Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tredimensionell karakterisering av interorganella kontaktställen i hepatocyter med användning av seriell sektionselektronmikroskopi

Published: June 9, 2022 doi: 10.3791/63496
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, University College London

Summary

Ett enkelt och omfattande protokoll för att förvärva tredimensionella detaljer om membrankontaktställen mellan organeller i hepatocyter från levern eller celler i andra vävnader.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi har länge ansetts vara guldstandarden för visualisering av cellulär ultrastruktur. Analysen är emellertid ofta begränsad till två dimensioner, vilket hindrar förmågan att fullt ut beskriva den tredimensionella (3D) ultrastrukturen och det funktionella förhållandet mellan organeller. Volymelektronmikroskopi (vEM) beskriver en samling tekniker som möjliggör förhör av cellulär ultrastruktur i 3D vid mesoskala, mikroskala och nanoskala upplösningar.

Detta protokoll ger en tillgänglig och robust metod för att hämta vEM-data med hjälp av seriell sektionsöverföring EM (TEM) och täcker de tekniska aspekterna av provbearbetning till digital 3D-rekonstruktion i ett enda, enkelt arbetsflöde. För att demonstrera användbarheten av denna teknik presenteras det ultrastrukturella 3D-förhållandet mellan endoplasmatisk retikulum och mitokondrier och deras kontaktställen i leverhepatocyter. Interorganelle kontakter tjänar viktiga roller vid överföring av joner, lipider, näringsämnen och andra små molekyler mellan organeller. Men trots deras första upptäckt i hepatocyter finns det fortfarande mycket att lära sig om deras fysiska egenskaper, dynamik och funktioner.

Interorganellkontakter kan visa en rad morfologier, som varierar i närheten av de två organellerna till varandra (vanligtvis ~ 10-30 nm) och omfattningen av kontaktplatsen (från punkterade kontakter till större 3D-cisternalliknande kontakter). Undersökningen av nära kontakter kräver högupplöst avbildning, och seriell sektion TEM är väl lämpad för att visualisera 3D-ultrastrukturell av interorganella kontakter under hepatocytdifferentiering, liksom förändringar i hepatocytarkitektur i samband med metaboliska sjukdomar.

Introduction

Sedan deras uppfinning på 1930-talet har elektronmikroskop gjort det möjligt för forskare att visualisera de strukturella komponenterna i celler och vävnader 1,2. De flesta undersökningar har gett 2D-information, eftersom byggandet av 3D-modeller kräver noggrann seriell sektionssamling, manuell fotografering, negativ bearbetning, manuell spårning och skapande och montering av 3D-modeller från glasskivor, plast eller styrofoam 3,4. Nästan 70 år senare har det skett betydande framsteg inom många aspekter av processen, från mikroskopprestanda, seriell sektionssamling, automatiserad digital bildbehandling, sofistikerad programvara och hårdvara för 3D-rekonstruktion, visualisering och analys till alternativa metoder för det som nu kollektivt kallas volym EM (vEM). Dessa vEM-tekniker anses i allmänhet ge 3D-ultrastrukturell information vid nanometerupplösningar över mikronskalor och omfattar transmissionselektronmikroskopi (TEM) och nyare svepelektronmikroskopi (SEM) -tekniker; se recensioner 5,6,7,8.

Till exempel använder fokuserad jonstråle SEM (FIB-SEM) en fokuserad jonstråle inuti en SEM för att fräsa bort blockets yta mellan sekventiella SEM-avbildningsskanningar av blockets yta, vilket möjliggör upprepad automatiserad fräsning / avbildning av ett prov och bygger upp en 3D-dataset för rekonstruktion 9,10. Däremot använder seriell blockyta SEM (SBF-SEM) ett ultramikrotom inuti SEM för att ta bort material från blockytan före avbildning 11,12, medan arraytomografi är en icke-destruktiv process som kräver insamling av seriella sektioner, på täckglas, skivor eller tejp, innan du skapar ett automatiserat arbetsflöde för avbildning av regionen av intresse i sekventiella sektioner i SEM för att generera 3D-datauppsättningen13 . I likhet med matristomografi kräver seriell sektion TEM (ssTEM) att fysiska sektioner samlas in före avbildning; Dessa avsnitt samlas dock in på TEM-rutnät och avbildas i en TEM 14,15,16. ssTEM kan utökas genom att utföra lutningstomografi 17,18,19. Seriell lutningstomografi ger den bästa upplösningen i x, y och z, och även om den har använts för att rekonstruera hela celler20 är det rimligt utmanande. Det här protokollet fokuserar på de praktiska aspekterna av ssTEM som den mest tillgängliga vEM-tekniken som är tillgänglig för många EM-laboratorier som kanske för närvarande inte har tillgång till specialiserade sektionerings- eller vEM-instrument men som skulle dra nytta av att generera 3D vEM-data.

Seriell ultramikrotomi för 3D-rekonstruktion har tidigare ansetts utmanande. Det var svårt att klippa raka band med jämn sektionstjocklek, kunna ordna och plocka upp band av rätt storlek, i rätt ordning, på galler med tillräckligt stöd, men utan gallerstänger som döljer intressanta regioner, och viktigast av allt, utan att förlora sektioner, eftersom en ofullständig serie kan förhindra fullständig 3D-rekonstruktion21. Förbättringar av kommersiella ultramikrotom, diamantskärnings- och trimningsknivar22,23, elektronlucentstödfilmer på galler21,24 och lim för att hjälpa till med sektionsvidhäftning och bandbevarande13,21 är dock bara några av de inkrementella framstegen genom åren som har gjort tekniken mer rutinmässig i många laboratorier. När seriella sektioner har samlats in är seriell avbildning i TEM enkel och kan ge EM-bilder med subnanometer px-storlekar i x och y, vilket möjliggör högupplöst förhör av de subcellulära strukturerna - ett potentiellt krav för många forskningsfrågor. Fallstudien som presenteras här visar användningen av ssTEM- och 3D-rekonstruktion i studien av endoplasmatisk retikulum (ER) -organellkontakter i leverhepatocyter, där ER-organellkontakter först observerades25,26.

Samtidigt som den är sammanhängande med kärnhöljet, gör ER också nära kontakter med många andra cellorganeller, inklusive lysosomer, mitokondrier, lipiddroppar och plasmamembranet27. ER-organellkontakter har varit inblandade i lipidmetabolism28, fosfoinositid och kalciumsignalering29, autofagireglering och stressrespons30,31. ER-organellkontakterna och andra interorganellkontakter är mycket dynamiska strukturer som svarar på cellulära metaboliska behov och extracellulära signaler. De har visat sig variera morfologiskt i storlek och form och avstånden mellan organellmembran32,33. Man tror att dessa ultrastrukturella skillnader sannolikt kommer att återspegla deras olika protein / lipidkompositioner och funktion34,35. Det är dock fortfarande en utmanande uppgift att definiera interorganellerande kontakter och analysera dem36. Därför krävs ett tillförlitligt men ändå enkelt protokoll för att undersöka och karakterisera interorganellerkontakter för vidare undersökningar.

Eftersom ER-organellkontakter kan sträcka sig från 10 till 30 nm i membran-till-membranseparation har guldstandarden för identifiering historiskt varit TEM. TEM med tunn sektion har avslöjat specifik subdomänlokalisering för bosatta ER-proteiner vid distinkta membrankontakter37. Traditionellt har detta avslöjat ER-organellkontakter med nm-upplösning men ofta bara presenterat en 2D-bild av dessa interaktioner. VEM-metoder avslöjar dock den ultrastrukturella presentationen och sammanhanget för dessa kontaktplatser i 3D, vilket möjliggör fullständig rekonstruktion av kontakter och mer exakt klassificering av kontakter (punkt kontra rörformig kontra cisternalliknande) och kvantifiering38,39. Förutom att vara den första celltypen där ER-organellkontakter observerades25,26, har hepatocyter ett omfattande system av andra interorganellkontakter som tjänar viktiga roller i deras arkitektur och fysiologi28,40. Emellertid saknas fortfarande en grundlig morfologisk karakterisering av ER-organell och andra interorganellkontakter i hepatocyter. Följaktligen är hur interorganella kontakter bildas och ombyggs under regenerering och reparation av särskild relevans för hepatocytbiologi och leverfunktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur inhystes i enlighet med det brittiska inrikesministeriets riktlinjer, och vävnadsskörden utfördes i enlighet med UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Provfixering och beredning

  1. Dissekera levervävnaden i lämpliga storleksbitar, cirka 8 mm x 8 mm x 3 mm, och placera bitarna i varm fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 37 °C).
  2. Injicera rumstemperatur (20-25 ° C) fixativ (1,5% glutaraldehyd i 1% sackaros, 0,1 M natriumkakodylat) i leverbitarna och överför dem från PBS till fixeringsmedel i upp till 20 min vid rumstemperatur. Håll alltid vävnaden nedsänkt i lösningar för att undvika torkning.
    OBS: Aldehyder är irriterande ämnen som är frätande och potentiellt cancerframkallande. Natriumkacodylat är giftigt vid förtäring eller inandning. Alla fixeringsmedel måste hanteras med lämplig personlig skyddsutrustning, och experimentet ska utföras i en draghuva. God fixering kommer att resultera i en fastare vävnad.
  3. Ställ in den vibrerande mikrotomen med ett blad, isbad och en kall PBS-fylld buffertbricka. Montera den första biten av fast levervävnad på en provhållare med cyanoakrylatlim och överför blocket till den vibrerande mikrotomen.
  4. Följ tillverkarens rekommendationer, närma dig vävnaden och skiva den fasta levern i 100 μm tjocka skivor.
  5. Samla skivorna med en spatel eller naturlig hårborste och överför dem till en 12- eller 24-brunns skål som innehåller iskall fix (1,5% glutaraldehyd, 0,1 M natriumkakodylat) på is. Låt skivorna ligga kvar på is tills alla prover har skivats och är redo att bearbetas ytterligare.
  6. Välj de skivor som innehåller de regioner som är av intresse för vidare bearbetning och tvätta med mild omrörning. Utför tre, 5 minuters tvättar med rumstemperatur 0,1 M natriumkakodylat i en 12- eller 24-brunns skål, så att skivorna har tillräcklig buffert för att röra sig fritt.
    OBS: I allmänhet väljs regioner av intresse baserat på anatomiska egenskaper relaterade till den biologiska frågan om studien och styrs av regioner i vävnaden som sannolikt kommer att finnas i hela serien, t.ex. inte på kanten av sektionen, och som är väl bevarade.
  7. I en draghuva, ersätt 0,1 M natriumkakodylat med nyberedd 1% osmiumtetroxid / 1,5% kaliumferricyanid. Placera skålen med 12 eller 24 brunnar i en förseglad behållare och överför behållaren till ett kylskåp med farliga kemikalier i 1 timme.
    OBS: Osmium är extremt farligt vid intag, inandning och hudkontakt. Kaliumferricyanid är irriterande och skadligt vid inandning och hudkontakt. Hantera alltid med lämplig personlig skyddsutrustning och utför experimentet i en dragskåpa.
  8. I en draghuva, ta bort osmiumtetroxid / kaliumferricyaniden till en dedikerad osmiumavfallsflaska och tvätta proverna i 5 minuter med 0,1 M natriumkacodylat tre gånger. Lämna proverna i en förseglad behållare över natten vid 4 °C.
    OBS: Potentiell pauspunkt. Prover kan förvaras i 0,1 M natriumkakodylat i en förseglad behållare vid 4 °C i veckor utan att det är till någon nackdel för konserveringen. Se till att det finns tillräcklig buffert för att förhindra torkning.
  9. Inkubera proverna med nyberedd 1% garvsyra i 0,05 M natriumkakodylat i 45 min i mörkret vid rumstemperatur.
    OBS: Garvsyra är irriterande och kan orsaka ögonskador. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och utför experimentet i en dragskåpa.
  10. Utför tre 5 minuters tvättar med ddH2O före uttorkning och inbäddning.

2. Provuttorkning, Epon-hartsinbäddning och montering

  1. Förbered Eponharts enligt följande viktförhållande (se steg 2.2). Tara en balans med en 100 ml engångsbägare i plast som innehåller en omrörningsstång. Skär ändarna från 5 pasteurpipetter av engångsplast och använd dessa för att överföra viskösa hartskomponenter till bägaren.
  2. Tillsätt sekventiellt 19,2 g harts-812, 7,6 g DDSA, 13,2 g MNA och 0,8 g DMP-30-accelerator i bägaren. Blanda hartskomponenterna noggrant för hand med den femte pasteurpipetten av ren plast.
    OBS: Undvik att införa bubblor men se till att bottenhartset blandas tillräckligt med toppen för att uppnå en färgförändring och grov blandning av komponentskikten. Alla hartskomponenter är irriterande och skadliga vid inandning och hudkontakt. DMP-30 är frätande och kan orsaka hudkorrosion. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
  3. Placera bägaren på en magnetomrörare och låt rör om försiktigt, blanda hartset regelbundet manuellt.
  4. Tvätta proverna med mild omrörning i 5 minuter med 70% etanol; upprepa en gång.
  5. Tvätta proverna med mild omrörning i 5 minuter med 90% etanol; upprepa en gång.
  6. Tvätta proverna med mild omrörning i 5 minuter med 100% etanol; upprepa en gång.
  7. Medan proverna är i 100% etanol tvättar i en dragskåpa, förbered en 50:50 (v / v) propylenoxid (PO):Epon blandning i en glasflaska med ett propylenoxid (PO) -resistent plastlock. Kläm försiktigt men säkert på glasflaskans lock, och samtidigt som du håller fast både lock och flaska, skaka eller virvel för att blanda.
    OBS: Propylenoxid är ett akut giftigt, brandfarligt irriterande som löser upp viss plast. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och utför experimentet i en dragskåpa.
  8. Efter steg 2.6 inkuberar du proverna med PO:Epon i 1 timme i en PO-beständig behållare (t.ex. aluminiumbrickor eller glasflaskor), med mild gungning/omrörning i dragskåpan.
  9. Överför proverna till 100% Epon i dragskåpan. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur i dragskåpan med gungning/rotation/omrörning. Överför PO:Epon-blandningen till en särskild Epon-avfallsflaska i glas.
  10. Upprepa steg 2.9 en gång.
  11. Montera proverna för inbäddning. Beroende på skivornas storlek och intresseområde, montera skivorna direkt på förpolymeriserade hartsstubbar eller bädda in dem platt för dissektion och bädda in dem igen vid ett senare tillfälle.
    OBS: För platt inbäddning kan en "cast-a slide" användas för att bädda in många skivor samtidigt. Överblivet harts kan användas för att fylla strålkapslar och bakas för att göra förpolymeriserade stubbar eller frysas för senare användning.
  12. När de är monterade och täckta i tillräckligt med harts för att fylla "cast-a slide" -hålrummet, baka proverna över natten i en 60 ° C ugn.
    OBS: Potentiell pauspunkt. Prover kan förvaras vid rumstemperatur i flera år.
  13. För återinbäddning, identifiera den region som är av intresse för de platta inbäddade vävnadsskivorna. Skär ut vävnadsbiten av lämplig storlek (1 mm 2 till4 mm 2) med en juvelerarsåg och bädda in den igen med harts som förberetts, som i steg 2.2, på toppen av ett förpolymeriserat block och baka över natten i en ugn på 60 °C.
    OBS: Alternativt kan vävnadsstycket limmas på en stubbe eller stift med tvådelat epoxiharts. Låt stå för att ställa in över natten. Potentiell pauspunkt.

3. Trimning och seriell sektionering av inbäddade prover

OBS: Sektionering är en inlärd färdighet; användare bör vara skickliga på ultratunn sektionering innan de försöker seriell sektionering. Eftersom exakta mikrotomkontroller varierar mellan tillverkare, följ tillverkarens instruktioner och riktlinjer.

  1. Med provet låst i trimadaptern, använd ett rakblad för att noggrant trimma hartsets inbäddade vävnad för att uppfylla följande kriterier (se figur 1A,B):
    1. Se till att det finns en plan, övre yta som exponerar vävnaden runt det intressanta området.
    2. Se till att en trapetsform med de övre och nedre kanterna är rena och parallella.
    3. Säkerställ övergripande dimensioner på 200-500 μm i x, 100-500 μm i y.
    4. Se till att ett asymmetriskt blockansikte, t.ex. höger hörn på ~ 90 °, övre vänstra hörnet stumt och vänster nedre hörn akut.
      OBS: En trimkryoknife kan vara ett alternativt verktyg för ett rakblad. De andra rekommendationerna är för användarvänlighet för beställning av sektioner vid bildbehandling. Valfritt: Om sektioner inte bildar stabila band kan en kontaktcement appliceras på framkanten av blockytan för att underlätta bandbildning. Rakblad är skarpa; var noga med att hålla rakbladet så att oavsiktliga glidningar sannolikt inte kommer att leda till personlig skada.

Figure 1
Bild 1: Seriell sektion TEM-arbetsflöde. (A) Diagram över provet i hartsblocket. (B) Trimblock för att generera en trapetsformad form med kanter som är lämpliga för seriell sektionering och asymmetrisk blockyta för att säkerställa känd orientering. (C) Diagram som visar band av seriesektioner som flyter på vattenytan i diamantknivbåten. (D) Diagram som visar sektions- och bandorganisationen, som dikterar sektionernas ordning, på ett TEM-spårgaller med en diameter på 3 mm. (E) TEM-avbildning och navigering. Visa band- och sektionsordning och använda "gula stjärnklistermärken" på bildskärmen för skärmreferenser för att säkerställa ombild av samma region av intresse i efterföljande avsnitt. (F) Bildjustering och beskärning. (G) Segmentering, 3D-rekonstruktion och visualisering. Förkortning: TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. När du har trimmat, överför provbågen, tillsammans med chucken och provet, till mikrotomens provarm och placera provbågen så att bågens rörelseområde löper från topp till botten; säkra provbågen på plats.
  2. Placera och lås diamantkniven i knivhållaren, se till att skärvinkeln är lämpligt inställd på kniven. Lås knivhållaren ordentligt i scenen.
  3. När scenen tänds på, använd kniven framåt medan du ständigt kontrollerar förhållandet mellan blockytan och knivens kant. För försiktigt kniven mot provet, justera kontinuerligt knivens sidovinkel, provlutning och provrotation genom att justera relevanta vred tills blocket är i linje med knivens kant.
  4. Stäng av scenens uppbelysning; slå på scenen nedbelysning; sätt toppen och botten av skärfönstret på provarmen; och lämna provet strax under knivkanten.
  5. Fyll knivbåten med ren ddH2O och se till att vattenytan är jämn med knivseggen och bara något konkav.
  6. Valfritt: Doppa en ögonfrans i 0,1% Triton X-100 och sedan i knivbåtens vatten för att minska vattnets ytspänning för att underlätta kloroformning och bandupptagning.
  7. Förbered arbetsstationen med ögonfransar (ögonfransar limmade på en cocktailpinne), formvarbelagda slitsgaller, märkta crossover-pincett, kloroform, 0,1% Triton X-100-lösning, destillerat vatten, filterpapper och rutnät med rutnätsanteckningar.
  8. Ställ in skärhastigheten på 1 mm/s och den ursprungliga skärtjockleken på 100 nm och starta skärcykeln.
  9. När den första sektionen har skurits, ändra skärparametrarna till en skärhastighet vid 0,8 mm/s och skärtjockleken till 70 nm och fortsätt att klippa, så att sektioner kan bilda ett band som rör sig längs ytan på den vattenfyllda knivbåten (figur 1C).
    OBS: Det är viktigt att vara medveten om färgen på de sektioner som produceras eftersom detta ofta är en mer exakt guide till tjockleken på hartssektionerna. Silversektionerna är vanligtvis cirka 70 nm tjocka, medan grå sektioner är tunnare och guldsektionerna är tjockare.
  10. Låt mikrotomen fortsätta klippa sektioner och bandet blir längre.
    OBS: Det är viktigt att undvika stora vibrationer och fysiska störningar i rummet. Utkast kan orsaka att sektionerna rör sig på vattenytan i knivbåten, och fysiska vibrationer kan orsaka att mikrotomen skär ojämnt.
  11. När tillräckligt många sektioner har samlats in och innan bandet kommer till slutet av båten, stoppa skärningen (strax efter att provet har passerat knivens kant).
    Obs!: Antalet avsnitt som behövs beror på storleken på blockytan och storleken på datauppsättningen som ska samlas in. Således är det användbart att vara medveten om förhållandet mellan blockets storlek och slitsnätet när de skurna sektionerna lossna.
  12. Använd en ögonfrans i varje hand och bryt försiktigt bandet i mindre band som kan passa in i längden på spårnätet, var noga med att notera deras relativa positioner inifrån provet.
    OBS: Om deras kombinerade bredd passar kan flera band försiktigt placeras bredvid varandra och plockas upp tillsammans i ett enda slitsrutnät. Om du plockar upp flera band på ett enda slitsrutnät, var uppmärksam på bandens ordning och relativa position. Placera till exempel alltid banden längre in i provet till höger om ett band som redan finns i provet (figur 1D).
  13. Valfritt: Håll muspekaren över sektionerna med en applikatorstång av glas för att platta ut dem.
    OBS: Kloroform är giftigt och irriterande. Låt inte kloroform vidröra vattenytan eller sektionerna. Om det av misstag gör det måste vattnet tas bort och kniven tvättas innan den återgår till sektionering. Kloroformen kan skada sektionerna och försämra limet som säkrar diamanten i knivbåten.
  14. Använd de första numrerade pincetterna och plocka upp det första tomma slitsgallret (på höger sida av spåret, formvarsidan nedåt), doppa försiktigt i Triton X-100 och sedan två gånger i det destillerade vattnet innan du tar bort överflödigt vatten från tångkanten med hjälp av ett filterpapper.
  15. Med en ögonfrans i ena handen och tången i den andra handen, sänk försiktigt ungefär 2/3av det formvarbelagda slitsgallret i knivbåtens vatten (bort från sektionerna), så att formvarsidan är vänd nedåt och spårets högra långa kant är vid vattenytan och parallellt med vattenkanten.
  16. Vifta försiktigt gallret i vattnet mot banden så att sektionerna vid returslaget driver mot gallret. Fortsätt att göra detta i mindre och mindre wafts tills bandets högra kant ligger i linje med spårets högra kant. Sedan, med den sista waften, ta försiktigt upp gallret för att plocka upp sektionerna i spårnätet.
  17. Låt gallret i tången torka innan du förvarar det i rutnätslådan, korrekt kommenterat på rutnätsrutans referensblad.
  18. Upprepa steg 3.16 tills alla band har samlats in, så att ordningen på menyflikarna bibehålls.
  19. Om ytterligare sektioner krävs, dra tillbaka kniven 150 nm eller så, kontrollera vattennivån i båten och lägg till mer om det behövs. Starta skärprocessen igen och följ steg 3.11-3.18.
  20. När alla sektioner har samlats in, se till att knivkanten är fri från sektionsskräp, dra tillbaka kniven från blockytan och ta bort och rengör kniven.

4. Färgning av galler

  1. När de är torra, fläck sektionerna med Reynolds blycitrat antingen på parafilm på bänken eller i en petriskål. Placera flera pellets natriumhydroxid under ett petriskållock för att ge en koldioxidfri miljö. Sedan, försiktigt, bort från pelletsen, pipetter 40 μL droppar Reynolds blycitrat på parafilmen, en för varje galler.
    OBS: Fläcka inte för många galler på en gång; t.ex. bör det maximala vara 6. Försök att inte andas direkt på färgningsskålen. Koldioxid kan reagera med blycitrat och orsaka oönskad fällning på gallret.
  2. Invertera varje galler (sektionssidan nedåt) på blycitratdroppen och låt stå skyddad av petriskålslocket i 7 till 10 minuter. Medan gallren färgas, förbered en större andra bit parafilm på bänken med fem 300 μL droppar destillerat vatten för varje galler.
  3. Vid slutet av blycitrarinkubationen, överför varje galler till en droppe destillerat vatten för att tvätta i 1 min utan att andas direkt på gallret.
  4. Upprepa steg 4.3 totalt fem gånger.
  5. Använd numrerade crossover-pincett, plocka upp det första gallret, rör vid kanten på gallret för att filtrera papper för att transportera bort det mesta av vattnet och låt torka i tången (i minst 20 minuter). Upprepa för varje rutnät.

5. Bildförvärv av TEM

OBS: Eftersom exakta TEM-kontroller varierar mellan tillverkare, följ tillverkarens instruktioner och riktlinjer. Följande steg bör utföras av användare som redan är skickliga på TEM användning.

  1. Före avbildning, utför de vanliga kontrollerna, t.ex. stråljustering, få referenser och prova eucentricitet.
  2. Ladda försiktigt det första rutnätet med seriella sektioner i provhållaren, var noga med att justera spåret (och därmed sektionerna) till mikroskopstegets vertikala axel.
    OBS: Denna noggrannhet är inte nödvändig men sparar tid under förvärv och framtida datahanteringssteg. När du sätter in rutnätet (sektionssidan nedåt eller sektionssidan uppåt), var noga med att avbilda alla rutnät i samma riktning.
  3. Vid låg förstoring, observera ordningen, platsen och positionen för de seriella sektionerna (figur 1E). Navigera till den mellersta delen av serien i rutnätet.
    OBS: Beroende på det exakta forskningsmålet kan tillvägagångssätt för avbildning variera; Följande är dock en användbar utgångspunkt. Sektionernas form och bandens förhållande (som hämtas i steg 3.14) dikterar vilken sektion som var först och vilken sektion som var sist på rutnätet.
  4. Bläddra i exemplet och identifiera en region av intresse. Observera provet vid önskad förstoring och överväg att samla serien med en något lägre förstoring, eftersom sektioner ofta inte är perfekt inriktade och bilder kan behöva beskäras senare.
  5. Ta referensbilder vid lägre förstoringar för att uppskatta sammanhanget för den intressanta regionen, dess grova läge vid olika förstoringar i förhållande till sektionsgränser och landmärkefunktioner i provet. Använd dessa för att signera den region som är av intresse i andra avsnitt.
  6. Valfritt: För skärmreferenser, använd återanvändbart självhäftande kitt, klistermärken eller en bit OHP-papper (overhead projector), tejpat på skärmen, för att placera tillfälliga markörer på skärmen för att möjliggöra rutinmässig ombildning av samma funktioner i det område som är av intresse i mitten av bilden, i hela datauppsättningen (se gula stjärnor i figur 1E).
  7. Använd referensbilderna och navigera till det område som är av intresse i den första delen av rutnätet och skaffa en bild med önskad förstoring.
    OBS: När du sparar bilder, anteckna det första filnamnet på den första bilden i serien och använd sekventiell namngivningsnomenklatur så att alla bildnamn följer den sekventiella ordningen för serieavsnitten.
  8. Navigera till nästa avsnitt och upprepa steg 5.7 tills alla avsnitt har avbildats för den region som är av intresse.

6. Bildexport och registrering av seriesektionsjustering

  1. Exportera bildfilerna som tillhör samma stack till en enda mapp. Kontrollera att mappen är sorterad efter filnamn.
    OBS: Bilderna bör helst ha samma rotnamn och följa den ordning i vilken de har förvärvats.
  2. Öppna Fiji och klicka på Arkiv | Importera | Bildsekvens.
  3. Klicka på den första bilden i mappen och klicka på Öppna. Vänta tills ett popup-fönster med sekvensalternativ visas (Figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Skapande av en seriell stack och seriell sektionsjustering med Fiji. (A) Skärmdump som visar sekvensalternativen när du laddar bilderna för att göra en seriell stack. (B) Skärmdump av TrackEM2-plugin-programmet och nyckelfönstren i plugin-programmet. Tryck på OK i Slice separation för att fortsätta med justeringen. (C) Skärmbild efter att seriell stack har laddats i visualiseringsfönstret. Tre sekventiella fönster med justeringsparametrar dyker upp när Justera stacksegment har valts . Exportera den justerade stacken när justeringen är klar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Klicka på Sortera namn numeriskt | Konvertera till 8-bitars alternativ. Tryck på OK.
    OBS: Konvertering till 8-bitars hjälper till att importera data till Amira och minskar filstorleken, vilket möjliggör snabbare bearbetningshastigheter i senare steg.
  2. Kontrollera fullständigheten, sekvensen och förstoringen av den skapade stacken. Spara den skapade stacken som en .tif fil.
    OBS: Bilder borde ha förvärvats vid samma förstoring.
  3. Kör TrakEM2-plugin41. Gå till Arkiv | Nya | TrackEM2 (tom).
    OBS: Plugin kommer att be användaren att spara TrackEM2-filerna. Om det behövs sparar du TrackEM2-filerna i bildmappen. Tre fönster ska visas: ett projektfönster, ett stacknavigeringsfönster (vänster) och ett stackvisualiseringsfönster (bild 2B).
  4. Högerklicka till det svarta visualiseringsfönstret. Klicka på Importera | Importera stacken och välj den tidigare skapade stacken.
  5. Klicka på OK för att läsa in stacken i stacknavigeringsfönstret.
    OBS: Ett segmentavskiljningsfönster dyker upp för att be om pixel- och dimensionsrelation. För endast stackjustering klickar du på OK för att hoppa över det här steget.
  6. Använd skjutreglaget för att kontrollera alla skivor i stapeln. Leta efter det inlästa segmentet, som visas som en korrigering i navigeringsplanen. Välj de korrigeringar som ska ingå i följande justering.
    OBS: Valda patchar blir blåa.
  7. Håll muspekaren över visningsfönstret. Högerklicka på bilden, välj Justera | Justera stapelsegment (figur 2C-1).
  8. Ange justeringsparametrarna genom en uppsättning av tre sekventiella fönster.
    OBS: För de flesta data, börja med en styv justering (möjliggör rotation och översättning men inte transformation) och behåll andra parametrar som standard (figur 2C-2).
  9. Låt justeringen köras tills avläsningsloggen säger Montage klar.
    OBS: Körtid beror på antalet voxels och datorns hastighet.
  10. Kontrollera den justerade stacken i visningsfönstret. Tryck på Alt och - tangenterna (i PC) eller Ctrl och - tangenterna (i Mac) för en zoomningsvy av den justerade stacken.
  11. Om du är nöjd med den justerade stacken högerklickar du på Exportera | Gör platt bild för att spara den justerade stacken.
  12. Välj den första bilden som början på stacken och den sista bilden som slutet på stacken, klicka på OK (Figur 2C-3). Spara den justerade stacken som .tif.
    OBS: För att minska filstorleken, beskär data så att de endast innehåller den nödvändiga regionen av intresse.
  13. Om det behövs kör du en affinjustering på den justerade stacken. Öppna den justerade stacken i Fiji, välj Plugin | Registrering | StackReg.
  14. Välj affine alternativ och tryck på OK. Vänta tills programmet är klart.
  15. Spara den affine-justerade stacken med ett annat filnamn.

7. Segmentering och 3D-rekonstruktion

  1. Öppna Amira42. Klicka på | Öppna Data för att läsa in den justerade stacken.
  2. Ange voxelmätningarna i det nya popup-fönstret (Figur 3A).

Figure 3
Bild 3: Segmentering av seriell stack med Amira. (A) Popup-fönstret för Voxel-definition innan du laddar en justerad stack. (B) Skärmdump av projektgränssnittet efter import av en stack. Välj fliken Segmentering för att starta objektspårning i panelen Segmenteringsredigerare. (C) Viktiga funktioner på fliken segmentering. Definiera objekten för segmentering i avsnittet Segmenteringsredigerare på fliken Segmentering. Använd zoomfunktionen för att hjälpa till att identifiera objekt. Välj borstverktyget och spåra objektets gräns. Klicka på symbolen + under Markering för att tilldela spårningen. Ett tilldelat objekt verkar ha en röd gräns i visningsfönstret för ortoslice. Klicka här för att se en större version av denna figur.

OBS: En bildstacknod visas i projektgränssnittet och en ortoslice visas i visningsfönstret till höger (figur 3B).

  1. Starta segmenteringen genom att välja fliken Segmentering (bild 3B).
    Obs!: Vi rekommenderar att du sparar segmenteringsförloppet före och under segmenteringen. Gå till Model | Spara modell som alla .am-filer som passar.
  2. Klicka på Nytt i segmenteringsredigeringspanelen för att definiera nya objekt i materiallistan. Högerklicka för att ändra objektets färg och dubbelklicka för att byta namn på objektet.
  3. För manuell segmentering väljer du segmenteringsverktyget under materiallistan. Välj standardverktyget Brush för att markera pixlarna (Figur 3C).
    OBS: Alternativt kan du använda borstverktyget för att spåra objektets kontur och trycka på Skift + F för att fylla objektet.
  4. För att konvertera borstverktyget till ett radergummi, tryck kontinuerligt på Ctrl medan du väljer pixlar för korrigering. Kommentera varje skiva i stapeln.
  5. När du har bekräftat det tilldelar du valet till en etikett genom att klicka på tecknet + . Klicka på - tecknet för att ta bort markeringen.
  6. Gå tillbaka till projektgränssnittet när segmenteringen är klar. Leta efter en nod med tillägget ".label" som är anslutet till bildstacken.
  7. Högerklicka på tillägget ".label" och välj Generera Surface-| Ansök om att skapa en .surf-fil.
  8. Om du vill återge 3D-modellen för ett segmenterat objekt högerklickar du på .surf-filen och väljer Surface-vy för att generera en 3D-modell i visningsfönstret.
  9. Spara 3D-modellen för visualisering eller ytterligare kvantitativa analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För denna teknik väljs regioner av intresse utifrån det biologiska forskningsmålet och identifieras före trimning och sektionering av inbäddad vävnad. På samma sätt kan storleken på blockytan dikteras av forskningsfrågan; I detta fall trimmades provet för att lämna en blockyta på cirka 0,3 mm x 0,15 mm (figur 4A). Detta möjliggjorde två rutnät med 9 seriella sektioner per rutnät, vilket gav 18 seriella sektioner och införlivade en volym levervävnad med en volym av cirka 62 μm3 (316 μm x 150 μm x 1,3 μm). Denna volym var tillräcklig för att möjliggöra fullständig 3D-rekonstruktion av enskilda mitokondrier i levervävnad.

Figure 4
Figur 4: Segmentering och 3D-rekonstruktion som granskar morfologin hos ER och tillhörande ER-mitokondrikontakter. (A) Översikt över bandet av seriella sektioner i TEM. (B) Lågförstoringsbild av intressanta regioner och kontextuella landmärken för omlokalisering. Skalstänger = 40 μm (i), 20 μm (ii), 5 μm (iii), 1 μm (iv). (C) Vänster: EM-tomogram av två apposerade hepatocyter. Höger: segmenterad version av samma tomogram. Spår av ER (gul), mitokondrier (cyan) och intermembrankontakter mellan ER och mitokondrier i olika utrymmen: 0-20 nm (magenta); 21-100 nm (blå). (D) En ortoslice isolerad från den rekonstruerade modellen som endast visar akuten och de olika membrankontakterna, vilket motsvarar det pilkommenterade området i insatsen. (E) 3D-rekonstruktion av de segmenterade organellerna och kontakterna mellan ER och mitokondrier i olika vinklar. Förkortningar: ER = endoplasmatisk retikulum; TEM = transmissionselektronmikroskopi; mt = mitokondrier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Visualisering av de seriella sektionerna med TEM vid låg förstoring hjälper till att identifiera det angivna intresseområdet och dess sammanhang inom resten av vävnaden (figur 4B). Dessa bilder kan användas för att hitta samma region av intresse i efterföljande avsnitt. En region av intresse som visar god bevarande vid en gräns mellan två apposerade hepatocyter valdes och presenterades här. Högre förstoringsavbildning möjliggör observation av de morfologiska detaljerna hos de olika organellerna (figur 4C) med nm-upplösning. För att illustrera två typer av ER-organellföreningar segmenterades utvalda mitokondrier och ER, manuellt spåra kanten på membranen som presenterades med förbättrad elektrondensitet. Därefter ställdes borstverktyget in på en fast nm/ px-tjocklek (figur 3B) och användes för att följa gränsen för organellen av intresse för att markera regionerna mellan de två riktade organellerna som låg inom ett angivet kontaktavstånd till varandra och kunde betecknas som en viss klass av organellkontakter. Figur 4D visar en lutad ortoslice överlagrad med segmenteringsspår och dess relativa position (pilspets i inloppsmodellen 3D) inom hela mitokondrionen.

Spåren tilldelades olika färger, rekonstruerades till en 3D-modell efter segmentering och visades i olika riktningar (figur 4E). ER-strukturen (gul) visade sig vara delvis transparent i de mellersta panelerna för att visualisera ER-mitokondriernas kontakter och mitokondrier (cyan) under. Modellens främre och bakre vyer avslöjar en asymmetrisk fördelning av interorganellkontakter med olika intermembranavstånd. Intermembranutrymme mindre än 21 nm tilldelades som ER-mitokondrikontakt (rosa) eftersom funktioner som lipidöverföring har rapporterats vara genomförbara på detta avstånd43. Intermembranutrymmet (blått) mellan 21 och 100 nm kommenterades också eftersom denna region kan representera de nyligen rapporterade mitokondrierna-grova ER-föreningarna44. Omslag av ER-strukturer med liknande krökning observerades i 3D-modellen (figur 4E). Figur 4D visar ett exempel på att ändra intermembranavstånd (~ 40 nm → ~ 20 nm → ~ 40 nm) mellan omslags-ER-cisternae och mitokondrierna. Metoden möjliggör uppföljande patchanalys av dessa två distinkta intermembranrum, så att kvantitativ analys av deras överflöd, distribution och topologi är möjlig.

Gäller Seriell tomografi TEM för seriell sektion FIB-SEM SBF-SEM Array tomografi
Lateral (x,y) upplösning 0,5 nm 0,5 nm 2 nm 2 nm 2 nm
(Minsta px-storlek)
Axiell (z) upplösning 1 nm 50 nm 4 nm 20 nm 50 nm
(Minsta px-djup) Begränsad till sektionstjocklek Begränsad till sektionstjocklek
Volymintervall för data i typiska applikationer 0,1 - 50 μm3 10 - 250 μm3 10 - 1 x 104 μm3 10 – 1 x 1012 μm3 10 - ∞ μm3
Se över eller återskapa proverna Möjlig Möjlig Inte möjligt Inte möjligt Möjlig
Kostnad för utrustningen ££ £ ££ ££ ££
(exempel på instrument) (200 kV TEM) (120 kV TEM) (FIB-SEM) (SBF-SEM) (SEM+AT)
Kostnad för underhåll av utrustning ££ £ ££ ££ £

Tabell 1: Översikt över volymelektronmikroskopitekniker. Förkortningar: EM = elektronmikroskopi; TEM = överföring EM; FIB-SEM = fokuserad jonstråle SEM; SBF-SEM = seriell blockyta SEM; SEM + AT = SEM med arraytomografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En tillgänglig vEM-teknik för att visualisera organellstruktur och interaktioner i 3D beskrivs i detta protokoll. Morfologin hos interorganellkontakter i hepatocyter presenteras som en fallstudie här. Detta tillvägagångssätt har emellertid också tillämpats för att undersöka en mängd andra prover och forskningsområden, inklusive Schwann-cell-endotelinteraktioner i perifera nerver45, Weibel Palade Body biogenes i endotelceller46, lastsekretion i njurceller47 och synapsmorfologi i hippocampala neuroner48 . För att bättre förstå leverbiologi kan detta tillvägagångssätt användas för att undersöka hepatocytmorfologi i 2D-cellodling, 3D-leverorganoidmodellsystem49 och levervävnad. Detta robusta och flexibla tillvägagångssätt kan användas av många laboratorier med tillgång till ett konventionellt 120 kV transmissionselektronmikroskop och ultramikrotom och kräver inte dyra provberedningstekniker.

Även om detta är ett tillgängligt protokoll är det viktigt att notera att det finns alternativa vEM-tekniker som kan ge forskaren vissa fördelar, beroende på forskningsfrågan. Se tabell 1 för en översikt 6,50,51. Ofta påverkar upplösningen och volymen av de data som behövs direkt forskarnas val av vEM-teknik och hur enkelt och snabbt projektet kan utvecklas. FIB-SEM kan till exempel ta bort mycket tunna lager från provet före avbildning, vilket resulterar i utmärkt z-upplösning (z-tjocklek så låg som 4 nm) och potentiellt ger volymetriska 3D-data med isotropa voxeller. Detta möjliggör visualisering av data med samma upplösning från alla vinklar, vilket ibland kan ge tydliga fördelar när kontaktpunkter är svåra att urskilja 52,53. FIB-SEM kan generera stora volymer men är ofta kostsamt och tidskrävande, medan SBF-SEM är en utmärkt teknik att använda när större volymer krävs, t.ex. 100-tals till 1000-tals i avsnitt54. SBF-SEM och arraytomografi ger liknande xy-upplösning som FIB-SEM men med reducerad z-upplösning. Eftersom arraytomografi innebär att man samlar fysiska sektioner är z-upplösningen kanske den fattigaste av sina konkurrenter (z tjocklek 50+ nm) men har flera distinkta fördelar. Främst, eftersom det är en icke-destruktiv teknik, kan provet ses över vid olika xy-upplösningar, med enkel montage, vid olika tidpunkter och i många regioner, vilket gör att fullständig kontext och detalj kan uppskattas i ett enda prov. Seriell sektion TEM delar också denna fördel; Eftersom sektioner måste samlas in på TEM-rutnät är det dock bättre lämpat för mindre volymer som kräver att färre sektioner samlas in före avbildning. Den är dock kompatibel med TEM-lutningstomografi, en teknik som ger mycket hög z-upplösning (z-tjocklek så låg som 2 nm) av mycket små volymer, vilket möjliggör ytterligare förhör av specifika kontaktplatser av intresse om det behövs.

Oavsett vilken vEM-metod som används är bevarande av prov avgörande för projektets framgång. Fixeringsmediet bör vara en isotonisk matchning till vävnaderna, och överföringen till fixeringsmediet bör ske snabbt för att undvika torkning av vävnaderna55. Levervävnad kan vara utmanande att bevara, och även om det erbjuder utmärkt bevarande, vilket möjliggör retention av levervävnad för ytterligare experiment, är hela leverperfusion för elektronmikroskopi ofta inte möjlig. Leverkilnålperfusion är ett utmärkt alternativ56. Kryoimmobilisering är också ett alternativ men kräver omedelbar högtrycksfrysning för att uppnå homogen förglasning av färska vibratomsektioner; således är detta tillvägagångssätt ganska utmanande. Efter den första fixeringen finns det en mängd olika EM-provberedningsprotokoll som ger tillfredsställande resultat. Ett rutinmässigt TEM-protokoll presenteras här57, men "enbloc megametal" -protokoll har också framgångsrikt använts med andra biologiska prover45,58. Medan dessa "enbloc megametal" -protokoll ger mer kontrast i provet, vilket ger vissa strukturer ett mer starkt färgat utseende, har de också fördelen att ta bort kravet på att fläcka sektioner, vilket minskar risken för att lägga till oönskad fläckfällning på prover och skadliga galler i processen.

Ett annat kritiskt steg i detta protokoll är ultratunn sektionering och bandsamling. Att samla seriesektioner från skärbåtens vattenyta är en manuell process som kan leda till skadade och saknade sektioner. Till exempel, om sektioner misslyckas med att fästa vid varandra och bildar stabila band, kan kontaktcement appliceras på framkanten av blockytan för att stabilisera banden13. Varaktigheten och den rutinmässiga framgången för detta steg är färdighetsberoende59. Även om en uppsjö av modellspecifika sektionsplockningsmetoder60,61 kan förvirra nybörjare, kan vissa enkla, praktiska guider55,62 för rutinmässig sektionering, tillsammans med övning, avsevärt förbättra sektioneringsförmågan. Detta protokoll kräver minimal specialutrustning, och med hjälp av videofilmer som visar de praktiska aspekterna av manuella manipulationstekniker under sektionering, bandavskiljning och bandhantering och upphämtning, ger en utmärkt nybörjarguide till seriell sektionering.

Volym EM-bildanalys fortsätter att vara ett utvecklingsområde med en mängd olika alternativ för öppen källkod och kommersiell programvara som för närvarande finns tillgängliga, och listan växer ständigt. Ett urval av programvara för anpassning (TrakEM241), 3D-segmentering och rekonstruktion (Amira42) presenteras här; Det finns dock många alternativ tillgängliga för anpassning (t.ex. Fiji, Register Virtual Slices63, Atlas5 och 3D-rekonstruktion (t.ex. MIB64; Rekonstruera65; IMOD66). För relativt små analysprojekt, oavsett om data genereras lokalt eller kommer från öppet delade datalager (EMPIAR67, Open Organelle68), är manuell segmentering som beskrivs här ett tillgängligt och genomförbart alternativ. Men för större dataset vänder sig många användare till maskininlärning och artificiell intelligens för automatisering av dessa uppgifter69,70, liksom crowdsourcing-volontärer71 eller kombinerar båda72.

I slutändan, efter anpassning och 3D-segmentering, avslöjar 3D-rekonstruktion inte bara morfologin hos de aktuella strukturerna utan, viktigare, också deras förhållande till andra organeller, inklusive de unika egenskaperna hos alla närvarande kontaktplatser. Dessa organellkontakter kan analyseras ytterligare, och funktioner som antalet kontakter, kontaktyta, volymer av organeller och morfometriska parametrar för organellerna kan extraheras och jämföras mellan experimentella modeller70. Kvantitationsalternativen är många, och deras relevans varierar enormt beroende på den exakta forskningsfrågan. Därför har de inte behandlats på djupet som en del av detta protokoll.

Patologiska processer som påverkar organellkontakter har varit inblandade i både sällsynta (t.ex. Wilsons sjukdom) och vanliga (viral hepatit och alkoholfri steatohepatit) störningar 73,74,75. Till exempel verkar kontaktställena för ER-mitokondrier och mitokondrier-lipiddroppar reglera lipidmetabolismen i hepatocyter; därför är studien av dessa kontakter av stort intresse. Sammanfattningsvis är seriell sektion TEM och efterföljande 3D-rekonstruktion och analys en kraftfull teknik för att förhöra interorganelle kontakter och undersöka deras relativa betydelse i leverfunktioner och sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro och Ania Straatman-Iwanowska för teknisk experthjälp. Vi tackar också Stefan lab-medlemmar och Ian J. White för hjälpsamma diskussioner. J.J.B. stöds av MRC-finansiering till MRC Laboratory of Molecular Cell Biology vid UCL, tilldelningskod MC_U12266B. C.J.S. stöds av MRC-finansiering till MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit vid UCL, tilldelningskod MC_UU_00012/6. P.G. finansieras av Europeiska forskningsrådet, bidragskod ERC-2013-StG-337057.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325 (1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , Springer. New York, NY. (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24 (2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675 (2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102 (2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287 (2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180 (2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091 (2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873 (2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111 (2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043 (2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003 (2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480 (2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., et al. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. Beichel, R. R., Sonka, M., et al. 4241, Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605 (2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196 (2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273 (2021).

Tags

Biologi utgåva 184
Tredimensionell karakterisering av interorganella kontaktställen i hepatocyter med användning av seriell sektionselektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chun Chung, G. H., Gissen, P.,… More

Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter