Denne protokol beskriver opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning under kontrollerede forhold for robust og hurtig genvinding og oprensning af proteomprøver inden massespektrometri.
Mens flere fremskridt inden for massespektrometri (MS) instrumenter har forbedret kvalitativ og kvantitativ proteomanalyse, er mere pålidelige front-end-tilgange til at isolere, berige og behandle proteiner foran MS afgørende for en vellykket proteomkarakterisering. Lav, inkonsekvent proteingenvinding og resterende urenheder såsom overfladeaktive stoffer er skadelige for MS-analyse. Proteinudfældning betragtes ofte som upålidelig, tidskrævende og teknisk udfordrende at udføre sammenlignet med andre prøveforberedelsesstrategier. Disse bekymringer overvindes ved at anvende optimale proteinudfældningsprotokoller. For acetoneudfældning er kombinationen af specifikke salte, temperaturregulering, opløsningsmiddelsammensætning og udfældningstid kritisk, mens effektiviteten af chloroform / methanol / vandudfældning afhænger af korrekt pipettering og hætteglasmanipulation. Alternativt er disse nedbørsprotokoller strømlinede og halvautomatiske i en engangsspinpatron. De forventede resultater af opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning i det konventionelle format og ved hjælp af en engangsfiltrerings- og ekstraktionspatron i to trin er illustreret i dette arbejde. Dette omfatter den detaljerede karakterisering af proteomiske blandinger ved bottom-up LC-MS/MS-analyse. Den overlegne ydeevne af SDS-baserede arbejdsgange demonstreres også i forhold til ikke-forurenet protein.
Proteomanalyse ved massespektrometri er blevet stadig strengere på grund af den forbedrede følsomhed, opløsning, scanningshastighed og alsidighed af moderne MS-instrumenter. Ms-fremskridt bidrager til større proteinidentifikationseffektivitet og mere præcis kvantificering 1,2,3,4,5. Med forbedret MS-instrumentering kræver forskere en tilsvarende konsistent front-end-prøveforberedelsesstrategi, der er i stand til kvantitativ genopretning af proteiner med høj renhed på minimal tid på tværs af alle faser af arbejdsgangen 6,7,8,9,10,11 . For nøjagtigt at afspejle et biologisk systems proteomstatus skal proteiner isoleres fra den oprindelige prøvematrix på en effektiv og upartisk måde. Til dette formål sikrer herunder et denaturerende overfladeaktivt stof, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), effektiv proteinekstraktion og opløseliggørelse12. SDS forstyrrer imidlertid kraftigt elektrosprayionisering, hvilket forårsager alvorlig MS-signalundertrykkelse, hvis den ikke elimineres korrekt13.
Forskellige SDS-udtømningsstrategier er tilgængelige til efterfølgende proteomanalyse, såsom retention af proteiner over et molekylærvægtafskæringsfilter indeholdt i engangsspinpatroner 14,15,16. Den filterstøttede prøveforberedelsesmetode (FASP) foretrækkes, da den effektivt udtømmer SDS under 10 ppm, hvilket letter optimal MS. Proteingenvinding med FASP er imidlertid variabel, hvilket førte til udforskning af andre teknikker. Kromatografiske tilgange, der selektivt fanger protein (eller overfladeaktivt stof), har udviklet sig til forskellige praktiske patroner eller perlebaserede formater 17,18,19,20,21. I betragtning af disse enkle og (ideelt set) konsistente strategier til proteinrensning overses den klassiske tilgang til proteinudfældning med organiske opløsningsmidler ofte som en lovende tilgang til proteinisolering. Mens udfældning af opløsningsmidler har vist sig at nedbryde SDS under kritiske niveauer med succes, har proteingenvinding længe været en bekymring for denne tilgang. Flere grupper har observeret en proteingendannelsesbias med uacceptabelt lave nedbørsudbytter som funktion af proteinkoncentration, molekylvægt og hydrofobicitet22,23. På grund af mangfoldigheden af nedbørsprotokoller, der er rapporteret i litteraturen, blev der udviklet standardiserede nedbørsforhold. I 2013 rapporterede Crowell et al. først afhængigheden af ionstyrke på udfældningseffektiviteten af proteiner i 80% acetone24. For alle undersøgte proteiner viste tilsætning af op til 30 mM natriumchlorid sig at være afgørende for at maksimere udbyttet (op til 100% genopretning). For nylig viste Nickerson et al., at kombinationen af endnu højere ionstyrke (op til 100 mM) med forhøjet temperatur (20 ° C) under acetoneudfældning gav næsten kvantitativ genopretning i 2-5 min25. Et lille fald i genopretningen af proteiner med lav molekylvægt (LMW) blev observeret. Derfor demonstrerede en efterfølgende rapport fra Baghalabadi et al. den vellykkede genopretning af LMW-proteiner og peptider (≤5 kDa) ved at kombinere specifikke salte, især zinksulfat, med et højere niveau af organisk opløsningsmiddel (97% acetone)26.
Mens raffinering af udfældningsprotokollen giver en mere pålidelig proteinrensningsstrategi for MS-baseret proteomics, afhænger succesen med konventionel nedbør stærkt af brugerteknik. Et primært mål med dette arbejde er at præsentere en robust nedbørsstrategi, der letter isoleringen af proteinpellet fra den forurenende supernatant. En engangsfiltreringspatron blev udviklet til at eliminere pipettering ved at isolere aggregeret protein over et porøst PTFE-membranfilter27. MS-interfererende komponenter i supernatanten fjernes effektivt i et kort centrifugeringstrin med lav hastighed. Engangsfilterpatronen tilbyder også en udskiftelig SPE-patron, som letter efterfølgende prøveoprydning efter resolubilisering og valgfri proteinfordøjelse forud for massespektrometri.
En række anbefalede proteomudfældningsarbejdsgange præsenteres her, herunder modificeret acetone og chloroform / methanol / vand28 protokoller, i et konventionelt (hætteglasbaseret) og et halvautomatisk format i en engangs to-tilstandsfiltrerings- og ekstraktionspatron. De resulterende proteingenvindinger og SDS-udtømningseffektivitet fremhæves sammen med bottom-up LC-MS / MS proteomdækning for at demonstrere det forventede resultat fra hver protokol. De praktiske fordele og ulemper forbundet med hver tilgang diskuteres.
Optimal MS-karakterisering opnås, når resterende SDS er udtømt under 10 ppm. Mens alternative tilgange, såsom FASP og fordøjelse på perler, tilbyder kvantitativ SDS-udtømning med variabel genopretning 31,32,33, er det primære mål med nedbør at maksimere renhed og udbytte samtidigt. Dette afhænger af effektiv isolering af supernatanten (indeholdende SDS) uden at forstyrre proteinpillen. Med hætteglasbaseret nedbør, n…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Forfatterne takker Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) og SPARC BioCentre (Molecular Analysis) på Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) for deres bidrag til erhvervelsen af MS-data.
Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |