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Chemistry

Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die lösungsmittelbasierte Proteinfällung unter kontrollierten Bedingungen für eine robuste und schnelle Gewinnung und Reinigung von Proteomproben vor der Massenspektrometrie.

Abstract

Während mehrere Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) die qualitative und quantitative Proteomanalyse verbessert haben, sind zuverlässigere Front-End-Ansätze zur Isolierung, Anreicherung und Verarbeitung von Proteinen vor MS entscheidend für eine erfolgreiche Proteomcharakterisierung. Geringe, inkonsistente Proteinrückgewinnung und Restverunreinigungen wie Tenside sind schädlich für die MS-Analyse. Die Proteinfällung wird im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsstrategien oft als unzuverlässig, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll angesehen. Diese Bedenken werden durch den Einsatz optimaler Proteinausscheidungsprotokolle überwunden. Für die Acetonfällung ist die Kombination von spezifischen Salzen, Temperaturregelung, Lösungsmittelzusammensetzung und Fällungszeit von entscheidender Bedeutung, während die Effizienz der Chloroform-/Methanol-/Wasserfällung von der richtigen Pipettierung und der Manipulation der Durchstechflasche abhängt. Alternativ werden diese Fällungsprotokolle in einer Einweg-Spinkartusche optimiert und halbautomatisch. Die erwarteten Ergebnisse der lösungsmittelbasierten Proteinfällung im konventionellen Format und unter Verwendung einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche werden in dieser Arbeit veranschaulicht. Dazu gehört die detaillierte Charakterisierung proteomischer Gemische durch Bottom-up-LC-MS/MS-Analyse. Die überlegene Leistung von SDS-basierten Arbeitsabläufen wird auch im Vergleich zu nicht kontaminiertem Protein demonstriert.

Introduction

Die Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ist aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit, Auflösung, Scangeschwindigkeit und Vielseitigkeit moderner MS-Instrumente immer strenger geworden. MS-Fortschritte tragen zu einer höheren Proteinidentifizierungseffizienz und einer präziseren Quantifizierungbei 1,2,3,4,5. Mit verbesserter MS-Instrumentierung fordern die Forscher eine entsprechend konsistente Front-End-Probenvorbereitungsstrategie, die in der Lage ist, hochreine Proteine in kürzester Zeit über alle Phasen des Workflows hinweg quantitativ zurückzugewinnen 6,7,8,9,10,11 . Um den Proteomstatus eines biologischen Systems genau widerzuspiegeln, müssen Proteine effizient und unvoreingenommen aus der nativen Probenmatrix isoliert werden. Zu diesem Zweck gewährleistet die Einbeziehung eines denaturierenden Tensids wie Natriumdodecylsulfat (SDS) eine effiziente Proteinextraktion und -solubilisierung12. SDS stört jedoch stark die Elektrospray-Ionisation, was zu einer starken MS-Signalunterdrückung führt, wenn es nicht ordnungsgemäß eliminiertwird 13.

Für die anschließende Proteomanalyse stehen verschiedene SDS-Depletionsstrategien zur Verfügung, wie z.B. die Retention von Proteinen über einem Molekulargewichts-Cutoff-Filter, der in Einweg-Spinkartuschen14,15,16 enthalten ist. Die filtergestützte Probenvorbereitungsmethode (FASP) wird bevorzugt, da sie SDS unter 10 ppm effektiv erschöpft und eine optimale MS ermöglicht. Die Proteinrückgewinnung mit FASP ist jedoch variabel, was die Erforschung anderer Techniken veranlasste. Chromatographische Ansätze, die selektiv Protein (oder Tensid) einfangen, haben sich zu verschiedenen praktischen Kartuschen oder perlenbasierten Formaten entwickelt 17,18,19,20,21. Angesichts dieser einfachen und (idealerweise) konsistenten Strategien zur Proteinreinigung wird der klassische Ansatz der Proteinfällung mit organischen Lösungsmitteln oft als vielversprechender Ansatz zur Proteinisolierung übersehen. Während gezeigt wird, dass die Ausfällung von Lösungsmitteln SDS erfolgreich unter kritische Werte abbaut, ist die Proteinrückgewinnung seit langem ein Problem dieses Ansatzes. Mehrere Gruppen haben eine Proteinrückgewinnungsverzerrung beobachtet, mit inakzeptabel niedrigen Niederschlagsausbeuten als Funktion der Proteinkonzentration, des Molekulargewichts und der Hydrophobie22,23. Aufgrund der Vielfalt der in der Literatur berichteten Niederschlagsprotokolle wurden standardisierte Niederschlagsbedingungen entwickelt. Im Jahr 2013 berichteten Crowell et al. erstmals über die Abhängigkeit der Ionenstärke von der Ausfällungseffizienz von Proteinen in 80% Aceton24. Für alle untersuchten Proteine erwies sich die Zugabe von bis zu 30 mM Natriumchlorid als unerlässlich, um die Ausbeute zu maximieren (bis zu 100% Rückgewinnung). In jüngerer Zeit zeigten Nickerson et al., dass die Kombination von noch höherer Ionenstärke (bis zu 100 mM) mit erhöhter Temperatur (20 °C) während der Acetonfällung zu einer nahezu quantitativen Erholung in 2-5 min25 führte. Es wurde ein leichter Rückgang der Rückgewinnung von niedermolekularen (LMW) Proteinen beobachtet. Daher zeigte ein nachfolgender Bericht von Baghalabadi et al. die erfolgreiche Rückgewinnung von LMW-Proteinen und Peptiden (≤5 kDa) durch Kombination spezifischer Salze, insbesondere Zinksulfat, mit einem höheren Gehalt an organischem Lösungsmittel (97% Aceton)26.

Während die Verfeinerung des Fällungsprotokolls eine zuverlässigere Proteinreinigungsstrategie für MS-basierte Proteomik verleiht, hängt der Erfolg der konventionellen Niederschlagung stark von der Benutzertechnik ab. Ein primäres Ziel dieser Arbeit ist es, eine robuste Fällungsstrategie zu präsentieren, die die Isolierung des Proteinpellets vom kontaminierenden Überstand erleichtert. Eine Einwegfiltrationskartusche wurde entwickelt, um das Pipettieren zu eliminieren, indem aggregiertes Protein über einem porösen PTFE-Membranfilterisoliert wird 27. MS-störende Bauteile im Überstand werden in einem kurzen, langsamen Zentrifugationsschritt effektiv entfernt. Die Einweg-Filterpatrone bietet auch eine austauschbare SPE-Kartusche, die eine anschließende Probenreinigung nach der Resobilisierung und dem optionalen Proteinaufschluss vor der Massenspektrometrie ermöglicht.

Eine Reihe von empfohlenen Proteom-Fällungs-Workflows werden hier vorgestellt, einschließlich modifizierter Aceton- und Chloroform/Methanol/Wasser-28-Protokolle , in einem konventionellen (auf Durchstechflaschen basierenden) und einem halbautomatischen Format in einer Einweg-Zwei-Zustands-Filtrations- und Extraktionskartusche. Die daraus resultierenden Proteinrückgewinnungsraten und SDS-Abbaueffizienzen werden zusammen mit der Bottom-up-LC-MS/MS-Proteomabdeckung hervorgehoben, um das erwartete Ergebnis jedes Protokolls zu demonstrieren. Die praktischen Vor- und Nachteile, die mit jedem Ansatz verbunden sind, werden diskutiert.

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Protocol

1. Wesentliche Überlegungen und Probenvorbereitung

  1. Verwenden Sie nur hochreine Lösungsmittel (Aceton, Chloroform, Methanol) (>99,5%) und Chemikalien, frei von überschüssiger Feuchtigkeit.
  2. Natriumchlorid- und Zinksulfatlösungen (1 M) in Wasser herstellen.
    HINWEIS: Salzlösungen können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden, solange sie frei von Verunreinigungen oder mikrobiellem Wachstum sind.
  3. Verwenden Sie die kleinste Mikrozentrifugendurchstechflasche aus Polypropylen (PP), die ausreicht, um das erforderliche Volumen an Proben und Lösungsmitteln zu erhalten, um die Ausfällung zu induzieren.
  4. Stellen Sie sicher, dass die SDB-Konzentration in der auszufällenden Probe nicht größer als 2 % (w/v) ist. Wenn SDS höher ist, verdünnen Sie die Probe mit Wasser.
  5. Stellen Sie eine Proteinkonzentration zwischen 0,01 und 10 g/L für eine optimale Fällungseffizienz sicher.
    HINWEIS: Die optimale Masse für die Ausfällung liegt zwischen 1-100 μg Protein.
  6. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungsmittel und Lösungen vor dem Gebrauch frei von Feinstaub sind. Führen Sie entweder eine Filtration (<0,5 μm) oder einen Zentrifugationsschritt (10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur) durch, um ungelöste Partikel zu entfernen.
  7. Wenn Disulfidbindungsreduktion und Alkylierung erforderlich sind, führen Sie diese Schritte vor der Proteinausfällung durch. Überschüssige reduzierende und alkylierende Reagenzien werden durch den Fällungsprozess entfernt.
  8. Fallen Sie die Proteine aus, indem Sie eines der Protokolle auswählen und ausführen (Schritte 2, 3, 4 oder 5).

2. Schnelle (Fläschchen-basierte) Proteinfällung mit Aceton

  1. 90 μL (partikelfreie) Protein- oder Proteomlösung in ein PP-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Dann fügen Sie 10 μL wässriges NaCl von 1 M hinzu.
    HINWEIS: Wenn die Ionenstärke des Proteomextrakts bereits 100 mM übersteigt, ist kein zusätzliches Salz erforderlich.
  2. Pipettieren Sie 400 μL Aceton in die Probe. Verschließen Sie die Durchstechflasche und klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche, um die Lösungsmittel zu kombinieren. Ein kräftiges Mischen ist nicht erforderlich.
    HINWEIS: Das Volumen von Protein, Salz und Aceton kann erhöht werden, solange das relative Verhältnis von jedem beibehalten wird.
  3. Lassen Sie die Durchstechflasche bei Raumtemperatur ungestört mindestens 2 min inkubieren.
    HINWEIS: Längere Inkubationen, einschließlich solcher bei reduzierter Temperatur (z. B. herkömmliche Acetonfällung verwendet über Nacht Niederschlag im Gefrierschrank), können zur Bildung größerer (sichtbarer) aggregierter Proteinpartikel führen (Abbildung 1A), die im Allgemeinen die gesamte Proteinrückgewinnung nicht verbessern.
  4. Legen Sie nach der Inkubation Proben in eine Zentrifuge und notieren Sie die Ausrichtung der Durchstechflasche. Drehen Sie für mindestens 2 min, bei 10.000 x g oder höher bei Raumtemperatur.
  5. Lösen Sie die Durchstechflasche und dekantieren Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie die Durchstechflasche langsam in einen Abfallbehälter umdrehen. Befestigen Sie die umgekehrte Durchstechflasche mit einem Papiertuch, um Lösungsmittelreste aus der Durchstechflasche zu ziehen.
    VORSICHT: Lösungsmittelabfälle sollten gemäß den entsprechenden Protokollen aufbewahrt und entsorgt werden.
  6. Für SDS-haltige Proben geben Sie 400 μL frisches Aceton ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
    HINWEIS: Schritt 2.6 ist optional.
    1. Zentrifugieren Sie die Probe sofort (10.000 x g oder höher für 1 min bei Raumtemperatur) und legen Sie die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor. Dekantieren Sie das Waschlösungsmittel wie in Schritt 2.5 beschrieben.
  7. Lassen Sie die Probe bei geöffneter Kappe vollständig trocknen (~ 1 min). Rekapitulieren Sie die Durchstechflasche und fahren Sie mit der Solubibilisierung des Pellets fort (Schritt 6).

3. Ausfällung von niedermolekularen (LMW) Peptiden (ZnSO4 + Aceton)

  1. Geben Sie 54 μL Proteomextrakt in eine 2 ml PP-Durchstechflasche ab und fügen Sie dann 6 μL 1 M ZnSO4 hinzu.
    HINWEIS: Eine optimale Rückgewinnung von LMW-Peptiden (≤5 kDa) wird durch Zugabe von Aceton zu einem Volumenanteil von 97 % erreicht. Unter der Annahme einer 2 ml PP-Durchstechflasche beträgt das maximale Anfangsprobenvolumen 54 μL.
  2. 1940 μL Aceton zu einem Volumenanteil von 97 % hinzufügen. Zum Mischen vorsichtig schwenken und mindestens 2 min ungestört auf der Tischplatte stehen lassen.
  3. Zentrifen Sie (10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur) und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Durchstechflasche umkehren und dann die Durchstechflasche mit einem Papiertuch berühren.
  4. Für SDS-haltige Proben geben Sie 400 μL frisches Aceton ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
    HINWEIS: Schritt 3.4 ist optional.
    1. Die Probe wird sofort gemäß Schritt 3.3 zentrifugiert, wobei die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor gelegt wird. Dekantieren Sie das Waschlösungsmittel wie in Schritt 3.3 beschrieben.
  5. Das resultierende trockene Pellet in einem wässrigen Lösungsmittel mit kurzer Vortex oder Beschallung (~ 5 min) wieder auflösen.

4. Proteinausfällung durch Chloroform/Methanol/Wasser (CMW)

  1. Geben Sie 100 μL der Protein- oder Proteomlösung in eine PP-Durchstechflasche ab. 400 μL Methanol hinzufügen, gefolgt von 100 μL Chloroform. Die Durchstechflasche und den Wirbel kurz verschließen, um sie zu mischen.
    HINWEIS: Für den CMW-Niederschlag werden 1,5 ml Fläschchen mit schmalem Boden bevorzugt (Abbildung 2A).
    ACHTUNG: Chloroform-Lösungsmittel sollte in einer geeigneten Lüftungshaube gehandhabt werden. Alle Lösungsmittel, die mit Chloroform in Berührung kommen, sollten bei der Entsorgung als halogenierter Abfall behandelt werden.
  2. Dosieren Sie schnell 300 μL Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche. Verschließen Sie die Durchstechflasche. Lassen Sie die Probe 1 min lang ungestört auf der Tischplatte sitzen.
    HINWEIS: Die Lösung wird sofort wolkig weiß angezeigt. Vermeiden Sie es, die Durchstechflasche nach Zugabe von Wasser zu mischen.
  3. Legen Sie die PP-Durchstechflasche in eine Zentrifuge und drehen Sie sie für mindestens 5 Minuten (10.000 x g oder höher bei Raumtemperatur).
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation bilden sich zwei sichtbare Lösungsmittelschichten (obere Schicht = Methanol/Wasser; unten = Chloroform). An der Lösungsmittelgrenzfläche bildet sich ein festes Proteinpellet (Abbildung 2A).
  4. Entfernen Sie mit einer großen Mikropipettenspitze (1 ml) und halten Sie die Durchstechflasche bei ~ 45 ° und entfernen Sie ~ 700 μL des Lösungsmittels mit einer gleichmäßigen Rate aus der oberen Schicht.
  5. Verwenden Sie eine kleinere (200 μL) Mikropipettenspitze, um die obere Lösungsmittelschicht von der ~ 45 ° geneigten Durchstechflasche zu entfernen. In einer kontinuierlichen Bewegung pipettieren, bis die obere Lösungsmittelschicht eine Perle in der Durchstechflasche bildet.
  6. 400 μL frisches Methanol in die Durchstechflasche der Probe geben, ohne das Pellet zu stören, indem das Lösungsmittel an der Seite der Durchstechflasche abgegeben wird.
  7. Verschließen Sie die Durchstechflasche. Kombinieren Sie die Lösungsmittelschichten, indem Sie die Durchstechflasche vorsichtig schaukeln, um die Lösungsmittel miteinander zu verwirbeln.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine Störung des Pellets zu vermeiden. Wirbeln Sie die Durchstechflasche nicht auf.
  8. Unter Berücksichtigung der Ausrichtung der Durchstechflasche im Rotor zentrifugieren Sie mindestens 10 min (10.000 x g bei Raumtemperatur). Das Proteinpellet haftet am Boden der Durchstechflasche (Abbildung 2B).
  9. Kippen Sie die Durchstechflasche um 45°, wobei das Pellet nach unten zeigt. Platzieren Sie die Pipettenspitze entlang der Oberkante der Durchstechflasche und entfernen Sie den Überstand mit einer 1 ml Mikropipettenspitze mit einer langsamen, aber kontinuierlichen Geschwindigkeit. Halten Sie ~ 20 μL Lösungsmittel in der Durchstechflasche zurück.
  10. Waschen Sie das Proteinpellet für SDS-haltige Proben, indem Sie langsam 400 μL frisches Methanol dosieren. Wirbeln Sie die Durchstechflasche nicht auf.
    1. Fahren Sie direkt mit der Zentrifugation fort (10.000 x g für 2 min bei Temperatur) und legen Sie die Durchstechflasche mit der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor.
  11. Entfernen Sie das Lösungsmittel gemäß Schritt 4.9. Lassen Sie die Probe in einem Rauch an der Luft trocknen, bis das restliche Lösungsmittel verdunstet.
  12. Konsultieren Sie die empfohlenen Resolubilisierungsverfahren in Schritt 6.

5. Proteinfällung mit einer Einweg-Filterpatrone

HINWEIS: Jedes in den Schritten 2-5 beschriebene lösungsmittelbasierte Fällungsprotokoll kann in einer zweistufigen Filtrations- und Extraktionskartusche durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).

  1. Wenn der Stecker an der oberen Filterpatrone befestigt ist (Abbildung 3A), dosieren Sie das gewünschte Volumen des extrahierten Proteoms, Salzes und Lösungsmittels, wie in einer der drei folgenden Optionen beschrieben.
    1. (Option 1) Für die Proteinfällung mit Aceton 90 μL Protein- oder Proteomlösung, 10 μL 1 M wässriges NaCl und 400 μL Aceton kombinieren. Inkubieren Sie für mindestens 2 Minuten auf dem Tisch.
      HINWEIS: Für konzentrierte Proteinproben (1 g/L) entsteht ein sichtbarer Niederschlag (Abbildung 3B).
    2. (Option 2) Für die LMW-Peptidfällung kombinieren Sie 15 μL der Probe, 1,5 μL 1 MZnSO 4 und 485 μL Aceton. Inkubieren Sie für mindestens 2 Minuten auf dem Tisch.
      HINWEIS: Eine Salzkonzentration von 90 mM in der wässrigen Probe hat keinen Einfluss auf die Erholung im Vergleich zu den in Schritt 3 empfohlenen 100 mM.
    3. (Option 3) Für die CMW-Fällung fügen Sie 50 μL Proteomextrakt, 200 μL Methanol und 50 μL Chloroform hinzu. Die Durchstechflasche verschließen und kurz zum Kombinieren umdrehen.
      1. Geben Sie schnell 150 μL Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche ab. Inkubieren Sie für 1 min auf der Tischplatte.
  2. Zentrifuge für 2 min bei 2.500 x g bei Raumtemperatur mit dem Stecker noch an der Filterkartusche befestigt.
  3. Drehen Sie die Patrone um, schrauben Sie sie ab und entfernen Sie den Stecker von der Patronenbasis.
  4. Legen Sie die Filterpatrone in eine saubere Durchstechflasche und kehren Sie sie zur Zentrifuge zurück. Drehen Sie für 3 Minuten bei 500 x g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Durchflusslösungsmittel aus der unteren Durchstechflasche.
    HINWEIS: Wenn in der oberen Filterpatrone Lösungsmittel verbleibt, kehren Sie zur Zentrifuge zurück und führen Sie eine zusätzliche Drehung durch.
  5. Waschen Sie das Proteinpellet, indem Sie 400 μL Aceton in die Filtrationskartusche geben (bei CMW-Fällung in Schritt 5.1.3 400 μL Methanol zugeben).
  6. Zentrifuge für 3 min bei 500 x g bei Raumtemperatur oder bis kein Lösungsmittel mehr in der oberen Kartusche verbleibt.
  7. Das Fällungspellet wie in Schritt 6 beschrieben wieder auflösen.

6. Resolubilisierung von Proteinpellets

  1. Befeuchten Sie die Membran an der Basis der Filtrationskartusche, indem Sie 2-5 μL Isopropanol unmittelbar vor den unten beschriebenen Resolubilisierungsprotokollen direkt auf die Membran dosieren.
  2. Befolgen Sie eine der folgenden Resolubilisierungsmethoden.
    1. (Option 1) Mindestens 20 μL wässriger Puffer mit ≥2% SDB in die Filtrationspatrone geben. Kappe und Wirbel kräftig (~1 min). Alternativ beschallen (>10 min), um das Proteinpellet zu dispergieren.
      1. Erhitzen Sie die Probe bei 95 °C für 5 min). Wiederholen Sie den Mischschritt nach dem Erhitzen.
        HINWEIS: Laemmli Gel-Ladepuffer kann das Proteinpellet wieder auflösen. SDS-haltige Proben sind jedoch nicht kompatibel mit Trypsin-Aufschluss und Umkehrphasen-LC und MS.
    2. (Option 2) Bereiten Sie eine Lösung von 80% (v/v) Ameisensäure in Wasser vor. Die saure Lösung (-20 °C) sowie die Filtrationskartusche mit ausgefälltem Protein werden vorgekühlt.
      1. Geben Sie 50 μL kalte Ameisensäure in die Kartusche; Kappe und Wirbel für 30 s. Zurück zum Gefrierschrank (-20 °C) für 10 min.
      2. Wirbeln Sie die Patrone erneut für 30 s. Wiederholen Sie dann den Kühl- und Mischzyklus noch einmal (10 min, -20 °C, 30 s Vortex).
      3. Fügen Sie Wasser zu einem endgültigen 500 μL hinzu und verdünnen Sie die Ameisensäure auf 8%.
        HINWEIS: Das kalte Ameisensäureprotokoll ist mit dem nachfolgenden Trypsinaufschluss nicht kompatibel, aber mit LC-MS kompatibel.
    3. (Option 3) 50 μL frisch zubereiteter 8 Mio. Harnstoff in Wasser in die Filterpatrone geben. Beschallung für 30 min.
      1. Lassen Sie die Kartusche 1 Stunde (bis über Nacht) auf der Tischplatte inkubieren.
      2. Verdünnen Sie den 8 M Harnstoff mindestens 5-fach mit Wasser oder einem geeigneten Puffer.
        HINWEIS: Nach der Verdünnung ist das Harnstoff-Solubilisierungsprotokoll mit der nachfolgenden Trypsin-Verdauung sowie LC-MS kompatibel.

7. Proteinverdauung

  1. Für die Bottom-up-MS-Analyse unterziehen Sie die re-solubilisierten Proteine der enzymatischen Verdauung mit einer der beiden unten genannten Methoden.
    1. (Option 1) Bei der Ameisensäure-Resobilisierung ist das Anfangsvolumen von 80 % Ameisensäure in Schritt 6.2.2.1 auf 25 μl zu reduzieren. In Schritt 6.2.2.3 wird die Ameisensäure mit 375 μl Wasser auf 5 % (v/v) verdünnt.
    2. Geben Sie Pepsin mit einem ungefähren Protein-Enzym-Verhältnis von 50:1 in die Kartusche ab. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur mit einem an der Filterpatrone befestigten Stecker.
  2. (Option 2) Für die Resolubilisierung in Harnstoff ist ein pH-Wert zwischen 8 und 8,3 unter Einbeziehung von 100 mM Tris oder Ammoniumbicarbonat in Schritt 6.2.3.2 sicherzustellen.
    1. Fügen Sie Trypsin bei einem ungefähren Verhältnis von Protein zu Enzymmasse von 50: 1 hinzu. Mit einem an der Kartusche befestigten Stecker wird die Probe über Nacht in einem warmen Wasserbad bei 37 °C inkubiert.
    2. Beenden Sie den Aufschluss, indem Sie die Lösung mit 10% TFA auf ein letztes 1% ansäuern.
  3. Gewinnen Sie das Pepsin- oder Trypsin-verdaute Protein zurück, indem Sie den Pfropfen von der Basis des Filters entfernen und die in einer sauberen Durchstechflasche enthaltene Kartusche zentrifugieren (2 min, 5000 x g, Raumtemperatur).

8. SPE-Bereinigung

HINWEIS: Für eine zusätzliche Probenentsalzung nach dem Aufschluss oder Lösungsmittelaustausch kann die Probe wie beschrieben einer umgekehrten Phasenreinigung unterzogen werden.

  1. Grundierung einer SPE-Kartusche (siehe Materialtabelle) durch Passieren von 300 μL Methanol (2 min, 400 x g), gefolgt von 300 μL 5% Acetonitril/0,1% TFA (2 min, 400 x g).
  2. Schließen Sie die grundierte SPE-Kartusche an die Basis der Filtrationskartusche an, die resolubilisiertes oder verdautes Protein enthält.
  3. Drehen Sie das Protein durch die SPE-Kartusche (5 min, 800 x g bei Raumtemperatur). Wenn das Lösungsmittel in der oberen Kartusche verbleibt, bringen Sie die Kartusche zur Zentrifuge zurück und wiederholen Sie die Drehung.
    HINWEIS: Wenn Sie die Probe ein zweites Mal durch die SPE-Kartusche führen, kann dies die Wiederherstellung verbessern.
  4. 300 μL 5 % Acetonitril/0,1 % TFA in Wasser in die Kartusche geben. Zum Waschen durch die SPE-Kartusche (2 min, 2000 x g) fließen. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  5. Für LMW-Proteine oder verdaute Peptide eluieren Sie die Probe, indem Sie 300 μL 50% Acetonitril/0,1% TFA (5 min, 2500 x g) fließen lassen.
  6. Für intakte Proteine folgen Sie Schritt 8.5 mit einem zusätzlichen Elutionsschritt mit 300 μL 75% Acetonitril/0,1% TFA. Kombinieren Sie die beiden resultierenden Extrakte.
    HINWEIS: Schritt 8.6 ist optional.

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Representative Results

Abbildung 4 fasst die erwartete SDS-Erschöpfung nach einer Fläschchen- oder kartuschengestützten Ausfällung von Proteinen in einer Einweg-Filterpatrone unter Verwendung von Aceton zusammen. Die konventionelle Inkubation über Nacht (-20 °C) in Aceton wird mit dem schnellen Acetonfällungsprotokoll bei Raumtemperatur (Schritt 2) sowie der CMW-Niederschlagsmenge (Schritt 4) verglichen. Das Rest-SDS wurde mit dem Methylenblau-Wirkstoff-Assay (MBAS)29 quantifiziert. Kurz gesagt, 100 μL Probe wurde mit 100 μL MBAS-Reagenz (250 mg Methylenblau, 50 g Natriumsulfat, 10 mL Schwefelsäure, in Wasser auf 1,0 L verdünnt) kombiniert, gefolgt von der Zugabe von 400 μL Chloroform und Absorptionsmessung der organischen Schicht bei 651 nm auf einem UV/Vis-Spektralphotometer. Alle Ansätze reduzieren SDS, um eine optimale MS-Analyse zu ermöglichen.

Die quantitative und reproduzierbare Proteinrückgewinnung wird nach schneller Acetonfällung und CMW-Ausfällung erreicht, wie in Abbildung 5 durch SDS PAGE-Analyse eines verarbeiteten Hefe-Gesamtzelllysats zu sehen ist. Durch die Ausfällung in einer Einweg-Filterpatrone entfällt die Notwendigkeit, den SDS-haltigen Überstand vorsichtig zu pipettieren, während die aggregierten Proteine über einem Membranfilter zurückgehalten werden. Eine konsistente Wiederherstellung wird mit allen Niederschlagsprotokollen erreicht, ohne dass sichtbare Bänder in den überstehenden Fraktionen über drei unabhängige Replikate hinweg erkannt werden.

Abbildung 6 quantifiziert die erwarteten Ausbeuten, einschließlich der Resolubilisierung von gefällten Proteinpellets unter Verwendung von kalter Ameisensäure (Schritt 6). Die CMW-Fällung ermöglicht eine quantitative Rückgewinnung durch sorgfältige Konservierung des Pellets in einem auf Durchstechflaschen basierenden Ansatz (Schritt 5), der dem mit der Kartusche erhaltenen Ansatz entspricht (100 ± 4 % gegenüber 101 ± 3 %). Die Rückgewinnung von Aceton-gefällten Proteinpellets profitiert von einer Filtrationskartusche mit einer Verbesserung der Ausbeute um 15-20 %. In Fläschchen hängt die Isolierung des Acetonüberstands aus dem aggregierten Protein im Wesentlichen von der Haftung des Pellets an der PP-Röhrchenoberfläche ab; Die Filterpatrone beseitigt dieses Problem, da der Filter eine hohe Rückgewinnung von ausgefälltem Protein ohne Pipettieren gewährleistet.

Um LMW-Proteine und -Peptide effizient zurückzugewinnen, wird das Aceton-Fällungsprotokoll modifiziert, indemZnSO 4 durch NaCl ersetzt und der Lösungsmittelanteil auf 97% erhöht wird. Die Kombination dieses spezifischen Salzes und eines höheren Gehalts an organischem Lösungsmittel ist für die hohe Rückgewinnung von LMW-Proteinen und Peptidenerforderlich 26. Wie in Abbildung 7 zu sehen ist, zeigt die kartuschenbasierte Proteinfällung eine überlegene Erholung einer Pepsin-verdauten Probe von Rinderplasma im Vergleich zur Ausfällung auf Durchstechflasche. Die Einweg-Spinkartusche kann über 90% der LMW-Peptide zurückgewinnen. Deutlichere Unterschiede in der Reichweite werden bei der Verwendung von NaCl in der Kartusche festgestellt, was die Bedeutung des Salztyps für die Maximierung der Ausbeute bestätigt. Die Einbeziehung vonZnSO 4 im Gegensatz zu NaCl führt zu einem aggregierten Proteinpellet, das leichter vom Spinkartuschenfilter eingefangen wird.

Um die Wirksamkeit von ausfallenden Proteinen über einen weiten Dynamikbereich zu beurteilen, wurde eine Mischung aus drei Standardproteinen verarbeitet: β-Galactosidase (β-gal ) aus E. coli, Cytochrom c (Cyt c) aus Rindern und Enolase (Eno) aus S. cerevisiae. Das Massenverhältnis von β-gal:Cyt c:Eno betrug 10.000:10:1. Die Proben enthielten zunächst 2% SDS vor der kartuschenbasierten Fällung (Schritt 5) und wurden resolubilisiert und mit Trypsin verdaut (Schritte 6 und 7). Proben, die in Durchstechflaschen vorbereitet wurden, dienten als Kontrolle, da sie kein SDB hatten und den Niederschlag ausließen. Alle Proben wurden einer gleichwertigen SPE-Bereinigung unterzogen (Schritt 8). Es wurde Bottom-up-MS durchgeführt, wobei MS/MS-Spektren gegen eine kombinierte Datenbank durchsucht wurden, die alle Proteine der drei beteiligten Spezies enthielt (siehe Materialverzeichnis für Instrumenten- und Softwareplattformen). Es wurde eine Peptid-False-Discovery-Rate von 1% angewendet. Alle drei Proteine wurden durch MS identifiziert, mit 666, 28 und 35 einzigartigen Peptiden für β-gal, Cyt c und Eno. Abbildung 8 quantifiziert das relative Verhältnis (Peptidspitzenintensität) aus jeder Probe, wobei ein Verhältnis über 1 eine höhere Peptidhäufigkeit für Proben widerspiegelt, die in den Einweg-Filterpatronen verarbeitet werden. Die Ergebnisse zeigen die Vorteile der Integration von SDS in einen Proteomik-Workflow, der Minimierung des Proteinverlusts (z. B. von der potenziellen Adsorption bis zur Probendurchstechflasche) und der Maximierung der Peptidausbeute.

Rinderleber wurde in einem örtlichen Lebensmittelgeschäft beschafft. Die Proteine wurden isoliert, indem das Gewebe mit einer Lösung von 1% SDS extrahiert wurde. Anschließend wurde das wiedergewonnene Proteom ausgefällt, resolubilisiert (Harnstoff) und mit Trypsin verdaut, alles in einer Einwegkartusche. Bottom-up LC-MS/MS wurde durchgeführt, was zur Identifizierung von durchschnittlich ~ 8.000 Proteinen (~ 30.000 Peptide) führte. Falsche Entdeckungsraten von 0,5% und 1,0% für Peptidspektren und Proteingruppen wurden verwendet, indem die Rinderdatenbank durchsucht wurde. Die technische Reproduzierbarkeit dieses kartuschenbasierten Workflows wird durch überlappende Proteinidentifikationen bewertet. Die Replikations-MS-Injektionen einer gemeinsamen verdauten Probe erreichen im Durchschnitt 78 ± 0,5% Überschneidung mit den identifizierten Proteinen. Im Vergleich dazu erreichten Proben, die unabhängig voneinander in diskreten Kartuschen hergestellt wurden, eine Überlappung von 76 ± 0,5%. Diese Daten deuten darauf hin, dass der Beitrag der Probenvorbereitung zur Gesamtvariabilität der Analyse im Vergleich zu dem, der bereits durch den instrumentellen LC-MS-Ansatz beigetragen wurde, gering ist. Die aus drei technischen Replikaten identifizierten Rinderproteine (unabhängig voneinander in drei Einwegkartuschen verarbeitet) wurden weiter hinsichtlich ihres Molekulargewichts, ihrer Hydrophobie und ihres isoelektrischen Punktes charakterisiert, wie in Abbildung 9 dargestellt. Eine bidirektionale ANOVA konnte keine statistischen Unterschiede in den identifizierten Proteomen über die technischen Replikate hinweg bestimmen. Schließlich vergleicht Abbildung 10 die Anzahl der identifizierten Peptide pro Protein über die drei replizierten Probenpräparate. Die Korrelationskoeffizienten in diesen Diagrammen (0,94-0,95) zeigen die hohe Konsistenz des Probenvorbereitungsansatzes für die Bottom-up-MS-Analyse.

Figure 1
Abbildung 1: Aceton-ausgefällte Proteine. Proben, die 100 und 1.000 μg Protein enthalten, kombiniert mit 100 mM NaCl und gefällt mit 80% Aceton (A) nach 5 min Fällungszeit und (B) nach Fällung und anschließender Zentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Proteinausfällung durch Chloroform/Methanol/Wasser. Eine Probe, die 50 μg Protein enthält, fällt gemäß Schritt 4 aus. (A) Unmittelbar nach Schritt 4.4. (B) Unmittelbar nach Schritt 4.8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Fotos einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche für die Proteinfällung. Eine Probe, die 100 μg Protein enthielt, wurde mit 100 mM NaCl und 80% Aceton in (A) der zusammengesetzten Filtrations- und SPE-Kartusche kombiniert und (B) für 5 min ausgefällt, bis Proteinaggregate sichtbar wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: SDS-Depletionseffizienz nach Proteinausscheidung. Der Prozentsatz des entfernten SDS wird aus der Acetonfällung mit dem konventionellen Protokoll (über Nacht bei -20 °C), dem Schnellprotokoll (2-minütige Inkubation bei Raumtemperatur) oder durch Chloroform/Methanol/Wasser (CMW)-Ausfällung eines S. cerevisiae-Lysats sowohl im konventionellen (Durchstechflaschen-) als auch im Kartuschenformat angezeigt. Diese Proben enthielten zunächst 0,5% SDS (5.000 ppm), was darauf hindeutet, dass >99,8% SDS-Entfernung für eine optimale MS-Analyse erforderlich ist. Das Rest-SDS wird durch einen MBAS-Assay (Methylenblau-Wirkstoffe) quantifiziert. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von technischen Replikaten dar (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Gesamterholung des Proteoms durch Niederschlag. SDS PAGE zeigt die Rückgewinnung von S. cerevisiae Gesamtproteinlysat, das durch (A) konventionelle Acetonfällung, (B) Chloroform/Methanol/Wasserfällung und (C) schnelle Acetonfällung gefällt wird. Proteinbänder werden ausschließlich in der Pelletfraktion beobachtet, ohne sichtbare Banden im Überstand (Super.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Überlegene Proteinrückgewinnung innerhalb einer Filtrationspatrone. Für die Ausfällung des S. cerevisiae-Gesamtproteinlysats erleichtert die Einweg-Spinkartusche die quantitative Erholung mit Aceton- und CMW-Fällung. Eine hohe Ausbeute ist auch mit Fällung auf Flättchenbasis möglich, obwohl eine sorgfältige Probenmanipulation und Pipettierung erforderlich sind. LC-UV-bewertete Proteinrückgewinnung nach Resolubilisierung des Pellets mit kalter Ameisensäure sind hier dargestellt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von technischen Replikaten dar (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Hohe Fällungsausbeuten für niedermolekulare Peptide. Ein modifiziertes Acetonfällungsprotokoll für Peptide und Proteine ≤5 kDa beinhaltet die Kopplung von 100 mMZnSO 4 mit 97% Aceton, um die höchsten Ausbeuten zu erzielen. Die durch eine Einweg-Filtrationskartusche erleichterte Ausfällung zeigt eine verbesserte Rückgewinnung im Vergleich zu herkömmlichen Fläschchenniederschlägen unter allen drei Niederschlagsbedingungen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von technischen Replikaten dar (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Höhere Rückgewinnung von Standardproteinen im SDS-basierten Workflow. Tukey Box-and-Whisker zeichnet30 der relativen MS-Signalintensität für Peptide auf, die aus SDS-haltigen Proteinen gewonnen werden, die in einer Einwegfiltrationskartusche relativ zu einer Kontrollprobe verarbeitet werden (kein SDS, kein Niederschlag). Die verwendeten Proteine umfassen einen weiten Konzentrationsdynamikbereich - β-Galactosidase:Cytochrom c:enolase = 10.000:10:1. Jedes Quartil innerhalb der Boxen enthält 25% der Verteilung, während Fehlerbalken 95% der Verteilung umfassen. Der Mittelwert wird durch "+" und der Median durch eine horizontale Linie angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Identifizierte Proteinverteilungen aus technischen Replikaten. Tukey Box-and-Whisker-Diagramme charakterisieren (A) das Molekulargewicht, (B) die Hydrophobie und (C) den isoelektrischen Punkt von Proteinen, die durch Bottom-up-LC-MS/MS nach dreifachen Zubereitungen eines Rinderleberlysats in einer zweistufigen Filtrations- und Extraktionskartusche identifiziert wurden. Es gab keinen statistischen Unterschied in diesen Merkmalen durch bidirektionale ANOVA (S. < 0,05). Jedes Quartil innerhalb der Boxen enthält 25% der Verteilung, während Fehlerbalken 95% der Verteilung umfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 10
Abbildung 10: Korrelation von Peptid-IDs pro Protein durch den SDS-basierten Präparationsworkflow über präparative Replikate hinweg. Analyse der Bottom-up-Proteom-Reproduzierbarkeit über (A) Proben 1 und 2, (B) Proben 2 und 3 und (C) Proben 1 und 3 basierend auf der Anzahl der Peptid-MS-Identifikationen pro Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Eine optimale MS-Charakterisierung wird erreicht, wenn das verbleibende SDS unter 10 ppm erschöpft ist. Während alternative Ansätze wie FASP und Auf-Perlen-Verdauung eine quantitative SDS-Erschöpfung mit variabler Rückgewinnung31,32,33 bieten, besteht das Hauptziel des Niederschlags darin, Reinheit und Ertrag gleichzeitig zu maximieren. Dies hängt davon ab, den Überstand (der das SDS enthält) effektiv zu isolieren, ohne das Proteinpellet zu stören. Bei der Fällung auf Fläschchenbasis ist es immer wahrscheinlicher, dass ein Teil der aggregierten Pellets versehentlich verloren geht, sobald der Großteil des Überstands durch Pipettieren entfernt wurde. Aus diesem Grund ist es wichtig, einen signifikanteren Anteil des Restlösungsmittels (~20 μL) zu hinterlassen und einen Waschschritt34 hinzuzufügen. Der Waschschritt verdünnt und entfernt das Restlösungsmittel aus der Durchstechflasche. Insbesondere bei CMW ist es unnötig, das Probenfläschchen zu wirbeln, sobald sich das Pellet gebildet hat. Das Aufbrechen des Pellets durch kräftiges Rühren hat den unerwünschten Effekt, dass die Wahrscheinlichkeit eines Verlusts durch versehentliches Pipettieren erhöht wird. Wenn Wirbelung eingeschlossen ist (wie in früheren Protokollen empfohlen)35, besteht die Möglichkeit, dass Teile des CMW-Pellets an der Unterseite der Durchstechflaschenkappe haften; Nach der Zentrifugation bleibt das Pellet auf der Kappe der Durchstechflasche fixiert und kann zu einem Verlust von ~ 50% führen.

Eine schnelle Ausfällung kann mit hoher Rückgewinnung von verdünnten Proteomproben, idealerweise zwischen 0,01-2 mg/ml, oder einer entsprechenden Proteinmasse zwischen 1-200 μg durchgeführt werden. Quantitative und reproduzierbare Rückgewinnungsraten ab unter 0,01 mg/ml Protein können jedoch von längeren Niederschlagszeiten von 10 min bis 1 h profitieren, was die Durchsatzbeschränkungen des Fällungsablaufs zeigt. Überraschenderweise zeigen konzentriertere Proben (10 mg/ml) eine statistische Verringerung der Ausbeute, vermutlich durch versehentliche Pipettierverluste. Unter der Annahme >10 μg Protein sollte ein sichtbares Pellet an der Seite der Durchstechflasche beobachtet werden (Abbildung 1B). Kleinere Mengen, bis hinunter zu 1 μg, sind schwierig zu sehen. Dies stellt die Fähigkeit in Frage, den Überstand zu pipettieren, ohne das Proteinpellet zu stören. Die Durchstechflasche kann (langsam) mit Aceton umgedreht werden, um das Lösungsmittel vom Pellet zu trennen. Bei CMW haftet das Pellet nicht zuverlässig ausreichend am Fläschchen, wodurch das Pipettieren dem Dekantieren des Überstands vorgezogen wird. Für die Fällung auf Durchstechflaschenbasis wird empfohlen, mit einem möglichst kleinen Mikrozentrifugenröhrchen zu arbeiten, um die beabsichtigten Proben- und Lösungsmittelvolumina zu erleichtern. Die Ausfällung in der bei dieser Arbeit verwendeten Einwegfiltrationskartusche bietet eine maximale Volumenkapazität von 500 μL, wodurch eine Proteinfällung mit 80% Aceton auf Probenvolumina bis zu 100 μL ermöglicht wird. Proben-, Salz- und Lösungsmittelvolumina können entsprechend angepasst werden, wenn die empfohlenen Konzentrationen eingehalten werden.

Die Reinheit des Proteinpellets, das aus der Fällung auf Basis organischer Lösungsmittel gewonnen wird, ist durch die Komplexität der Probenmatrix, die Pufferkomponenten und die Fällungsbedingungen begrenzt. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass spezifische Pufferkomponenten wie Glycin (verwendet für SDS PAGE-Trennungen) zusammen mit Protein unter Verwendung von 80% Aceton ausfallen. Glycin bleibt jedoch durch CMW-Ausfällung löslich. Es wurde berichtet, dass Aceton DNA-Fragmente36,37 ausfällt und möglicherweise unerwünschte Hintergrundverunreinigungen zu dem gewonnenen Pellet hinzufügt. Die Ausfällung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden erfordert einen erhöhten Gehalt an organischem Lösungsmittel und einen bestimmten Salztyp, um die Ausbeute zu maximieren. Während mehrere Salze erforscht wurden, liefertZnSO 4 gleichbleibend hohe Produkte. Dieses Salz fällt in Abwesenheit von Protein in 97% Aceton aus. Somit enthält das resultierende Proteinpellet eine hohe Konzentration an Salz. Es wird darauf hingewiesen, dass bei Verwendung von 90% Aceton nach Volumen auch hohe Peptidausbeuten erzielt werden, obwohl ein statistisch signifikanter Rückgang (~ 5%) der Erholung erwartet wird. Dies ermöglicht jedoch die Verarbeitung eines signifikanteren Probenvolumens (bis zu 180 μL, mit 20 μL von 1 M ZnSO4) in jedem 2 ml Fläschchen. Abgesehen von Matrixverunreinigungen, die mit dem Proteinpellet co-ausfallen, muss festgestellt werden, dass die Lösungsmittelausfällung von Natur aus eine Denaturierung der Probeverursacht 38,39. Daher ist dieses Protokoll nicht für die Herstellung von funktionellen Proteinen oder nativen MS-Workflows anwendbar. Es wurde auch berichtet, dass Aceton kovalente Proteinmodifikationen an Glycinresten40 verursacht und eine Massenverschiebung von +98 u induziert, von der spekuliert wird, dass sie ein Nebenprodukt von Aldolkondensationsaceton41 ist.

Beim Einsatz einer Filtrationskartusche zur Proteinfällung beruht die Isolierung des Proteinpellets auf der Rückhaltung von Aggregaten über einem PTFE-Membranfilter. Die Porosität dieser Membran übersteigt die eines Molekulargewichts-Cutoff-Filters (wie in FASP) und ermöglicht eine Proteinisolierung mit reduzierten Spinzeiten. Der schnelle Lösungstransfer bei niedrigen Spingeschwindigkeiten hängt von der ordnungsgemäßen Benetzung der PTFE-Membran ab. Organische Lösungsmittel fließen leicht durch, obwohl ein trockener PTFE-Filter wässrige Lösungsmittel verhindert. Wenn die Filterpatrone verstopft zu sein scheint, sollte die Membran wieder benetzt werden, indem ein kleines Volumen organischer Lösungsmittel (z. B. Isopropanol) direkt auf den Filter aufgetragen wird. Abhängig von der Größe des Proteinpellets und dem verwendeten Probenvolumen kann eine zusätzliche Zentrifugation oder Spins mit höheren Geschwindigkeiten (bis zu 3.000 x g) erforderlich sein, um sicherzustellen, dass das gesamte Lösungsmittel die Filtrationspatrone passiert hat.

Die Proteinrückgewinnung aus der Fällung unter optimalen Bedingungen wird letztendlich durch die Herausforderung der Wiederauflösung von Pellets begrenzt, wobei nur wenige Lösungsmitteloptionen mit der nachgelagerten Verarbeitung und LC-MS kompatibel sind. Darüber hinaus tragen mehrere Niederschlagsbedingungen wie lange Exposition gegenüber niedrigen Temperaturen und Übertrocknung eines dicht gepackten Pellets zu den Herausforderungen der Wiederaufschlusslösungbei 40. Es wird darauf hingewiesen, dass CMW-Proteinpellets im Allgemeinen weniger löslich sind als Acetonpellets. Eine maximale Resolubilisierungseffizienz des ausgefällten Proteins um 80 % kalte Ameisensäure (Schritt 6.2.2) wurde zuvor berichtet42; Die kalte Temperatur verhindert eine Proteinmodifikation, die sonst in konzentrierter Ameisensäure43,44 auftritt. Das Verdünnen der Säurekonzentration verlangsamt auch die Modifikationsreaktion. Ameisensäure wird für Top-Down-MS-Ansätze oder vor der enzymatischen Verdauung mit Pepsin empfohlen. Die Verwendung dieses Lösungsmittels erfordert wenig physikalische Behandlung; Die Zugabe von nur 5 μL (genug, um das Proteinpellet zu bedecken) kann in Kombination mit Vortexing, kurzer Beschallung oder wiederholtem Pipettieren ausreichend sein. Ebenso ist bei Proben, die von SDS PAGE analysiert werden sollen, das erneute Auflösen in SDS-haltigem Laemmli-Puffer sehr effektiv, wenn es mit einer bescheidenen Durchmischung der Probe vor dem Erhitzen kombiniert wird. Diese Lösungsmittel sind jedoch beide mit Trypsin unverträglich. Die Resolubilisierung mit 8 M Harnstoff wird vor der Trypsin-Verdauung empfohlen, um sicherzustellen, dass der Harnstoff frisch zubereitet wurde (noch am selben Tag). Ein Mindestvolumen von 50 μL Puffer wird für die Protein-Resolubibilisierung innerhalb der Filtrationskartusche empfohlen, um den Kontakt zwischen dem chaotropen Lösungsmittel und dem Pellet zu maximieren und die Auflösung während der Beschallung, des wiederholten Pipettierens und/oder des Vortexens zu unterstützen. Alternative Ansätze nutzen Trypsin, um das Protein wieder zu lösen, was bedeutet, dass das Protein vor der Enzymzugabe nicht vollständig wieder aufgelöst werden muss. Dieser Ansatz kann jedoch die Verdauung verzerren und die löslicheren Spezies begünstigen, während hydrophobe Proteine eine kürzere Verdauungszeit erfahren45. Die Zugabe von 8 Mio. Harnstoff zusammen mit basischen Puffern wie Tris oder Ammoniumbicarbonat erfordert einen Aufreinigungsschritt nach dem Aufschluss der Proben. Für solche Probenadditive ist die Aufreinigung der Umkehrphasensäule ideal. Die in dieser Studie verwendete Einweg-Filtrationskartusche wird durch eine austauschbare SPE-Patrone mit umgekehrter Phase ergänzt. Diese Kartusche eignet sich auch hervorragend für den Lösungsmittelaustausch, im Falle des Ameisensäure-Resolubilisierungsprotokolls. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder Festphasenextraktionsansatz mit einem inhärenten Verlust bei der Probengewinnung verbunden ist. Daher sollte der Benutzer die Vorteile der Wiederherstellung und der zusätzlichen Reinigung für sein Experiment abwägen.

Es wird erwartet, dass diese Protokolle es Proteomik-Forschern ermöglichen werden, ihre waschmittelbasierten Arbeitsabläufe zu rationalisieren und SDS für die Proteomextraktion zu nutzen. Vorbereitende Strategien, die eine konsistente Wiederherstellung des gesamten Proteoms ermöglichen, sind von entscheidender Bedeutung. Eine zweistufige Spinkartusche vereinfacht die Möglichkeit einer schnellen, robusten und reproduzierbaren Proteomprobenisolierung. Ein solcher Ansatz wäre für Anwendungen geeignet, die eine rigorose Analyse erfordern, ohne den Probendurchsatz zu beeinträchtigen, wie z. B. klinische Einstellungen oder groß angelegte Forschungsinitiativen46. Zukünftige Anwendungen dieser Ansätze können die Entdeckung von Biomarkern, den Nachweis, die genaue Quantifizierung sowie die Entdeckung von Arzneimitteln und Wirkstoffzielen umfassen.

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Disclosures

Das Doucette-Labor konzipierte und patentierte die ProTrap XG, die in dieser Studie verwendet wurde. AAD ist auch Gründungspartner von Proteoform Scientific, das die Probenvorbereitungskartusche vermarktet hat.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert. Die Autoren danken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) und SPARC BioCentre (Molecular Analysis) am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) für ihre Beiträge zur Erfassung von MS-Daten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

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Chemie Ausgabe 180 Massenspektrometrie Proteomik Probenvorbereitung Natriumdodecylsulfat Fällung Proteinaufschluss Aceton Chloroform/Methanol/Wasser
Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie
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Nickerson, J. L., Baghalabadi, V.,… More

Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

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