    OPMERKING: Over het algemeen worden interessante regio's geselecteerd op basis van anatomische kenmerken die verband houden met de biologische kwestie van het onderzoek en geleid door gebieden van het weefsel die waarschijnlijk in de hele reeks aanwezig zijn, bijvoorbeeld niet aan de rand van de sectie, en die goed bewaard zijn gebleven.
  7. Vervang in een zuurkast 0,1 M natriumcactrodielaat door vers bereid 1% osmiumtetroxide/1,5% kaliumferritanide. Plaats de 12- of 24-wells schaal in een afgesloten container en breng de container gedurende 1 uur over naar een koelkast met gevaarlijke chemicaliën.
    OPMERKING: Osmium is uiterst gevaarlijk in geval van inname, inademing en huidcontact. Kaliumferritanide is irriterend en schadelijk bij inademing en huidcontact. Gebruik altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer het experiment uit in een zuurkast.
  8. Verwijder in een zuurkast het osmiumtetroxide/kaliumferritanide in een speciale osmiumafvalfles en was de monsters gedurende 5 minuten driemaal met 0,1 M natriumcacellodaat. Laat de monsters een nacht bij 4 °C in een afgesloten recipiënt staan.
    OPMERKING: Potentieel pauzepunt. Monsters kunnen wekenlang in 0,1 M natriumkactrodielaat in een afgesloten container bij 4 °C worden bewaard met weinig schade aan de conservering. Zorg voor voldoende buffer om uitdroging te voorkomen.
  9. Incubeer de monsters met vers bereid 1% looizuur in 0,05 M natriumcacodylaat gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Looizuur is irriterend en kan oogbeschadiging veroorzaken. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer het experiment uit in een zuurkast.
  10. Voer drie wasbeurten van 5 minuten uit met ddH2O voorafgaand aan uitdroging en inbedding.

2. Monster dehydratie, Epon hars inbedding, en montage

  1. Bereid eponhars volgens de volgende gewichtsverhouding (zie stap 2.2). Tarra een balans met een plastic bekerglas van 100 ml met daarin een roerstaaf. Snijd de uiteinden uit 5 plastic Pasteur-pipetten en gebruik deze om viskeuze harscomponenten in het bekerglas over te brengen.
  2. Voeg achtereenvolgens 19,2 g hars-812, 7,6 g DDSA, 13,2 g MNA en 0,8 g DMP-30-versneller toe aan het bekerglas. Gebruik de vijfde schone kunststof Pasteur pipet om de harscomponenten grondig met de hand te mengen.
    OPMERKING: Vermijd het introduceren van bubbels, maar zorg voor voldoende menging van de onderste hars met de bovenkant om een kleurverandering en ruwe menging van de componentlagen te bereiken. Alle harscomponenten zijn irriterend en schadelijk bij inademing en huidcontact. DMP-30 is corrosief en kan huidcorrosie veroorzaken. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
  3. Plaats het bekerglas op een magneetroerder en laat zachtjes roeren, waarbij de hars periodiek handmatig wordt gemengd.
  4. Was de monsters met zachte agitatie gedurende 5 minuten met 70% ethanol; herhaal dit een keer.
  5. Was de monsters met voorzichtig roeren gedurende 5 minuten met 90% ethanol; herhaal dit een keer.
  6. Was de monsters met voorzichtig roeren gedurende 5 minuten met 100% ethanol; herhaal dit een keer.
  7. Terwijl de monsters zich in 100% ethanolwassingen in een zuurkast bevinden, bereidt u een 50:50 (v / v) propyleenoxide (PO): Epon-mengsel in een glazen injectieflacon met een propyleenoxide (PO) -resistent plastic deksel. Klik voorzichtig maar veilig op het deksel van de glazen injectieflacon en terwijl u zowel het deksel als de injectieflacon vasthoudt, schud of vortex om te mengen.
    OPMERKING: Propyleenoxide is een acuut giftige, ontvlambare irriterende stof die sommige kunststoffen oplost. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer het experiment uit in een zuurkast.
  8. Incubeer na stap 2.6 de monsters met PO:Epon gedurende 1 uur in een PO-bestendige container (bijv. aluminium trays of glazen injectieflacons), met zacht schommelen/roeren in de zuurkast.
  9. Breng in de zuurkast de monsters over op 100% Epon. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in de zuurkast met schommelen/draaien/roeren. Breng het PO:Epon-mengsel over in een speciale glazen Epon-afvalfles.
  10. Herhaal stap 2.9 eenmaal.
  11. Koppel de voorbeelden voor insluiting. Afhankelijk van de grootte van de plakjes en het gebied van interesse, monteer je de plakjes direct op voorgepolymeriseerde harsstronken of sluit je ze plat in voor dissectie en sluit je ze op een later tijdstip opnieuw in.
    OPMERKING: Voor flat-embedding kan een "cast-a slide" worden gebruikt om veel segmenten tegelijk in te sluiten. Overgebleven hars kan worden gebruikt om straalcapsules te vullen en gebakken om voorgepolymeriseerde stobben te maken of bevroren voor later gebruik.
  12. Eenmaal gemonteerd en bedekt met voldoende hars om de "cast-a slide" -holte te vullen, bakt u de monsters een nacht in een oven van 60 °C.
    OPMERKING: Potentieel pauzepunt. Monsters kunnen jarenlang bij kamertemperatuur worden bewaard.
  13. Voor het opnieuw insluiten identificeert u het interessegebied in de platte ingebedde weefselsegmenten. Knip met behulp van een juwelierszaag het stuk weefsel van de juiste grootte (1 mm2 tot 4 mm2) uit en sluit het opnieuw in met hars bereid, zoals in stap 2.2, op de bovenkant van een voorpolymeriseerd blok en bak een nacht in een oven van 60 °C.
    OPMERKING: Als alternatief kan het weefselstuk worden gelijmd op een stomp of pin met tweedelige epoxyhars. Laat een nacht staan. Potentieel pauzepunt.

3. Bijsnijden en seriële sectie van ingebedde monsters

OPMERKING: Sectieren is een aangeleerde vaardigheid; gebruikers moeten bekwaam zijn in ultradunne secties voordat ze seriële secties proberen. Aangezien de exacte microtome-controles per fabrikant verschillen, volgt u de instructies en richtlijnen van de fabrikant.

  1. Gebruik, terwijl het monster is vergrendeld in de trimadapter, een scheermesje om het in hars ingebedde weefsel zorgvuldig bij te snijden om aan de volgende criteria te voldoen (zie figuur 1A,B):
    1. Zorg ervoor dat er een plat, bovenoppervlak is dat het weefsel rond het interessegebied blootlegt.
    2. Zorg voor een trapeziumvorm waarbij de boven- en onderranden schoon en parallel zijn.
    3. Zorg voor totale afmetingen van 200-500 μm in x, 100-500 μm in y.
    4. Zorg voor een asymmetrisch blokvlak, bijvoorbeeld rechtse hoeken van ~90 °, stompe hoek in de linkerbovenhoek en de linkerbenedenhoek.
      OPMERKING: Een trimmende cryoknife kan een alternatief hulpmiddel zijn voor een scheermesje. De andere aanbevelingen zijn voor gebruikersgemak voor het bestellen van secties bij het maken van afbeeldingen. Optioneel: Als secties geen stabiele linten vormen, kan een contactcement op de voorrand van het blokvlak worden aangebracht om de lintvorming te bevorderen. Scheermesjes zijn scherp; zorg ervoor dat u het scheermesje zo vasthoudt dat het onwaarschijnlijk is dat onbedoelde uitglijders leiden tot persoonlijk letsel.

Figure 1
Figuur 1: Seriële sectie TEM-workflow. (A) Diagram van het monster in het harsblok. (B) Trimblok om een trapeziumvorm te genereren met randen die geschikt zijn voor seriële sectie en asymmetrisch blokvlak om een bekende oriëntatie te garanderen. (C) Diagram met linten van seriële secties, drijvend op het wateroppervlak in de diamantmesboot. (D) Diagram met de sectie- en lintindeling, dicterend de volgorde van secties, op een TEM-sleufraster met een diameter van 3 mm. (E) TEM-beeldvorming en -navigatie. Het weergeven van de volgorde van linten en secties en het gebruik van "gele sterstickers" op de monitor voor schermverwijzingen om ervoor te zorgen dat hetzelfde interessante gebied in volgende secties opnieuw wordt weergegeven. (F) Uitlijning en bijsnijden van afbeeldingen. (G) Segmentatie, 3D-reconstructie en visualisatie. Afkorting: TEM = transmissie elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Breng na het trimmen de monsterboog, samen met de klauwplaat en het monster, over naar de monsterarm van de microtoom en plaats de monsterboog zo dat het reisbereik van de boog van boven naar beneden loopt; zet de monsterboog op zijn plaats.
  2. Plaats en vergrendel het diamantmes in de meshouder en zorg ervoor dat de snijhoek op de juiste manier op het mes is ingesteld. Vergrendel de messenhouder stevig in het podium.
  3. Terwijl het podium oplicht, gebruikt u het mes vooruit terwijl u voortdurend de relatie tussen het blokvlak en de rand van het mes controleert. Beweeg het mes voorzichtig naar het monster en pas voortdurend de zijdelingse hoek, monsterkanteling en monsterrotatie aan door de relevante knoppen aan te passen totdat het blok is uitgelijnd met de rand van het mes.
  4. Zet de podiumverlichting uit; zet de downlighting van het podium aan; stel de boven- en onderkant van het snijvenster van de monsterarm in; en laat het monster net onder de mesrand staan.
  5. Vul de messenboot met schone ddH2O en zorg ervoor dat het wateroppervlak vlak is met de rand van het mes en net iets hol is.
  6. Optioneel: Dompel een wimper in de 0,1% Triton X-100 en vervolgens in het water van de messenboot om de oppervlaktespanning van het water te verminderen om chloroforming en lintopname te bevorderen.
  7. Bereid het werkstation voor met wimpers (wimper gelijmd op een cocktailprikker), formvar-gecoate sleufroosters, gelabelde crossover-tang, chloroform, 0,1% Triton X-100-oplossing, gedestilleerd water, filterpapier en rasterdoos met rasterdoosnotities.
  8. Stel de snijsnelheid in op 1 mm/s en de initiële snijdikte op 100 nm en start de snijcyclus.
  9. Nadat de eerste sectie is gesneden, wijzigt u de snijparameters in een snijsnelheid van 0,8 mm / s en de snijdikte in 70 nm en gaat u verder met snijden, waardoor secties een lint vormen dat langs het oppervlak van de met water gevulde messenboot beweegt (figuur 1C).
    OPMERKING: Het is belangrijk om op de hoogte te zijn van de kleur van de secties die worden geproduceerd, omdat dit vaak een nauwkeurigere gids is voor de dikte van de harssecties. Zilveren secties zijn meestal ongeveer 70 nm dik, terwijl grijze secties dunner zijn en gouden secties dikker.
  10. Laat het microtoom doorgaan met het doorknippen van secties en het lint langer worden.
    OPMERKING: Het is belangrijk om grote trillingen en fysieke verstoringen in de kamer te voorkomen. Tocht kan ervoor zorgen dat de secties op het wateroppervlak in de mesboot bewegen en fysieke trillingen kunnen ervoor zorgen dat het microtoom ongelijkmatig snijdt.
  11. Zodra voldoende secties zijn verzameld en voordat het lint het einde van de boot bereikt, stopt u met snijden (net nadat het monster de rand van het mes is gepasseerd).
    OPMERKING: Het aantal benodigde secties is afhankelijk van de grootte van het blokvlak en de grootte van de te verzamelen gegevensset. Het is dus handig om je bewust te zijn van de relatie tussen de grootte van het blok en het slotraster als de snijsecties loskomen.
  12. Gebruik een wimper in elke hand en breek het lint voorzichtig in kleinere linten die in de lengte van het sleufraster passen, waarbij u ervoor zorgt dat u een notitie maakt van hun relatieve posities vanuit het monster.
    OPMERKING: Als hun gecombineerde breedte past, kunnen meerdere linten voorzichtig naast elkaar worden geplaatst en samen in één sleufraster worden opgepakt. Als u meerdere linten op één sleufraster oppakt, let dan op de volgorde en de relatieve positie van de linten. Plaats de linten bijvoorbeeld altijd verder in het monster rechts van een lint dat al in het monster zit (figuur 1D).
  13. Optioneel: Gebruik een glazen applicatorstaaf en beweeg een druppel chloroform over de secties om ze af te vlakken.
    OPMERKING: Chloroform is giftig en irriterend. Laat chloroform het wateroppervlak of delen niet raken. Als dit per ongeluk het geval is, moet het water worden verwijderd en het mes worden gewassen voordat het terugkeert naar de sectie. De chloroform kan de secties beschadigen en de lijm afbreken die de diamant in de messenboot vastzet.
  14. Gebruik de eerste genummerde tang om het eerste lege sleufrooster op te pakken (aan de rechterkant van de sleuf, formvar-zijde naar beneden), voorzichtig in de Triton X-100 te dopen en vervolgens twee keer in het gedestilleerde water voordat u overtollig water van de tangrand verwijdert met behulp van een stuk filterpapier.
  15. Met een wimper in de ene hand en de tang in de andere hand, laat u ongeveer 2/3rd van het met formvar gecoate gleufrooster voorzichtig in het water van de messenboot zakken (weg van de secties), zodat de formvar-kant naar beneden is gericht en de rechter lange rand van de sleuf zich aan het wateroppervlak bevindt en evenwijdig aan de rand van het water.
  16. Waait het rooster voorzichtig in het water naar de linten, zodat bij de terugslag de secties naar het raster afdrijven. Blijf dit doen in steeds kleinere wafts totdat de rechterrand van het lint uitlijnt met de rechterrand van de sleuf. Breng vervolgens met de laatste waft voorzichtig het raster omhoog om de secties in het sleufraster op te pakken.
  17. Laat het rooster in de tang drogen voordat u het opbergt in het rastervak, dat op de juiste manier is geannoteerd op het referentieblad van het rastervak.
  18. Herhaal stap 3.16 totdat alle linten zijn verzameld en zorg ervoor dat de volgorde van de linten behouden blijft.
  19. Als verdere secties nodig zijn, trek het mes dan ongeveer 150 nm in, controleer het waterniveau in de boot en voeg indien nodig meer toe. Start het snijproces opnieuw en volg de stappen 3.11-3.18.
  20. Zodra alle secties zijn verzameld, moet u ervoor zorgen dat de mesrand vrij is van sectieresten, trekt u het mes weg van het blokvlak en verwijdert en reinigt u het mes.

4. Rasterkleuring

  1. Eenmaal droog, bevlek de secties met Reynolds' loodcitraat op parafilm op de bank of in een petrischaaltje. Plaats verschillende pellets natriumhydroxide onder het deksel van een petrischaal om een kooldioxidevrije omgeving te creëren. Pipetteer vervolgens voorzichtig, weg van de pellets, 40 μL druppels van Reynolds' loodcitraat op de parafilm, één voor elk rooster.
    OPMERKING: Vlek niet te veel roosters tegelijk; Het maximum moet bijvoorbeeld 6 zijn. Probeer niet direct op de vlekkenschaal te ademen. Koolstofdioxide kan reageren met het loodcitraat en ongewenste neerslag op de roosters veroorzaken.
  2. Keer elk rooster (sectie met de zijkant naar beneden) om op de loodcitraatdruppel en laat het 7 tot 10 minuten beschermd door het deksel van de petrischaal. Terwijl de roosters vlekken maken, bereid je een groter tweede stuk parafilm op de bank voor met vijf druppels gedestilleerd water van 300 μL voor elk rooster.
  3. Breng aan het einde van de incubatie van het loodcitraat elk rooster over in een druppel gedestilleerd water om gedurende 1 minuut te wassen zonder direct op de roosters te ademen.
  4. Herhaal stap 4.3 in totaal vijf keer.
  5. Gebruik genummerde crossover-tang, pak het eerste raster op, raak de rand van het raster aan om papier te filteren om het grootste deel van het water af te voeren en laat drogen in de tang (gedurende ten minste 20 minuten). Herhaal dit voor elk raster.

5. Imaging acquisitie door TEM

OPMERKING: Aangezien de exacte TEM-besturingselementen per fabrikant verschillen, volgt u de instructies en richtlijnen van de fabrikant. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd door gebruikers die al bekwaam zijn in het gebruik van TEM.

  1. Voer voorafgaand aan de beeldvorming de gebruikelijke controles uit, bijvoorbeeld bundeluitlijning, versterkingsreferenties en voorbeeld-eucentriciteit.
  2. Laad voorzichtig het eerste raster van seriële secties in de monsterhouder en zorg ervoor dat de sleuf (en dus secties) wordt uitgelijnd met de verticale as van de microscooptrap.
    OPMERKING: Deze nauwkeurigheid is niet essentieel, maar bespaart tijd tijdens acquisitie en toekomstige gegevensverwerkingsfasen. Wanneer u het raster invoegt (sectie met de zijkant naar beneden of de sectie met de zijkant naar boven), moet u ervoor zorgen dat u alle rasters in dezelfde richting weergeeft.
  3. Let bij lage vergroting op de volgorde, locatie en positie van de seriële secties (figuur 1E). Navigeer naar het middelste gedeelte van de reeks op het raster.
    OPMERKING: Afhankelijk van het exacte onderzoeksdoel kunnen benaderingen voor beeldvorming variëren; het volgende is echter een nuttig uitgangspunt. De vorm van de secties en de relatie van de linten (zoals opgepikt in stap 3.14) bepalen welke sectie het eerst was en welke sectie het laatst op het raster stond.
  4. Blader door het voorbeeld en identificeer een interessante regio. Observeer het monster met de gewenste vergroting en overweeg de reeks te verzamelen bij een iets lagere vergroting, omdat secties vaak niet perfect zijn uitgelijnd en afbeeldingen mogelijk later moeten worden bijgesneden.
  5. Neem referentieafbeeldingen bij lagere vergrotingen om de context van het interessegebied, de ruwe locatie bij verschillende vergrotingen ten opzichte van sectiegrenzen en oriëntatiepunten in het voorbeeld te waarderen. Gebruik deze om de regio van interesse in andere secties aan te geven.
  6. Optioneel: gebruik voor schermverwijzingen herbruikbare zelfklevende stopverf, stickers of een stuk overheadprojectorpapier (OHP) dat op het scherm is geplakt, om tijdelijke markeringen op het scherm te plaatsen om routinematige heruitvinding van dezelfde kenmerken van het interessegebied in het midden van de afbeelding mogelijk te maken, in de hele dataset (zie gele sterren in figuur 1E).
  7. Navigeer met behulp van de referentieafbeeldingen naar het interessante gebied in het eerste gedeelte van het raster en verkrijg een afbeelding met de gewenste vergroting.
    OPMERKING: Noteer bij het opslaan van afbeeldingen de eerste bestandsnaam van de eerste afbeelding van de serie en gebruik een sequentiële naamgevingsnomenclatuur zodat alle afbeeldingsnamen de volgorde van de seriële secties volgen.
  8. Navigeer naar de volgende sectie en herhaal stap 5.7 totdat alle secties zijn afgebeeld voor dat interessante gebied.

6. Afbeeldingsexport en registratie van seriële sectie-uitlijning

  1. Exporteer de afbeeldingsbestanden die tot dezelfde stapel behoren naar één map. Zorg ervoor dat de map is gesorteerd op bestandsnaam.
    OPMERKING: De afbeeldingen moeten idealiter dezelfde rootnaam hebben en de volgorde volgen waarin ze zijn verkregen.
  2. Open Fiji en klik op Bestand | | importeren Beeldreeks.
  3. Klik op de eerste afbeelding van de map en klik op Openen. Wacht tot er een pop-upvenster met sequentieopties verschijnt (afbeelding 2A).

Figure 2
Figuur 2: Het maken van een seriële stapel en seriële sectie-uitlijning met Fiji. (A) Screenshot met de sequentie-opties bij het laden van de afbeeldingen voor het maken van een seriële stapel. (B) Screenshot van de TrackEM2 plugin en de key windows van de plugin. Druk op OK in de segmentscheiding om door te gaan met de uitlijning. (C) Screenshot na het succesvol laden van de seriële stack in het visualisatievenster. Er verschijnen drie opeenvolgende vensters met uitlijningsparameters zodra Stacksegmenten uitlijnen zijn geselecteerd. Exporteer de uitgelijnde stapel zodra de uitlijning is voltooid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Klik op Namen numeriek sorteren | Converteren naar 8-bits optie. Druk op OK.
    OPMERKING: Conversie naar 8-bits helpt bij het importeren van de gegevens in Amira en verkleint de bestandsgrootte, waardoor hogere verwerkingssnelheden in latere stappen mogelijk zijn.
  2. Controleer de volledigheid, volgorde en vergroting van de gemaakte stapel. Sla de gemaakte stapel op als een .tif bestand.
    OPMERKING: Afbeeldingen moeten bij dezelfde vergroting zijn verkregen.
  3. Voer de TrakEM2 plugin41 uit. Ga naar Bestand | Nieuwe | TrackEM2 (leeg).
    OPMERKING: De plug-in vraagt de gebruiker om de TrackEM2-bestanden op te slaan. Sla indien nodig de TrackEM2-bestanden op in de afbeeldingsmap. Er moeten drie vensters worden weergegeven: een projectvenster, een venster voor stapelnavigatie (links) en een deelvenster voor stapelvisualisatie (afbeelding 2B).
  4. Klik met de rechtermuisknop op het zwarte visualisatievenster. Klik op | importeren Importeer de stapel en selecteer de eerder gemaakte stapel.
  5. Klik op OK om de stapel in het navigatievenster van de stapel te laden.
    OPMERKING: Er verschijnt een segmentscheidingsvenster waarin om de pixel- en dimensierelatie wordt gevraagd. Voor alleen stapeluitlijning klikt u op OK om deze stap over te slaan.
  6. Gebruik de schuifregelaar om alle segmenten van de stapel te controleren. Zoek naar het geladen segment, dat als patch in het navigatieplan wordt weergegeven. Selecteer de patches die in de volgende uitlijning worden opgenomen.
    OPMERKING: Geselecteerde patches worden blauw.
  7. Plaats de muisaanwijzer op het weergavevenster. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Uitlijnen | Stapelsegmenten uitlijnen (afbeelding 2C-1).
  8. Geef de uitlijningsparameters op via een set van drie opeenvolgende vensters.
    OPMERKING: Begin voor de meeste gegevens met een rigide uitlijning (maakt rotatie en translatie mogelijk, maar geen transformatie) en houd andere parameters als standaard (figuur 2C-2).
  9. Laat de uitlijning worden uitgevoerd totdat in het uitleeslogboek montage gereed staat.
    OPMERKING: Runtime is afhankelijk van het aantal voxels en de snelheid van de computer.
  10. Controleer de uitgelijnde stapel in het weergavevenster. Druk op alt- en - toetsen (op pc) of op Ctrl en - (in Mac) voor een uitzoomweergave van de uitgelijnde stapel.
  11. Als u tevreden bent met de uitgelijnde stapel, klikt u met de rechtermuisknop op Exporteren | Maak een platte afbeelding om de uitgelijnde stapel op te slaan.
  12. Selecteer de eerste afbeelding als het begin van de stapel en de laatste afbeelding als het einde van de stapel, klik op OK (Afbeelding 2C-3). Sla de uitgelijnde stapel op als .tif.
    OPMERKING: Als u de bestandsgrootte wilt verkleinen, snijdt u de gegevens bij zodat ze alleen het benodigde interessegebied bevatten.
  13. Voer indien nodig een affiene uitlijning uit op de uitgelijnde stapel. Open de uitgelijnde stapel in Fiji, selecteer Plugin | Registratie | StackReg.
  14. Kies de optie affiene en druk op OK. Wacht tot het programma is voltooid.
  15. Sla de affiene uitgelijnde stapel op met een andere bestandsnaam.

7. Segmentatie en 3D reconstructie

  1. Open Amira42. Klik op Bestand | Open Gegevens om de uitgelijnde stack te laden.
  2. Geef de voxelmetingen op in het nieuwe pop-upvenster (figuur 3A).

Figure 3
Figuur 3: Segmentatie van seriële stack met behulp van Amira. (A) Het Voxel-definitie pop-upvenster voordat een uitgelijnde stack wordt geladen. (B) Screenshot van de projectinterface na het importeren van een stack. Selecteer het tabblad Segmentatie om objecttracering te starten in het deelvenster Segmentatie-editor. (C) Belangrijkste kenmerken van het segmentatietabblad. Definieer de objecten voor segmentatie in de sectie Segmentatie-editor van het tabblad Segmentatie. Gebruik de zoomfunctie om objecten te identificeren. Selecteer het penseel en trek de grens van het object over. Klik op het symbool + onder Selectie om de tracering toe te wijzen. Een toegewezen object lijkt een rode grens te hebben in het deelvenster met orthoslice. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Er verschijnt een afbeeldingsstapelknooppunt in de projectinterface en een orthoslice in het weergavevenster aan de rechterkant (afbeelding 3B).

  1. Als u segmentatie wilt starten, selecteert u het tabblad Segmentatie (afbeelding 3B).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de voortgang van de segmentatie voor en tijdens de segmentatie op te slaan. Ga naar Model | Model opslaan als elk .am-bestand dat past.
  2. Klik op Nieuw in het deelvenster segmentatie-editor om nieuwe objecten in de materiaallijst te definiëren. Klik met de rechtermuisknop om de kleur van het object te wijzigen en dubbelklik om de naam van het object te wijzigen.
  3. Voor handmatige segmentatie kiest u het segmentatiegereedschap onder de materiaallijst. Selecteer het standaardpenseel om de pixels te markeren (Afbeelding 3C).
    OPMERKING: U kunt ook het penseel gebruiken om de omtrek van het object te traceren en op Shift + F drukken om het object te vullen.
  4. Als u het penseelgereedschap wilt omzetten in een gum, drukt u voortdurend op Ctrl terwijl u pixels selecteert voor correctie. Annoteer elk plakje in de stapel.
  5. Eenmaal bevestigd, wijst u de selectie toe aan een label door op het + -teken te klikken. Klik op het teken - om de selectie te verwijderen.
  6. Ga terug naar de projectinterface zodra de segmentatie is voltooid. Zoek naar een knooppunt met de extensie ".label" die is verbonden met de afbeeldingsstapel.
  7. Klik met de rechtermuisknop op de extensie ".label" en selecteer Surface genereren | Solliciteer om een SURF-bestand te maken.
  8. Als u het 3D-model van een gesegmenteerd object wilt renderen, klikt u met de rechtermuisknop op het SURF-bestand en selecteert u Surface-weergave om een 3D-model te genereren in het weergavevenster.
  9. Sla het 3D-model op voor visualisatie of verdere kwantitatieve analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor deze techniek worden interessante regio's geselecteerd op basis van het biologische onderzoeksdoel en geïdentificeerd voorafgaand aan het trimmen en doorsnijden van ingebed weefsel. Evenzo kan de grootte van het blokvlak worden bepaald door de onderzoeksvraag; in dit geval werd het monster bijgesneden om een blokvlak van ongeveer 0,3 mm x 0,15 mm achter te laten (figuur 4A). Dit maakte twee rasters van 9 seriële secties per raster mogelijk, die 18 seriële secties leverden en een volume leverweefsel van een volume van ongeveer 62 μm3 (316 μm x 150 μm x 1,3 μm) bevatten. Dit volume was voldoende om de volledige 3D-reconstructie van individuele mitochondriën in leverweefsel mogelijk te maken.

Figure 4
Figuur 4: Segmentatie en 3D-reconstructie van de morfologie van ER en geassocieerde ER-mitochondriale contacten. (A) Overzicht van lint van seriële secties in de TEM. (B) Weergave met lage vergroting van de interessante regio en contextuele oriëntatiepunten voor verplaatsing. Schaalstaven = 40 μm (i), 20 μm (ii), 5 μm (iii), 1 μm (iv). (C) Links: EM-tomogram van twee geapoeteerde hepatocyten. Rechts: gesegmenteerde versie van hetzelfde tomogram. Spoor van de ER (geel), mitochondriën (cyaan) en intermembraancontacten tussen het ER en mitochondriën van verschillende ruimte: 0-20 nm (magenta); 21-100 nm (blauw). (D) Een orthoslice geïsoleerd uit het gereconstrueerde model met alleen het ER en de verschillende membraancontacten, overeenkomend met het met pijl geannoteerde gebied in de inzet. (E) 3D reconstructie van de gesegmenteerde organellen en ER-mitochondria contacten onder verschillende hoeken. Afkortingen: ER = endoplasmic reticulum; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie; mt = mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Visualisatie van de seriële secties door TEM bij lage vergroting helpt bij het identificeren van het aangewezen interessegebied en de context ervan in de rest van het weefsel (figuur 4B). Deze afbeeldingen kunnen worden gebruikt om dezelfde interessante regio in volgende secties te vinden. Een gebied van belang met een goede conservering op een grens tussen twee gearonte hepatocyten werd hier geselecteerd en gepresenteerd. Hogere vergrotingsbeeldvorming maakt het mogelijk om de morfologische details van de verschillende organellen (figuur 4C) met nm-resolutie waar te nemen. Om twee soorten ER-organelassociaties te illustreren, werden geselecteerde mitochondriën en het ER gesegmenteerd, waarbij handmatig de rand van de membranen met een verbeterde elektronendichtheid werd getraceerd. Daarna werd het penseelgereedschap ingesteld op een vaste nm /px-dikte (figuur 3B) en gebruikt om de grens van het betreffende organel te volgen om de gebieden tussen de twee beoogde organellen te markeren die zich binnen een gespecificeerde contactafstand tot elkaar bevonden en konden worden aangeduid als een bepaalde klasse van organelcontacten. Figuur 4D toont een gekantelde orthoslice bedekt met segmentatiesporen en de relatieve positie (pijlpunt in het inlaat 3D-model) binnen het hele mitochondrion.

De sporen kregen verschillende kleuren toegewezen, werden na segmentatie gereconstrueerd tot een 3D-model en weergegeven in verschillende richtingen (figuur 4E). De ER (gele) structuur bleek gedeeltelijk transparant te zijn in de middelste panelen om de ER-mitochondria contacten en mitochondriën (cyaan) eronder te visualiseren. De voor- en achterkant van het model onthullen een asymmetrische verdeling van interorganelle contacten van verschillende intermembrane afstanden. Intermembraanruimte kleiner dan 21 nm werd toegewezen als ER-mitochondria contact (roze) omdat functies zoals lipidenoverdracht op deze afstand haalbaar zijngemeld 43. De intermembraanruimte (blauw) tussen 21 en 100 nm werd ook geannoteerd omdat dit gebied de recent gerapporteerde mitochondria-ruwe-ER-associaties44 kan vertegenwoordigen. Wikkelende ER-structuren met vergelijkbare kromming werden waargenomen in het 3D-model (figuur 4E). Figuur 4D toont een voorbeeld van veranderende intermembraanafstand (~40 nm → ~20 nm → ~40 nm) tussen de wikkelende ER-cisternae en de mitochondriën. De methode maakt follow-up patchanalyse van deze twee verschillende intermembrane ruimten mogelijk, zodat kwantitatieve analyse van hun abundantie, verdeling en topologie mogelijk is.

Betreft Seriële tomografie Seriële sectie TEM FIB-SEM SBF-SEM Array Tomografie
Laterale (x,y) resolutie 0,5 nm 0,5 nm 2 nm 2 nm 2 nm
(Minimale px-grootte)
Axiale (z) resolutie 1 nm 50 nm 4 nm 20 nm 50 nm
(Minimale px diepte) Beperkt tot sectiedikte Beperkt tot sectiedikte
Volumebereiken van gegevens in typische toepassingen 0,1 - 50 μm3 10 - 250 μm3 10 - 1 x 104 μm3 10 – 1 x 1012 μm3 10 - ∞ μm3
De monsters opnieuw bekijken of opnieuw bekijken Mogelijk Mogelijk Niet mogelijk Niet mogelijk Mogelijk
Kosten van de apparatuur ££ £ ££ ££ ££
(voorbeelden van instrumenten) (200 kV TEM) (120 kV TEM) (FIB-SEM) (SBF-SEM) (SEM+AT)
Kosten van onderhoud van apparatuur ££ £ ££ ££ £

Tabel 1: Overzicht van volume-elektronenmicroscopietechnieken. Afkortingen: EM = elektronenmicroscopie; TEM = transmissie-EM; FIB-SEM = gefocusseerde ionenbundel SEM; SBF-SEM = seriële blok gezicht SEM; SEM + AT = SEM met Array Tomografie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een toegankelijke vEM-techniek voor het visualiseren van organelstructuur en interacties in 3D wordt in dit protocol beschreven. De morfologie van interorganelle contacten in hepatocyten wordt hier gepresenteerd als een casestudy. Deze aanpak is echter ook toegepast om een verscheidenheid aan andere monsters en onderzoeksgebieden te onderzoeken, waaronder Schwann cel-endotheelinteracties in perifere zenuwen45, Weibel Palade Body biogenese in endotheelcellen46, ladingsecretie in niercellen47 en synapsmorfologie in hippocampale neuronen48 . Om de leverbiologie beter te begrijpen, kan deze benadering worden gebruikt om hepatocytenmorfologie in 2D-celkweek, 3D-hepatische organoïde modelsystemen49 en leverweefsel te onderzoeken. Deze robuuste en flexibele aanpak kan door veel laboratoria worden gebruikt met toegang tot een conventionele 120 kV transmissie-elektronenmicroscoop en ultramicrotoom en vereist geen dure monstervoorbereidingstechnieken.

Hoewel dit een toegankelijk protocol is, is het belangrijk op te merken dat er alternatieve vEM-technieken zijn die bepaalde voordelen kunnen bieden aan de onderzoeker, afhankelijk van de onderzoeksvraag; zie tabel 1 voor een overzicht 6,50,51. Vaak zijn de resolutie en het volume van de benodigde gegevens direct van invloed op de keuze van de onderzoekers voor de vEM-techniek en het gemak en de snelheid waarmee het project kan vorderen. FIB-SEM kan bijvoorbeeld zeer dunne lagen uit het monster verwijderen voorafgaand aan de beeldvorming, wat resulteert in een uitstekende z-resolutie (z-dikte zo laag als 4 nm) en mogelijk volumetrische 3D-gegevens levert met isotrope voxels. Dit maakt visualisatie van de gegevens met gelijke resolutie vanuit elke hoek mogelijk, wat soms duidelijke voordelen kan bieden wanneer contactpunten moeilijk te onderscheiden zijn 52,53. FIB-SEM kan grote volumes genereren, maar is vaak kostbaar en tijdrovend, terwijl SBF-SEM een uitstekende techniek is om te gebruiken wanneer grotere volumes nodig zijn, bijvoorbeeld 100s tot 1000s van secties54. SBF-SEM en arraytomografie bieden een vergelijkbare xy-resolutie als FIB-SEM, maar met een lagere z-resolutie. Omdat arraytomografie het verzamelen van fysieke secties omvat, is de z-resolutie misschien wel de slechtste van zijn concurrenten (z-dikte 50+ nm), maar heeft verschillende duidelijke voordelen. Omdat het een niet-destructieve techniek is, kan het monster met verschillende xy-resoluties opnieuw worden bekeken, met eenvoudige montaging, op verschillende tijdstippen en in tal van regio's, waardoor volledige context en detail in één monster kunnen worden gewaardeerd. Seriële sectie TEM deelt dit voordeel ook; Omdat secties echter op TEM-rasters moeten worden verzameld, is het beter geschikt voor kleinere volumes waarvoor minder secties moeten worden verzameld voordat ze worden afgebeeld. Het is echter compatibel met TEM-kanteltomografie, een techniek die een zeer hoge z-resolutie (z-dikte zo laag als 2 nm) van zeer kleine volumes biedt, waardoor indien nodig verdere ondervraging van specifieke contactlocaties van belang mogelijk is.

Ongeacht de vEM-aanpak is het behoud van monsters van cruciaal belang voor het succes van het project. Het fixatiemedium moet een isotone match zijn met de weefsels en de overdracht naar het fixatiemedium moet snel worden uitgevoerd om uitdroging van de weefsels te voorkomen55. Leverweefsel kan een uitdaging zijn om te behouden, en hoewel het uitstekende conservering biedt, waardoor leverweefsel kan worden vastgehouden voor aanvullende experimenten, is volledige leverperfusie voor elektronenmicroscopie vaak niet mogelijk. Leverwignaaldperfusie is een uitstekend alternatief56. Cryo-implantatie is ook een optie, maar vereist onmiddellijke hogedrukbevriezing om homogene vitrificatie van verse vibratome-secties te bereiken; deze aanpak is dus een behoorlijke uitdaging. Na de eerste fixatie zijn er verschillende em-monstervoorbereidingsprotocollen die bevredigende resultaten opleveren. Een routine TEM-protocol wordt hier gepresenteerd57, maar "enbloc megametal" -protocollen zijn ook met succes gebruikt met andere biologische monsters45,58. Hoewel deze "enbloc megametal" -protocollen meer contrast in het monster bieden, waardoor sommige structuren een zwaarder gekleurd uiterlijk krijgen, hebben ze ook het voordeel dat ze de vereiste voor vleksecties verwijderen, waardoor het risico op het toevoegen van ongewenste vleksprint op monsters en schadelijke roosters in het proces wordt verminderd.

Een andere cruciale stap in dit protocol is ultradunne sectie en lintverzameling. Het verzamelen van seriële secties van het wateroppervlak van de snijboot is een handmatig proces dat kan leiden tot beschadigde en ontbrekende secties. Als secties bijvoorbeeld niet aan elkaar hechten en stabiele linten vormen, kan contactcement op de voorrand van het blokvlak worden aangebracht om de linten te stabiliseren13. De duur en het routinematige succes van deze stap zijn vaardigheidsafhankelijk59. Hoewel een overvloed aan modelspecifieke sectiekeuzemethoden60,61 beginners in verwarring kan brengen, kunnen enkele eenvoudige, praktische handleidingen55,62 voor routinematig sectiewerk, samen met oefening, de sectievaardigheden aanzienlijk verbeteren. Dit protocol vereist minimale specialistische apparatuur en biedt met behulp van videobeelden die de praktische aspecten van handmatige manipulatietechnieken tijdens secties, lintloslating en lintbehandeling en pick-up laten zien, een uitstekende beginnershandleiding voor seriële secties.

Volume EM-beeldanalyse blijft een gebied van ontwikkeling met een verscheidenheid aan open-source en commerciële software-opties die momenteel beschikbaar zijn, en de lijst groeit voortdurend. Een selectie van software voor uitlijning (TrakEM241), 3D-segmentatie en reconstructie (Amira42) worden hier gepresenteerd; er zijn echter veel alternatieven beschikbaar voor uitlijning (bijv. Fiji, Register Virtual Slices63, Atlas5 en 3D-reconstructie (bijv. MIB64; Reconstrueer65; IMOD66). Voor relatief kleine analyseprojecten, ongeacht of de gegevens lokaal worden gegenereerd of afkomstig zijn uit openlijk gedeelde datastores (EMPIAR67, Open Organelle68), is handmatige segmentatie die hier wordt beschreven een toegankelijke en haalbare optie. Voor grotere datasets wenden veel gebruikers zich echter tot machine learning en kunstmatige intelligentie voor automatisering van deze taken69,70, evenals crowdsourcing-vrijwilligers71 of het combineren van beide72.

Uiteindelijk, na uitlijning en 3D-segmentatie, onthult 3D-reconstructie niet alleen de morfologie van de structuren in kwestie, maar, belangrijker nog, ook hun relatie met andere organellen, inclusief de unieke kenmerken van eventuele aanwezige contactlocaties. Deze organelcontacten kunnen verder worden geanalyseerd en kenmerken zoals het aantal contacten, contactoppervlak, volumes organellen en morfometrische parameters van de organellen kunnen worden geëxtraheerd en vergeleken tussen experimentele modellen70. Kwantificeringsopties zijn talrijk en hun relevantie varieert enorm, afhankelijk van de exacte onderzoeksvraag. Daarom zijn ze niet diepgaand behandeld als onderdeel van dit protocol.

Pathologische processen die organelcontacten beïnvloeden, zijn betrokken bij zowel de zeldzame (bijv. De ziekte van Wilson) als veel voorkomende (virale hepatitis en niet-alcoholische steatohepatitis) aandoeningen 73,74,75. De ER-mitochondria en mitochondria-lipidedruppelcontactplaatsen lijken bijvoorbeeld het lipidenmetabolisme in hepatocyten te reguleren; daarom is de studie van deze contacten van groot belang. Kortom, seriële sectie TEM en daaropvolgende 3D-reconstructie en -analyse is een krachtige techniek om interorganelle-contacten te ondervragen en hun relatieve belang in leverfuncties en ziekten te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro en Ania Straatman-Iwanowska voor de deskundige technische bijstand. We bedanken ook Stefan lableden en Ian J. White voor de nuttige discussies. J.J.B. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology aan de UCL, toekenningscode MC_U12266B. C.J.S. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit aan de UCL, toekenningscode MC_UU_00012/6. P.G. wordt gefinancierd door de European Research Council, subsidiecode ERC-2013-StG-337057.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325 (1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , Springer. New York, NY. (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24 (2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675 (2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102 (2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287 (2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180 (2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091 (2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873 (2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111 (2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043 (2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003 (2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480 (2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., et al. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. Beichel, R. R., Sonka, M., et al. 4241, Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605 (2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196 (2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273 (2021).

Tags

Biologie Nummer 184
Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chun Chung, G. H., Gissen, P.,… More

Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter