Summary
Le présent protocole décrit la précipitation protéique à base de solvant dans des conditions contrôlées pour une récupération et une purification robustes et rapides des échantillons de protéome avant la spectrométrie de masse.
Abstract
Bien que les multiples progrès réalisés dans les instruments de spectrométrie de masse (SEP) aient amélioré l’analyse qualitative et quantitative du protéome, des approches frontales plus fiables pour isoler, enrichir et traiter les protéines avant la SEP sont essentielles à la caractérisation réussie du protéome. Une récupération faible et incohérente des protéines et des impuretés résiduelles telles que les tensioactifs nuisent à l’analyse de la SEP. La précipitation des protéines est souvent considérée comme peu fiable, longue et techniquement difficile à effectuer par rapport à d’autres stratégies de préparation d’échantillons. Ces préoccupations sont surmontées en utilisant des protocoles optimaux de précipitation des protéines. Pour la précipitation de l’acétone, la combinaison de sels spécifiques, le contrôle de la température, la composition du solvant et le temps de précipitation sont essentiels, tandis que l’efficacité de la précipitation du chloroforme / méthanol / eau dépend d’un pipetage et d’une manipulation du flacon appropriés. Alternativement, ces protocoles de précipitation sont rationalisés et semi-automatisés dans une cartouche de rotation jetable. Les résultats attendus de la précipitation des protéines à base de solvant dans le format conventionnel et de l’utilisation d’une cartouche de filtration et d’extraction jetable en deux étapes sont illustrés dans ce travail. Cela comprend la caractérisation détaillée des mélanges protéomiques par analyse ascendante LC-MS/MS. Les performances supérieures des flux de travail basés sur les FDS sont également démontrées par rapport aux protéines non contaminées.
Introduction
L’analyse du protéome par spectrométrie de masse est devenue de plus en plus rigoureuse, en raison de la sensibilité, de la résolution, de la vitesse de balayage et de la polyvalence accrues des instruments MS modernes. Les progrès de la SEP contribuent à une plus grande efficacité d’identification des protéines et à une quantification plus précise 1,2,3,4,5. Grâce à l’amélioration de l’instrumentation de la SEP, les chercheurs exigent une stratégie de préparation d’échantillons front-end cohérente capable de récupérer quantitativement des protéines de haute pureté en un minimum de temps à toutes les étapes du flux de travail 6,7,8,9,10,11 . Pour refléter avec précision l’état protéomique d’un système biologique, les protéines doivent être isolées de la matrice de l’échantillon natif de manière efficace et impartiale. À cette fin, l’inclusion d’un tensioactif dénaturant, tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS), assure une extraction et une solubilisation efficaces des protéines12. Cependant, les FDS interfèrent fortement avec l’ionisation par électropulvérisation, provoquant une suppression sévère du signal MS si elle n’est pas correctement éliminée13.
Diverses stratégies d’épuisement des FDS sont disponibles pour une analyse ultérieure du protéome, telles que la rétention de protéines au-dessus d’un filtre de coupure de poids moléculaire contenu dans des cartouches de spin jetables 14,15,16. La méthode de préparation d’échantillons assistée par filtre (FASP) est privilégiée car elle épuise efficacement les FDS en dessous de 10 ppm, facilitant ainsi une SEP optimale. Cependant, la récupération des protéines avec LE FASP est variable, ce qui a incité à l’exploration d’autres techniques. Les approches chromatographiques qui capturent sélectivement les protéines (ou tensioactifs) ont évolué en diverses cartouches pratiques ou formats à base de billes 17,18,19,20,21. Compte tenu de ces stratégies simples et (idéalement) cohérentes de purification des protéines, l’approche classique de la précipitation des protéines avec des solvants organiques est souvent négligée comme une approche prometteuse de l’isolement des protéines. Bien qu’il soit démontré que la précipitation des solvants épuise les FDS en dessous des niveaux critiques avec succès, la récupération des protéines est une préoccupation de longue date de cette approche. Plusieurs groupes ont observé un biais de récupération des protéines, avec des rendements de précipitations inacceptablement bas en fonction de la concentration en protéines, du poids moléculaire et de l’hydrophobicité22,23. En raison de la diversité des protocoles de précipitations rapportés dans la littérature, des conditions de précipitations normalisées ont été élaborées. En 2013, Crowell et al. ont signalé pour la première fois la dépendance de la force ionique à l’efficacité des précipitations des protéines dans 80% d’acétone24. Pour toutes les protéines examinées, l’ajout de chlorure de sodium jusqu’à 30 mM s’est avéré essentiel pour maximiser les rendements (jusqu’à 100 % de récupération). Plus récemment, Nickerson et al. ont montré que la combinaison d’une force ionique encore plus élevée (jusqu’à 100 mM) avec une température élevée (20 ° C) pendant les précipitations d’acétone donnait une récupération presque quantitative en 2-5 min25. Une légère baisse de la récupération des protéines de faible poids moléculaire (LMW) a été observée. Par conséquent, un rapport ultérieur de Baghalabadi et al. a démontré la récupération réussie des protéines et des peptides LMW (≤5 kDa) en combinant des sels spécifiques, en particulier le sulfate de zinc, avec un niveau plus élevé de solvant organique (97% d’acétone)26.
Bien que l’affinement du protocole de précipitation confère une stratégie de purification des protéines plus fiable pour la protéomique basée sur la SEP, le succès des précipitations conventionnelles repose fortement sur la technique de l’utilisateur. L’un des principaux objectifs de ces travaux est de présenter une stratégie de précipitation robuste qui facilite l’isolement de la pastille de protéine du surnageant contaminant. Une cartouche de filtration jetable a été développée pour éliminer le pipetage en isolant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane poreuse en PTFE27. Les composants interférants de la SEP dans le surnageant sont efficacement éliminés lors d’une étape de centrifugation courte et à basse vitesse. La cartouche filtrante jetable offre également une cartouche SPE interchangeable, qui facilite le nettoyage ultérieur des échantillons après laolubilisation et la digestion facultative des protéines, avant la spectrométrie de masse.
Une série de flux de travail recommandés pour la précipitation du protéome sont présentés ici, y compris les protocoles modifiés acétone et chloroforme/méthanol/eau28 , dans un format conventionnel (à base de flacons) et semi-automatisé dans une cartouche de filtration et d’extraction jetable à deux états. Les récupérations de protéines et l’efficacité de l’épuisement des FDS qui en résultent sont mises en évidence, ainsi que la couverture ascendante du protéome LC-MS/MS, afin de démontrer le résultat attendu de chaque protocole. Les avantages et les inconvénients pratiques associés à chaque approche sont discutés.
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Protocol
1. Considérations matérielles et pré-préparation de l’échantillon
- Utilisez uniquement des solvants de haute pureté (acétone, chloroforme, méthanol) (>99,5%) et des produits chimiques, exempts d’excès d’humidité.
- Préparer des solutions de chlorure de sodium et de sulfate de zinc (1 M) dans l’eau.
REMARQUE: Les solutions salines peuvent être stockées indéfiniment à température ambiante, à condition qu’elles soient exemptes de contaminants ou de croissance microbienne. - Utilisez le plus petit flacon de microcentrifugeuse en polypropylène (PP) suffisant pour retenir le volume requis d’échantillon et de solvants pour induire la précipitation.
- S’assurer que la concentration de FDS dans l’échantillon à précipiter n’est pas supérieure à 2 % (p/v). Si la FDS est plus élevée, diluer l’échantillon avec de l’eau.
- Assurer une concentration en protéines comprise entre 0,01 et 10 g/L pour une efficacité optimale des précipitations.
REMARQUE: La masse optimale pour les précipitations varie entre 1 et 100 μg de protéines. - Assurez-vous que tous les solvants et solutions sont exempts de particules avant utilisation. Effectuer une filtration (<0,5 μm) ou une étape de centrifugation (10 000 x g pendant 1 min à température ambiante) pour éliminer les particules non dissoutes.
- Si une réduction de la liaison disulfure et une alkylation sont nécessaires, effectuez ces étapes avant la précipitation des protéines. L’excès de réactifs réducteurs et alkylants sera éliminé par le processus de précipitation.
- Précipitez les protéines en sélectionnant et en exécutant l’un des protocoles (étapes 2, 3, 4 ou 5).
2. Précipitation rapide des protéines (à base de flacon) avec de l’acétone
- Pipeter 90 μL de solution de protéines ou de protéomes (sans particules) dans un tube de microcentrifugation pp. Ensuite, ajoutez 10 μL de NaCl aqueux 1 M.
REMARQUE: Si la force ionique de l’extrait de protéome dépasse déjà 100 mM, aucun sel supplémentaire n’est nécessaire. - Pipeter 400 μL d’acétone dans l’échantillon. Boucher le flacon et tapoter doucement le flacon pour combiner les solvants. Un mélange vigoureux n’est pas nécessaire.
REMARQUE: Le volume de protéines, de sel et d’acétone peut être augmenté tant que le rapport relatif de chacun est maintenu. - Laisser le flacon incuber à température ambiante, sans être dérangé, pendant au moins 2 min.
REMARQUE : Des incubations plus longues, y compris celles à température réduite (p. ex., la précipitation conventionnelle d’acétone utilise des précipitations nocturnes dans le congélateur), peuvent entraîner la formation de particules protéiques agrégées plus grandes (visibles) (figure 1A), qui n’améliorent généralement pas la récupération totale des protéines. - Après l’incubation, placer les échantillons dans une centrifugeuse en notant l’orientation du flacon. Tourner pendant au moins 2 min, à 10 000 x g ou plus à température ambiante.
- Décapsulez le flacon et décantez doucement le surnageant en inversant lentement le flacon dans un conteneur à déchets. Touchez le flacon inversé à une serviette en papier pour extraire le solvant résiduel du flacon.
ATTENTION : Les solvants résiduaires doivent être conservés et jetés conformément aux protocoles appropriés. - Pour les échantillons contenant des FDS, distribuer 400 μL d’acétone fraîche en veillant à ne pas déranger la pastille.
REMARQUE: L’étape 2.6 est facultative.- Centrifuger immédiatement l’échantillon (10 000 x g ou plus pendant 1 min à température ambiante), en plaçant le flacon dans le rotor dans la même orientation que le spin initial. Décantez le solvant de lavage comme décrit à l’étape 2.5.
- Laisser sécher complètement l’échantillon avec le bouchon ouvert (~1 min). Récapitulez le flacon et procédez à la solubilisation des granulés (étape 6).
3. Précipitation de peptides de faible poids moléculaire (LMW) (ZnSO4 + acétone)
- Distribuer 54 μL d’extrait de protéome dans un flacon de PP de 2 mL, puis ajouter 6 μL de 1 M ZnSO4.
REMARQUE: La récupération optimale des peptides LMW (≤5 kDa) est obtenue en ajoutant de l’acétone à un final 97% en volume. En supposant un flacon de PP de 2 mL, le volume initial maximal de l’échantillon est de 54 μL. - Ajouter 1940 μL d’acétone à un dernier 97% en volume. Tourbillonner doucement pour mélanger, et laisser reposer sans être dérangé sur la paillasse pendant au moins 2 min.
- Centrifuger (10 000 x g pendant 1 min à température ambiante) et retirer le surnageant en inversant le flacon, puis en touchant le flacon à une serviette en papier.
- Pour les échantillons contenant des FDS, distribuer 400 μL d’acétone fraîche en veillant à ne pas déranger la pastille.
REMARQUE: L’étape 3.4 est facultative.- Centrifugez immédiatement l’échantillon conformément à l’étape 3.3, en plaçant le flacon dans le rotor dans la même orientation que le spin initial. Décantez le solvant de lavage comme décrit à l’étape 3.3.
- Re-solubiliser la pastille sèche résultante dans un solvant aqueux avec un bref vortex ou sonication (~5 min).
4. Précipitation des protéines par chloroforme/méthanol/eau (CMW)
- Distribuer 100 μL de la solution de protéine ou de protéome dans un flacon de PP. Ajouter 400 μL de méthanol, suivi de 100 μL de chloroforme. Boucher le flacon et vortex brièvement pour mélanger.
REMARQUE : Pour les précipitations CMW, on préfère les flacons de 1,5 mL à fond étroit (figure 2A).
ATTENTION : Le solvant chloroforme doit être manipulé dans une hotte de ventilation appropriée. Tous les solvants qui entrent en contact avec le chloroforme doivent être traités comme des déchets halogénés lorsqu’ils sont éliminés. - Distribuer rapidement 300 μL d’eau directement au centre du flacon. Coiffer le flacon. Laissez l’échantillon reposer sur la paillasse sans être dérangé pendant 1 min.
REMARQUE: La solution apparaîtra immédiatement blanc trouble. Évitez de mélanger le flacon après l’ajout d’eau. - Placer le flacon de PP dans une centrifugeuse et tourner pendant au moins 5 min (10 000 x g ou plus à température ambiante).
REMARQUE: Une fois centrifugés, deux couches de solvant visibles se formeront (couche supérieure = méthanol / eau; fond = chloroforme). Une pastille de protéine solide se forme à l’interface du solvant (Figure 2A). - À l’aide d’une grande pointe de micropipette (1 mL) et en maintenant le flacon à ~45°, retirez ~700 μL du solvant de la couche supérieure à une vitesse uniforme.
- Utilisez une micropipette plus petite (200 μL) pour continuer à retirer la couche supérieure de solvant du flacon incliné d’environ 45 °. Pipet en un mouvement continu jusqu’à ce que la couche supérieure de solvant forme une perle dans le flacon.
- Ajouter 400 μL de méthanol frais au flacon d’échantillon, sans perturber la pastille, en distribuant le solvant sur le côté du flacon.
- Coiffer le flacon. Combinez les couches de solvant en berçant doucement le flacon pour faire tourbillonner les solvants ensemble.
REMARQUE: Il est essentiel d’éviter de perturber le granulé. Ne pas vortexer le flacon. - En notant l’orientation du flacon dans le rotor, centrifuger pendant au moins 10 min (10 000 x g à température ambiante). La pastille de protéine adhère au fond du flacon (figure 2B).
- Basculez le flacon à 45°, avec la pastille vers le bas. Placez l’embout de la pipette le long du bord supérieur du flacon et retirez le surnageant avec une pointe de micropipette de 1 mL à un rythme lent mais continu. Conserver ~20 μL de solvant dans le flacon.
- Lavez la pastille de protéine pour les échantillons contenant des FDS en distribuant lentement 400 μL de méthanol frais. Ne pas vortexer le flacon.
- Procéder directement à la centrifugation (10 000 x g pendant 2 min à température), en plaçant le flacon dans le rotor avec la même orientation que le spin initial.
- Retirez le solvant, conformément à l’étape 4.9. Laisser sécher l’échantillon à l’air libre dans une fumière jusqu’à ce que le solvant résiduel s’évapore.
- Consultez les procédures de résolution recommandées à l’étape 6.
5. Précipitation des protéines à l’aide d’une cartouche de filtration jetable
REMARQUE: Chaque protocole de précipitation à base de solvant décrit aux étapes 2 à 5 peut être effectué dans une cartouche de filtration et d’extraction en deux étapes (voir tableau des matériaux).
- Une fois le bouchon fixé à la cartouche de filtration supérieure (Figure 3A), distribuez le volume souhaité du protéome, du sel et du solvant extraits, comme indiqué dans l’une des trois options ci-dessous.
- (Option 1) Pour la précipitation des protéines avec l’acétone, combiner 90 μL de solution de protéine ou de protéome, 10 μL de NaCl aqueux de 1 M et 400 μL d’acétone. Incuber pendant un minimum de 2 min sur la paillasse.
REMARQUE : Un précipité visible se développera pour les échantillons de protéines concentrées (1 g/L) (figure 3B). - (Option 2) Pour la précipitation peptidique LMW, combiner 15 μL de l’échantillon, 1,5 μL de 1 M ZnSO4 et 485 μL d’acétone. Incuber pendant un minimum de 2 min sur la paillasse.
REMARQUE : Une concentration de sel de 90 mM dans l’échantillon aqueux n’aura pas d’incidence sur la récupération par rapport aux 100 mM recommandés à l’étape 3. - (Option 3) Pour la précipitation CMW, ajouter 50 μL d’extrait de protéome, 200 μL de méthanol et 50 μL de chloroforme. Boucher le flacon et vortex brièvement pour combiner.
- Distribuer rapidement 150 μL d’eau directement au centre du flacon. Incuber pendant 1 min sur la paillasse.
- (Option 1) Pour la précipitation des protéines avec l’acétone, combiner 90 μL de solution de protéine ou de protéome, 10 μL de NaCl aqueux de 1 M et 400 μL d’acétone. Incuber pendant un minimum de 2 min sur la paillasse.
- Centrifuger pendant 2 min à 2 500 x g à température ambiante avec le bouchon toujours attaché à la cartouche de filtration.
- Inversez la cartouche, puis dévissez et retirez la fiche de la base de la cartouche.
- Placez la cartouche de filtration dans un flacon propre et retournez à la centrifugeuse. Tourner pendant 3 min à 500 x g à température ambiante. Jetez le solvant d’écoulement du flacon inférieur.
REMARQUE: S’il reste un solvant dans la cartouche de filtration supérieure, retournez à la centrifugeuse et effectuez un tour supplémentaire. - Lavez la pastille de protéine en ajoutant 400 μL d’acétone à la cartouche de filtration (pour la précipitation CMW, étape 5.1.3, ajouter 400 μL de méthanol).
- Centrifuger pendant 3 min à 500 x g à température ambiante ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solvant dans la cartouche supérieure.
- Re-solubiliser la pastille de précipitation comme décrit à l’étape 6.
6. Resolubilisation des granulés de protéines
- Mouiller la membrane à la base de la cartouche de filtration en distribuant 2 à 5 μL d’isopropanol directement sur la membrane immédiatement avant les protocoles de résolution décrits ci-dessous.
- Suivez l’une des méthodes de résolution suivantes.
- (Option 1) Ajouter un minimum de 20 μL de tampon aqueux contenant ≥2 % de FDS à la cartouche de filtration. Capuchon et vortex vigoureusement (~1 min). Alternativement, sonicate (>10 min) pour disperser la pastille de protéine.
- Chauffer l’échantillon à 95 °C pendant 5 min). Répétez l’étape de mélange après le chauffage.
REMARQUE: Le tampon de chargement du gel Laemmli peut re-solubiliser la pastille de protéine. Cependant, les échantillons contenant des FDS sont incompatibles avec la digestion de la trypsine et la LC et la SEP en phase inversée.
- Chauffer l’échantillon à 95 °C pendant 5 min). Répétez l’étape de mélange après le chauffage.
- (Option 2) Préparer une solution d’acide formique à 80% (v/v) dans l’eau. Précérez la solution acide (-20 °C), ainsi que la cartouche de filtration contenant des protéines précipitées.
- Distribuer 50 μL d’acide formique froid dans la cartouche; bouchon et vortex pendant 30 s. Remettre au congélateur (-20 °C) pendant 10 min.
- Vortex la cartouche à nouveau pendant 30 s. Ensuite, répétez le cycle de refroidissement et de mélange une fois de plus (10 min, -20 °C, 30 s de vortex).
- Ajouter de l’eau à un dernier 500 μL, en diluant l’acide formique à 8%.
REMARQUE: Le protocole d’acide formique froid est incompatible avec la digestion ultérieure de la trypsine, mais est compatible avec LC-MS.
- (Option 3) Ajouter 50 μL d’urée fraîchement préparée de 8 M dans de l’eau à la cartouche de filtration. Sonicate pendant 30 min.
- Laisser la cartouche incuber sur la paillasse pendant 1 h (jusqu’à la nuit).
- Diluer l’urée de 8 M au moins 5 fois avec de l’eau ou un tampon approprié.
REMARQUE: Une fois dilué, le protocole de solubilisation de l’urée est compatible avec la digestion ultérieure de la trypsine, ainsi qu’avec la LC-MS.
- (Option 1) Ajouter un minimum de 20 μL de tampon aqueux contenant ≥2 % de FDS à la cartouche de filtration. Capuchon et vortex vigoureusement (~1 min). Alternativement, sonicate (>10 min) pour disperser la pastille de protéine.
7. Digestion des protéines
- Pour l’analyse ascendante de la SEP, soumettez les protéines relufulisées à une digestion enzymatique en utilisant l’une des deux méthodes mentionnées ci-dessous.
- (Option 1) Pour laolubilisation de l’acide formique, réduire le volume initial d’acide formique à 80 % à l’étape 6.2.2.1 à 25 μL. À l’étape 6.2.2.3, utiliser 375 μL d’eau pour diluer l’acide formique à 5 % (v/v).
- Distribuer la pepsine dans la cartouche à un rapport protéine/enzyme approximatif de 50:1. Avec un bouchon fixé à la cartouche de filtration, incuber l’échantillon pendant la nuit à température ambiante.
- (Option 2) Pour la resolubilisation dans l’urée, assurer un pH compris entre 8 et 8,3 avec l’inclusion de 100 mM de Tris ou de bicarbonate d’ammonium à l’étape 6.2.3.2.
- Ajouter la trypsine à un rapport approximatif de la masse protéique à l’enzyme de 50: 1. Avec un bouchon attaché à la cartouche, incuber l’échantillon pendant la nuit dans un bain d’eau tiède à 37 °C.
- Terminez la digestion en acidifiant la solution avec 10% de TFA jusqu’à un final 1%.
- Récupérez la protéine digérée à la pepsine ou à la trypsine en retirant le bouchon de la base du filtre et en centrifugant la cartouche contenue dans un flacon propre (2 min, 5000 x g, température ambiante).
8. Nettoyage spe
REMARQUE: Pour le dessalement supplémentaire de l’échantillon après la digestion ou l’échange de solvant, l’échantillon peut être soumis à un nettoyage en phase inversée comme décrit.
- Amorcer une cartouche SPE (voir tableau des matériaux) en passant 300 μL de méthanol (2 min, 400 x g) suivi de 300 μL d’acétonitrile à 5 % / 0,1 % de TFA (2 min, 400 x g).
- Connectez la cartouche SPE apprêtée à la base de la cartouche de filtration contenant des protéines relubrisées ou digérées.
- Faites tourner la protéine à travers la cartouche SPE (5 min, 800 x g à température ambiante). Si le solvant reste dans la cartouche supérieure, retournez la cartouche à la centrifugeuse et répétez la rotation.
REMARQUE: Passer l’échantillon à travers la cartouche SPE une deuxième fois peut améliorer la récupération. - Ajouter 300 μL d’acétonitrile à 5 % / 0,1 % de TFA dans l’eau à la cartouche. Pour laver, faire couler à travers la cartouche SPE (2 min, 2000 x g). Jetez le flux.
- Pour les protéines LMW ou les peptides digérés, éluer l’échantillon en faisant couler 300 μL d’acétonitrile à 50 % / 0,1 % de TFA (5 min, 2500 x g).
- Pour les protéines intactes, suivez l’étape 8.5 avec une étape d’élution supplémentaire en utilisant 300 μL d’acétonitrile à 75 % / 0,1 % de TFA. Combinez les deux extraits résultants.
REMARQUE: L’étape 8.6 est facultative.
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Representative Results
La figure 4 résume l’épuisement prévu des FDS à la suite d’une précipitation de protéines à base de flacon ou facilitée par une cartouche dans une cartouche filtrante jetable utilisant de l’acétone. L’incubation nocturne conventionnelle (-20 °C) dans l’acétone est comparée au protocole de précipitation rapide de l’acétone à température ambiante (étape 2), ainsi qu’aux précipitations CMW (étape 4). La FDS résiduelle a été quantifiée par le dosage des substances actives au bleu de méthylène (MBAS)29. En bref, un échantillon de 100 μL a été combiné avec un réactif MBAS de 100 μL (250 mg de bleu de méthylène, 50 g de sulfate de sodium, 10 mL d’acide sulfurique, dilué dans de l’eau à 1,0 L), suivi de l’ajout de 400 μL de chloroforme et de la mesure de l’absorbance de la couche organique à 651 nm sur un spectrophotomètre UV/Vis. Toutes les approches réduisent les FDS pour permettre une analyse optimale de la SEP.
La récupération quantitative et reproductible des protéines est obtenue après une précipitation rapide de l’acétone et une précipitation CMW, comme le montre la figure 5 grâce à l’analyse SDS PAGE d’un lysat cellulaire total de levure transformé. La précipitation dans une cartouche de filtration jetable élimine le besoin de pipeter soigneusement le surnageant contenant du SDS tout en conservant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane. Une récupération cohérente est obtenue avec tous les protocoles de précipitation, sans bandes visibles détectées dans les fractions surnageantes sur trois répliques indépendantes.
La figure 6 quantifie les rendements attendus, y compris la résolution des granulés de protéines précipités à l’aide d’acide formique froid (étape 6). La précipitation CMW permet une récupération quantitative en préservant soigneusement la pastille dans une approche à base de flacon (étape 5), ce qui équivaut à celle obtenue à l’aide de la cartouche (100 ± 4% contre 101 ± 3%, respectivement). La récupération des pastilles de protéines précipitées à l’acétone bénéficie d’une cartouche de filtration, avec une amélioration de 15 à 20 % du rendement observée. Dans les flacons, l’isolement du surnageant d’acétone de la protéine agrégée repose essentiellement sur l’adhérence de la pastille à la surface du tube PP; la cartouche de filtration élimine ce problème car le filtre assure une récupération élevée des protéines précipitées sans pipetage.
Pour récupérer efficacement les protéines et les peptides LMW, le protocole de précipitation de l’acétone est modifié en substituant NaCl à ZnSO4 et en augmentant le pourcentage de solvant à 97%. La combinaison de ce sel spécifique et de niveaux plus élevés de solvant organique est nécessaire pour la récupération élevée des protéines et des peptides LMW26. Comme le montre la figure 7, la précipitation protéique à base de cartouche démontre une récupération supérieure d’un échantillon de plasma bovin digéré par la pepsine par rapport à la précipitation à base de flacon. La cartouche de spin jetable peut récupérer plus de 90% des peptides LMW. Des différences de rendement plus significatives sont notées dans la cartouche lors de l’utilisation de NaCl, confirmant l’importance du type de sel pour maximiser le rendement. L’inclusion de ZnSO4 par opposition à NaCl donne une pastille de protéine agrégée qui est plus facilement piégée par le filtre à cartouche de spin.
Pour évaluer l’efficacité des protéines précipitantes sur une large plage dynamique, un mélange de trois protéines standard a été traité : la β-galactosidase (β gal) d’E. coli, le cytochrome c (Cyt c) de bovin et l’énolase (Eno) de S. cerevisiae. Le rapport de masse de β-gal:Cyt c:Eno était de 10 000:10:1. Les échantillons contenaient initialement 2 % de FDS avant la précipitation à base de cartouche (étape 5) et ont été relularbinisés et digérés avec de la trypsine (étapes 6 et 7). Les échantillons préparés dans des flacons ont agi comme un témoin, n’ayant pas de FDS et omettant les précipitations. Tous les échantillons ont fait l’objet d’un nettoyage SPE équivalent (étape 8). La SEP ascendante a été menée, avec des spectres MS/MS recherchés dans une base de données combinée contenant toutes les protéines des trois espèces impliquées (voir tableau des matériaux pour les plates-formes d’instruments et de logiciels). Un taux de fausse découverte de peptides de 1% a été utilisé. Les trois protéines ont été identifiées par la SEP, avec 666, 28 et 35 peptides uniques pour β-gal, Cyt c et Eno, respectivement. La figure 8 quantifie le rapport relatif (intensité maximale peptidique) de chaque échantillon, avec un rapport supérieur à 1 reflétant une abondance peptidique plus élevée pour les échantillons traités dans les cartouches filtrantes jetables. Les résultats démontrent les avantages de l’intégration de fdS dans un flux de travail protéomique, minimisant la perte de protéines (par exemple, de l’adsorption potentielle au flacon d’échantillon) et maximisant les rendements en peptides.
Le foie de bovin était acheté dans une épicerie locale. Les protéines ont été isolées en extrayant le tissu avec une solution de FDS à 1%. Par la suite, le protéome récupéré a été précipité, re-solubilisé (urée) et digéré avec de la trypsine, le tout dans une cartouche jetable. La LC-MS/MS ascendante a été menée, ce qui a permis d’identifier en moyenne environ 8 000 protéines (environ 30 000 peptides). Des taux de fausse découverte de 0,5 % et 1,0 % pour les spectres peptidiques et les groupes de protéines ont été utilisés, en effectuant des recherches dans la base de données bovine. La reproductibilité technique de ce flux de travail basé sur des cartouches est évaluée par des identifications de protéines qui se chevauchent. Les injections répliquées de SEP d’un échantillon digéré commun atteignent en moyenne 78 ± 0,5% de chevauchement avec les protéines identifiées. En comparaison, les échantillons préparés indépendamment dans des cartouches discrètes ont atteint 76 ± 0,5% de chevauchement. Ces données suggèrent que la contribution de la préparation de l’échantillon à la variabilité totale de l’analyse est mineure, par rapport à celle déjà apportée par l’approche instrumentale LC-MS. Les protéines bovines identifiées à partir de trois répliques techniques (traitées indépendamment dans trois cartouches jetables) ont ensuite été caractérisées en fonction de leur poids moléculaire, de leur hydrophobicité et de leur point isoélectrique, illustrés à la figure 9. Une ANOVA bidirectionnelle n’a pas pu déterminer les différences statistiques dans les protéomes identifiés entre les répliques techniques. Enfin, la figure 10 compare le nombre de peptides identifiés par protéine parmi les trois préparations d’échantillons répliqués. Les coefficients de corrélation de ces graphiques (0,94-0,95) démontrent la grande cohérence de l’approche de préparation des échantillons pour l’analyse ascendante de la SEP.
Figure 1 : Protéines précipitées par l’acétone. Échantillons contenant 100 et 1 000 μg de protéines combinés à 100 mM de NaCl et précipités avec 80 % d’acétone (A) après 5 min de précipitation et (B) après précipitation et centrifugation subséquente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Précipitation des protéines par chloroforme/méthanol/eau. Un échantillon contenant 50 μg de protéines précipité conformément à l’étape 4. (A) Immédiatement après l’étape 4.4. B) Immédiatement après l’étape 4.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Photos d’une cartouche jetable de filtration et d’extraction en deux étapes pour la précipitation des protéines. Un échantillon contenant 100 μg de protéines a été combiné avec 100 mM de NaCl et 80% d’acétone dans (A) la cartouche de filtration et de SPE assemblée et (B) précipité pendant 5 min jusqu’à ce que les agrégats de protéines deviennent visibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Efficacité de l’épuisement des FDS après précipitation des protéines. Le pourcentage de FDS retiré est indiqué dans les précipitations d’acétone avec le protocole conventionnel (pendant la nuit à -20 °C), le protocole rapide (2 min d’incubation à température ambiante) ou par précipitation chloroforme/méthanol/eau (CMW) d’un lysat de S. cerevisiae, à la fois sous forme conventionnelle (flacon) et sous forme de cartouche. Ces échantillons contenaient initialement 0,5 % de FDS (5 000 ppm), ce qui implique > l’élimination des FDS de 99,8 % est nécessaire pour une analyse optimale de la SEP. La FDS résiduelle est quantifiée par dosage des substances actives au bleu de méthylène (MBAS). Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport aux répétitions techniques (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Récupération totale du protéome par les précipitations. SDS PAGE montre la récupération du lysat protéique total de S. cerevisiae, précipité par (A) précipitation conventionnelle d’acétone, (B) précipitation chloroforme/méthanol/eau, et (C) précipitation rapide d’acétone. Les bandes protéiques sont exclusivement observées dans la fraction granulée, sans bandes visibles dans le surnageant (Super.). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Récupération supérieure des protéines dans une cartouche de filtration. Pour la précipitation du lysat protéique total de S. cerevisiae, la cartouche de spin jetable facilite la récupération quantitative avec l’acétone et la précipitation CMW. Une récupération élevée est également possible avec des précipitations à base de flacons, bien qu’une manipulation minutieuse des échantillons et un pipetage soient nécessaires. La récupération des protéines évaluée par LC-UV après laolubilisation de la pastille avec de l’acide formique froid est montrée ici. Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport aux répétitions techniques (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Rendements de précipitation élevés pour les peptides de faible poids moléculaire. Un protocole de précipitation d’acétone modifié pour les peptides et les protéines ≤5 kDa implique le couplage de 100 mM de ZnSO4 avec 97% d’acétone pour obtenir les rendements les plus élevés. Les précipitations facilitées par une cartouche de filtration jetable démontrent une meilleure récupération par rapport aux précipitations conventionnelles à base de flacons dans les trois conditions de précipitation. Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport aux répétitions techniques (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Récupération plus élevée des protéines standard dans le flux de travail basé sur les FDS. Tukey Box-and-Whisker trace30 de l’intensité relative du signal MS pour les peptides récupérés à partir de protéines contenant du SDS traitées dans une cartouche de filtration jetable par rapport à un échantillon témoin (pas de FDS, pas de précipitation). Les protéines utilisées couvrent une large plage dynamique de concentration β-galactosidase:cytochrome c:énolase = 10 000:10:1. Chaque quartile dans les boîtes contient 25% de la distribution, tandis que les barres d’erreur englobent 95% de la distribution. La moyenne est indiquée par « + » et la médiane par une ligne horizontale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Distributions de protéines identifiées à partir de répliques techniques. Les diagrammes Tukey Box-and-Whisker caractérisent (A) le poids moléculaire, (B) l’hydrophobicité et (C) le point isoélectrique des protéines identifiées par LC-MS/MS ascendant après des préparations triplicates d’un lysat de foie bovin dans une cartouche de filtration et d’extraction en deux étapes. Il n’y avait pas de différence statistique dans ces caractéristiques selon l’ANOVA bidirectionnelle (p < 0,05). Chaque quartile dans les boîtes contient 25% de la distribution, tandis que les barres d’erreur englobent 95% de la distribution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Corrélation des ID peptidiques par protéine à travers le flux de travail de préparation basé sur SDS entre les réplicats préparatifs. Analyse de la reproductibilité ascendante du protéome sur les échantillons (A) 1 et 2, (B) les échantillons 2 et 3, et (C) les échantillons 1 et 3 en fonction du nombre d’identifications peptidiques MS par protéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La caractérisation optimale de la SEP est obtenue lorsque la FDS résiduelle est épuisée en dessous de 10 ppm. Alors que d’autres approches, telles que le FASP et la digestion sur billes, offrent un épuisement quantitatif des FDS avec une récupération variable 31,32,33, l’objectif principal des précipitations est de maximiser la pureté et le rendement simultanément. Cela dépend de l’isolation efficace du surnageant (contenant la FDS) sans perturber la pastille de protéine. Avec les précipitations à base de flacons, une fois que la majeure partie du surnage est éliminée par pipetage, il est de plus en plus probable que certaines des pastilles agrégées soient accidentellement perdues. Pour cette raison, il est essentiel de laisser derrière lui une fraction plus importante du solvant résiduel (~20 μL) et d’ajouter une étapede lavage 34. L’étape de lavage dilue et élimine le solvant résiduel du flacon. En particulier avec CMW, il n’est pas nécessaire de vortexer le flacon d’échantillon une fois que la pastille s’est formée. La perturbation de la pastille par une agitation vigoureuse a pour effet indésirable d’augmenter la probabilité de perte due à un pipetage accidentel. Si le vortex est inclus (comme le recommandent les protocoles précédents)35, il est possible que des portions de la pastille CMW adhèrent à la face inférieure du bouchon du flacon; une fois centrifugé, la pastille reste fixée sur le bouchon du flacon et peut entraîner une perte d’environ 50%.
Des précipitations rapides peuvent être effectuées avec une récupération élevée des échantillons de protéome dilué, idéalement entre 0,01 et 2 mg / mL, ou une masse protéique correspondante comprise entre 1 et 200 μg. Cependant, les récupérations quantitatives et reproductibles à partir de moins de 0,01 mg/mL de protéines peuvent bénéficier de temps de précipitation plus longs allant de 10 min à 1 h, démontrant les limites de débit du flux de travail de précipitation. Étonnamment, des échantillons plus concentrés (10 mg/mL) montrent une réduction statistique du rendement, probablement due à des pertes accidentelles par pipetage. En supposant > 10 μg de protéines, une pastille visible doit être observée sur le côté du flacon (figure 1B). De plus petites quantités, jusqu’à 1 μg, sont difficiles à voir. Cela met à l’épreuve la capacité de pipeter le surnageant sans perturber la pastille de protéine. Le flacon peut être inversé (lentement) avec de l’acétone pour séparer le solvant de la pastille. Pour CMW, la pastille n’adhère pas suffisamment au flacon de manière fiable, favorisant ainsi le pipetage par rapport à la décantation du surnageant. Pour les précipitations à base de flacons, il est recommandé de travailler avec le plus petit tube de microcentrifugation possible pour faciliter les volumes d’échantillons et de solvants prévus. La précipitation dans la cartouche de filtration jetable utilisée dans ce travail fournit une capacité de volume maximale de 500 μL, permettant la précipitation des protéines avec 80% d’acétone sur des volumes d’échantillon allant jusqu’à 100 μL. Les volumes d’échantillons, de sel et de solvants peuvent être ajustés en conséquence si les concentrations recommandées sont maintenues.
La pureté de la pastille de protéine récupérée à partir de précipitations à base de solvants organiques est limitée par la complexité de la matrice de l’échantillon, des composants tampons et des conditions de précipitation. Par exemple, il a été démontré que des composants tampons spécifiques tels que la glycine (utilisée pour les séparations SDS PAGE) co-précipitent avec les protéines en utilisant 80% d’acétone. Cependant, la glycine reste soluble grâce aux précipitations CMW. Il a été rapporté que l’acétone précipitedes fragments d’ADN 36,37, ajoutant potentiellement des impuretés de fond indésirables à la pastille récupérée. La précipitation de protéines et de peptides de faible poids moléculaire nécessite un niveau élevé de solvant organique et un type de sel spécifique pour maximiser le rendement. Bien que plusieurs sels aient été explorés, ZnSO4 fournit des produits constamment élevés. Ce sel va précipiter dans 97% d’acétone en l’absence de protéines. Ainsi, la pastille protéique résultante contient une forte concentration de sel. Il est à noter que l’utilisation de 90% d’acétone en volume permettra également d’obtenir des rendements peptidiques élevés, bien qu’une baisse statistiquement significative (~ 5%) de la récupération soit attendue. Cependant, cela permet de traiter un volume d’échantillon plus important (jusqu’à 180 μL, avec 20 μL de 1 M ZnSO4) dans chaque flacon de 2 mL. Au-delà des impuretés matricielles co-précipitant avec la pastille de protéine, il faut préciser que la précipitation du solvant provoque intrinsèquement la dénaturation de l’échantillon38,39. Par conséquent, ce protocole ne s’applique pas aux préparations de protéines fonctionnelles ou aux flux de travail natifs de la SEP. Il a également été rapporté que l’acétone provoque des modifications des protéines covalentes aux résidus de glycine40 et induit un changement de masse de +98 u, supposé être un sous-produit de l’acétone41 de condensation de l’aldol.
Lors de l’utilisation d’une cartouche de filtration pour la précipitation des protéines, l’isolement de la pastille de protéine repose sur la rétention des agrégats au-dessus d’un filtre à membrane en PTFE. La porosité de cette membrane dépasse celle d’un filtre de coupure de poids moléculaire (comme on le voit dans FASP), permettant l’isolement des protéines avec des temps de rotation réduits. Le transfert rapide de la solution à de faibles vitesses de rotation repose sur un mouillage approprié de la membrane en PTFE; les solvants organiques circulent facilement, bien qu’un filtre en PTFE sec empêche les solvants aqueux. Si la cartouche de filtration semble obstruée, la membrane doit être ré-humidifiée en appliquant directement un petit volume de solvant organique (par exemple, l’isopropanol) sur le filtre. Selon la taille de la pastille de protéine et le volume d’échantillon utilisé, une centrifugation supplémentaire ou des rotations à des vitesses plus élevées (jusqu’à 3 000 x g) peuvent être nécessaires pour s’assurer que tout le solvant a traversé la cartouche de filtration.
La récupération des protéines à partir des précipitations dans des conditions optimales est finalement limitée par le défi de la re-solubilisation des granulés, avec peu d’options de solvants compatibles avec le traitement en aval et le LC-MS. De plus, plusieurs conditions de précipitations telles que de longues expositions à de basses températures et le séchage excessif d’une pastille bien emballée contribuent aux défis de re-solubilisation40. Il est à noter que les granulés de protéines CMW sont généralement moins solubles que les granulés d’acétone. L’efficacité maximisée de la re-solubilisation des protéines précipitées par 80% d’acide formique froid (étape 6.2.2) a déjà été rapportée42; la température froide empêche la modification des protéines, qui se produit autrement dans l’acide formique concentré43,44. La dilution de la concentration acide ralentit également la réaction de modification. L’acide formique est recommandé pour les approches descendantes de SEP ou avant la digestion enzymatique avec de la pepsine. L’utilisation de ce solvant nécessite peu de traitement physique; l’ajout de seulement 5 μL (assez pour couvrir la pastille de protéine) peut être suffisant lorsqu’il est combiné avec un vortex, une brève sonication ou un pipetage répété. De même, pour les échantillons destinés à être analysés par SDS PAGE, la recombinaison dans le tampon Laemmli contenant SDS est très efficace, lorsqu’elle est combinée à un mélange modeste de l’échantillon avant le chauffage. Cependant, ces solvants sont tous deux incompatibles avec la trypsine. La resolubilisation avec de l’urée 8 M est recommandée avant la digestion de la trypsine, en s’assurant que l’urée a été fraîchement préparée (le jour même). Un volume minimum de tampon de 50 μL est recommandé pour la re-solubilisation des protéines dans la cartouche de filtration afin de maximiser le contact entre le solvant chaotropique et la pastille, ainsi que pour faciliter la dissolution pendant la sonication, le pipetage répété et / ou le vortex. D’autres approches exploitent la trypsine pour resolialiser la protéine, ce qui signifie que la protéine n’a pas besoin d’être complètement dissoute avant l’ajout d’enzymes. Cependant, cette approche peut biaiser la digestion, favorisant les espèces les plus solubles tandis que les protéines hydrophobes connaissent un temps de digestion plus court45. L’ajout d’urée de 8 M, ainsi que de tampons de base tels que le Tris ou le bicarbonate d’ammonium, nécessite une étape de nettoyage de l’échantillon après la digestion. Pour de tels additifs d’échantillon, le nettoyage de la colonne en phase inversée est idéal. La cartouche de filtration jetable utilisée dans cette étude est complétée par une cartouche SPE interchangeable en phase inversée. Cette cartouche est également idéale pour l’échange de solvants, dans le cas du protocole de résolution de l’acide formique. Il est important de noter que toute approche d’extraction en phase solide est associée à une perte inhérente à la récupération de l’échantillon. Par conséquent, l’utilisateur doit peser les avantages de la récupération et de la purification supplémentaire pour son expérience.
On s’attend à ce que ces protocoles permettent aux chercheurs en protéomique de rationaliser leurs flux de travail à base de détergents, en capitalisant sur les FDS pour l’extraction du protéome. Les stratégies de préparation qui facilitent la récupération cohérente du protéome complet sont essentielles. Une cartouche de rotation à deux étages simplifie la possibilité d’isoler rapidement, robuste et reproductible les échantillons de protéome. Une telle approche serait adaptée aux applications nécessitant une analyse rigoureuse sans sacrifier les débits d’échantillons, telles que les milieux cliniques ou les initiatives de recherche à grande échelle46. Les applications futures de ces approches pourraient inclure la découverte de biomarqueurs, la détection, la quantification précise et la découverte de médicaments et de cibles de médicaments.
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Disclosures
Le laboratoire Doucette a conçu et breveté le ProTrap XG utilisé dans cette étude. AAD est également un partenaire fondateur de Proteoform Scientific, qui a commercialisé la cartouche de préparation d’échantillons.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. Les auteurs remercient Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) et SPARC BioCentre (Molecular Analysis) de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) pour leur contribution à l’acquisition de données sur la SP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
References
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