Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tredimensjonal karakterisering av Interorganelle kontaktsteder i Hepatocytter ved hjelp av seriell seksjon elektronmikroskopi

Published: June 9, 2022 doi: 10.3791/63496
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, University College London

Summary

En enkel og omfattende protokoll for å skaffe tredimensjonale detaljer om membrankontaktsteder mellom organeller i hepatocytter fra leveren eller cellene i andre vev.

Abstract

Transmisjonselektronmikroskopi har lenge vært ansett for å være gullstandarden for visualisering av cellulær ultrastruktur. Imidlertid er analysen ofte begrenset til to dimensjoner, noe som hemmer evnen til å beskrive den tredimensjonale (3D) ultrastrukturelle og funksjonelle forholdet mellom organeller fullt ut. Volumelektronmikroskopi (vEM) beskriver en samling teknikker som muliggjør forhør av cellulær ultrastruktur i 3D ved mesoskala, mikroskala og nanoskala oppløsninger.

Denne protokollen gir en tilgjengelig og robust metode for å skaffe vEM-data ved hjelp av seriell seksjonsoverføring EM (TEM) og dekker de tekniske aspektene ved prøvebehandling til digital 3D-rekonstruksjon i en enkelt, grei arbeidsflyt. For å demonstrere nytten av denne teknikken presenteres 3D ultrastrukturelle forholdet mellom endoplasmisk retikulum og mitokondrier og deres kontaktsteder i lever hepatocytter. Interorganelle kontakter tjener viktige roller i overføringen av ioner, lipider, næringsstoffer og andre små molekyler mellom organeller. Til tross for deres første oppdagelse i hepatocytter, er det imidlertid fortsatt mye å lære om deres fysiske egenskaper, dynamikk og funksjoner.

Interorganelle kontakter kan vise en rekke morfologier, varierende i nærheten av de to organellene til hverandre (vanligvis ~ 10-30 nm) og omfanget av kontaktstedet (fra punktering av kontakter til større 3D-cisternal-lignende kontakter). Undersøkelsen av nære kontakter krever høyoppløselig avbildning, og seriell seksjon TEM er godt egnet til å visualisere 3D ultrastrukturell interorganelle kontakter under hepatocytdifferensiering, samt endringer i hepatocyttarkitektur forbundet med metabolske sykdommer.

Introduction

Siden oppfinnelsen på 1930-tallet har elektronmikroskoper gjort det mulig for forskere å visualisere strukturkomponentene i celler og vev 1,2. De fleste undersøkelser har gitt 2D-informasjon, da bygging av 3D-modeller krever omhyggelig seriell seksjonsinnsamling, manuell fotografering, negativ behandling, manuell sporing og opprettelse og montering av 3D-modeller fra glassplater, plast eller Styrofoam 3,4. Nesten 70 år senere har det vært betydelige fremskritt i mange aspekter av prosessen, fra mikroskopytelse, seriell seksjonssamling, automatisert digital bildebehandling, sofistikert programvare og maskinvare for 3D-rekonstruksjon, visualisering og analyse til alternative tilnærminger for det som nå kalles samlet volum EM (vEM). Disse vEM-teknikkene vurderes generelt å gi 3D ultrastrukturell informasjon ved nanometeroppløsninger på tvers av mikronvekter og omfatter transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og nyere skanningselektronmikroskopiteknikker (SEM). se anmeldelser 5,6,7,8.

For eksempel bruker fokusert ionstråle SEM (FIB-SEM) en fokusert ionstråle inne i en SEM for å frese bort overflaten av blokken mellom sekvensielle SEM-bildeskanninger av blokkens overflate, slik at den gjentatte automatiserte fresingen / avbildningen av en prøve og bygge opp et 3D-datasett for rekonstruksjon 9,10. I motsetning bruker serieblokkflaten SEM (SBF-SEM) en ultramikrotomi inne i SEM for å fjerne materiale fra blokkflaten før bildebehandling11,12, mens matrisetomografi er en ikke-ødeleggende prosess som krever innsamling av serielle seksjoner, på coverlips, wafers eller tape, før du setter opp en automatisert arbeidsflyt for avbildning av interesseområdet i sekvensielle seksjoner i SEM for å generere 3D-datasettet13 . I likhet med matrisetomografi krever seriell seksjon TEM (ssTEM) at fysiske seksjoner samles inn før avbildning. Disse seksjonene samles imidlertid inn på TEM-rutenett og avbildet i en TEM 14,15,16. ssTEM kan utvides ved å utføre tilt tomografi 17,18,19. Seriell vippetomografi gir den beste oppløsningen i x, y og z, og selv om den har blitt brukt til å rekonstruere hele celler20, er det rimelig utfordrende. Denne protokollen fokuserer på de praktiske aspektene ved ssTEM som den mest tilgjengelige vEM-teknikken som er tilgjengelig for mange EM-laboratorier som for øyeblikket ikke har tilgang til spesialiserte seksjonerings- eller vEM-instrumenter, men som vil ha nytte av å generere 3D vEM-data.

Seriell ultramikrotomi for 3D-rekonstruksjon har tidligere vært ansett som utfordrende. Det var vanskelig å kutte rette bånd av jevn seksjonstykkelse, kunne ordne og plukke opp bånd av riktig størrelse, i riktig rekkefølge, på rutenett med tilstrekkelig støtte, men uten rutenettstenger som skjuler interesseområder, og viktigst av alt, uten å miste seksjoner, da en ufullstendig serie kan forhindre full 3D-rekonstruksjon21. Forbedringer av kommersielle ultramikrotomer, diamantskjæring og trimming av kniver 22,23, elektron lucent støttefilmer på rutenett21,24, og lim for å hjelpe seksjonsadhesjon og båndbevaring13,21 er bare noen av de inkrementelle fremskrittene gjennom årene som har gjort teknikken mer rutinemessig i mange laboratorier. Når serielle seksjoner er samlet inn, er seriell bildebehandling i TEM grei og kan gi EM-bilder med subnanometer px størrelser i x og y, slik at høyoppløselig avhør av subcellulære strukturer -et potensielt krav for mange forskningsspørsmål. Casestudien som presenteres her viser bruk av ssTEM og 3D-rekonstruksjon i studiet av endoplasmatisk retikulum (ER)-organelle kontakter i lever hepatocytter, hvor ER-organelle kontakter først ble observert 25,26.

Mens den er sammenhengende med atomkonvolutten, tar ER også nær kontakt med mange andre celleorganeller, inkludert lysosomer, mitokondrier, lipiddråper og plasmamembranen27. ER-organelle kontakter har vært involvert i lipidmetabolisme28, fosfoinositid og kalsiumsignalering29, autofagiregulering og stressrespons30,31. ER-organelle kontakter og andre interorganelle kontakter er svært dynamiske strukturer som reagerer på cellulære metabolske behov og ekstracellulære signaler. De har vist seg å variere morfologisk i størrelse og form og avstandene mellom organellemembraner32,33. Det antas at disse ultrastrukturelle forskjellene sannsynligvis vil gjenspeile deres forskjellige protein / lipidsammensetninger og funksjon34,35. Det er imidlertid fortsatt en utfordrende oppgave å definere interorganelle kontakter og analysere dem36. Derfor er det nødvendig med en pålitelig, men enkel protokoll for å undersøke og karakterisere interorganelle kontakter for videre undersøkelser.

Siden ER-organelle kontakter kan variere fra 10 til 30 nm i membran-til-membran separasjon, har gullstandarden for identifikasjon historisk vært TEM. Tynnseksjon TEM har avdekket spesifikk lokalisering av underdomene for residente ER-proteiner ved distinkte membrankontakter37. Tradisjonelt har dette avdekket ER-organelle kontakter med NM-oppløsning, men ofte bare presentert en 2D-visning av disse interaksjonene. VEM-tilnærminger avslører imidlertid den ultrastrukturelle presentasjonen og konteksten til disse kontaktsidene i 3D, noe som muliggjør full rekonstruksjon av kontakter og mer nøyaktig klassifisering av kontakter (punkt vs. rørformet vs. cisternal-lignende) og kvantifisering38,39. I tillegg til å være den første celletypen der ER-organelle kontakter ble observert25,26, har hepatocytter et omfattende system av andre interorganelle kontakter som tjener viktige roller i deres arkitektur og fysiologi28,40. Imidlertid mangler fortsatt grundig morfologisk karakterisering av ER-organelle og andre interorganelle kontakter i hepatocytter. Følgelig er hvordan interorganelle kontakter dannes og omdanner under regenerering og reparasjon spesielt relevant for hepatocyt biologi og leverfunksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrene ble plassert i samsvar med uk Home Office retningslinjer, og vev høsting ble utført i samsvar med UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Prøvefiksering og forberedelse

  1. Disseker levervevet i passende størrelsesstykker, ca. 8 mm x 8 mm x 3 mm, og legg bitene i varm fosfatbufret saltvann (PBS, 37 °C).
  2. Injiser romtemperatur (20-25 °C) fikseringsmiddel (1,5% glutaraldehyd i 1% sukrose, 0,1 M natriumkakroktylat) i leverbitene og overfør dem fra PBS til fiksering i opptil 20 minutter ved romtemperatur. Hold alltid vevet nedsenket i løsninger for å unngå tørking.
    MERK: Aldehyder er irriterende stoffer som er etsende og potensielt kreftfremkallende. Natriumkaktocylat er giftig ved svelging eller innånding. Alle fikseringer må håndteres mens du bruker passende personlig verneutstyr, og eksperimentet skal utføres i en avtrekkshette. God fiksering vil resultere i et fastere vev.
  3. Sett opp den vibrerende mikrotomen med et blad, et isbad og et kaldt PBS-fylt bufferbrett. Monter det første stykke fast levervev på en prøveholder med cyanoacrylatlim og overfør blokken til den vibrerende mikrotomen.
  4. Etter produsentens anbefalinger, nærmer du vevet og skjærer den faste leveren i 100 μm tykke skiver.
  5. Samle skivene ved hjelp av en spatel eller naturlig hårmaling og overfør dem til en 12- eller 24-brønns tallerken som inneholder iskald løsning (1,5% glutaraldehyd, 0,1 M natriumkaktocylat) på is. La skivene stå på is til alle prøvene er kuttet og klare til å bli behandlet videre.
  6. Velg skivene som inneholder interesseområdene for videre behandling og vask med mild agitasjon. Utfør tre, 5 min vasker med romtemperatur 0,1 M natriumkaktokylat i en 12- eller 24-brønns tallerken, slik at skivene har tilstrekkelig buffer til å bevege seg fritt.
    MERK: Generelt velges interesseområder basert på anatomiske egenskaper knyttet til det biologiske spørsmålet i studien og styres av områder av vevet som sannsynligvis vil være til stede i hele serien, for eksempel ikke på kanten av delen, og som er godt bevart.
  7. I en avtrekkshette, erstatt 0,1 M natriumkakroktylat med nytilberedt 1% osmium tetroxide / 1,5% kalium ferricyanid. Plasser den 12- eller 24-brønns retten i en forseglet beholder og overfør beholderen til et kjøleskap med farlige kjemikalier i 1 time.
    MERK: Osmium er ekstremt farlig ved inntak, innånding og hudkontakt. Kalium ferricyanid er irriterende og er skadelig ved innånding og hudkontakt. Håndter alltid med passende personlig verneutstyr, og utfør eksperimentet i en avtrekkshette.
  8. I en avtrekkshette, fjern osmium tetroxide/ kalium ferricyanid til en dedikert osmium avfallsflaske, og vask prøvene i 5 min med 0,1 M natriumkakroktylat tre ganger. La prøvene ligge i en forseglet beholder over natten ved 4 °C.
    MERK: Potensielt pausepunkt. Prøver kan lagres i 0,1 M natriumkakroktylat i en forseglet beholder ved 4 °C i uker med liten skade på bevaring. Kontroller at det er tilstrekkelig buffer for å unngå tørking.
  9. Inkuber prøvene med nytilberedt 1% tannsyre i 0,05 M natriumkaktokylat i 45 min i mørket ved romtemperatur.
    MERK: Tannsyre er irriterende og kan forårsake øyeskader. Bruk passende personlig verneutstyr og utfør eksperimentet i en avtrekkshette.
  10. Utfør tre 5 min vasker med ddH2O før dehydrering og innebygging.

2. Prøvedehydrering, Epon-harpiksinnbygging og montering

  1. Forbered Epon-harpiks i henhold til følgende forhold etter vekt (se trinn 2.2). Ta en balanse med et 100 ml engangs plastbeger som inneholder en rørestang. Klipp endene fra 5 engangsplast Pasteur pipetter og bruk disse til å overføre viskøse harpikskomponenter til begeret.
  2. Tilsett sekvensielt 19,2 g harpiks-812, 7,6 g DDSA, 13,2 g MNA og 0,8 g DMP-30 akselerator i begeret. Bruk den femte rene pasteurpipetten i plast til å blande harpikskomponentene grundig for hånd.
    MERK: Unngå å introdusere bobler, men sørg for tilstrekkelig blanding av bunnharpiksen med toppen for å oppnå en fargeendring og grov blanding av komponentlagene. Alle harpikskomponenter er irriterende og er skadelige ved innånding og hudkontakt. DMP-30 er etsende og kan forårsake hudkorrosjon. Bruk egnet personlig verneutstyr.
  3. Plasser begeret på en magnetisk røre og la det røre forsiktig, bland regelmessig harpiksen manuelt.
  4. Vask prøvene med mild agitasjon i 5 min med 70% etanol; gjenta én gang.
  5. Vask prøvene med mild agitasjon i 5 min med 90% etanol; gjenta én gang.
  6. Vask prøvene med mild agitasjon i 5 min med 100% etanol; gjenta én gang.
  7. Mens prøvene er i 100% etanol vasker i en avtrekkshette, lag en 50:50 (v / v) propylenoksid (PO): Epon blanding i et hetteglass med et propylenoksid (PO)-motstandsdyktig plastlokk. Klipp forsiktig, men sikkert på hetteglasslokket i glass, og hold fast i både lokk og hetteglass, rist eller virvel for å blande.
    MERK: Propylenoksid er et akutt giftig, brannfarlig irriterende middel som løser opp litt plast. Bruk passende personlig verneutstyr og utfør eksperimentet i en avtrekkshette.
  8. Etter trinn 2.6, inkuber prøvene med PO:Epon i 1 time i en PO-bestandig beholder (f.eks. aluminiumsbrett eller hetteglass i glass), med skånsom gynge-/agitasjon i avtrekkshetten.
  9. I avtrekkshetten overfører du prøvene til 100% Epon. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur i avtrekkshetten med gynging/rotasjon/agitasjon. Overfør PO:Epon-blandingen til en dedikert Epon-avfallsflaske i glass.
  10. Gjenta trinn 2.9 én gang.
  11. Monter eksemplene for innebygging. Avhengig av størrelsen på stykkene og interesseområdet, monterer du skivene direkte på prepolymeriserte harpiksstubber eller bygger dem flat inn for disseksjon og bygger dem inn på nytt på et senere tidspunkt.
    MERK: For flat innebygging kan en "cast-a slide" brukes til å bygge inn mange skiver samtidig. Rester harpiks kan brukes til å fylle bjelkekapsler og bakes for å lage prepolymeriserte stubber eller frosset til senere bruk.
  12. Når den er montert og dekket av tilstrekkelig harpiks til å fylle "støpt lysbilde"-hulrommet, baker du prøvene over natten i en 60 °C ovn.
    MERK: Potensielt pausepunkt. Prøver kan lagres ved romtemperatur i årevis.
  13. For å bygge inn på nytt, identifiser interesseområdet for de flate innebygde vevsskivene. Bruk en gullsmedsag, klipp ut vevet av passende størrelse (1 mm2 til 4 mm2) og legg inn på nytt ved hjelp av harpiks tilberedt, som i trinn 2.2, på toppen av en prepolymerisert blokk og bake over natten i en 60 °C ovn.
    MERK: Alternativt kan vevsstykket limes til en stubbe eller pinne med todelt epoksyharpiks. La det stå over natten. Potensielt pausepunkt.

3. Trimming og seriell seksjonering av innebygde prøver

MERK: Seksjonering er en lært ferdighet; brukere bør være dyktige til ultrathin seksjonering før forsøk på seriell seksjonering. Ettersom nøyaktige mikrotomkontroller varierer på tvers av produsenter, følger du produsentens instruksjoner og retningslinjer.

  1. Når prøven er låst i trimmeadapteren, bruker du et barberblad til forsiktig å trimme det innebygde harpiksvevet for å oppfylle følgende kriterier (se figur 1A,B):
    1. Forsikre deg om at det er en flat, topp overflate som utsetter vevet rundt interesseområdet.
    2. Sørg for at en trapesformet form med topp- og bunnkantene er rene og parallelle.
    3. Sørg for overordnede dimensjoner på 200-500 μm i x, 100-500 μm i y.
    4. Sørg for en asymmetrisk blokkansikt, for eksempel høyre hjørner på ~ 90 °, øvre venstre hjørne stump og venstre nedre hjørne akutt.
      MERK: En trimmende kryokube kan være et alternativt verktøy for et barberblad. De andre anbefalingene er for brukerkomfort for bestilling av seksjoner ved avbildning. Valgfritt: Hvis seksjoner ikke danner stabile bånd, kan en kontaktsement påføres forkanten av blokkflaten for å hjelpe bånddannelse. Barberblader er skarpe; pass på å holde barberbladet slik at utilsiktet glidning er usannsynlig å føre til personlig skade.

Figure 1
Figur 1: Seriell seksjon TEM arbeidsflyt. (A) Diagram over prøven i harpiksblokken. (B) Trim blokk for å generere en trapesformet form med kanter som er egnet for seriell seksjonering og asymmetrisk blokkansikt for å sikre kjent orientering. (C) Diagram som viser bånd av serielle seksjoner, som flyter på vannoverflaten i diamantknivbåten. (D) Diagram som viser delen og båndorganisasjonen, dikterer rekkefølgen på seksjoner, på et TEM-sporrutenett med 3 mm diameter. (E) TEM-avbildning og navigasjon. Vise bånd- og seksjonsrekkefølge og bruke "gule stjerneklistremerker" på skjermen for skjermreferanse for å sikre ny avbildning av samme interesseområde i etterfølgende deler. (F) Bildejustering og beskjæring. (G) Segmentering, 3D-rekonstruksjon og visualisering. Forkortelse: TEM = transmisjonselektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Når den er trimmet, overfør prøvebuen, sammen med chucken og prøven, til prøvearmen til mikrotomen, og plasser prøvebuen slik at buens reiseområde går fra topp til bunn; prøvebuen på plass.
  2. Plasser og lås diamantkniven i knivholderen, og pass på at skjærevinkelen er stilt inn riktig på kniven. Lås knivholderen godt inn i scenen.
  3. Når scenen lyser opp, bruk knivens fremrykning mens du hele tiden kontrollerer forholdet mellom blokkflaten og knivens kant. Før kniven forsiktig mot prøven, og juster knivens sidevinkel, prøvevinkel og prøverotasjon forsiktig ved å justere de aktuelle knottene til blokken er justert til knivens kant.
  4. Slå av sceneopplysingen. slå på scenen downlighting; sett toppen og bunnen av skjærevinduet på prøvearmen; og la prøven ligge like under knivkanten.
  5. Fyll knivbåten med ren ddH2O og sørg for at vannoverflaten er i vater med knivens kant og bare litt konkav.
  6. Valgfritt: Dypp en øyenvippe i 0,1 % Triton X-100 og deretter i knivbåtvannet for å redusere overflatespenningen på vannet for å hjelpe kloroforming og båndhenting.
  7. Forbered arbeidsstasjonen med øyevipper (øyenvippe limt til en cocktailpinne), formvarbelagte sporgitter, merkede crossover-tang, kloroform, 0,1% Triton X-100-løsning, destillert vann, filterpapir og rutenettboks med rutenettboksnotater.
  8. Sett skjærehastigheten på 1 mm/s og den første skjæretykkelsen til 100 nm og start skjæresyklusen.
  9. Når den første delen er kuttet, endrer du skjæreparametrene til en skjærehastighet på 0,8 mm/s og skjæretykkelsen til 70 nm, og fortsetter å kutte, slik at seksjonene kan danne et bånd som beveger seg nedover overflaten på den vannfylte knivbåten (figur 1C).
    MERK: Det er viktig å være klar over fargen på seksjonene som produseres, da dette ofte er en mer nøyaktig guide til tykkelsen på harpiksdelene. Sølvseksjoner er vanligvis rundt 70 nm tykke, mens grå seksjoner er tynnere og gullseksjoner er tykkere.
  10. La mikrotomet fortsette å kutte seksjoner og båndet for å bli lengre.
    MERK: Det er viktig å unngå store vibrasjoner og fysiske forstyrrelser i rommet. Utkast kan føre til at seksjonene beveger seg på overflaten av vannet i knivbåten, og fysiske vibrasjoner kan føre til at mikrotomet skjærer ujevnt.
  11. Når nok seksjoner er samlet inn og før båndet kommer til enden av båten, stopp kuttingen (like etter at prøven har passert knivens kant).
    MERK: Antall seksjoner som trengs, avhenger av størrelsen på blokkflaten og størrelsen på datasettet som skal samles inn. Dermed er det nyttig å være klar over forholdet mellom størrelsen på blokken og sporrutenettet når kuttdelene kommer av.
  12. Bruk en øyenvippe i hver hånd, og bryt båndet forsiktig inn i mindre bånd som får plass i lengden på sporrutenettet, og pass på å notere seg deres relative posisjoner fra prøven.
    MERK: Hvis den kombinerte bredden passer, kan flere bånd plasseres forsiktig ved siden av hverandre og plukkes opp sammen i ett enkelt sporrutenett. Hvis du plukker opp flere bånd på ett enkelt sporrutenett, må du være oppmerksom på rekkefølgen og den relative plasseringen av båndene. Du må for eksempel alltid plassere båndene lenger inn i eksemplet til høyre for et bånd som allerede finnes i eksemplet (figur 1D).
  13. Valgfritt: Bruk en glassapplikatorstang til å sveve en dråpe kloroform over seksjonene for å flate dem ut.
    MERK: Kloroform er giftig og irriterende. Ikke la kloroform berøre vannoverflaten eller seksjonene. Hvis det ved et uhell gjør det, må vannet fjernes og kniven vaskes før den går tilbake til seksjonering. Kloroformen kan skade seksjonene og forringe limet som fester diamanten inn i knivbåten.
  14. Bruk de første nummererte tangene til å plukke opp det første tomme sporgitteret (på høyre side av sporet, formvar-siden ned), dypp forsiktig i Triton X-100, og deretter to ganger i destillert vann før du fjerner overflødig vann fra tangkanten ved hjelp av et stykke filterpapir.
  15. Med en øyenvippe i den ene hånden og tangene i den andre hånden, senk forsiktig ca. 2/3rd av det formvarbelagte sporgitteret i vannet på knivbåten (bort fra seksjonene), slik at formvar-siden vender ned, og høyre langkant av sporet er på overflaten av vannet og parallelt med vannkanten.
  16. Vift forsiktig rutenettet i vannet mot båndene slik at seksjonene når returslaget driver mot rutenettet. Fortsett å gjøre dette i mindre og mindre vifter til høyre kant av båndet er på linje med høyre kant av sporet. Deretter, med den siste waften, ta forsiktig rutenettet opp for å plukke seksjonene opp i sporgitteret.
  17. La rutenettet ligge i tangene for å tørke før du lagrer det i rutenettboksen, riktig kommentert på referansearket for rutenettboksen.
  18. Gjenta trinn 3.16 til alle båndene er samlet inn, slik at båndrekkefølgen opprettholdes.
  19. Hvis det er behov for flere seksjoner, trekk kniven tilbake 150 nm eller så, kontroller vannstanden i båten, og tilsett mer om nødvendig. Start skjæreprosessen på nytt ved å følge trinn 3.11-3.18.
  20. Når alle seksjonene er samlet inn, må du sørge for at knivkanten er fri for seksjonsrester, trekke kniven bort fra blokkflaten og fjerne og rengjøre kniven.

4. Farge på rutenettet

  1. Når de er tørre, kan du farge delene med Reynolds' blysitrat enten på parafilm på benken eller i en Petri-tallerken. Plasser flere pellets av natriumhydroksid under et Petri-parabolens lokk for å gi et karbondioksidfritt miljø. Deretter, forsiktig, vekk fra pellets, pipette 40 μL dråper Reynolds bly sitrat på parafilmen, en for hvert rutenett.
    MERK: Ikke flekk for mange rutenett samtidig; for eksempel bør maksimumet være 6. Prøv å ikke puste direkte på fargingsfatet. Karbondioksid kan reagere med blysitrat og forårsake uønsket bunnfall på rutenettene.
  2. Snu hvert rutenett (seksjonssiden ned) på blysitratdråpen og la det være beskyttet av Petri-parabolens lokk i 7 til 10 min. Mens gitteret flekker, lag et større andre stykke parafilm på benken med fem 300 μL dråper destillert vann for hvert rutenett.
  3. På slutten av blysitratinkubasjonen overfører du hvert rutenett til en dråpe destillert vann for å vaske i 1 min uten å puste direkte på gitteret.
  4. Gjenta trinn 4.3 totalt fem ganger.
  5. Bruk nummererte crossover tang, plukk opp det første rutenettet, berør kanten av rutenettet for å filtrere papir for å transportere bort det meste av vannet, og la det tørke i tangene (i minst 20 minutter). Gjenta dette for hvert rutenett.

5. Imaging oppkjøp av TEM

MERK: Ettersom nøyaktige TEM-kontroller varierer på tvers av produsenter, følger du produsentens instruksjoner og retningslinjer. Følgende trinn bør utføres av brukere som allerede er dyktige på TEM-bruk.

  1. Før avbildning utfører du de vanlige kontrollene, for eksempel strålejustering, forsterkningsreferanser og prøve-eusentrisitet.
  2. Last forsiktig det første rutenettet av serielle seksjoner inn i prøveholderen, pass på å justere sporet (og derfor seksjoner) til mikroskopets vertikale akse.
    MERK: Denne nøyaktigheten er ikke viktig, men sparer tid under anskaffelse og fremtidige datahåndteringsstadier. Når du setter inn rutenettet (inndelingssiden ned eller inndelingssiden opp), må du passe på å se alle rutenettene i samme retning.
  3. Ved lav forstørrelse må du følge rekkefølgen, plasseringen og plasseringen til de serielle delene (figur 1E). Naviger til den midterste delen av serien i rutenettet.
    MERK: Avhengig av det nøyaktige forskningsmålet, kan tilnærmingene for avbildning variere; Følgende er imidlertid et nyttig utgangspunkt. Formen på inndelingene og forholdet mellom båndene (som plukket opp i trinn 3.14) dikterer hvilken inndeling som var først, og hvilken inndeling som sist var i rutenettet.
  4. Bla gjennom eksemplet, og identifiser et område av interesse. Vær oppmerksom på prøven ved ønsket forstørrelse, og vurder å samle serien med en litt lavere forstørrelse, da seksjoner ofte ikke er perfekt justert, og bilder må kanskje beskjæres senere.
  5. Ta referansebilder med lavere forstørrelser for å sette pris på konteksten til interesseområdet, dens grove beliggenhet ved forskjellige forstørrelser i forhold til seksjonsgrenser og landemerkefunksjoner i eksemplet. Bruk disse til å signere området av interesse i andre seksjoner.
  6. Valgfritt: For skjermreferanse, bruk gjenbrukbart lim kitt, klistremerker eller et stykke overhead projektor (OHP) papir, tapet til skjermen, for å plassere midlertidige markører på skjermen for å tillate rutinemessig reimaging av de samme funksjonene i området av interesse i midten av bildet, gjennom hele datasettet (se gule stjerner i figur 1E).
  7. Bruk referansebildene til å navigere til interesseområdet i den første delen av rutenettet, og skaff deg et bilde ved ønsket forstørrelse.
    MERK: Når du lagrer bilder, noterer du ned det første filnavnet på det første bildet i serien, og bruker sekvensiell navngivings nomenklatur slik at alle bildenavn følger den sekvensielle rekkefølgen til de serielle delene.
  8. Gå til neste inndeling, og gjenta trinn 5.7 til alle inndelingene er avbildet for det interesseområdet.

6. Registrering av bildeeksport og seriell seksjonsjustering

  1. Eksporter bildefilene som tilhører samme stakk, til én enkelt mappe. Kontroller at mappen er sortert etter filnavn.
    MERK: Bildene skal ideelt sett ha samme rotnavn og følge rekkefølgen de er anskaffet i.
  2. Åpne Fiji og klikk på Fil | Importere | Bildesekvens.
  3. Klikk på det første bildet av mappen og klikk Åpne. Vent til et popup-vindu med sekvensalternativer vises (figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Opprettelse av en seriell stakk og seriell seksjonsjustering ved hjelp av Fiji. (A) Skjermbilde som viser sekvensalternativene når du laster inn bildene for å lage en seriell stakk. (B) Skjermbilde av TrackEM2-plugin og nøkkelvinduene til plugin-modulen. Trykk OK i stykkeseparasjonen for å fortsette justeringen. (C) Skjermbilde etter at seriestakken er lastet inn i visualiseringsruten. Tre sekvensielle vinduer med justeringsparametere vises når Juster stakkstykker er valgt. Eksporter den justerte stakken når justeringen er fullført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Klikk Sorter navn numerisk | Konverter til 8-biters alternativ. Trykk OK.
    MERK: Konvertering til 8-biters hjelper deg med å importere dataene til Amira og reduserer filstørrelsen, noe som gir raskere behandlingshastigheter i senere trinn.
  2. Kontroller fullstendigheten, sekvensen og forstørrelsen av den opprettede stakken. Lagre den opprettede stakken som en .tif fil.
    MERK: Bilder skal ha blitt anskaffet med samme forstørrelse.
  3. Utfør TrakEM2-plugin41. Gå til Fil | Nytt | TrackEM2 (tom).
    MERK: Plugin-modulen vil be brukeren om å lagre TrackEM2-filene. Lagre om nødvendig TrackEM2-filene i bildemappen. Tre vinduer skal vises: et prosjektvindu, et stabelnavigasjonsvindu (til venstre) og en stakkvisualiseringsrute (figur 2B).
  4. Høyreklikk til den svarte visualiseringsruten. Klikk Importer | Importer stakken , og velg den tidligere opprettede stakken.
  5. Klikk OK for å laste inn stakken i stakknavigasjonsvinduet.
    MERK: Et stykkeseparasjonsvindu dukker opp for å be om piksel- og dimensjonsforhold. Hvis du bare vil ha stakkjustering, klikker du OK for å hoppe over dette trinnet.
  6. Bruk glidebryteren til å kontrollere alle delene i stabelen. Se etter det lastede stykket, som vises som en oppdatering i navigasjonsplanen. Velg oppdateringene som skal inkluderes i følgende justering.
    MERK: Utvalgte oppdateringer blir blå.
  7. Hold musen over visningsruten. Høyreklikk bildet, velg Juster | Juster stakkstykker (figur 2C-1).
  8. Angi justeringsparameterne gjennom et sett med tre sekvensielle vinduer.
    MERK: For de fleste data starter du med en stiv justering (tillater rotasjon og oversettelse, men ikke transformasjon) og beholder andre parametere som standard (figur 2C-2).
  9. Tillat justeringen å kjøre til avlesningsloggen sier Montasje ferdig.
    MERK: Kjøretid avhenger av antall voxels og hastigheten på datamaskinen.
  10. Kontroller den justerte stakken i visningsruten. Trykk alt - og - tastene (i PC) eller Ctrl - og - tastene (i Mac) for å zoome ut av den justerte stakken.
  11. Hvis du er fornøyd med den justerte stakken, høyreklikker du Eksporter | Lag et flatt bilde for å lagre den justerte stakken.
  12. Velg det første bildet som starten på stabelen og det siste bildet som slutten av stabelen, og klikk OK (figur 2C-3). Lagre den justerte stakken som .tif.
    MERK: Hvis du vil redusere filstørrelsen, beskjærer du dataene slik at de bare inneholder det nødvendige interesseområdet.
  13. Hvis det er nødvendig, utfører du en affinejustering på den justerte stakken. Åpne den justerte stakken i Fiji, velg Plugin | Registrering | StackReg.
  14. Velg affine-alternativet , og trykk OK. Vent til programmet er fullført.
  15. Lagre den affinejusterte stakken med et annet filnavn.

7. Segmentering og 3D-rekonstruksjon

  1. Åpne Amira42. Klikk Fil | Åpne Data for å laste inn den justerte stakken.
  2. Angi voxel-målene i det nye popup-vinduet (figur 3A).

Figure 3
Figur 3: Segmentering av serieltabel ved hjelp av Amira. (A) Popup-vinduet voxel definition før du laster inn en justert stakk. (B) Skjermbilde av prosjektgrensesnittet etter import av en stakk. Velg Segmentering-fanen for å starte objektsporing i segmenteringsredigeringspanelet. (C) Viktige funksjoner i segmenteringsfanen. Definer objektene for segmentering under Segmenteringsredigering på fanebladet Segmentering. Bruk zoomfunksjonen til å hjelpe til med identifisering av objekter. Velg penselverktøyet, og spor grensen til objektet. Klikk +-symbolet under Utvalg for å tilordne sporingen. Et tilordnet objekt ser ut til å ha en rød grense i den ortopediske visningsruten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: En bildestakknode vises i prosjektgrensesnittet, og en ortopedisk vises i visningsruten til høyre (figur 3B).

  1. Hvis du vil starte segmenteringen, velger du segmenteringsfanen (figur 3B).
    MERK: Det anbefales å lagre segmenteringsfremdriften før og under segmenteringen. Gå til Modell | Lagre modell som en hvilken som helst AM-fil som passer.
  2. Klikk Ny i segmenteringsredigeringspanelet for å definere nye objekter i materiallisten. Høyreklikk for å endre fargen på objektet, og dobbeltklikk for å gi nytt navn til objektet.
  3. For manuell segmentering velger du segmenteringsverktøyet under materiallisten. Velg standard penselverktøy for å utheve bildepunktene (figur 3C).
    MERK: Alternativt kan du bruke penselverktøyet til å spore omrisset av objektet og trykke SKIFT + F for å fylle objektet.
  4. Hvis du vil konvertere penselverktøyet til et viskelær, trykker du kontinuerlig CTRL mens du merker bildepunkter for korrigering. Sett inn merknader i hvert stykke i stabelen.
  5. Når det er bekreftet, tilordner du valget til en etikett ved å klikke på +- tegnet. Klikk - for å fjerne det merkede området.
  6. Gå tilbake til prosjektgrensesnittet når segmenteringen er fullført. Se etter en node med filtypen LABEL som er koblet til bildestakken.
  7. Høyreklikk utvidelsen ".label", og velg Generer Surface | Bruk for å opprette en SURF-fil.
  8. Hvis du vil gjengi 3D-modellen for et segmentert objekt, høyreklikker du SURF-filen og velger Overflatevisning for å generere en 3D-modell i visningsruten.
  9. Lagre 3D-modellen for visualisering eller ytterligere kvantitative analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For denne teknikken velges interesseområder basert på det biologiske forskningsmålet og identifiseres før trimning og seksjonering av innebygd vev. På samme måte kan størrelsen på blokkflaten dikteres av forskningsspørsmålet; I dette tilfellet ble prøven trimmet for å etterlate en blokkskive på ca. 0,3 mm x 0,15 mm (figur 4A). Dette tillot to gitter på 9 serielle seksjoner per rutenett, noe som gir 18 serielle seksjoner og inkorporerer et volum levervev på et volum på ca. 62 μm3 (316 μm x 150 μm x 1,3 μm). Dette volumet var tilstrekkelig til å tillate fullstendig 3D-rekonstruksjon av individuelle mitokondrier i levervev.

Figure 4
Figur 4: Segmentering og 3D-rekonstruksjon som gjennomgår morfologien til ER og tilhørende ER-mitokondrier. (A) Oversikt over bånd av serielle seksjoner i TEM. (B) Lav forstørrelsesvisning av interesseområde og kontekstuelle landemerker for flytting. Skalastenger = 40 μm (i), 20 μm (ii), 5 μm (iii), 1 μm (iv). (C) Venstre: EM tomogram av to apposed hepatocytter. Høyre: segmentert versjon av samme tomogram. Spor av ER (gul), mitokondrier (cyan) og intermembrane kontakter mellom ER og mitokondrier i forskjellig rom: 0-20 nm (magenta); 21-100 nm (blå). (D) En ortopedisk isolert fra den rekonstruerte modellen som bare viser ER og de forskjellige membrankontaktene, som tilsvarer det pil kommenterte området i innfellingen. (E) 3D-rekonstruksjon av segmenterte organeller og ER-mitokondrier kontakter i forskjellige vinkler. Forkortelser: ER = endoplasmic retikulum; TEM = transmisjonselektronmikroskopi; mt = mitokondrier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Visualisering av de serielle seksjonene av TEM ved lav forstørrelse bidrar til å identifisere det angitte interesseområdet og dets kontekst i resten av vevet (figur 4B). Disse bildene kan brukes til å finne samme interesseområde i etterfølgende seksjoner. En interesseregion som viser god bevaring ved en grense mellom to apposed hepatocytter ble valgt og presentert her. Høyere forstørrelsesavbildning gjør det mulig å observere de morfologiske detaljene i de forskjellige organellene (figur 4C) med NM-oppløsning. For å illustrere to typer ER-organelle assosiasjoner ble utvalgte mitokondrier og ER segmentert, og sporet manuelt kanten av membranene som presenterer med forbedret elektrontetthet. Etterpå ble børsteverktøyet satt til en fast nm/px-tykkelse (figur 3B) og brukes til å følge grensen til organellen av interesse for å markere regionene mellom de to målrettede organellene som var innenfor en spesifisert kontaktavstand til hverandre og kunne betegnes som en bestemt klasse organellekontakter. Figur 4D viser en vippet ortopedisk overlagt med segmenteringsspor og den relative posisjonen (pilspiss i innløpsmodellen for 3D) i hele mitokondrinen.

Sporene ble tilordnet forskjellige farger, rekonstruert til en 3D-modell etter segmentering, og vist i forskjellige retninger (figur 4E). ER -strukturen (gul) ble vist å være delvis gjennomsiktig i de midterste panelene for å visualisere ER-mitokondrienes kontakter og mitokondrier (cyan) under. Forsiden og baksiden av modellen avslører en asymmetrisk fordeling av interorganelle kontakter av forskjellige intermembrane mellomrom. Intermembrane plass mindre enn 21 nm ble tildelt som ER-mitokondrier kontakt (rosa) fordi funksjoner som lipid overføring har blitt rapportert å være mulig på denne avstanden43. Intermembrane rommet (blå) mellom 21 og 100 nm ble også kommentert fordi denne regionen kan representere den nylig rapporterte mitokondri-grov-ER foreninger44. Innpakning av ER-strukturer av lignende krumning ble observert i 3D-modellen (figur 4E). Figur 4D viser et eksempel på å endre intermembrane avstand (~40 nm → ~20 nm → ~40 nm) mellom innpakningen ER cisternae og mitokondriene. Metoden tillater oppfølgingsplasteranalyse av disse to distinkte intermembrane områdene, slik at kvantitativ analyse av deres overflod, distribusjon og topologi er mulig.

Bekymringer Seriell tomografi Seriell inndeling TEM FIB-SEM SBF-SEM Matrisetomografi
Lateral oppløsning (x,y) 0,5 nm 0,5 nm 2 nm 2 nm 2 nm
(Minimum px-størrelse)
Aksial oppløsning (z) 1 nm 50 nm 4 nm 20 nm 50 nm
(Minimum px dybde) Begrenset til seksjonstykkelse Begrenset til seksjonstykkelse
Volumområder for data i vanlige programmer 0,1 - 50 μm3 10 - 250 μm3 10 - 1 x 104 μm3 10 – 1 x 1012 μm3 10 - ∞ μm3
Revisit eller reimage av prøvene Mulig Mulig Ikke mulig Ikke mulig Mulig
Kostnaden for utstyret ££ £ ££ ££ ££
(instrumenteksempler) (200 kV TEM) (120 kV TEM) (FIB-SEM) (SBF-SEM) (SEM+AT)
Kostnad for vedlikehold av utstyr ££ £ ££ ££ £

Tabell 1: Oversikt over mikroskopiteknikker for volumelektroner. Forkortelser: EM = elektronmikroskopi; TEM = overføring EM; FIB-SEM = fokusert ionstråle SEM; SBF-SEM = seriell blokk ansikt SEM; SEM + AT = SEM med matrisetomografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En tilgjengelig vEM-teknikk for visualisering av organellstruktur og interaksjoner i 3D er beskrevet i denne protokollen. Morfologien til interorganelle kontakter i hepatocytter presenteres som en casestudie her. Imidlertid har denne tilnærmingen også blitt brukt til å undersøke en rekke andre prøver og forskningsområder, inkludert Schwann celle-endotelinteraksjoner i perifere nerver45, Weibel Palade Body biogenese i endotelceller46, lastsekresjon i nyreceller47 og synapsemorfologi i hippocampale nevroner48. . For bedre å forstå leverbiologi, kan denne tilnærmingen brukes til å undersøke hepatocyttmorfologi i 2D-cellekultur, 3D leverorganoidmodellsystemer49 og levervev. Denne robuste og fleksible tilnærmingen kan brukes av mange laboratorier med tilgang til et konvensjonelt 120 kV overføringselektronmikroskop og ultramikrotomi og krever ikke dyre prøveprepareringsteknikker.

Selv om dette er en tilgjengelig protokoll, er det viktig å merke seg at det finnes alternative vEM-teknikker som kan gi visse fordeler for forskeren, avhengig av problemstillingen; se tabell 1 for oversikt 6,50,51. Ofte påvirker oppløsningen og volumet av dataene som trengs direkte forskernes valg av vEM-teknikken og hvor enkelt og raskt prosjektet kan utvikle seg. FIB-SEM kan for eksempel fjerne svært tynne lag fra prøven før avbildning, noe som resulterer i utmerket z-oppløsning (z-tykkelse så lav som 4 nm) og potensielt gi volumetriske 3D-data med isotrope voxels. Dette gjør det mulig å visualisere dataene med lik oppløsning fra alle vinkler, noe som noen ganger kan gi klare fordeler når kontaktpunkter er vanskelige å skjelne52,53. FIB-SEM kan generere store volumer, men er ofte kostbart og tidkrevende, mens SBF-SEM er en utmerket teknikk å bruke når større volumer kreves, for eksempel 100 til 1000 seksjoner54. SBF-SEM og matrisetomografi gir lignende xy-oppløsning som FIB-SEM, men med redusert z-oppløsning. Ettersom matrisetomografi innebærer å samle fysiske seksjoner, er z-oppløsningen kanskje den fattigste av konkurrentene (z tykkelse 50+ nm), men har flere forskjellige fordeler. Først og fremst, fordi det er en ikke-ødeleggende teknikk, kan prøven besøkes på nytt ved forskjellige xy-oppløsninger, med enkel montasje, til forskjellige tider og på tvers av mange regioner, slik at full kontekst og detaljer kan verdsettes i et enkelt utvalg. Seriell seksjon TEM deler også denne fordelen; Siden seksjoner må samles inn i TEM-rutenett, er det imidlertid bedre egnet for mindre volumer som krever at færre seksjoner samles før avbildning. Imidlertid er den kompatibel med TEM tilt tomografi, en teknikk som gir svært høy z-oppløsning (z tykkelse så lav som 2 nm) av svært små volumer, noe som muliggjør ytterligere avhør av spesifikke kontaktsteder av interesse om nødvendig.

Uansett hvilken vEM-tilnærming som tas, er prøvebevaring avgjørende for prosjektets suksess. Fikseringsmediet skal være en isotonisk match med vevet, og overføringen til fikseringsmediet bør gjøres raskt for å unngå tørking av vevet55. Levervev kan være utfordrende å bevare, og selv om det tilbyr utmerket bevaring, slik at oppbevaring av levervev for flere eksperimenter, er hele leverperfusjon for elektronmikroskopi ofte ikke mulig. Lever-kile nål perfusjon er et utmerket alternativ56. Kryoimmobilisering er også et alternativ, men krever umiddelbar høytrykksfrysing for å oppnå homogen vitrifisering av friske vibratome seksjoner; Dermed er denne tilnærmingen ganske utfordrende. Etter første fiksering er det en rekke EM-prøveforberedelsesprotokoller som gir tilfredsstillende resultater. En rutinemessig TEM-protokoll presenteres her57, men "enbloc megametal" protokoller har også blitt brukt med andre biologiske prøver45,58. Selv om disse "enbloc megametal" protokollene gir mer kontrast i prøven, noe som gir noen strukturer et mer farget utseende, har de også fordelen av å fjerne kravet om å flekke seksjoner, og dermed redusere risikoen for å legge til uønsket flekkutfelling på prøver og skadelige rutenett i prosessen.

Et annet kritisk trinn i denne protokollen er ultratynn inndeling og båndsamling. Innsamling av serielle seksjoner fra skjærebåtens vannoverflate er en manuell prosess som kan føre til skadede og manglende seksjoner. Hvis for eksempel seksjoner ikke overholder hverandre og danner stabile bånd, kan kontaktsement påføres forkanten av blokksnittet for å stabilisere båndene13. Varigheten og rutinesuksessen for dette trinnet erferdighetsavhengige 59. Selv om en mengde modellspesifikke seksjonsplukkingsmetoder60,61 kan forvirre nybegynnere, kan noen enkle, praktiske guider55,62 for rutinemessig seksjonering, sammen med praksis, forbedre seksjonsferdighetene betydelig. Denne protokollen krever minimalt med spesialutstyr, og ved hjelp av videoopptak som viser de praktiske aspektene ved manuelle manipuleringsteknikker under seksjonering, båndavløsning og båndhåndtering og henting, gir en utmerket nybegynnerveiledning til seriell seksjonering.

Volum EM-bildeanalyse fortsetter å være et utviklingsområde med en rekke åpne kildekode- og kommersielle programvarealternativer som for øyeblikket er tilgjengelige, og listen vokser stadig. Et utvalg av programvare for justering (TrakEM241), 3D-segmentering og rekonstruksjon (Amira42) presenteres her; Mange alternativer er imidlertid tilgjengelige for justering (f.eks. Fiji, Register Virtual Slices63, Atlas5 og 3D rekonstruksjon (f.eks. Rekonstruere65; IMOD66). For relativt små analyseprosjekter, uavhengig av om dataene genereres lokalt eller hentes fra åpent delte datalagre (EMPIAR67, Open Organelle68), er manuell segmentering beskrevet her et tilgjengelig og gjennomførbart alternativ. Men for større datasett vender mange brukere seg til maskinlæring og kunstig intelligens for automatisering av disse oppgavene69,70, samt crowd-sourcing frivillige71 eller kombinerer begge72.

Til syvende og sist, etter justering og 3D-segmentering, avslører 3D-rekonstruksjon ikke bare morfologien til de aktuelle strukturene, men viktigst av alt, også deres forhold til andre organeller, inkludert de unike egenskapene til eventuelle kontaktsteder som er tilstede. Disse organelle kontaktene kan analyseres videre, og funksjoner som antall kontakter, kontaktområde, volumer av organeller og morfometriske parametere i organellene kan ekstraheres og sammenlignes mellom eksperimentelle modeller70. Kvantifiserelsesalternativer er mange, og deres relevans varierer enormt avhengig av det nøyaktige forskningsspørsmålet. Derfor har de ikke blitt dekket i dybden som en del av denne protokollen.

Patologiske prosesser som påvirker organelle kontakter har vært involvert i både de sjeldne (f.eks. Wilsons sykdom) og vanlige (viral hepatitt og alkoholfri steatohepatitt) lidelser 73,74,75. For eksempel ser det ut til at ER-mitokondriene og mitokondriene-lipiddråpekontaktstedene regulerer lipidmetabolismen i hepatocytter; Derfor er studiet av disse kontaktene av stor interesse. Avslutningsvis er seriell seksjon TEM og påfølgende 3D-rekonstruksjon og analyse en kraftig teknikk for å forhøre interorganelle kontakter og sondere deres relative betydning i leverfunksjoner og sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro og Ania Straatman-Iwanowska for ekspert teknisk assistanse. Vi takker også Stefan lab medlemmer og Ian J. White for nyttige diskusjoner. J.J.B. støttes av MRC-finansiering til MRC Laboratory of Molecular Cell Biology ved UCL, priskode MC_U12266B. C.J.S. støttes av MRC-finansiering til MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit ved UCL, priskode MC_UU_00012/6. P.G. er finansiert av Det europeiske forskningsrådet, tilskuddskode ERC-2013-StG-337057.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325 (1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , Springer. New York, NY. (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24 (2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675 (2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102 (2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287 (2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180 (2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091 (2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873 (2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111 (2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043 (2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003 (2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480 (2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., et al. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. Beichel, R. R., Sonka, M., et al. 4241, Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605 (2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196 (2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273 (2021).

Tags

Biologi utgave 184
Tredimensjonal karakterisering av Interorganelle kontaktsteder i Hepatocytter ved hjelp av seriell seksjon elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chun Chung, G. H., Gissen, P.,… More

Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter