Summary

Organisk opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning til robust proteomrensning forud for massespektrometri

Published: February 07, 2022
doi:

Summary

Denne protokol beskriver opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning under kontrollerede forhold for robust og hurtig genvinding og oprensning af proteomprøver inden massespektrometri.

Abstract

Mens flere fremskridt inden for massespektrometri (MS) instrumenter har forbedret kvalitativ og kvantitativ proteomanalyse, er mere pålidelige front-end-tilgange til at isolere, berige og behandle proteiner foran MS afgørende for en vellykket proteomkarakterisering. Lav, inkonsekvent proteingenvinding og resterende urenheder såsom overfladeaktive stoffer er skadelige for MS-analyse. Proteinudfældning betragtes ofte som upålidelig, tidskrævende og teknisk udfordrende at udføre sammenlignet med andre prøveforberedelsesstrategier. Disse bekymringer overvindes ved at anvende optimale proteinudfældningsprotokoller. For acetoneudfældning er kombinationen af specifikke salte, temperaturregulering, opløsningsmiddelsammensætning og udfældningstid kritisk, mens effektiviteten af chloroform / methanol / vandudfældning afhænger af korrekt pipettering og hætteglasmanipulation. Alternativt er disse nedbørsprotokoller strømlinede og halvautomatiske i en engangsspinpatron. De forventede resultater af opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning i det konventionelle format og ved hjælp af en engangsfiltrerings- og ekstraktionspatron i to trin er illustreret i dette arbejde. Dette omfatter den detaljerede karakterisering af proteomiske blandinger ved bottom-up LC-MS/MS-analyse. Den overlegne ydeevne af SDS-baserede arbejdsgange demonstreres også i forhold til ikke-forurenet protein.

Introduction

Proteomanalyse ved massespektrometri er blevet stadig strengere på grund af den forbedrede følsomhed, opløsning, scanningshastighed og alsidighed af moderne MS-instrumenter. Ms-fremskridt bidrager til større proteinidentifikationseffektivitet og mere præcis kvantificering 1,2,3,4,5. Med forbedret MS-instrumentering kræver forskere en tilsvarende konsistent front-end-prøveforberedelsesstrategi, der er i stand til kvantitativ genopretning af proteiner med høj renhed på minimal tid på tværs af alle faser af arbejdsgangen 6,7,8,9,10,11 . For nøjagtigt at afspejle et biologisk systems proteomstatus skal proteiner isoleres fra den oprindelige prøvematrix på en effektiv og upartisk måde. Til dette formål sikrer herunder et denaturerende overfladeaktivt stof, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), effektiv proteinekstraktion og opløseliggørelse12. SDS forstyrrer imidlertid kraftigt elektrosprayionisering, hvilket forårsager alvorlig MS-signalundertrykkelse, hvis den ikke elimineres korrekt13.

Forskellige SDS-udtømningsstrategier er tilgængelige til efterfølgende proteomanalyse, såsom retention af proteiner over et molekylærvægtafskæringsfilter indeholdt i engangsspinpatroner 14,15,16. Den filterstøttede prøveforberedelsesmetode (FASP) foretrækkes, da den effektivt udtømmer SDS under 10 ppm, hvilket letter optimal MS. Proteingenvinding med FASP er imidlertid variabel, hvilket førte til udforskning af andre teknikker. Kromatografiske tilgange, der selektivt fanger protein (eller overfladeaktivt stof), har udviklet sig til forskellige praktiske patroner eller perlebaserede formater 17,18,19,20,21. I betragtning af disse enkle og (ideelt set) konsistente strategier til proteinrensning overses den klassiske tilgang til proteinudfældning med organiske opløsningsmidler ofte som en lovende tilgang til proteinisolering. Mens udfældning af opløsningsmidler har vist sig at nedbryde SDS under kritiske niveauer med succes, har proteingenvinding længe været en bekymring for denne tilgang. Flere grupper har observeret en proteingendannelsesbias med uacceptabelt lave nedbørsudbytter som funktion af proteinkoncentration, molekylvægt og hydrofobicitet22,23. På grund af mangfoldigheden af nedbørsprotokoller, der er rapporteret i litteraturen, blev der udviklet standardiserede nedbørsforhold. I 2013 rapporterede Crowell et al. først afhængigheden af ionstyrke på udfældningseffektiviteten af proteiner i 80% acetone24. For alle undersøgte proteiner viste tilsætning af op til 30 mM natriumchlorid sig at være afgørende for at maksimere udbyttet (op til 100% genopretning). For nylig viste Nickerson et al., at kombinationen af endnu højere ionstyrke (op til 100 mM) med forhøjet temperatur (20 ° C) under acetoneudfældning gav næsten kvantitativ genopretning i 2-5 min25. Et lille fald i genopretningen af proteiner med lav molekylvægt (LMW) blev observeret. Derfor demonstrerede en efterfølgende rapport fra Baghalabadi et al. den vellykkede genopretning af LMW-proteiner og peptider (≤5 kDa) ved at kombinere specifikke salte, især zinksulfat, med et højere niveau af organisk opløsningsmiddel (97% acetone)26.

Mens raffinering af udfældningsprotokollen giver en mere pålidelig proteinrensningsstrategi for MS-baseret proteomics, afhænger succesen med konventionel nedbør stærkt af brugerteknik. Et primært mål med dette arbejde er at præsentere en robust nedbørsstrategi, der letter isoleringen af proteinpellet fra den forurenende supernatant. En engangsfiltreringspatron blev udviklet til at eliminere pipettering ved at isolere aggregeret protein over et porøst PTFE-membranfilter27. MS-interfererende komponenter i supernatanten fjernes effektivt i et kort centrifugeringstrin med lav hastighed. Engangsfilterpatronen tilbyder også en udskiftelig SPE-patron, som letter efterfølgende prøveoprydning efter resolubilisering og valgfri proteinfordøjelse forud for massespektrometri.

En række anbefalede proteomudfældningsarbejdsgange præsenteres her, herunder modificeret acetone og chloroform / methanol / vand28 protokoller, i et konventionelt (hætteglasbaseret) og et halvautomatisk format i en engangs to-tilstandsfiltrerings- og ekstraktionspatron. De resulterende proteingenvindinger og SDS-udtømningseffektivitet fremhæves sammen med bottom-up LC-MS / MS proteomdækning for at demonstrere det forventede resultat fra hver protokol. De praktiske fordele og ulemper forbundet med hver tilgang diskuteres.

Protocol

1. Materielle overvejelser og prøveforberedelse Brug kun opløsningsmidler med høj renhed (acetone, chloroform, methanol) (>99,5%) og kemikalier, fri for overskydende fugt. Forbered natriumchlorid- og zinksulfatopløsninger (1 M) i vand.BEMÆRK: Saltopløsninger kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur, så længe de er fri for forurenende eller mikrobiel vækst. Brug det mindste hætteglas med polypropylen (PP) mikrocentrifuge, der er tilstrækkeligt til at b…

Representative Results

Figur 4 opsummerer den forventede SDS-udtømning efter hætteglasbaseret eller patron-faciliteret udfældning af proteiner i en engangsfilterpatron ved anvendelse af acetone. Konventionel inkubation natten over (-20 °C) i acetone sammenlignes med den hurtige acetoneudfældningsprotokol ved stuetemperatur (trin 2) samt CMW-udfældning (trin 4). Resterende SDS blev kvantificeret ved methylenblåt aktive stof (MBAS) assay29. Kort fortalt blev 100 μL prøve kombineret m…

Discussion

Optimal MS-karakterisering opnås, når resterende SDS er udtømt under 10 ppm. Mens alternative tilgange, såsom FASP og fordøjelse på perler, tilbyder kvantitativ SDS-udtømning med variabel genopretning 31,32,33, er det primære mål med nedbør at maksimere renhed og udbytte samtidigt. Dette afhænger af effektiv isolering af supernatanten (indeholdende SDS) uden at forstyrre proteinpillen. Med hætteglasbaseret nedbør, n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Forfatterne takker Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) og SPARC BioCentre (Molecular Analysis) på Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) for deres bidrag til erhvervelsen af MS-data.

Materials

Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Play Video

Cite This Article
Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

View Video