Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Осаждение белка на основе органических растворителей для надежной очистки протеома перед масс-спектрометрией

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

Настоящий протокол описывает осаждение белка на основе растворителей в контролируемых условиях для надежного и быстрого восстановления и очистки образцов протеома перед масс-спектрометрией.

Abstract

В то время как многочисленные достижения в инструментах масс-спектрометрии (РС) улучшили качественный и количественный анализ протеомов, более надежные интерфейсные подходы к выделению, обогащению и обработке белков перед РС имеют решающее значение для успешной характеристики протеома. Низкое, непоследовательное восстановление белка и остаточные примеси, такие как поверхностно-активные вещества, наносят ущерб анализу РС. Осаждение белка часто считается ненадежным, трудоемким и технически сложным для выполнения по сравнению с другими стратегиями подготовки образцов. Эти проблемы преодолеваются путем использования оптимальных протоколов осаждения белка. Для осаждения ацетона комбинация конкретных солей, контроля температуры, состава растворителя и времени осаждения имеет решающее значение, в то время как эффективность осаждения хлороформа / метанола / воды зависит от надлежащего пипетирования и манипуляции с флаконами. В качестве альтернативы, эти протоколы осаждения оптимизированы и полуавтоматизированы в одноразовом отжимном картридже. В данной работе проиллюстрированы ожидаемые результаты осаждения белка на основе растворителя в традиционном формате и с использованием одноразового двухступенчатого фильтрационного и экстракционного картриджа. Это включает в себя детальную характеристику протеомных смесей с помощью анализа LC-MS/MS снизу вверх. Превосходная производительность рабочих процессов на основе SDS также демонстрируется по сравнению с незагрязненным белком.

Introduction

Анализ протеомов с помощью масс-спектрометрии становится все более строгим благодаря повышенной чувствительности, разрешению, скорости сканирования и универсальности современных приборов MS. Достижения РС способствуют повышению эффективности идентификации белка и более точному количественному определению 1,2,3,4,5. С улучшенными приборами MS исследователи требуют соответствующей последовательной стратегии подготовки образцов, способной количественно восстанавливать белки высокой чистоты за минимальное время на всех этапах рабочего процесса 6,7,8,9,10,11 . Чтобы точно отразить протеомный статус биологической системы, белки должны быть выделены из нативной матрицы образца эффективным и непредвзятым образом. С этой целью, включая денатурирующее поверхностно-активное вещество, такое как додецилсульфат натрия (SDS), обеспечивает эффективную экстракцию белка и солюбилизацию12. Тем не менее, SDS сильно препятствует электрораспылению ионизации, вызывая серьезное подавление сигнала MS, если не устранить должным образом13.

Для последующего анализа протеомов доступны различные стратегии истощения SDS, такие как удержание белков над фильтром отсечения молекулярной массы, содержащимся в одноразовых спиновых картриджах 14,15,16. Метод пробоподготовки с помощью фильтра (FASP) является предпочтительным, поскольку он эффективно истощает SDS ниже 10 ppm, способствуя оптимальному РС. Тем не менее, восстановление белка с помощью FASP является переменным, что побудило к исследованию других методов. Хроматографические подходы, которые избирательно захватывают белок (или поверхностно-активное вещество), превратились в различные удобные картриджи или форматы на основе бусин 17,18,19,20,21. Учитывая эти простые и (в идеале) последовательные стратегии очистки белка, классический подход осаждения белка органическими растворителями часто упускается из виду как перспективный подход к выделению белка. В то время как осаждение растворителей успешно истощает SDS ниже критических уровней, восстановление белка является давней проблемой этого подхода. Несколько групп наблюдали смещение восстановления белка, с неприемлемо низким выходом осадков в зависимости от концентрации белка, молекулярной массы и гидрофобности22,23. В связи с разнообразием протоколов осаждения, о которых сообщается в литературе, были разработаны стандартизированные условия осаждения. В 2013 году Crowell et al. впервые сообщили о зависимости ионной силы от эффективности осаждения белков в 80% ацетона24. Было показано, что для всех исследованных белков добавление до 30 мМ хлорида натрия необходимо для максимизации выхода (до 100% восстановления). Совсем недавно Nickerson et al. показали, что сочетание еще более высокой ионной силы (до 100 мМ) с повышенной температурой (20 °C) во время осаждения ацетона давало почти количественное восстановление за 2-5 мин25. Наблюдалось небольшое снижение восстановления низкомолекулярных (LMW) белков. Таким образом, последующий отчет Baghalabadi et al. продемонстрировал успешное восстановление белков и пептидов LMW (≤5 кДа) путем объединения специфических солей, особенно сульфата цинка, с более высоким уровнем органического растворителя (97% ацетона)26.

В то время как совершенствование протокола осаждения обеспечивает более надежную стратегию очистки белка для протеомики на основе MS, успех обычных осадков в значительной степени зависит от пользовательской техники. Основной целью этой работы является представление надежной стратегии осаждения, которая облегчает выделение белковой гранулы из загрязняющего супернатанта. Одноразовый фильтрационный картридж был разработан для устранения пипетирования путем выделения агрегированного белка над пористым мембранным фильтром27 из PTFE. МС-интерферирующие компоненты в супернатанте эффективно удаляются на короткой низкоскоростной стадии центрифугирования. Одноразовый фильтрующий картридж также предлагает сменный картридж SPE, который облегчает последующую очистку образца после рерастворимости и дополнительного переваривания белка перед масс-спектрометрией.

Здесь представлен ряд рекомендуемых рабочих процессов осаждения протеомов, включая модифицированные протоколы ацетона и хлороформа/метанола/воды28 , в обычном (на основе флаконов) и полуавтоматическом формате в одноразовом двухсударственном фильтрационном и экстракционном картридже. Результирующее восстановление белка и эффективность истощения SDS выделены вместе с покрытием протеома LC-MS/MS снизу вверх, чтобы продемонстрировать ожидаемый результат от каждого протокола. Обсуждаются практические преимущества и недостатки, связанные с каждым подходом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Материальные соображения и предварительная подготовка образцов

  1. Используйте только растворители высокой чистоты (ацетон, хлороформ, метанол) (>99,5%) и химические вещества, свободные от лишней влаги.
  2. Готовят растворы хлорида натрия и сульфата цинка (1 М) в воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Солевые растворы могут храниться неопределенно долго при комнатной температуре, если они не содержат загрязняющих веществ или микробов.
  3. Используйте мельчайший флакон микроцентрифуги из полипропилена (ПП), достаточный для сохранения необходимого объема образца и растворителей для индуцирования осаждения.
  4. Убедитесь, что концентрация SDS в образце, подлежащем осаждению, не превышает 2% (мас./об.). Если SDS выше, разбавьте образец водой.
  5. Обеспечьте концентрацию белка от 0,01 до 10 г/л для оптимальной эффективности осаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная масса для осадков колеблется в пределах 1-100 мкг белка.
  6. Перед использованием убедитесь, что все растворители и растворы не содержат твердых частиц. Выполните либо стадию фильтрации (<0,5 мкм), либо стадию центрифугирования (10 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре) для удаления нерастворенных частиц.
  7. Если требуется восстановление дисульфидной связи и алкилирование, проводят эти этапы до осаждения белка. Избыточные восстанавливающие и алкилирующие реагенты будут удалены в процессе осаждения.
  8. Осаждение белков путем выбора и выполнения одного из протоколов (этапы 2, 3, 4 или 5).

2. Быстрое осаждение белка (на основе флакона) с ацетоном

  1. Пипет 90 мкл белка (без твердых частиц) или раствор протеома в микроцентрифужную трубку ПП. Затем добавляют 10 мкл 1 М водного раствора NaCl.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ионная сила экстракта протеома уже превышает 100 мМ, дополнительная соль не требуется.
  2. Пипетка 400 мкл ацетона в образец. Закройте флакон крышкой и осторожно постучите по флакону, чтобы соединить растворители. Энергичное перемешивание не требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем белка, соли и ацетона может быть увеличен до тех пор, пока сохраняется относительное соотношение каждого из них.
  3. Дайте флакону инкубироваться при комнатной температуре, без помех, в течение минимум 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительные инкубации, в том числе при пониженной температуре (например, обычное осаждение ацетона использует ночное осаждение в морозильной камере), может привести к образованию более крупных (видимых) агрегированных белковых частиц (рис. 1А), которые, как правило, не улучшают общее восстановление белка.
  4. После инкубации поместите образцы в центрифугу, отметив ориентацию флакона. Вращайтесь в течение минимум 2 мин, при 10 000 х г или выше при комнатной температуре.
  5. Открутите флакон и аккуратно декантируйте супернатант, медленно перевернув флакон в контейнер для отходов. Прикоснитесь перевернутым флаконом к бумажному полотенцу, чтобы извлечь остаточный растворитель из флакона.
    ВНИМАНИЕ: Отходы растворителей должны сохраняться и выбрасываться в соответствии с соответствующими протоколами.
  6. Для образцов, содержащих SDS, дозируйте 400 мкл свежего ацетона, стараясь не потревожить гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.6 является необязательным.
    1. Немедленно центрифугируют образец (10 000 х г или выше в течение 1 мин при комнатной температуре), помещая флакон в ротор в той же ориентации, что и начальный спин. Декантируйте промывочный растворитель, как описано на этапе 2.5.
  7. Дайте образцу полностью высохнуть с открытой крышкой (~1 мин). Повторите чашечку флакона и приступайте к солюбилизации гранул (этап 6).

3. Осаждение низкомолекулярных (LMW) пептидов (ZnSO4 + ацетон)

  1. Дозировать 54 мкл экстракта протеома во флакон ПП 2 мл, а затем добавить 6 мкл 1 МZnSO4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное восстановление пептидов НМВ (≤5 кДа) достигается путем добавления ацетона к конечным 97% по объему. Предполагая, что флакон ПП объемом 2 мл, максимальный начальный объем образца составляет 54 мкл.
  2. Добавьте 1940 мкл ацетона к конечным 97% по объему. Осторожно покрутите, чтобы перемешать, и дайте спокойно постоять на столешнице в течение минимум 2 минут.
  3. Центрифугу (10 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре) и удалить надотворное вещество, перевернув флакон, а затем прикоснувшись флаконом к бумажному полотенцу.
  4. Для образцов, содержащих SDS, дозируйте 400 мкл свежего ацетона, стараясь не потревожить гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3.4 является необязательным.
    1. Немедленно центрифугируйте образец в соответствии с этапом 3.3, помещая флакон в ротор в той же ориентации, что и начальный спин. Декантируйте промывочный растворитель, как описано на этапе 3.3.
  5. Повторно солюбилизируйте полученные сухие гранулы в водном растворителе с коротким вихрем или обработкой ультразвуком (~5 мин).

4. Осаждение белка хлороформом/метанолом/водой (ХМВ)

  1. Дозируйте 100 мкл белка или раствора протеома во флакон PP. Добавьте 400 мкл метанола, а затем 100 мкл хлороформа. На короткое время замыкайте флакон и вихрь, чтобы перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для осадков КТМ предпочтение отдается флаконам объемом 1,5 мл с узким дном (рис. 2А).
    ВНИМАНИЕ: Хлороформный растворитель следует обрабатывать в соответствующей вентиляционной вытяжке. Все растворители, которые контактируют с хлороформом, должны рассматриваться как галогенированные отходы при утилизации.
  2. Быстро дозируйте 300 мкл воды непосредственно в центр флакона. Колпачок флакона. Дайте образцу посидеть на столе без помех в течение 1 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор сразу же появится мутным белым цветом. Избегайте смешивания флакона после добавления воды.
  3. Поместите пробирку из полипропилена в центрифугу и открутите не менее 5 минут (10 000 х г или выше при комнатной температуре).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования образуются два видимых слоя растворителя (верхний слой = метанол/вода; нижний = хлороформ). На границе раздела растворителя образуется твердая белковая гранула (рисунок 2А).
  4. Используя большой (1 мл) наконечник микропипетки и удерживая флакон при ~45°, удалите ~700 мкл растворителя из верхнего слоя с равномерной скоростью.
  5. Используйте меньший (200 мкл) наконечник микропипетки, чтобы продолжить удаление верхнего слоя растворителя из флакона с наклоном ~45°. Пипеткой одним непрерывным движением до тех пор, пока верхний слой растворителя не образует шарик во флаконе.
  6. Добавьте 400 мкл свежего метанола во флакон с образцом, не нарушая гранулу, дозируя растворитель вниз по бокам флакона.
  7. Колпачок флакона. Соедините слои растворителя, осторожно раскачивая флакон, чтобы закрутить растворители вместе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать разрушения гранул. Не вихряйте флакон.
  8. Отмечая ориентацию флакона в роторе, центрифуга в течение минимум 10 мин (10 000 х г при комнатной температуре). Белковая гранула прилипает к дну флакона (рисунок 2В).
  9. Опрокините флакон под углом 45°, гранулу повернуть вниз. Поместите наконечник пипетки вдоль верхнего края флакона и удалите надпоставление кончиком микропипетки объемом 1 мл с медленной, но непрерывной скоростью. Сохраните ~20 мкл растворителя во флаконе.
  10. Промыть белковые гранулы для образцов, содержащих SDS, медленно дозируя 400 мкл свежего метанола. Не вихряйте флакон.
    1. Приступайте непосредственно к центрифугированию (10 000 х г в течение 2 мин при температуре), помещая флакон в ротор с той же ориентацией, что и начальный спин.
  11. Удалите растворитель в соответствии со стадией 4.9. Дайте образцу высохнуть на воздухе в вытяжном шкафу до тех пор, пока остаточный растворитель не испарится.
  12. Проконсультируйтесь с рекомендуемыми процедурами резолюбилизации на этапе 6.

5. Осаждение белка с помощью одноразового фильтрационного картриджа

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый протокол осаждения на основе растворителя, описанный на этапах 2-5, может быть выполнен в двухступенчатом картридже фильтрации и экстракции (см. Таблицу материалов).

  1. С помощью пробки, прикрепленной к верхнему фильтрационному картриджу (фиг.3A), дозируйте желаемый объем экстрагированного протеома, соли и растворителя, как описано в одном из трех вариантов ниже.
    1. (Вариант 1) Для осаждения белка с ацетоном смешайте 90 мкл белка или раствора протеома, 10 мкл 1 M водного NaCl и 400 мкл ацетона. Инкубируйте в течение минимум 2 минут на столешнице.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Видимый осадок будет образовываться для концентрированных белковых образцов (1 г/л) (рисунок 3B).
    2. (Вариант 2) Для осаждения пептидов LMW смешайте 15 мкл образца, 1,5 мкл 1 M ZnSO4 и 485 мкл ацетона. Инкубируйте в течение минимум 2 минут на столешнице.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация соли 90 мМ в водном образце не повлияет на извлечение по сравнению с 100 мМ, рекомендованными на этапе 3.
    3. (Вариант 3) Для осаждения ХМВ добавляют 50 мкл экстракта протеома, 200 мкл метанола и 50 мкл хлороформа. Закройте флакон и ненадолго вихрь соединить.
      1. Быстро дозируйте 150 мкл воды непосредственно в центр флакона. Инкубировать в течение 1 мин на столешнице.
  2. Центрифуга в течение 2 мин при 2 500 х г при комнатной температуре с заглушкой, все еще прикрепленной к фильтрационному картриджу.
  3. Переверните картридж, а затем открутите и извлеките заглушку из основания картриджа.
  4. Поместите фильтрационный картридж в чистый флакон и вернитесь в центрифугу. Отжимать в течение 3 мин при 500 х г при комнатной температуре. Выбросьте проточный растворитель из нижнего флакона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо растворитель остается в верхнем фильтрационном картридже, вернитесь в центрифугу и выполните дополнительное отжим.
  5. Промыть белковую гранулу, добавив 400 мкл ацетона в фильтрационный картридж (для осаждения CMW, стадия 5.1.3, добавить 400 мкл метанола).
  6. Центрифуга в течение 3 мин при 500 х г при комнатной температуре или до тех пор, пока в верхнем картридже не останется растворителя.
  7. Повторно солюбилизируйте гранулы осаждения, как описано на этапе 6.

6. Резолюбилизация белковых гранул

  1. Смачивайте мембрану у основания фильтрационного картриджа путем дозирования 2-5 мкл изопропанола непосредственно на мембрану непосредственно перед протоколами рерастворимости, описанными ниже.
  2. Следуйте одному из следующих методов рерастворимости.
    1. (Вариант 1) Добавьте в фильтрационный картридж не менее 20 мкл водного буфера, содержащего ≥2% SDS. Колпачок и вихрь энергично (~1 мин). Альтернативно, ультразвук (>10 мин) для диспергирования белковой гранулы.
      1. Нагревайте образец при 95 °C в течение 5 мин). Повторите этап перемешивания после нагревания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрузочный буфер геля Laemmli может повторно солюбилизировать белковую гранулу. Однако образцы, содержащие SDS, несовместимы с перевариванием трипсина и обратной фазой LC и MS.
    2. (Вариант 2) Готовят раствор 80% (v/v) муравьиной кислоты в воде. Предварительно отклоняют раствор кислоты (-20 °С), а также фильтрационный картридж, содержащий осажденный белок.
      1. Влить в картридж 50 мкл холодной муравьиной кислоты; колпачок и вихрь в течение 30 с. Вернуть в морозильную камеру (-20 °C) на 10 мин.
      2. Вихрь картриджа снова в течение 30 с. Затем повторите цикл охлаждения и перемешивания еще раз (10 мин, -20 °C, вихрь 30 с).
      3. Добавьте воду в конечные 500 мкл, разбавляя муравьиную кислоту до 8%.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол холодной муравьиной кислоты несовместим с последующим перевариванием трипсина, но совместим с LC-MS.
    3. (Вариант 3) Добавьте 50 мкл свежеприготовленной 8 М мочевины в воду в фильтрационный картридж. Ультразвук в течение 30 мин.
      1. Дайте картриджу высиживаться на столешнице в течение 1 ч (до ночи).
      2. Разбавьте 8 М мочевины минимум в 5 раз водой или соответствующим буфером.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После разбавления протокол солюбилизации мочевины совместим с последующим перевариванием трипсина, а также LC-MS.

7. Переваривание белка

  1. Для анализа РС снизу вверх подвергайте повторно солюбилизированные белки ферментативному перевариванию с использованием одного из двух методов, упомянутых ниже.
    1. (Вариант 1) Для резолюбилизации муравьиной кислоты уменьшают начальный объем 80% муравьиной кислоты на стадии 6.2.2.1 до 25 мкл. На этапе 6.2.2.3 использовать 375 мкл воды для разбавления муравьиной кислоты до 5% (v/v).
    2. Дозируйте пепсин в картридж при приблизительном соотношении белка к ферменту 50:1. С помощью пробки, прикрепленной к фильтрационному картриджу, инкубируйте образец в течение ночи при комнатной температуре.
  2. (Вариант 2) Для рерастворимости в мочевине обеспечивают рН от 8 до 8,3 с включением 100 мМ tris или бикарбоната аммония на этапе 6.2.3.2.
    1. Добавляют трипсин при приблизительном соотношении массы белка к ферменту 50:1. С помощью пробки, прикрепленной к картриджу, инкубируйте образец в течение ночи на теплой водяной бане при 37 °C.
    2. Прекращают пищеварение путем подкисления раствора 10% TFA до конечного 1%.
  3. Восстановите переваренный пепсином или трипсином белок, сняв пробку с основания фильтра и центрифугируя картридж, содержащийся в чистом флаконе (2 мин, 5000 х г, комнатная температура).

8. Очистка SPE

ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительного обессоливания образца после сбраживания или обмена растворителем образец может быть подвергнут очистке в обратной фазе, как описано.

  1. Заправляйте картридж SPE (см. Таблицу материалов), пропуская 300 мкл метанола (2 мин, 400 х г) с последующим 300 мкл 5% ацетонитрила/0,1% ТФА (2 мин, 400 х г).
  2. Подключите загрунтованный картридж SPE к основанию фильтрационного картриджа, содержащего повторно солюбилизированный или переваренный белок.
  3. Раскрутите белок через картридж SPE (5 мин, 800 х г при комнатной температуре). Если растворитель остается в верхнем картридже, верните картридж в центрифугу и повторите вращение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное прохождение образца через картридж SPE может улучшить восстановление.
  4. Добавьте 300 мкл 5% ацетонитрила/0,1% TFA в воде в картридж. Для промывки проведите через картридж SPE (2 мин, 2000 х г). Отбросьте сквозной поток.
  5. Для белков LMW или переваренных пептидов элюируют образец путем протекания 300 мкл 50% ацетонитрила / 0,1% TFA (5 мин, 2500 х г).
  6. Для интактных белков следуйте шагу 8.5 с дополнительной стадией элюирования с использованием 300 мкл 75% ацетонитрила / 0,1% TFA. Смешайте два полученных экстракта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 8.6 является необязательным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 4 обобщено ожидаемое истощение SDS после осаждения белков на основе флакона или картриджа в одноразовый фильтрующий картридж с использованием ацетона. Обычная ночная инкубация (-20 °C) в ацетоне сравнивается с протоколом быстрого осаждения ацетона при комнатной температуре (стадия 2), а также с осаждением CMW (стадия 4). Остаточный SDS был количественно определен с помощью анализа29 активных веществ метиленового синего (MBAS). Вкратце, 100 мкл образца комбинировали со 100 мкл реагентом MBAS (250 мг метиленового синего, 50 г сульфата натрия, 10 мл серной кислоты, разбавленной в воде до 1,0 л), с последующим добавлением 400 мкл хлороформа и измерением поглощения органического слоя при 651 нм на спектрофотометре UV/Vis. Все подходы снижают SDS, чтобы обеспечить оптимальный анализ MS.

Количественное и воспроизводимое восстановление белка достигается после быстрого осаждения ацетона и осаждения CMW, как показано на рисунке 5 с помощью анализа SDS PAGE обработанного дрожжевого общего клеточного лизата. Осаждение в одноразовом фильтрационном картридже устраняет необходимость тщательной пипетки SDS-содержащего супернатанта, сохраняя при этом агрегированные белки над мембранным фильтром. Последовательное восстановление достигается со всеми протоколами осаждения, при этом в фракциях супернатанта не обнаруживаются видимые полосы в трех независимых репликациях.

На фиг.6 количественно определены ожидаемые выходы, включая ресулюбилизацию осажденных белковых гранул с использованием холодной муравьиной кислоты (этап 6). Осаждение КТМ обеспечивает количественное извлечение путем тщательного сохранения гранул в подходе на основе флаконов (этап 5), который равен полученному с использованием картриджа (100 ± 4% против 101 ± 3%, соответственно). Извлечение осажденных ацетоном белковых гранул выигрывает от фильтрационного картриджа, при этом наблюдается улучшение выхода на 15-20%. Во флаконах выделение супернатанта ацетона из агрегированного белка по существу зависит от прилипания гранулы к поверхности полипропиленовой трубки; фильтрационный картридж устраняет эту проблему, так как фильтр обеспечивает высокую рекуперацию осажденного белка без пипетирования.

Для эффективного восстановления белков и пептидов LMW протокол осаждения ацетона модифицируют путем замены NaCl на ZnSO4 и повышения процента растворителя до 97%. Сочетание этой специфической соли и более высоких уровней органического растворителя необходимо для высокого восстановления белков и пептидовLMW 26. Как видно на рисунке 7, осаждение белка на основе картриджа демонстрирует превосходное восстановление переваренного пепсином образца бычьей плазмы по сравнению с осаждением на основе флаконов. Одноразовый спин-картридж может восстановить более 90% пептидов LMW. Более существенные различия в ресурсе отмечаются в картридже при использовании NaCl, подтверждая важность типа соли для максимизации выхода. Включение ZnSO4 в отличие от NaCl приводит к агрегированной белковой грануле, которая легче захватывается спин-картриджным фильтром.

Для оценки эффективности осажденных белков в широком динамическом диапазоне была обработана смесь трех стандартных белков: β-галактозидазы (β-гал) из E. coli, цитохрома c (Cyt c) из крупного рогатого скота и енолазы (Eno) из S. cerevisiae. Массовое соотношение β-гал:Cyt c:Eno составляло 10 000:10:1. Образцы первоначально содержали 2% SDS до осаждения на основе картриджей (этап 5) и были повторно солюбилизированы и переварены трипсином (этапы 6 и 7). Образцы, приготовленные во флаконах, действовали в качестве контроля, не имея SDS и пропуская осадки. Все образцы были подвергнуты эквивалентной очистке SPE (этап 8). Проводился восходящий MS, при этом спектры MS/MS были найдены по объединенной базе данных, содержащей все белки из трех вовлеченных видов (см. Таблицу материалов для инструментальных и программных платформ). Была использована частота ложного обнаружения пептидов в размере 1%. Все три белка были идентифицированы MS, с 666, 28 и 35 уникальными пептидами для β-gal, Cyt c и Eno соответственно. На рисунке 8 количественно определено относительное соотношение (пиковая интенсивность пептидов) из каждого образца, причем отношение выше 1 отражает более высокое содержание пептидов для образцов, обработанных в одноразовых фильтрующих картриджах. Результаты демонстрируют преимущества включения SDS в рабочий процесс протеомики, минимизации потерь белка (например, от потенциальной адсорбции во флаконе образца) и максимизации выхода пептидов.

Бычья печень закупалась в местном продуктовом магазине. Белки выделяли путем экстракции ткани раствором 1% SDS. Впоследствии восстановленный протеом выпадал в осадок, повторно солюбилизировался (мочевина) и переваривался трипсином, и все это в одноразовом картридже. Было проведено восходящее LC-MS/MS, в результате чего было идентифицировано в среднем ~8000 белков (~30 000 пептидов). Показатели ложного обнаружения 0,5% и 1,0% для пептидных спектров и белковых групп были использованы при поиске в базе данных крупного рогатого скота. Техническая воспроизводимость этого рабочего процесса на основе картриджей оценивается через перекрывающиеся идентификации белков. Реплицированные инъекции РС общего переваренного образца достигают в среднем 78 ± 0,5% перекрытия с идентифицированными белками. Для сравнения, образцы, самостоятельно подготовленные в дискретных картриджах, достигли 76 ± перекрытия 0,5%. Эти данные свидетельствуют о том, что вклад пробоподготовки в общую изменчивость анализа незначителен по сравнению с тем, что уже вносит инструментальный подход LC-MS. Белки крупного рогатого скота, идентифицированные из трех технических реплик (обработанных независимо в трех одноразовых картриджах), были дополнительно охарактеризованы в отношении их молекулярной массы, гидрофобности и изоэлектрической точки, показанной на рисунке 9. Двусторонняя ANOVA не смогла определить статистические различия в идентифицированных протеомах по техническим репликам. Наконец, на рисунке 10 сравнивается количество идентифицированных пептидов на белок в трех реплицированных образцовых препаратах. Коэффициенты корреляции на этих графиках (0,94-0,95) демонстрируют высокую согласованность подхода к пробоподготовке для анализа МС снизу вверх.

Figure 1
Рисунок 1: Ацетон-осажденные белки. Образцы, содержащие 100 и 1000 мкг белка, в сочетании со 100 мМ NaCl и осажденные 80% ацетоном (А) после 5-минутного времени осаждения и (В) после осаждения и последующего центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Осаждение белка хлороформом/метанолом/водой. Образец, содержащий 50 мкг белка, осажденный в соответствии с этапом 4. (A) Сразу после шага 4.4. (B) Сразу после шага 4.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Фотографии одноразового двухступенчатого фильтрующего и экстракционного картриджа для осаждения белка. Образец, содержащий 100 мкг белка, соединяли со 100 мМ NaCl и 80% ацетона в (А) собранной фильтрации и картридже SPE и (В) осаждали в течение 5 мин до тех пор, пока белковые агрегаты не стали видимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Эффективность истощения SDS после осаждения белка. Процент удаленного SDS показан из осаждения ацетона с помощью обычного протокола (ночью при -20 °C), быстрого протокола (2 мин инкубации при комнатной температуре) или осаждения хлороформа / метанола / воды (CMW) лизата S. cerevisiae , как в обычном (флакон), так и в картриджном формате. Эти образцы первоначально содержали 0,5% SDS (5000 ppm), выводя, > 99,8% удаления SDS требуется для оптимального анализа MS. Остаточный SDS количественно определяется с помощью анализа активных веществ метиленового синего (MBAS). Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение от технических реплик (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Полное восстановление протеома в результате осаждения. SDS PAGE показывает восстановление общего лизата белка S. cerevisiae , осажденного (A) обычным осаждением ацетона, (B) осаждением хлороформа / метанола / воды и (C) быстрым осаждением ацетона. Белковые полосы наблюдаются исключительно в гранулированной фракции, без видимых полос в супернатанте (Super.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Превосходное восстановление белка в фильтрационном картридже. Для осаждения общего лизата белка S. cerevisiae одноразовый спин-картридж облегчает количественное восстановление с осаждением ацетона и CMW. Высокое извлечение также возможно при осаждении на основе флаконов, хотя требуется тщательная обработка проб и пипетка. Здесь показано восстановление белка с оценкой LC-UV после резолюбилизации гранул холодной муравьиной кислотой. Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение от технических реплик (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Высокие выходы осаждения для низкомолекулярных пептидов. Модифицированный протокол осаждения ацетона для пептидов и белков ≤5 кДа включает соединение 100 мМ ZnSO4 с 97% ацетоном для достижения самых высоких выходов. Осадки, облегчаемые одноразовым фильтрующим картриджем, демонстрируют улучшенное извлечение по сравнению с обычными осадками на основе флаконов во всех трех условиях осаждения. Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение от технических реплик (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Более высокое восстановление стандартных белков в рабочем процессе на основе SDS. Tukey Box-and-Whisker строитграфик 30 относительной интенсивности сигнала MS для пептидов, извлеченных из SDS-содержащих белков, обработанных в одноразовом фильтрационном картридже относительно контрольного образца (без SDS, без осадков). Используемые белки охватывают широкий динамический диапазон концентраций - β-галактозидазы: цитохром c: енолаза = 10 000: 10: 1. Каждый квартиль внутри коробок содержит 25% распределения, в то время как полосы ошибок охватывают 95% распределения. Среднее обозначается "+", а медиана - горизонтальной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Идентифицированное распределение белка из технических реплик. Графики Tukey Box-and-Whisker характеризуют (A) молекулярную массу, (B) гидрофобность и (C) изоэлектрическую точку белков, идентифицированных снизу вверх LC-MS/MS после трехкратных препаратов лизата печени крупного рогатого скота в двухступенчатом фильтрационном и экстракционном картридже. Не было выявлено статистической разницы в этих характеристиках по двусторонней ANOVA (p < 0,05). Каждый квартиль внутри коробок содержит 25% распределения, в то время как полосы ошибок охватывают 95% распределения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Корреляция идентификаторов пептидов на белок через рабочий процесс подготовки на основе SDS для препаративных реплик. Анализ воспроизводимости протеома снизу вверх по образцам (А) 1 и 2, (В) образцам 2 и 3 и (С) образцам 1 и 3 на основе количества идентификаций пептидных РС на белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Оптимальная характеристика МС достигается при истощении остаточного СДС ниже 10 ppm. В то время как альтернативные подходы, такие как FASP и переваривание на шариках, предлагают количественное истощение SDS с переменным извлечением 31,32,33, основной целью осадков является максимизация чистоты и выхода одновременно. Это зависит от эффективного выделения супернатанта (содержащего SDS) без нарушения белковой гранулы. При осаждении на основе флаконов, как только основная часть супернатанта удаляется путем пипетки, становится все более вероятным, что некоторые из агрегированных гранул случайно теряются. По этой причине важно оставить после себя более значительную долю остаточного растворителя (~20 мкл) и добавить стадию промывки34. Этап промывки разбавляет и удаляет остаточный растворитель из флакона. В частности, при CMW нет необходимости вихрять флакон с образцом после того, как гранула сформировалась. Разрушение гранул путем энергичного перемешивания имеет нежелательный эффект увеличения вероятности потери от случайного пипетирования. Если включено вихревое покрытие (как это рекомендовано предыдущими протоколами)35, существует вероятность того, что части гранулы ХМВ будут прилипать к нижней стороне крышки флакона; после центрифугирования гранула остается неподвижной на крышке флакона и может привести к потере ~ 50%.

Быстрое осаждение может быть выполнено с высоким восстановлением разбавленных образцов протеома, в идеале между 0,01-2 мг/мл, или соответствующей белковой массой между 1-200 мкг. Тем не менее, количественное и воспроизводимое извлечение, начиная с белка ниже 0,01 мг / мл, может выиграть от более длительного времени осаждения в диапазоне от 10 мин до 1 ч, демонстрируя ограничения пропускной способности рабочего процесса осаждения. Удивительно, но более концентрированные образцы (10 мг/мл) показывают статистическое снижение выхода, предположительно из-за случайных потерь при пипетке. Предполагая, >10 мкг белка, на стороне флакона должна наблюдаться видимая гранула (рисунок 1B). Меньшие количества, вплоть до 1 мкг, трудно увидеть. Это бросает вызов способности пипетки супернатанта, не нарушая белковую гранулу. Флакон может быть инвертирован (медленно) ацетоном, чтобы отделить растворитель от гранулы. Для CMW гранула недостаточно надежно прилипает к флакону, тем самым отдавая предпочтение пипетке, а не декантированию супернатанта. Для осаждения на основе флаконов рекомендуется работать с наименьшей возможной микроцентрифужной трубкой, чтобы облегчить предполагаемые объемы образца и растворителя. Осаждение в одноразовом фильтрационном картридже, используемом в этой работе, обеспечивает максимальную объемную емкость 500 мкл, что позволяет вытеснять белок с 80% ацетоном на объемах образцов до 100 мкл. Объемы проб, соли и растворителя могут быть соответствующим образом скорректированы, если рекомендуемые концентрации поддерживаются.

Чистота белковой гранулы, извлеченной из осаждения на основе органических растворителей, ограничена сложностью матрицы образца, буферных компонентов и условий осаждения. Например, было показано, что специфические буферные компоненты, такие как глицин (используемый для разделения SDS PAGE), осаждаются совместно с белком с использованием 80% ацетона. Тем не менее, глицин остается растворимым через осаждение CMW. Сообщалось, что ацетон осаждает фрагменты ДНК36,37, потенциально добавляя нежелательные фоновые примеси к восстановленной грануле. Осаждение низкомолекулярных белков и пептидов требует повышенного уровня органического растворителя и определенного типа соли для максимизации выхода. В то время как было исследовано несколько солей, ZnSO4 обеспечивает стабильно высокие продукты. Эта соль будет выпадать в осадок в 97% ацетона в отсутствие белка. Таким образом, полученная белковая гранула содержит высокую концентрацию соли. Отмечается, что использование 90% ацетона по объему также приведет к высоким выходам пептидов, хотя ожидается статистически значимое снижение (~ 5%) восстановления. Однако это позволяет обрабатывать более значительный объем образца (до 180 мкл, с 20 мкл по 1 М ZnSO4) в каждом флаконе объемом 2 мл. Помимо матричных примесей, сосуществующих вместе с белковой гранулой, следует отметить, что осаждение растворителем по своей сути вызывает денатурацию образца38,39. Поэтому данный протокол не применим к препаратам функциональных белков или нативным рабочим процессам РС. Сообщалось также, что ацетон вызывает модификации ковалентного белка в остаткахглицина 40 и индуцирует сдвиг массы +98 u, который, как предполагается, является побочным продуктом альдольной конденсации ацетона41.

При использовании фильтрационного картриджа для осаждения белка изоляция белковой гранулы зависит от удержания агрегатов над мембранным фильтром из PTFE. Пористость этой мембраны превышает пористость фильтра с отсечки молекулярной массы (как показано в FASP), что позволяет выделять белок с уменьшенным временем вращения. Быстрая передача раствора при низких скоростях отжима зависит от правильного смачивания мембраны из PTFE; органические растворители легко протекают, хотя сухой фильтр из PTFE препятствует водным растворителям. Если фильтрационный картридж кажется забитым, мембрану следует повторно смачивать путем непосредственного нанесения небольшого объема органического растворителя (например, изопропанола) на фильтр. В зависимости от размера белковой гранулы и объема используемого образца может потребоваться дополнительное центрифугирование или отжимы на более высоких скоростях (до 3000 х г), чтобы убедиться, что весь растворитель прошел через фильтрационный картридж.

Извлечение белка из осаждения с оптимальными условиями в конечном итоге ограничено проблемой повторного солюбилизации гранул, при этом несколько вариантов растворителей совместимы с последующей обработкой и LC-MS. Кроме того, несколько условий осаждения, таких как длительное воздействие низких температур и пересушивание плотно упакованных гранул, способствуют проблемам повторного солюбилизации40. Отмечается, что белковые гранулы CMW, как правило, менее растворимы, чем гранулы ацетона. Ранее сообщалось о максимальной эффективности ресолюбилизации осажденного белка 80% холодной муравьиной кислотой (стадия 6.2.2); холодная температура предотвращает модификацию белка, которая в противном случае происходит в концентрированной муравьиной кислоте43,44. Разбавление концентрации кислоты также замедляет реакцию модификации. Муравьиная кислота рекомендуется для нисходящих подходов к рассеянному склерозу или перед ферментативным пищеварением с пепсином. Использование этого растворителя требует небольшой физической обработки; добавление только 5 мкл (достаточно для покрытия белковой гранулы) может быть достаточным в сочетании с вихрем, кратковременной обработкой ультразвуком или повторным пипетированием. Аналогичным образом, для образцов, предназначенных для анализа SDS PAGE, повторное растворение в SDS-содержащем буфере Laemmli является высокоэффективным в сочетании со скромным перемешиванием образца перед нагревом. Однако эти растворители несовместимы с трипсином. Перед перевариванием трипсина рекомендуется повторное растворение 8 М мочевины, гарантируя, что мочевина была свежеприготовлена (в тот же день). Минимальный объем буфера 50 мкл рекомендуется для повторной солюбилизации белка в фильтрационном картридже для максимизации контакта между хаотропным растворителем и гранулой, а также для содействия растворению во время обработки ультразвуком, повторного пипетирования и/или вихря. Альтернативные подходы используют трипсин для повторной солюбилизации белка, что означает, что белок не должен быть полностью повторно растворен до добавления фермента. Тем не менее, этот подход может искажать пищеварение, отдавая предпочтение более растворимым видам, в то время как гидрофобные белки испытывают более короткое время переваривания45. Добавление 8 М мочевины вместе с основными буферами, такими как трис или бикарбонат аммония, требует стадии очистки образца после пищеварения. Для таких добавок для образцов идеально подходит очистка колонны с обратной фазой. Одноразовый фильтрационный картридж, используемый в данном исследовании, дополнен сменным картриджем SPE с обратной фазой. Этот картридж также идеально подходит для обмена растворителем, в случае протокола резолюбилизации муравьиной кислоты. Важно отметить, что любой подход к извлечению твердофазной фазы связан с присущими им потерями при извлечении образца. Поэтому пользователь должен взвесить преимущества восстановления и дополнительной очистки для своего эксперимента.

Ожидается, что эти протоколы позволят исследователям протеомики оптимизировать свои рабочие процессы на основе моющих средств, используя SDS для экстракции протеома. Подготовительные стратегии, которые способствуют последовательному восстановлению полного протеома, имеют решающее значение. Двухступенчатый спин-картридж упрощает возможность быстрой, надежной и воспроизводимой изоляции образцов протеома. Такой подход поддавался бы приложениям, требующим тщательного анализа, без ущерба для пропускной способности выборки, таким как клинические условия или крупномасштабные исследовательские инициативы46. Будущие применения этих подходов могут включать обнаружение биомаркеров, обнаружение, точное количественное определение и обнаружение лекарств и мишеней для лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Лаборатория Doucette разработала и запатентовала ProTrap XG, используемый в этом исследовании. AAD также является партнером-основателем Proteoform Scientific, которая коммерциализировала картридж для подготовки образцов.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады. Авторы благодарят Bioinformatics Solutions Inc. (Ватерлоо, Канада) и SPARC BioCentre (молекулярный анализ) в больнице для больных детей (Торонто, Канада) за их вклад в сбор данных о РС.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Tags

Химия выпуск 180 Масс-спектрометрия протеомика пробоподготовка додецилсульфат натрия осаждение сбраживание белка ацетон хлороформ/метанол/вода
Осаждение белка на основе органических растворителей для надежной очистки протеома перед масс-спектрометрией
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter