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Chemistry

Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

Summary

El presente protocolo describe la precipitación de proteínas a base de disolventes en condiciones controladas para una recuperación y purificación robustas y rápidas de muestras de proteoma antes de la espectrometría de masas.

Abstract

Si bien los múltiples avances en los instrumentos de espectrometría de masas (EM) han mejorado el análisis cualitativo y cuantitativo del proteoma, los enfoques frontales más confiables para aislar, enriquecer y procesar proteínas antes de la EM son críticos para una caracterización exitosa del proteoma. La recuperación de proteínas baja e inconsistente y las impurezas residuales como los surfactantes son perjudiciales para el análisis de la EM. La precipitación de proteínas a menudo se considera poco confiable, requiere mucho tiempo y técnicamente es difícil de realizar en comparación con otras estrategias de preparación de muestras. Estas preocupaciones se superan mediante el empleo de protocolos óptimos de precipitación de proteínas. Para la precipitación de acetona, la combinación de sales específicas, el control de la temperatura, la composición del disolvente y el tiempo de precipitación es crítica, mientras que la eficiencia de la precipitación de cloroformo / metanol / agua depende del pipeteo adecuado y la manipulación del vial. Alternativamente, estos protocolos de precipitación están optimizados y semiautomatizados dentro de un cartucho de centrifugado desechable. Los resultados esperados de la precipitación de proteínas a base de solvente en el formato convencional y el uso de un cartucho desechable de filtración y extracción de dos etapas se ilustran en este trabajo. Esto incluye la caracterización detallada de mezclas proteómicas mediante análisis LC-MS/MS de abajo hacia arriba. El rendimiento superior de los flujos de trabajo basados en SDS también se demuestra en relación con las proteínas no contaminadas.

Introduction

El análisis del proteoma por espectrometría de masas se ha vuelto cada vez más riguroso, debido a la mayor sensibilidad, resolución, velocidad de escaneo y versatilidad de los instrumentos modernos de MS. Los avances de la EM contribuyen a una mayor eficiencia de identificación de proteínas y a una cuantificación más precisa 1,2,3,4,5. Con una instrumentación mejorada de em, los investigadores exigen una estrategia de preparación de muestras front-end correspondientemente consistente capaz de recuperar cuantitativamente proteínas de alta pureza en un tiempo mínimo en todas las etapas del flujo de trabajo 6,7,8,9,10,11 . Para reflejar con precisión el estado del proteoma de un sistema biológico, las proteínas deben aislarse de la matriz de muestra nativa de manera eficiente e imparcial. Con este fin, la inclusión de un surfactante desnaturalizante, como el dodecil sulfato de sodio (SDS), garantiza una extracción y solubilización eficientes de proteínas12. Sin embargo, SDS interfiere fuertemente con la ionización por electropulverización, causando una severa supresión de la señal de EM si no se elimina adecuadamente13.

Existen varias estrategias de agotamiento de SDS para el posterior análisis del proteoma, como la retención de proteínas por encima de un filtro de corte de peso molecular contenido en cartuchos de espín desechables 14,15,16. El método de preparación de muestras asistido por filtro (FASP) se ve favorecido ya que agota efectivamente el SDS por debajo de 10 ppm, lo que facilita una EM óptima. Sin embargo, la recuperación de proteínas con FASP es variable, lo que impulsó la exploración de otras técnicas. Los enfoques cromatográficos que capturan selectivamente proteínas (o surfactantes) han evolucionado en varios cartuchos convenientes o formatos basados en cuentas 17,18,19,20,21. Dadas estas estrategias simples y (idealmente) consistentes para la purificación de proteínas, el enfoque clásico de la precipitación de proteínas con solventes orgánicos a menudo se pasa por alto como un enfoque prometedor para el aislamiento de proteínas. Si bien se ha demostrado que la precipitación con disolvente agota la SDS por debajo de los niveles críticos con éxito, la recuperación de proteínas ha sido una preocupación de larga data de este enfoque. Múltiples grupos han observado un sesgo de recuperación de proteínas, con rendimientos de precipitación inaceptablemente bajos en función de la concentración de proteínas, el peso molecular y la hidrofobicidad22,23. Debido a la diversidad de protocolos de precipitación reportados en la literatura, se desarrollaron condiciones de precipitación estandarizadas. En 2013, Crowell et al. informaron por primera vez la dependencia de la fuerza iónica en la eficiencia de precipitación de las proteínas en el 80% de acetona24. Para todas las proteínas examinadas, se demostró que la adición de cloruro de sodio de hasta 30 mM era esencial para maximizar los rendimientos (hasta un 100% de recuperación). Más recientemente, Nickerson et al. demostraron que la combinación de una fuerza iónica aún mayor (hasta 100 mM) con una temperatura elevada (20 ° C) durante la precipitación de acetona dio una recuperación casi cuantitativa en 2-5 min25. Se observó una ligera caída en la recuperación de proteínas de bajo peso molecular (LMW). Por lo tanto, un informe posterior de Baghalabadi et al. demostró la recuperación exitosa de proteínas y péptidos LMW (≤5 kDa) mediante la combinación de sales específicas, particularmente sulfato de zinc, con un mayor nivel de disolvente orgánico (97% acetona)26.

Si bien refinar el protocolo de precipitación brinda una estrategia de purificación de proteínas más confiable para la proteómica basada en la EM, el éxito de la precipitación convencional depende en gran medida de la técnica del usuario. Un objetivo principal de este trabajo es presentar una estrategia de precipitación robusta que facilite el aislamiento del pellet de proteína del sobrenadante contaminante. Se desarrolló un cartucho de filtración desechable para eliminar el pipeteo aislando la proteína agregada sobre un filtro de membrana de PTFE poroso27. Los componentes que interfieren con la EM en el sobrenadante se eliminan eficazmente en un paso de centrifugación corto y de baja velocidad. El cartucho de filtro desechable también ofrece un cartucho SPE intercambiable, que facilita la limpieza posterior de la muestra después de la resolubilización y la digestión opcional de proteínas, antes de la espectrometría de masas.

Aquí se presentan una serie de flujos de trabajo de precipitación de proteoma recomendados, incluidos los protocolos modificados de acetona y cloroformo / metanol / agua28 , en un formato convencional (basado en viales) y semiautomatizado en un cartucho desechable de filtración y extracción de dos estados. Se destacan las recuperaciones de proteínas resultantes y las eficiencias de agotamiento de SDS, junto con la cobertura de proteoma LC-MS/MS de abajo hacia arriba, para demostrar el resultado esperado de cada protocolo. Se discuten los beneficios prácticos y los inconvenientes asociados con cada enfoque.

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Protocol

1. Consideraciones materiales y preparación previa de la muestra

  1. Use solo solventes de alta pureza (acetona, cloroformo, metanol) (>99.5%) y productos químicos, libres de exceso de humedad.
  2. Preparar soluciones de cloruro de sodio y sulfato de zinc (1 M) en agua.
    NOTA: Las soluciones salinas se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, siempre y cuando estén libres de contaminantes o crecimiento microbiano.
  3. Utilice el vial de microcentrífuga de polipropileno (PP) más pequeño suficiente para retener el volumen requerido de muestra y disolventes para inducir la precipitación.
  4. Asegúrese de que la concentración de SDS en la muestra a precipitar no sea superior al 2% (p/v). Si el SDS es mayor, diluya la muestra con agua.
  5. Asegurar una concentración de proteína entre 0,01 y 10 g/L para una eficiencia óptima de la precipitación.
    NOTA: La masa óptima para la precipitación oscila entre 1-100 μg de proteína.
  6. Asegúrese de que todos los disolventes y soluciones estén libres de partículas antes de su uso. Realice una filtración (<0,5 μm) o una etapa de centrifugación (10.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente) para eliminar las partículas no disueltas.
  7. Si se requiere la reducción y alquilación de enlaces de disulfuro, realice estos pasos antes de la precipitación de proteínas. El exceso de reactivos reductores y alquilantes se eliminará a través del proceso de precipitación.
  8. Precipitar las proteínas seleccionando y realizando uno de los protocolos (pasos 2, 3, 4 o 5).

2. Precipitación rápida de proteínas (a base de viales) con acetona

  1. Pipetear 90 μL de proteína (libre de partículas) o solución de proteoma en un tubo de microcentrífuga PP. Luego, agregue 10 μL de NaCl acuoso de 1 M.
    NOTA: Si la resistencia iónica del extracto de proteoma ya supera los 100 mM, no se necesita sal adicional.
  2. Pipeta 400 μL de acetona en la muestra. Tapa el vial y golpea suavemente el vial para combinar los disolventes. No se requiere una mezcla vigorosa.
    NOTA: El volumen de proteína, sal y acetona se puede aumentar siempre que se mantenga la proporción relativa de cada uno.
  3. Deje que el vial se incube a temperatura ambiente, sin perturbaciones, durante un mínimo de 2 minutos.
    NOTA: Las incubaciones más largas, incluidas las que se realizan a temperatura reducida (por ejemplo, la precipitación convencional de acetona emplea precipitación durante la noche en el congelador), pueden dar lugar a la formación de partículas de proteína agregadas más grandes (visibles) (Figura 1A), que generalmente no mejoran la recuperación total de proteínas.
  4. Después de la incubación, coloque las muestras en una centrífuga, anotando la orientación del vial. Girar durante un mínimo de 2 min, a 10.000 x g o más a temperatura ambiente.
  5. Desmonte el vial y decante suavemente el sobrenadante invirtiendo lentamente el vial a un contenedor de residuos. Toque el vial invertido en una toalla de papel para extraer el disolvente residual del vial.
    PRECAUCIÓN: Los disolventes de desecho deben conservarse y desecharse según los protocolos apropiados.
  6. Para muestras que contengan SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, teniendo cuidado de no molestar el pellet.
    NOTA: El paso 2.6 es opcional.
    1. Centrifugar inmediatamente la muestra (10.000 x g o más durante 1 min a temperatura ambiente), colocando el vial en el rotor en la misma orientación que el giro inicial. Decantar el disolvente de lavado como se describe en el paso 2.5.
  7. Deje que la muestra se seque completamente con la tapa abierta (~ 1 min). Recapitule el vial y proceda con la solubilización de pellets (paso 6).

3. Precipitación de péptidos de bajo peso molecular (LMW) (ZnSO4 + acetona)

  1. Dispensar 54 μL de extracto de proteoma a un vial de PP de 2 ml y, a continuación, añadir 6 μL de 1 M de ZnSO4.
    NOTA: La recuperación óptima de los péptidos LMW (≤5 kDa) se obtiene mediante la adición de acetona a un 97% final en volumen. Suponiendo un vial de PP de 2 ml, el volumen máximo de muestra inicial es de 54 μL.
  2. Añadir 1940 μL de acetona a un 97% final en volumen. Agite suavemente para mezclar y deje reposar sin molestias en la mesa de trabajo durante un mínimo de 2 minutos.
  3. Centrifugar (10.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente) y retirar el sobrenadante invirtiendo el vial, y luego tocando el vial en una toalla de papel.
  4. Para muestras que contengan SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, teniendo cuidado de no molestar el pellet.
    NOTA: El paso 3.4 es opcional.
    1. Centrifuque inmediatamente la muestra según el paso 3.3, colocando el vial en el rotor en la misma orientación que el giro inicial. Decantar el disolvente de lavado como se describe en el paso 3.3.
  5. Resolubilizar el pellet seco resultante en un disolvente acuoso con un breve vórtice o sonicación (~5 min).

4. Precipitación de proteínas por cloroformo/metanol/agua (CMW)

  1. Dispensar 100 μL de la proteína o solución de proteoma en un vial de PP. Añadir 400 μL de metanol, seguido de 100 μL de cloroformo. Tapa el vial y el vórtice brevemente para mezclar.
    NOTA: Para la precipitación de CMW, se prefieren viales de 1,5 ml con fondos estrechos (Figura 2A).
    PRECAUCIÓN: El disolvente de cloroformo debe manipularse en una campana de ventilación adecuada. Todos los disolventes que entran en contacto con el cloroformo deben tratarse como residuos halogenados cuando se eliminan.
  2. Dispense rápidamente 300 μL de agua directamente en el centro del vial. Tapa el vial. Deje que la muestra se asiente en la mesa de trabajo sin ser molestada durante 1 minuto.
    NOTA: La solución aparecerá inmediatamente de color blanco turbio. Evite mezclar el vial después de la adición de agua.
  3. Coloque el vial de PP en una centrífuga y gire durante un mínimo de 5 minutos (10.000 x g o más a temperatura ambiente).
    NOTA: Una vez centrifugado, se formarán dos capas de disolvente visibles (capa superior = metanol/agua; inferior = cloroformo). Se forma un pellet de proteína sólida en la interfaz del disolvente (Figura 2A).
  4. Usando una punta de micropipeta grande (1 ml) y manteniendo el vial a ~ 45 °, retire ~ 700 μL del solvente de la capa superior a una velocidad uniforme.
  5. Use una punta de micropipeta más pequeña (200 μL) para continuar retirando la capa superior de disolvente del vial inclinado de ~45°. Pipetear en un movimiento continuo hasta que la capa superior de disolvente forme una perla en el vial.
  6. Añadir 400 μL de metanol fresco al vial de muestra, sin perturbar el pellet, dispensando el disolvente por el lateral del vial.
  7. Tapa el vial. Combine las capas de disolvente balanceando suavemente el vial para hacer girar los disolventes juntos.
    NOTA: Es esencial evitar la interrupción del pellet. No vórtice el vial.
  8. Teniendo en cuenta la orientación del vial en el rotor, centrífuga durante un mínimo de 10 min (10.000 x g a temperatura ambiente). El pellet de proteína se adhiere a la parte inferior del vial (Figura 2B).
  9. Incline el vial a 45°, con el pellet hacia abajo. Coloque la punta de la pipeta a lo largo del borde superior del vial y retire el sobrenadante con una punta de micropipeta de 1 ml a una velocidad lenta pero continua. Retener ~20 μL de disolvente en el vial.
  10. Lave el pellet de proteína para muestras que contengan SDS dispensando lentamente 400 μL de metanol fresco. No vórtice el vial.
    1. Proceda directamente con la centrifugación (10.000 x g durante 2 min a temperatura), colocando el vial en el rotor con la misma orientación que el giro inicial.
  11. Retire el disolvente, según el paso 4.9. Deje que la muestra se seque al aire en un vapor hasta que el disolvente residual se evapore.
  12. Consulte los procedimientos de resolubilización recomendados en el paso 6.

5. Precipitación de proteínas con un cartucho de filtración desechable

NOTA: Cada protocolo de precipitación a base de disolvente descrito en los pasos 2-5 se puede realizar en un cartucho de filtración y extracción de dos etapas (consulte la Tabla de materiales).

  1. Con el tapón conectado al cartucho de filtración superior (Figura 3A), dispense el volumen deseado del proteoma, la sal y el disolvente extraídos como se describe en una de las tres opciones a continuación.
    1. (Opción 1) Para la precipitación de proteínas con acetona, combine 90 μL de proteína o solución de proteoma, 10 μL de NaCl acuoso de 1 M y 400 μL de acetona. Incubar durante un mínimo de 2 min en la mesa de trabajo.
      NOTA: Se desarrollará un precipitado visible para muestras de proteínas concentradas (1 g/L) (Figura 3B).
    2. (Opción 2) Para la precipitación peptídica LMW, combine 15 μL de la muestra, 1,5 μL de 1 M ZnSO4 y 485 μL de acetona. Incubar durante un mínimo de 2 min en la mesa de trabajo.
      NOTA: Una concentración de sal de 90 mM en la muestra acuosa no afectará la recuperación en relación con los 100 mM recomendados en el paso 3.
    3. (Opción 3) Para la precipitación de CMW, agregue 50 μL de extracto de proteoma, 200 μL de metanol y 50 μL de cloroformo. Tapa el vial y brevemente el vórtice para combinar.
      1. Dispense rápidamente 150 μL de agua directamente en el centro del vial. Incubar durante 1 min en la mesa de trabajo.
  2. Centrífuga durante 2 min a 2.500 x g a temperatura ambiente con el tapón aún conectado al cartucho de filtración.
  3. Invierta el cartucho y, a continuación, desenrosque y retire el enchufe de la base del cartucho.
  4. Coloque el cartucho de filtración en un vial limpio y vuelva a la centrífuga. Girar durante 3 min a 500 x g a temperatura ambiente. Deseche el disolvente de flujo continuo del vial inferior.
    NOTA: Si queda algún disolvente en el cartucho de filtración superior, vuelva a la centrífuga y realice un giro adicional.
  5. Lave el pellet de proteína agregando 400 μL de acetona al cartucho de filtración (para la precipitación de CMW, paso 5.1.3, agregue 400 μL de metanol).
  6. Centrifugar durante 3 min a 500 x g a temperatura ambiente o hasta que no quede disolvente en el cartucho superior.
  7. Re-solubilizar el pellet de precipitación como se describe en el paso 6.

6. Resolubilización del pellet de proteína

  1. Humedezca la membrana en la base del cartucho de filtración dispensando 2-5 μL de isopropanol directamente a la membrana inmediatamente antes de los protocolos de resolubilización que se describen a continuación.
  2. Siga uno de los siguientes métodos de resolubilización.
    1. (Opción 1) Añadir un mínimo de 20 μL de tampón acuoso que contenga ≥2% SDS al cartucho de filtración. Tapa y vórtice vigorosamente (~1 min). Alternativamente, sonicate (>10 min) para dispersar el pellet de proteína.
      1. Calentar la muestra a 95 °C durante 5 min). Repita el paso de mezcla después del calentamiento.
        NOTA: El tampón de carga de gel Laemmli puede re-solubilizar el pellet de proteína. Sin embargo, las muestras que contienen SDS son incompatibles con la digestión de tripsina y la LC y LA EM de fase inversa.
    2. (Opción 2) Prepare una solución de ácido fórmico al 80% (v /v) en agua. Precargar la solución ácida (-20 °C), así como el cartucho de filtración que contiene proteína precipitada.
      1. Dispensar 50 μL de ácido fórmico frío en el cartucho; gorra y vórtice durante 30 s. Volver al congelador (-20 °C) durante 10 min.
      2. Vuelva a vórtice el cartucho durante 30 s. Luego, repita el ciclo de enfriamiento y mezcla una vez más (10 min, -20 °C, vórtice de 30 s).
      3. Agregue agua a un final de 500 μL, diluyendo el ácido fórmico al 8%.
        NOTA: El protocolo de ácido fórmico frío es incompatible con la digestión posterior de tripsina, pero es compatible con LC-MS.
    3. (Opción 3) Añadir 50 μL de urea 8 M recién preparadas en agua al cartucho de filtración. Sonicar durante 30 min.
      1. Deje que el cartucho se incube en la mesa de trabajo durante 1 h (hasta durante la noche).
      2. Diluya los 8 M de urea un mínimo de 5 veces con agua o tampón apropiado.
        NOTA: Una vez diluido, el protocolo de solubilización de urea es compatible con la digestión posterior de tripsina, así como con LC-MS.

7. Digestión de proteínas

  1. Para el análisis de EM de abajo hacia arriba, someta las proteínas resolubilizadas a digestión enzimática utilizando uno de los dos métodos mencionados a continuación.
    1. (Opción 1) Para la resolubilización del ácido fórmico, reduzca el volumen inicial del 80% de ácido fórmico en el paso 6.2.2.1 a 25 μL. En el paso 6.2.2.3, use 375 μL de agua para diluir el ácido fórmico al 5% (v/v).
    2. Dispense pepsina en el cartucho en una proporción aproximada de proteína a enzima de 50:1. Con un tapón conectado al cartucho de filtración, incube la muestra durante la noche a temperatura ambiente.
  2. (Opción 2) Para la resolubilización en urea, asegurar un pH entre 8 y 8.3 con la inclusión de 100 mM de Tris o bicarbonato de amonio en el paso 6.2.3.2.
    1. Agregue tripsina a una relación aproximada de proteína a masa enzimática de 50: 1. Con un tapón conectado al cartucho, incube la muestra durante la noche en un baño de agua tibia a 37 °C.
    2. Terminar la digestión acidificando la solución con 10% de TFA a un 1% final.
  3. Recupere la proteína digerida por pepsina o tripsina retirando el tapón de la base del filtro y centrifugando el cartucho contenido en un vial limpio (2 min, 5000 x g, temperatura ambiente).

8. Limpieza de SPE

NOTA: Para la desalinización adicional de la muestra después de la digestión o el intercambio de disolventes, la muestra puede estar sujeta a una limpieza de fase inversa como se describe.

  1. Cebar un cartucho SPE (ver Tabla de Materiales) pasando 300 μL de metanol (2 min, 400 x g) seguido de 300 μL de 5% de acetonitrilo/0,1% de TFA (2 min, 400 x g).
  2. Conecte el cartucho SPE cebado a la base del cartucho de filtración que contiene proteína resolubilizada o digerida.
  3. Haga girar la proteína a través del cartucho SPE (5 min, 800 x g a temperatura ambiente). Si el disolvente permanece en el cartucho superior, devuelva el cartucho a la centrífuga y repita el giro.
    NOTA: Pasar la muestra a través del cartucho SPE por segunda vez puede mejorar la recuperación.
  4. Añadir al cartucho 300 μL de acetonitrilo al 5%/0,1% de AGT en agua. Para lavar, fluya a través del cartucho SPE (2 min, 2000 x g). Descarta el flujo.
  5. Para proteínas LMW o péptidos digeridos, eluya la muestra fluyendo 300 μL de acetonitrilo al 50%/0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
  6. Para las proteínas intactas, siga el paso 8.5 con un paso de elución adicional utilizando 300 μL de 75% de acetonitrilo/0.1% de TFA. Combine los dos extractos resultantes.
    NOTA: El paso 8.6 es opcional.

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Representative Results

La Figura 4 resume el agotamiento esperado de SDS después de la precipitación de proteínas a base de vial o facilitada por cartucho en un cartucho de filtro desechable utilizando acetona. La incubación nocturna convencional (-20 °C) en acetona se compara con el protocolo de precipitación rápida de acetona a temperatura ambiente (paso 2), así como con la precipitación CMW (paso 4). La SDS residual se cuantificó mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS)29. Brevemente, la muestra de 100 μL se combinó con 100 μL de reactivo MBAS (250 mg de azul de metileno, 50 g de sulfato de sodio, 10 ml de ácido sulfúrico, diluido en agua a 1,0 L), seguido de la adición de 400 μL de cloroformo y la medición de absorbancia de la capa orgánica a 651 nm en un espectrofotómetro UV / Vis. Todos los enfoques reducen la SDS para permitir un análisis óptimo de la EM.

La recuperación cuantitativa y reproducible de proteínas se logra después de una rápida precipitación de acetona y precipitación de CMW, como se ve en la Figura 5 a través del análisis SDS PAGE de un lisado celular total de levadura procesada. La precipitación en un cartucho de filtración desechable elimina la necesidad de pipetear cuidadosamente el sobrenadante que contiene SDS mientras retiene las proteínas agregadas por encima de un filtro de membrana. Se obtiene una recuperación consistente con todos los protocolos de precipitación, sin que se detecten bandas visibles en las fracciones sobrenadantes a través de tres réplicas independientes.

La Figura 6 cuantifica los rendimientos esperados, incluida la resolubilización de gránulos de proteína precipitados utilizando ácido fórmico frío (paso 6). La precipitación CMW permite la recuperación cuantitativa al preservar cuidadosamente el pellet en un enfoque basado en viales (paso 5), que es igual al obtenido con el cartucho (100 ± 4% frente a 101 ± 3%, respectivamente). La recuperación de pellets de proteína precipitada por acetona se beneficia de un cartucho de filtración, con una mejora del 15-20 % en el rendimiento observado. En viales, el aislamiento del sobrenadante de acetona de la proteína agregada se basa esencialmente en la adherencia del pellet a la superficie del tubo de PP; el cartucho de filtración elimina esta preocupación, ya que el filtro garantiza una alta recuperación de la proteína precipitada sin pipeteo.

Para recuperar eficientemente las proteínas y péptidos LMW, se modifica el protocolo de precipitación de acetona sustituyendo NaCl por ZnSO4 y elevando el porcentaje de disolvente al 97%. La combinación de esta sal específica y niveles más altos de disolvente orgánico son necesarios para la alta recuperación de proteínas y péptidos LMW26. Como se ve en la Figura 7, la precipitación de proteínas basada en cartuchos demuestra una recuperación superior de una muestra de plasma bovino digerida con pepsina en relación con la precipitación basada en viales. El cartucho de espín desechable puede recuperar más del 90% de los péptidos LMW. Se observan diferencias más significativas en el rendimiento en el cartucho cuando se emplea NaCl, lo que confirma la importancia del tipo de sal para maximizar el rendimiento. La inclusión de ZnSO4 en lugar de NaCl da como resultado un pellet de proteína agregado que es atrapado más fácilmente por el filtro del cartucho de espín.

Para evaluar la eficacia de las proteínas precipitantes en un amplio rango dinámico, se procesó una mezcla de tres proteínas estándar: β-galactosidasa (β-gal) de E. coli, citocromo c (Cyt c) de bovino y enolasa (Eno) de S. cerevisiae. La relación de masa de β-gal:Cyt c:Eno fue de 10.000:10:1. Las muestras inicialmente contenían un 2% de SDS antes de la precipitación basada en cartuchos (paso 5) y se resolubilizaron y digirieron con tripsina (pasos 6 y 7). Las muestras preparadas en viales actuaron como control, sin SDS y omitiendo la precipitación. Todas las muestras fueron sometidas a una limpieza SPE equivalente (paso 8). Se realizó EM de abajo hacia arriba, con espectros de EM / EM buscados en una base de datos combinada que contenía todas las proteínas de las tres especies involucradas (ver Tabla de Materiales para plataformas de instrumentos y software). Se empleó una tasa de descubrimiento falso de péptidos del 1%. Las tres proteínas fueron identificadas por MS, con 666, 28 y 35 péptidos únicos para β-gal, Cyt c y Eno, respectivamente. La Figura 8 cuantifica la relación relativa (intensidad máxima del péptido) de cada muestra, con una relación superior a 1 que refleja una mayor abundancia de péptidos para las muestras procesadas en los cartuchos de filtro desechables. Los resultados demuestran los beneficios de incorporar SDS en un flujo de trabajo de proteómica, minimizar la pérdida de proteínas (por ejemplo, de la posible adsorción al vial de muestra) y maximizar los rendimientos de péptidos.

El hígado bovino fue adquirido en una tienda de comestibles local. Las proteínas se aislaron extrayendo el tejido con una solución de SDS al 1%. Posteriormente, el proteoma recuperado fue precipitado, re-solubilizado (urea) y digerido con tripsina, todo dentro de un cartucho desechable. Se realizó LC-MS/MS de abajo hacia arriba, lo que resultó en la identificación de un promedio de ~ 8,000 proteínas (~ 30,000 péptidos). Se emplearon tasas de descubrimiento falso de 0.5% y 1.0% para espectros de péptidos y grupos de proteínas, buscando en la base de datos bovina. La reproducibilidad técnica de este flujo de trabajo basado en cartuchos se evalúa a través de identificaciones de proteínas superpuestas. Las inyecciones replicadas de EM de una muestra digerida común logran en promedio 78 ± 0.5% de superposición con las proteínas identificadas. En comparación, las muestras preparadas de forma independiente en cartuchos discretos lograron una superposición del 76 ± del 0,5%. Estos datos sugieren que la contribución de la preparación de la muestra hacia la variabilidad total del análisis es menor, en relación con la ya aportada por el enfoque instrumental LC-MS. Las proteínas bovinas identificadas a partir de tres réplicas técnicas (procesadas independientemente en tres cartuchos desechables) se caracterizaron aún más en cuanto a su peso molecular, hidrofobicidad y punto isoeléctrico, que se muestran en la Figura 9. Un ANOVA bidireccional no pudo determinar las diferencias estadísticas en los proteomas identificados entre las réplicas técnicas. Finalmente, la Figura 10 compara el número de péptidos identificados por proteína en las tres preparaciones de muestras replicadas. Los coeficientes de correlación en estos gráficos (0.94-0.95) demuestran la alta consistencia del enfoque de preparación de muestras para el análisis de EM de abajo hacia arriba.

Figure 1
Figura 1: Proteínas precipitadas por acetona. Muestras que contienen 100 y 1.000 μg de proteína combinada con 100 mM de NaCl y precipitadas con 80% de acetona (A) después de 5 min de tiempo de precipitación y (B) después de la precipitación y posterior centrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Precipitación de proteínas por cloroformo/metanol/agua. Una muestra que contiene 50 μg de proteína precipitada según el paso 4. (A) Inmediatamente después del paso 4.4. (B) Inmediatamente después del paso 4.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Fotos de un cartucho desechable de filtración y extracción de dos etapas para la precipitación de proteínas. Se combinó una muestra que contenía 100 μg de proteína con 100 mM de NaCl y 80% de acetona en (A) la filtración ensamblada y el cartucho SPE y (B) se precipitó durante 5 minutos hasta que los agregados de proteínas se hicieron visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Eficiencia de agotamiento de SDS después de la precipitación de proteínas. El porcentaje de SDS eliminado se muestra a partir de la precipitación de acetona con el protocolo convencional (durante la noche a -20 °C), el protocolo rápido (incubación de 2 min a temperatura ambiente), o por la precipitación de cloroformo/metanol/agua (CMW) de un lisado de S. cerevisiae , tanto en formato convencional (vial) como de cartucho. Estas muestras inicialmente contenían 0.5% SDS (5,000 ppm), infiriendo >99.8% se requiere la eliminación de SDS para un análisis óptimo de MS. La SDS residual se cuantifica mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS). Las barras de error representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Recuperación total del proteoma a través de la precipitación. SDS PAGE muestra la recuperación del lisado total de proteínaS de S. cerevisiae , precipitado por (A) precipitación convencional de acetona, (B) precipitación de cloroformo/metanol/agua y (C) precipitación rápida de acetona. Las bandas proteicas se observan exclusivamente en la fracción de pellets, sin bandas visibles en el sobrenadante (Super.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Recuperación superior de proteínas dentro de un cartucho de filtración. Para la precipitación del lisado total de proteínaS de S. cerevisiae , el cartucho de espín desechable facilita la recuperación cuantitativa con precipitación de acetona y CMW. La alta recuperación también es posible con la precipitación a base de viales, aunque se requiere una cuidadosa manipulación de la muestra y pipeteo. LC-UV evaluó la recuperación de proteínas después de la resolubilización del pellet con ácido fórmico frío se muestran aquí. Las barras de error representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Altos rendimientos de precipitación para péptidos de bajo peso molecular. Un protocolo de precipitación de acetona modificado para péptidos y proteínas ≤5 kDa implica el acoplamiento de 100 mM de ZnSO4 con 97% de acetona para lograr los mayores rendimientos. La precipitación facilitada por un cartucho de filtración desechable demuestra una mejor recuperación en comparación con la precipitación convencional basada en viales en las tres condiciones de precipitación. Las barras de error representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Mayor recuperación de proteínas estándar en el flujo de trabajo basado en SDS. Tukey Box-and-Whisker traza30 de la intensidad relativa de la señal MS para péptidos recuperados de proteínas que contienen SDS procesadas en un cartucho de filtración desechable en relación con una muestra de control (sin SDS, sin precipitación). Las proteínas empleadas abarcan un amplio rango dinámico de concentración: β-galactosidasa: citocromo c: enolasa = 10,000: 10: 1. Cada cuartil dentro de las cajas contiene el 25% de la distribución, mientras que las barras de error abarcan el 95% de la distribución. La media se indica por "+" y la mediana por una línea horizontal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Distribuciones de proteínas identificadas a partir de réplicas técnicas. Los gráficos de Tukey Box-and-Whisker caracterizan (A) el peso molecular, (B) la hidrofobicidad y (C) el punto isoeléctrico de las proteínas identificadas por LC-MS/MS de abajo hacia arriba después de las preparaciones triplicadas de un lisado hepático bovino en un cartucho de filtración y extracción de dos etapas. No hubo diferencias estadísticas en estas características por ANOVA bidireccional (p < 0,05). Cada cuartil dentro de las cajas contiene el 25% de la distribución, mientras que las barras de error abarcan el 95% de la distribución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Correlación de identificaciones peptídicas por proteína a través del flujo de trabajo de preparación basado en SDS a través de réplicas preparativas. Análisis de la reproducibilidad del proteoma de abajo hacia arriba en (A) muestras 1 y 2, (B) muestras 2 y 3, y (C) muestras 1 y 3 basadas en el número de identificaciones peptídicas de EM por proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La caracterización óptima de la EM se logra cuando la SDS residual se agota por debajo de 10 ppm. Mientras que los enfoques alternativos, como el FASP y la digestión en perlas, ofrecen un agotamiento cuantitativo de SDS con recuperación variable 31,32,33, el objetivo principal de la precipitación es maximizar la pureza y el rendimiento simultáneamente. Esto depende de aislar efectivamente el sobrenadante (que contiene el SDS) sin alterar el pellet de proteína. Con la precipitación basada en viales, una vez que la mayor parte del sobrenadante se elimina mediante pipeteo, es cada vez más probable que algunos de los gránulos agregados se pierdan accidentalmente. Por esta razón, es esencial dejar atrás una fracción más significativa del disolvente residual (~ 20 μL) y agregar un paso de lavado34. La etapa de lavado diluye y elimina el disolvente residual del vial. Particularmente con CMW, no es necesario vórtice el vial de muestra una vez que se ha formado el pellet. Interrumpir el pellet a través de una agitación vigorosa tiene el efecto no deseado de aumentar la probabilidad de pérdida por pipeteo accidental. Si se incluye el vórtice (como lo recomendaron los protocolos anteriores)35, existe la posibilidad de que partes del pellet CMW se adhieran a la parte inferior de la tapa del vial; una vez centrifugado, el pellet permanece fijo en la tapa del vial y puede resultar en una pérdida de ~ 50%.

La precipitación rápida se puede realizar con una alta recuperación de muestras de proteoma diluido, idealmente entre 0.01-2 mg / ml, o una masa de proteína correspondiente entre 1-200 μg. Sin embargo, las recuperaciones cuantitativas y reproducibles a partir de menos de 0,01 mg/ml de proteína pueden beneficiarse de tiempos de precipitación más largos que van desde 10 min a 1 h, lo que demuestra las limitaciones de rendimiento del flujo de trabajo de precipitación. Sorprendentemente, las muestras más concentradas (10 mg/ml) muestran una reducción estadística en el rendimiento, presumiblemente por pérdidas accidentales de pipeteo. Suponiendo >10 μg de proteína, se debe observar un gránulo visible en el costado del vial (Figura 1B). Las cantidades más pequeñas, hasta 1 μg, son difíciles de ver. Esto desafía la capacidad de pipetear el sobrenadante sin interrumpir el pellet de proteína. El vial se puede invertir (lentamente) con acetona para separar el disolvente del pellet. Para CMW, el pellet no se adhiere de manera confiable lo suficiente al vial, favoreciendo así el pipeteo sobre la decantación del sobrenadante. Para la precipitación basada en viales, se recomienda trabajar con el tubo de microcentrífuga más pequeño posible para facilitar los volúmenes de muestra y disolvente previstos. La precipitación en el cartucho de filtración desechable empleado en este trabajo proporciona una capacidad de volumen máxima de 500 μL, lo que permite la precipitación de proteínas con 80% de acetona en volúmenes de muestra de hasta 100 μL. Los volúmenes de muestra, sal y disolvente se pueden ajustar en consecuencia si se mantienen las concentraciones recomendadas.

La pureza del pellet de proteína recuperado de la precipitación orgánica a base de solvente está limitada por la complejidad de la matriz de muestra, los componentes tampón y las condiciones de precipitación. Por ejemplo, se ha demostrado que componentes tampón específicos como la glicina (utilizada para las separaciones SDS PAGE) co-precipitan con la proteína utilizando un 80% de acetona. Sin embargo, la glicina permanece soluble a través de la precipitación de CMW. Se ha informado que la acetona precipita fragmentosde ADN 36,37, lo que podría agregar impurezas de fondo no deseadas al pellet recuperado. La precipitación de proteínas y péptidos de bajo peso molecular requiere un nivel elevado de disolvente orgánico y un tipo de sal específico para maximizar el rendimiento. Si bien se han explorado varias sales, ZnSO4 proporciona productos consistentemente altos. Esta sal precipitará en un 97% de acetona en ausencia de proteína. Por lo tanto, el pellet de proteína resultante contiene una alta concentración de sal. Se observa que el empleo de 90% de acetona por volumen también logrará altos rendimientos de péptidos, aunque se espera una caída estadísticamente significativa (~ 5%) en la recuperación. Sin embargo, esto permite procesar un volumen de muestra más significativo (hasta 180 μL, con 20 μL de 1 M ZnSO4) en cada vial de 2 mL. Más allá de las impurezas de la matriz que co-precipitan con el pellet de proteína, debe afirmarse que la precipitación de disolvente causa inherentemente la desnaturalización de la muestra38,39. Por lo tanto, este protocolo no es aplicable para las preparaciones de proteínas funcionales o flujos de trabajo nativos de EM. También se ha informado que la acetona causa modificaciones de proteínas covalentes en los residuos de glicina40 e induce un cambio de masa de +98 u, se especula que es un subproducto de la acetona41 de condensación de aldol.

Cuando se emplea un cartucho de filtración para la precipitación de proteínas, el aislamiento de la bolita de proteína se basa en la retención de agregados por encima de un filtro de membrana de PTFE. La porosidad de esta membrana excede la de un filtro de corte de peso molecular (como se ve en FASP), lo que permite el aislamiento de proteínas con tiempos de centrifugado reducidos. La transferencia rápida de la solución a bajas velocidades de centrifugado se basa en la humectación adecuada de la membrana de PTFE; los disolventes orgánicos fluyen fácilmente, aunque un filtro de PTFE seco impide los disolventes acuosos. Si el cartucho de filtración parece estar obstruido, la membrana debe volver a humedecerse aplicando directamente un pequeño volumen de disolvente orgánico (por ejemplo, isopropanol) al filtro. Dependiendo del tamaño del pellet de proteína y del volumen de muestra empleado, se puede requerir centrifugación adicional o giros a velocidades más altas (hasta 3.000 x g) para garantizar que todo el disolvente haya pasado a través del cartucho de filtración.

La recuperación de proteínas de la precipitación con condiciones óptimas está limitada en última instancia por el desafío de la resolubilización de pellets, con pocas opciones de solventes compatibles con el procesamiento posterior y LC-MS. Además, varias condiciones de precipitación, como las exposiciones prolongadas a bajas temperaturas y el secado excesivo de un pellet bien empaquetado, contribuyen a los desafíos de resolubilización40. Se observa que los gránulos de proteína CMW son generalmente menos solubles que los gránulos de acetona. Se ha informado previamente de una eficiencia de resolubilización maximizada de la proteína precipitada en un 80% de ácido fórmico frío (paso 6.2.2)42; la temperatura fría impide la modificación de proteínas, que de otro modo ocurre en el ácido fórmico concentrado43,44. Diluir la concentración de ácido también ralentiza la reacción de modificación. El ácido fórmico se recomienda para los enfoques de EM de arriba hacia abajo o antes de la digestión enzimática con pepsina. El empleo de este disolvente exige poco tratamiento físico; la adición de solo 5 μL (suficiente para cubrir el pellet de proteína) puede ser suficiente cuando se combina con vórtice, sonicación breve o pipeteo repetido. Del mismo modo, para las muestras destinadas a ser analizadas por SDS PAGE, la redesuelta en tampón Laemmli que contiene SDS es altamente efectiva, cuando se combina con una mezcla modesta de la muestra antes del calentamiento. Sin embargo, estos disolventes son incompatibles con la tripsina. Se recomienda la resolubilización con 8 M de urea antes de la digestión de tripsina, asegurando que la urea haya sido recién preparada (el mismo día). Se recomienda un volumen mínimo de tampón de 50 μL para la resolubilización de proteínas dentro del cartucho de filtración para maximizar el contacto entre el disolvente chaotrópico y el pellet, así como para ayudar a la disolución durante la sonicación, el pipeteo repetido y / o el vórtice. Los enfoques alternativos explotan la tripsina para re-solubilizar la proteína, lo que significa que la proteína no necesita ser completamente disuelta antes de la adición de enzimas. Sin embargo, este enfoque puede sesgar la digestión, favoreciendo a las especies más solubles, mientras que las proteínas hidrofóbicas experimentan un tiempo de digestión más corto45. La adición de 8 M de urea, junto con tampones básicos como Tris o bicarbonato de amonio, exige un paso de limpieza de la muestra posterior a la digestión. Para tales aditivos de muestra, la limpieza de la columna de fase invertida es ideal. El cartucho de filtración desechable empleado en este estudio se complementa con un cartucho SPE de fase inversa intercambiable. Este cartucho también es ideal para el intercambio de disolventes, en el caso del protocolo de resolubilización de ácido fórmico. Es importante tener en cuenta que cualquier enfoque de extracción en fase sólida se asocia con una pérdida inherente en la recuperación de la muestra. Por lo tanto, el usuario debe sopesar los beneficios de la recuperación y la purificación adicional para su experimento.

Se anticipa que estos protocolos permitirán a los investigadores de proteómica optimizar sus flujos de trabajo basados en detergentes, capitalizando SDS para la extracción de proteomas. Las estrategias preparatorias que facilitan la recuperación consistente del proteoma completo son críticas. Un cartucho de espín de dos etapas simplifica la oportunidad de un aislamiento de muestras de proteoma rápido, robusto y reproducible. Tal enfoque sería susceptible a aplicaciones que requieran un análisis riguroso sin sacrificar el rendimiento de las muestras, como los entornos clínicos o las iniciativas de investigación a gran escala46. Las aplicaciones futuras de estos enfoques pueden incluir el descubrimiento de biomarcadores, la detección, la cuantificación precisa y el descubrimiento de fármacos y dianas farmacológicas.

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Disclosures

El laboratorio Doucette concibió y patentó el ProTrap XG empleado en este estudio. AAD también es socio fundador de Proteoform Scientific, que comercializó el cartucho de preparación de muestras.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá. Los autores agradecen a Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canadá) y SPARC BioCentre (Análisis Molecular) en el Hospital para Niños Enfermos (Toronto, Canadá) por sus contribuciones a la adquisición de datos de EM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

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References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

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Química Número 180 Espectrometría de masas proteómica preparación de muestras dodecil sulfato de sodio precipitación digestión de proteínas acetona cloroformo/metanol/agua
Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas
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Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

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