Organisk opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning til robust proteomrensning forud for massespektrometri

Summary

Denne protokol beskriver opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning under kontrollerede forhold for robust og hurtig genvinding og oprensning af proteomprøver inden massespektrometri.

Abstract

Mens flere fremskridt inden for massespektrometri (MS) instrumenter har forbedret kvalitativ og kvantitativ proteomanalyse, er mere pålidelige front-end-tilgange til at isolere, berige og behandle proteiner foran MS afgørende for en vellykket proteomkarakterisering. Lav, inkonsekvent proteingenvinding og resterende urenheder såsom overfladeaktive stoffer er skadelige for MS-analyse. Proteinudfældning betragtes ofte som upålidelig, tidskrævende og teknisk udfordrende at udføre sammenlignet med andre prøveforberedelsesstrategier. Disse bekymringer overvindes ved at anvende optimale proteinudfældningsprotokoller. For acetoneudfældning er kombinationen af specifikke salte, temperaturregulering, opløsningsmiddelsammensætning og udfældningstid kritisk, mens effektiviteten af chloroform / methanol / vandudfældning afhænger af korrekt pipettering og hætteglasmanipulation. Alternativt er disse nedbørsprotokoller strømlinede og halvautomatiske i en engangsspinpatron. De forventede resultater af opløsningsmiddelbaseret proteinudfældning i det konventionelle format og ved hjælp af en engangsfiltrerings- og ekstraktionspatron i to trin er illustreret i dette arbejde. Dette omfatter den detaljerede karakterisering af proteomiske blandinger ved bottom-up LC-MS/MS-analyse. Den overlegne ydeevne af SDS-baserede arbejdsgange demonstreres også i forhold til ikke-forurenet protein.

Introduction

Proteomanalyse ved massespektrometri er blevet stadig strengere på grund af den forbedrede følsomhed, opløsning, scanningshastighed og alsidighed af moderne MS-instrumenter. Ms-fremskridt bidrager til større proteinidentifikationseffektivitet og mere præcis kvantificering 1,2,3,4,5. Med forbedret MS-instrumentering kræver forskere en tilsvarende konsistent front-end-prøveforberedelsesstrategi, der er i stand til kvantitativ genopretning af proteiner med høj renhed på minimal tid på tværs af alle faser af arbejdsgangen 6,7,8,9,10,11 . For nøjagtigt at afspejle et biologisk systems proteomstatus skal proteiner isoleres fra den oprindelige prøvematrix på en effektiv og upartisk måde. Til dette formål sikrer herunder et denaturerende overfladeaktivt stof, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), effektiv proteinekstraktion og opløseliggørelse¹². SDS forstyrrer imidlertid kraftigt elektrosprayionisering, hvilket forårsager alvorlig MS-signalundertrykkelse, hvis den ikke elimineres korrekt¹³.

Forskellige SDS-udtømningsstrategier er tilgængelige til efterfølgende proteomanalyse, såsom retention af proteiner over et molekylærvægtafskæringsfilter indeholdt i engangsspinpatroner 14,15,16. Den filterstøttede prøveforberedelsesmetode (FASP) foretrækkes, da den effektivt udtømmer SDS under 10 ppm, hvilket letter optimal MS. Proteingenvinding med FASP er imidlertid variabel, hvilket førte til udforskning af andre teknikker. Kromatografiske tilgange, der selektivt fanger protein (eller overfladeaktivt stof), har udviklet sig til forskellige praktiske patroner eller perlebaserede formater 17,18,19,20,21. I betragtning af disse enkle og (ideelt set) konsistente strategier til proteinrensning overses den klassiske tilgang til proteinudfældning med organiske opløsningsmidler ofte som en lovende tilgang til proteinisolering. Mens udfældning af opløsningsmidler har vist sig at nedbryde SDS under kritiske niveauer med succes, har proteingenvinding længe været en bekymring for denne tilgang. Flere grupper har observeret en proteingendannelsesbias med uacceptabelt lave nedbørsudbytter som funktion af proteinkoncentration, molekylvægt og hydrofobicitet^22,23. På grund af mangfoldigheden af nedbørsprotokoller, der er rapporteret i litteraturen, blev der udviklet standardiserede nedbørsforhold. I 2013 rapporterede Crowell et al. først afhængigheden af ionstyrke på udfældningseffektiviteten af proteiner i 80% acetone²⁴. For alle undersøgte proteiner viste tilsætning af op til 30 mM natriumchlorid sig at være afgørende for at maksimere udbyttet (op til 100% genopretning). For nylig viste Nickerson et al., at kombinationen af endnu højere ionstyrke (op til 100 mM) med forhøjet temperatur (20 ° C) under acetoneudfældning gav næsten kvantitativ genopretning i 2-5 min²⁵. Et lille fald i genopretningen af proteiner med lav molekylvægt (LMW) blev observeret. Derfor demonstrerede en efterfølgende rapport fra Baghalabadi et al. den vellykkede genopretning af LMW-proteiner og peptider (≤5 kDa) ved at kombinere specifikke salte, især zinksulfat, med et højere niveau af organisk opløsningsmiddel (97% acetone)²⁶.

Mens raffinering af udfældningsprotokollen giver en mere pålidelig proteinrensningsstrategi for MS-baseret proteomics, afhænger succesen med konventionel nedbør stærkt af brugerteknik. Et primært mål med dette arbejde er at præsentere en robust nedbørsstrategi, der letter isoleringen af proteinpellet fra den forurenende supernatant. En engangsfiltreringspatron blev udviklet til at eliminere pipettering ved at isolere aggregeret protein over et porøst PTFE-membranfilter²⁷. MS-interfererende komponenter i supernatanten fjernes effektivt i et kort centrifugeringstrin med lav hastighed. Engangsfilterpatronen tilbyder også en udskiftelig SPE-patron, som letter efterfølgende prøveoprydning efter resolubilisering og valgfri proteinfordøjelse forud for massespektrometri.

En række anbefalede proteomudfældningsarbejdsgange præsenteres her, herunder modificeret acetone og chloroform / methanol / vand²⁸ protokoller, i et konventionelt (hætteglasbaseret) og et halvautomatisk format i en engangs to-tilstandsfiltrerings- og ekstraktionspatron. De resulterende proteingenvindinger og SDS-udtømningseffektivitet fremhæves sammen med bottom-up LC-MS / MS proteomdækning for at demonstrere det forventede resultat fra hver protokol. De praktiske fordele og ulemper forbundet med hver tilgang diskuteres.

Protocol

1. Materielle overvejelser og prøveforberedelse Brug kun opløsningsmidler med høj renhed (acetone, chloroform, methanol) (>99,5%) og kemikalier, fri for overskydende fugt. Forbered natriumchlorid- og zinksulfatopløsninger (1 M) i vand.BEMÆRK: Saltopløsninger kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur, så længe de er fri for forurenende eller mikrobiel vækst. Brug det mindste hætteglas med polypropylen (PP) mikrocentrifuge, der er tilstrækkeligt til at b…

Representative Results

Figur 4 opsummerer den forventede SDS-udtømning efter hætteglasbaseret eller patron-faciliteret udfældning af proteiner i en engangsfilterpatron ved anvendelse af acetone. Konventionel inkubation natten over (-20 °C) i acetone sammenlignes med den hurtige acetoneudfældningsprotokol ved stuetemperatur (trin 2) samt CMW-udfældning (trin 4). Resterende SDS blev kvantificeret ved methylenblåt aktive stof (MBAS) assay29. Kort fortalt blev 100 μL prøve kombineret m…

Discussion

Optimal MS-karakterisering opnås, når resterende SDS er udtømt under 10 ppm. Mens alternative tilgange, såsom FASP og fordøjelse på perler, tilbyder kvantitativ SDS-udtømning med variabel genopretning 31,32,33, er det primære mål med nedbør at maksimere renhed og udbytte samtidigt. Dette afhænger af effektiv isolering af supernatanten (indeholdende SDS) uden at forstyrre proteinpillen. Med hætteglasbaseret nedbør, n…

Materials

Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid