Summary
Mevcut protokol, kütle spektrometrisinden önce proteom numunelerinin sağlam ve hızlı geri kazanımı ve saflaştırılması için kontrollü koşullar altında çözücü bazlı protein çökeltmesini açıklamaktadır.
Abstract
Kütle spektrometresi (MS) cihazlarındaki çoklu ilerlemeler kalitatif ve kantitatif proteom analizini geliştirmiş olsa da, MS'ten önce proteinleri izole etmek, zenginleştirmek ve işlemek için daha güvenilir ön uç yaklaşımları başarılı proteom karakterizasyonu için kritik öneme sahiptir. Düşük, tutarsız protein geri kazanımı ve yüzey aktif maddeler gibi artık safsızlıklar MS analizine zararlıdır. Protein çökeltmesi genellikle diğer numune hazırlama stratejilerine kıyasla güvenilmez, zaman alıcı ve teknik olarak gerçekleştirilmesi zor olarak kabul edilir. Bu endişeler, optimal protein çökeltme protokolleri kullanılarak aşılır. Aseton çökeltmesi için, spesifik tuzların, sıcaklık kontrolünün, çözücü bileşiminin ve çökeltme süresinin kombinasyonu kritik öneme sahipken, kloroform/metanolün/su çökeltmesinin verimliliği uygun pipetleme ve şişe manipülasyonuna bağlıdır. Alternatif olarak, bu çökeltme protokolleri tek kullanımlık bir spin kartuşu içinde kolaylaştırılmış ve yarı otomatiktir. Geleneksel formatta ve tek kullanımlık, iki aşamalı bir filtreleme ve ekstraksiyon kartuşu kullanılarak solvent bazlı protein çökeltmesinin beklenen sonuçları bu çalışmada gösterilmiştir. Bu, proteomik karışımların aşağıdan yukarıya LC-MS / MS analizi ile ayrıntılı karakterizasyonunu içerir. SDS tabanlı iş akışlarının üstün performansı, kontamine olmayan proteinlere göre de gösterilmiştir.
Introduction
Kütle spektrometresi ile proteom analizi, modern MS cihazlarının gelişmiş hassasiyeti, çözünürlüğü, tarama hızı ve çok yönlülüğü nedeniyle giderek daha titiz hale gelmiştir. MS ilerlemeleri, daha fazla protein tanımlama verimliliğine ve daha hassas kantitasyona katkıda bulunur 1,2,3,4,5. Geliştirilmiş MS enstrümantasyonu ile araştırmacılar, iş akışının tüm aşamalarında minimum sürede yüksek saflıkta proteinlerin kantitatif geri kazanımını sağlayabilen, buna karşılık gelen tutarlı bir ön uç numune hazırlama stratejisi talep etmektedirler 6,7,8,9,10,11 . Biyolojik bir sistemin proteom durumunu doğru bir şekilde yansıtmak için, proteinler doğal numune matrisinden verimli ve tarafsız bir şekilde izole edilmelidir. Bu amaçla, sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi denatüre edici bir yüzey aktif madde de dahil olmak üzere, etkili protein ekstraksiyonu ve çözündürme sağlar12. Bununla birlikte, SDS, elektrosprey iyonizasyonuna güçlü bir şekilde müdahale eder ve uygun şekilde elimine edilmezse ciddi MS sinyal bastırmasına neden olur13.
Sonraki proteom analizi için, proteinlerin tek kullanımlık spin kartuşları14,15,16'da bulunan moleküler ağırlık kesme filtresinin üzerinde tutulması gibi çeşitli SDS tükenme stratejileri mevcuttur. Filtre destekli numune hazırlama yöntemi (FASP), SDS'yi 10 ppm'nin altında etkili bir şekilde tükettiği ve optimal MS'yi kolaylaştırdığı için tercih edilir. Bununla birlikte, FASP ile protein geri kazanımı değişkendir ve bu da diğer tekniklerin araştırılmasına neden olmuştur. Proteini (veya yüzey aktif maddeyi) seçici olarak yakalayan kromatografik yaklaşımlar, çeşitli uygun kartuşlara veya boncuk bazlı formatlara dönüşmüştür 17,18,19,20,21. Protein saflaştırmaya yönelik bu basit ve (ideal olarak) tutarlı stratejiler göz önüne alındığında, organik çözücülerle protein çökeltmesinin klasik yaklaşımı genellikle protein izolasyonuna umut verici bir yaklaşım olarak göz ardı edilir. Solvent çökeltmesinin SDS'yi kritik seviyelerin altına başarıyla tükettiği gösterilmiş olsa da, protein geri kazanımı bu yaklaşımın uzun süredir devam eden bir endişesi olmuştur. Birden fazla grup, protein konsantrasyonunun, moleküler ağırlığın ve hidrofobikliğin bir fonksiyonu olarak kabul edilemez derecede düşük yağış verimi ile bir protein geri kazanım önyargısı gözlemlemiştir22,23. Literatürde bildirilen yağış protokollerinin çeşitliliği nedeniyle standartlaştırılmış yağış koşulları geliştirilmiştir. 2013 yılında, Crowell ve ark. ilk olarak% 80 aseton24'teki proteinlerin çökeltme verimliliğine iyonik mukavemetin bağımlılığını bildirmiştir. İncelenen tüm proteinler için, 30 mM'ye kadar sodyum klorür ilavesinin, verimi en üst düzeye çıkarmak için gerekli olduğu gösterilmiştir (% 100'e kadar geri kazanım). Daha yakın zamanlarda, Nickerson ve ark., aseton yağışı sırasında daha yüksek iyonik mukavemetin (100 mM'ye kadar) yüksek sıcaklık (20 ° C) ile kombinasyonunun 2-5 dakika25'te neredeyse kantitatif iyileşme sağladığını göstermiştir. Düşük moleküler ağırlıklı (LMW) proteinlerin geri kazanımında hafif bir düşüş gözlendi. Bu nedenle, Baghalabadi ve ark. tarafından hazırlanan bir sonraki rapor, spesifik tuzları, özellikle çinko sülfatı, daha yüksek bir organik çözücü (% 97 aseton) ile birleştirerek LMW proteinlerinin ve peptitlerinin (≤5 kDa) başarılı bir şekilde geri kazanıldığını göstermiştir26.
Yağış protokolünün rafine edilmesi, MS bazlı proteomikler için daha güvenilir bir protein saflaştırma stratejisi sunarken, geleneksel çökeltmenin başarısı büyük ölçüde kullanıcı tekniğine dayanmaktadır. Bu çalışmanın birincil amacı, protein peletinin kirletici süpernatandan izolasyonunu kolaylaştıran sağlam bir çökeltme stratejisi sunmaktır. Gözenekli PTFE membran filtresi27 üzerinde agrega proteini izole ederek pipetlemeyi ortadan kaldırmak için tek kullanımlık bir filtreleme kartuşu geliştirilmiştir. Süpernatanttaki MS müdahale eden bileşenler, kısa, düşük hızlı bir santrifüjleme adımında etkili bir şekilde çıkarılır. Tek kullanımlık filtre kartuşu ayrıca, kütle spektrometrisinden önce, çözündürme ve isteğe bağlı protein sindiriminin ardından numunenin temizlenmesini kolaylaştıran değiştirilebilir bir SPE kartuşu sunar.
Modifiye aseton ve kloroform/metanol/su28 protokolleri de dahil olmak üzere bir dizi önerilen proteom çökeltme iş akışı, geleneksel (şişe bazlı) ve tek kullanımlık iki durumlu filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunda yarı otomatik bir formatta sunulmaktadır. Elde edilen protein geri kazanımları ve SDS tükenme verimlilikleri, her protokolden beklenen sonucu göstermek için aşağıdan yukarıya LC-MS / MS proteom kapsamı ile birlikte vurgulanır. Her yaklaşımla ilişkili pratik faydalar ve dezavantajlar tartışılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malzeme hususları ve numune ön hazırlığı
- Sadece yüksek saflıkta çözücüler (aseton, kloroform, metanol) (>% 99,5) ve aşırı nem içermeyen kimyasallar kullanın.
- Suda sodyum klorür ve çinko sülfat çözeltileri (1 M) hazırlayın.
NOT: Tuz çözeltileri, kirletici madde veya mikrobiyal büyüme içermedikleri sürece oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir. - Yağışı indüklemek için gerekli numune hacmini ve çözücüleri korumak için yeterli olan en küçük polipropilen (PP) mikrosantrifüj şişesini kullanın.
- Çökeltilecek numunedeki SDS konsantrasyonunun %2'den (w/v) fazla olmadığından emin olun. SDS daha yüksekse, numuneyi suyla seyreltin.
- Optimum çökeltme verimliliği için 0,01 ila 10 g/L arasında bir protein konsantrasyonu sağlayın.
NOT: Yağış için en uygun kütle 1-100 μg protein arasında değişmektedir. - Kullanmadan önce tüm çözücülerin ve çözeltilerin partikül madde içermediğinden emin olun. Çözünmemiş partikülleri gidermek için bir filtreleme (<0,5 μm) veya santrifüjleme adımı (oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 x g) gerçekleştirin.
- Disülfit bağının azaltılması ve alkilasyon gerekiyorsa, protein çökelmesinden önce bu adımları uygulayın. Aşırı indirgeyici ve alkilleyici reaktifler çökeltme işlemi ile uzaklaştırılacaktır.
- Protokollerden birini seçip uygulayarak proteinleri çökeltin (adım 2, 3, 4 veya 5).
2. Aseton ile hızlı (şişe bazlı) protein çökeltmesi
- Pipet 90 μL (partikülsüz) protein veya proteom çözeltisi PP mikrosantrifüj tüpüne dönüşür. Ardından, 10 μL 1 M sulu NaCl ekleyin.
NOT: Proteom ekstraktının iyonik mukavemeti zaten 100 mM'yi aşarsa, ek tuz gerekmez. - Pipet 400 μL aseton numunenin içine alınır. Şişeyi kapatın ve çözücüleri birleştirmek için şişeye hafifçe dokunun. Güçlü karıştırma gerekli değildir.
NOT: Protein, tuz ve aseton hacmi, her birinin göreceli oranı korunduğu sürece arttırılabilir. - Şişenin oda sıcaklığında, rahatsız edilmeden, en az 2 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin.
NOT: Düşük sıcaklıktakiler de dahil olmak üzere daha uzun inkübasyonlar (örneğin, geleneksel aseton çökeltmesi, dondurucuda gece boyunca çökeltme kullanır), genellikle toplam protein geri kazanımını iyileştirmeyen daha büyük (görünür) agrega protein partiküllerinin (Şekil 1A) oluşumuna neden olabilir. - Kuluçkayı takiben, numuneleri şişenin oryantasyonunu not ederek bir santrifüje yerleştirin. Oda sıcaklığında 10.000 x g veya daha yüksek bir sıcaklıkta en az 2 dakika boyunca döndürün.
- Şişenin kapağını açın ve şişeyi yavaşça bir atık kabına çevirerek süpernatantı yavaşça boşaltın. Şişeden artık çözücü çekmek için ters çevrilmiş şişeyi bir kağıt havluya dokunun.
DİKKAT: Atık çözücüler uygun protokollere göre tutulmalı ve atılmalıdır. - SDS içeren numuneler için, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek 400 μL taze aseton dağıtın.
NOT: Adım 2.6 isteğe bağlıdır.- Numuneyi derhal santrifüj edin (oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 x g veya daha yüksek), şişeyi rotora ilk sıkma ile aynı yönde yerleştirin. Yıkama çözücüsünü adım 2.5'te açıklandığı gibi boşaltın.
- Numunenin kapak açıkken tamamen kurumasını bekleyin (~1 dakika). Şişeyi özetleyin ve pelet çözünürlüğü ile devam edin (adım 6).
3. Düşük moleküler ağırlıklı (LMW) peptitlerin çökelmesi (ZnSO4 + aseton)
- 2 mL PP şişesine 54 μL proteom ekstraktı dağıtın ve ardından 6 μL 1 M ZnSO4 ekleyin.
NOT: LMW peptitlerinin (≤5 kDa) optimum geri kazanımı, hacimce son %97'ye aseton eklenerek elde edilir. 2 mL'lik bir PP şişesi varsayarak, maksimum ilk numune hacmi 54 μL'dir. - 1940 μL asetonu, hacimce son %97'ye ekleyin. Karıştırmak için hafifçe döndürün ve tezgahın üstünde en az 2 dakika boyunca rahatsız edilmeden durun.
- Santrifüj (oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 x g) ve şişeyi ters çevirerek ve ardından şişeyi bir kağıt havluya dokundurarak süpernatantı çıkarın.
- SDS içeren numuneler için, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek 400 μL taze aseton dağıtın.
NOT: Adım 3.4 isteğe bağlıdır.- Numuneyi adım 3.3'e göre derhal santrifüj edin ve şişeyi rotora ilk sıkma ile aynı yönde yerleştirin. Yıkama çözücüsünü adım 3.3'te açıklandığı gibi boşaltın.
- Elde edilen kuru peleti kısa vorteks veya sonikasyon (~ 5 dakika) ile sulu bir çözücü içinde yeniden çözündürün.
4. Kloroform / metanol / su (CMW) ile protein çökeltme
- 100 μL protein veya proteom çözeltisini bir PP şişesine dağıtın. 400 μL metanol ekleyin, ardından 100 μL kloroform ekleyin. Şişeyi ve girdabı karıştırmak için kısaca kapatın.
NOT: CMW çökeltme için, dar tabanlı 1,5 mL şişeler tercih edilir (Şekil 2A).
DİKKAT: Kloroform çözücü uygun bir havalandırma başlığında kullanılmalıdır. Kloroformla temas eden tüm çözücüler, bertaraf edildiğinde halojenli atık olarak muamele görmelidir. - 300 μL suyu doğrudan şişenin merkezine hızlı bir şekilde dağıtın. Şişeyi kapatın. Numunenin tezgahta 1 dakika boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin.
NOT: Çözüm hemen bulutlu beyaz görünecektir. Su ilavesini takiben şişeyi karıştırmaktan kaçının. - PP şişesini bir santrifüje yerleştirin ve en az 5 dakika (oda sıcaklığında 10.000 x g veya daha yüksek) döndürün.
NOT: Santrifüj edildikten sonra, iki görünür çözücü katmanı oluşacaktır (üst katman = metanol / su; alt = kloroform). Solvent arayüzünde katı bir protein peleti oluşur (Şekil 2A). - Büyük (1 mL) bir mikropipet ucu kullanarak ve şişeyi ~45°'de tutarak, çözücünün ~700 μL'sini üst tabakadan eşit bir oranda çıkarın.
- Üst çözücü tabakasını ~45° eğimli şişeden çıkarmaya devam etmek için daha küçük (200 μL) bir mikropipet ucu kullanın. Pipet, üst çözücü tabakası şişede bir boncuk oluşturana kadar sürekli bir hareketle.
- Çözücüyü şişenin kenarından aşağı dağıtarak, peleti rahatsız etmeden numune şişesine 400 μL taze metanol ekleyin.
- Şişeyi kapatın. Solventleri bir araya getirmek için şişeyi hafifçe sallayarak çözücü katmanlarını birleştirin.
NOT: Peletin bozulmasını önlemek önemlidir. Şişeyi vortekse etmeyin. - Şişenin rotordaki oryantasyonuna dikkat ederek, en az 10 dakika (oda sıcaklığında 10.000 x g) santrifüj yapın. Protein peleti şişenin dibine yapışır (Şekil 2B).
- Şişeyi 45°'de, pelet aşağı bakacak şekilde devirin. Pipet ucunu şişenin üst kenarı boyunca yerleştirin ve süpernatantı 1 mL'lik bir mikropipet ucu ile yavaş ama sürekli bir hızda çıkarın. Şişede ~ 20 μL çözücü tutun.
- SDS içeren numuneler için protein peletini 400 μL taze metanolü yavaşça dağıtarak yıkayın. Şişeyi vortekse etmeyin.
- Doğrudan santrifüjleme ile devam edin (sıcaklıkta 2 dakika boyunca 10.000 x g), şişeyi rotora ilk spinle aynı yönde yerleştirin.
- Çözücüyü adım 4.9'a göre çıkarın. Artık çözücü buharlaşana kadar numunenin bir duman başlığı içinde hava ile kurumasına izin verin.
- 6. adımda önerilen çözünürlük prosedürlerine başvurun.
5. Tek kullanımlık bir filtrasyon kartuşu kullanarak protein çökeltme
NOT: Adım 2-5'te açıklanan her çözücü bazlı çökeltme protokolü, iki aşamalı bir filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunda gerçekleştirilebilir (bkz.
- Fiş üst filtreleme kartuşuna takılıyken (Şekil 3A), çıkarılan proteom, tuz ve çözücünün istenen hacmini aşağıdaki üç seçenekten birinde belirtildiği gibi dağıtın.
- (Seçenek 1) Aseton ile protein çökeltmesi için, 90 μL protein veya proteom çözeltisini, 10 μL 1 M sulu NaCl ve 400 μL asetonu birleştirin. Tezgahın üstünde en az 2 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Konsantre protein örnekleri (1 g / L) için görünür bir çökelti gelişecektir (Şekil 3B). - (Seçenek 2) LMW peptid çökeltmesi için, numunenin 15 μL'sini, 1.5 μL'lik 1 M ZnSO4'ü ve 485 μL asetonunu birleştirin. Tezgahın üstünde en az 2 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Sulu numunedeki 90 mM'lik bir tuz konsantrasyonu, adım 3'te önerilen 100 mM'ye göre geri kazanımı etkilemeyecektir. - (Seçenek 3) CMW çökeltmesi için 50 μL proteom ekstresi, 200 μL metanol ve 50 μL kloroform ekleyin. Şişeyi kapatın ve birleştirmek için kısaca vorteks.
- 150 μL suyu doğrudan şişenin merkezine hızlı bir şekilde dağıtın. Tezgahın üstünde 1 dakika kuluçkaya yatırın.
- (Seçenek 1) Aseton ile protein çökeltmesi için, 90 μL protein veya proteom çözeltisini, 10 μL 1 M sulu NaCl ve 400 μL asetonu birleştirin. Tezgahın üstünde en az 2 dakika kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında 2.500 x g'da 2 dakika boyunca santrifüj, fiş hala filtrasyon kartuşuna takılıyken.
- Kartuşu ters çevirin ve ardından fişi kartuş tabanından söküp çıkarın.
- Filtrasyon kartuşunu temiz bir şişeye yerleştirin ve santrifüje geri dönün. Oda sıcaklığında 500 x g'da 3 dakika döndürün. Akış çözücüsünü alt şişeden atın.
NOT: Üst filtrasyon kartuşunda herhangi bir çözücü kalırsa, santrifüje geri dönün ve ek bir sıkma işlemi gerçekleştirin. - Filtrasyon kartuşuna 400 μL aseton ekleyerek protein peletini yıkayın (CMW çökeltmesi için, adım 5.1.3, 400 μL metanol ekleyin).
- Oda sıcaklığında 500 x g'da 3 dakika boyunca veya üst kartuşta çözücü kalmayana kadar santrifüj yapın.
- Yağış peletini adım 6'da açıklandığı gibi yeniden çözündürün.
6. Protein peletinin çözündürülmesi
- Aşağıda açıklanan çözünürlük protokollerinden hemen önce 2-5 μL izopropanolü doğrudan membrana dağıtarak filtrasyon kartuşunun tabanındaki membranı ıslatın.
- Aşağıdaki çözümleme yöntemlerinden birini izleyin.
- (Seçenek 1) Filtreleme kartuşuna %≥2 SDS içeren en az 20 μL sulu tampon ekleyin. Cap ve vorteksi kuvvetlice (~1 dk.) Alternatif olarak, protein peletini dağıtmak için >10 dakika) sonikat yapın.
- Numuneyi 95 °C'de 5 dakika ısıtın). Isıtmadan sonra karıştırma adımını tekrarlayın.
NOT: Laemmli jel yükleme tamponu, protein peletini yeniden çözündürebilir. Bununla birlikte, SDS içeren örnekler tripsin sindirimi ve ters fazlı LC ve MS ile uyumlu değildir.
- Numuneyi 95 °C'de 5 dakika ısıtın). Isıtmadan sonra karıştırma adımını tekrarlayın.
- (Seçenek 2) Suda% 80 (v / v) formik asit çözeltisi hazırlayın. Asit çözeltisini (-20 ° C) ve çökeltilmiş protein içeren filtrasyon kartuşunu önceden soğutun.
- Kartuşa 50 μL soğuk formik asit dağıtın; 30 s için kapak ve vorteks. 10 dakika boyunca dondurucuya (-20 °C) geri dönün.
- Kartuşu 30 saniye boyunca tekrar vorteksleyin. Ardından, soğutma ve karıştırma döngüsünü bir kez daha tekrarlayın (10 dakika, -20 °C, 30 s girdap).
- Son 500 μL'ye su ekleyerek formik asidi% 8'e seyreltin.
NOT: Soğuk formik asit protokolü sonraki tripsin sindirimi ile uyumlu değildir, ancak LC-MS ile uyumludur.
- (Seçenek 3) Filtrasyon kartuşuna suda 50 μL taze hazırlanmış 8 M üre ekleyin. 30 dakika boyunca sonikate.
- Kartuşun tezgah üstünde 1 saat boyunca (gece boyunca inkübe edilmesine izin verin).
- 8 M üreyi su veya uygun tamponla en az 5 kat seyreltin.
NOT: Seyreltildikten sonra, üre çözünürlük protokolü, sonraki tripsin sindirimi ve LC-MS ile uyumludur.
- (Seçenek 1) Filtreleme kartuşuna %≥2 SDS içeren en az 20 μL sulu tampon ekleyin. Cap ve vorteksi kuvvetlice (~1 dk.) Alternatif olarak, protein peletini dağıtmak için >10 dakika) sonikat yapın.
7. Protein sindirimi
- Aşağıdan yukarıya MS analizi için, aşağıda belirtilen iki yöntemden birini kullanarak yeniden çözünür proteinleri enzimatik sindirime tabi tutun.
- (Seçenek 1) Formik asit çözünürlüğü için, adım 6.2.2.1'de %80 formik asidin başlangıç hacmini 25 μL'ye düşürün. Adım 6.2.2.3'te, formik asidi% 5'e (v / v) seyreltmek için 375 μL su kullanın.
- Pepsini kartuşa yaklaşık 50:1 protein-enzim oranında dağıtın. Filtrasyon kartuşuna takılı bir fişle, numuneyi gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- (Seçenek 2) Ürede çözündürme için, adım 6.2.3.2'de 100 mM Tris veya amonyum bikarbonat dahil edilerek 8 ila 8.3 arasında bir pH sağlayın.
- Yaklaşık 50: 1'lik bir protein-enzim kütle oranında tripsin ekleyin. Karbuğa takılı bir fiş ile, numuneyi gece boyunca 37 ° C'de ılık su banyosunda inkübe edin.
- Çözeltiyi% 10 TFA ile sonuncu% 1'e asitleştirerek sindirimi sonlandırın.
- Pepsin veya tripsin sindirilmiş proteini, fişi filtrenin tabanından çıkararak ve temiz bir şişede (2 dakika, 5000 x g, oda sıcaklığı) bulunan kartuşu santrifüj ederek geri kazanın.
8. SPE temizliği
NOT: Çürütme veya çözücü değişimini takiben ilave numune tuzdan arındırma işlemi için, numune açıklandığı gibi ters fazlı temizlemeye tabi tutulabilir.
- Bir SPE kartuşunu (bakınız Malzeme Tablosu) 300 μL metanol (2 dk, 400 x g) ve ardından 300 μL %5 asetonitril/%0,1 TFA (2 dk, 400 x g) geçirerek astarlayın.
- Astarlanmış SPE kartuşunu, yeniden çözünür veya sindirilmiş protein içeren filtreleme kartuşunun tabanına bağlayın.
- Proteini SPE kartuşundan döndürün (oda sıcaklığında 5 dakika, 800 x g). Çözücü üst kartuşta kalırsa, kartuşu santrifüje geri koyun ve sıkma işlemini tekrarlayın.
NOT: Numunenin SPE kartuşundan ikinci kez geçirilmesi kurtarmayı iyileştirebilir. - Karbuğa 300 μL %5 asetonitril/%0,1 TFA su ekleyin. Yıkamak için SPE kartuşundan geçirin (2 dk, 2000 x g). Akış akışını atın.
- LMW proteinleri veya sindirilmiş peptitler için, numuneyi 300 μL% 50 asetonitril / % 0.1 TFA (5 dakika, 2500 x g) akıtarak süzün.
- Bozulmamış proteinler için, 300 μL% 75 asetonitril / % 0.1 TFA kullanarak ek bir elüsyon adımı ile adım 8.5'i izleyin. Elde edilen iki özü birleştirin.
NOT: Adım 8.6 isteğe bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4 , proteinlerin aseton kullanılarak tek kullanımlık bir filtre kartuşunda şişe bazlı veya kartuş tarafından kolaylaştırılmış çökeltilmesini takiben beklenen SDS tükenmesini özetlemektedir. Aseton cinsinden geleneksel gece inkübasyonu (-20 ° C), oda sıcaklığında (adım 2) hızlı aseton çökeltme protokolü ve CMW çökeltmesi (adım 4) ile karşılaştırılır. Kalıntı SDS, metilen mavisi aktif maddeler (MBAS) testi29 ile ölçülmüştür. Kısaca, 100 μL numune 100 μL MBAS reaktif (250 mg metilen mavisi, 50 g sodyum sülfat, 10 mL sülfürik asit, suda 1.0 L'ye seyreltilmiş) ile birleştirildi, ardından 400 μL kloroform eklenmesi ve bir UV / Vis spektrofotometresinde 651 nm'de organik tabakanın absorbans ölçümü yapıldı. Tüm yaklaşımlar, optimal MS analizine izin vermek için SDS'yi azaltır.
Kantitatif ve tekrarlanabilir protein geri kazanımı, işlenmiş bir maya toplam hücre lizatının SDS PAGE analizi ile Şekil 5'te görüldüğü gibi, hızlı aseton çökeltmesi ve CMW çökelmesini takiben elde edilir. Tek kullanımlık bir filtreleme kartuşundaki çöküntü, SDS içeren süpernatantın dikkatlice pipetlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırırken, agrega proteinleri bir membran filtresinin üzerinde tutar. Tüm çökeltme protokolleri ile tutarlı bir iyileşme elde edilir, üç bağımsız replikasyonda süpernatant fraksiyonlarda görünür bant tespit edilmez.
Şekil 6, soğuk formik asit kullanılarak çökeltilmiş protein peletlerinin çözündürülmesi de dahil olmak üzere beklenen verimleri ölçer (adım 6). CMW çökeltmesi, peleti kartuş kullanılarak elde edilene eşit olan şişe bazlı bir yaklaşımda (adım 5) dikkatli bir şekilde koruyarak kantitatif geri kazanım sağlar (sırasıyla 100 ±% 4'e karşı 101 ±% 3). Aseton çökeltilmiş protein peletlerinin geri kazanımı, bir filtrasyon kartuşundan yararlanır ve verimde% 15-20'lik bir iyileşme gözlenir. Şişelerde, aseton süpernatantının agrega proteininden izolasyonu, esas olarak peletin PP tüp yüzeyine yapışmasına dayanır; filtreleme kartuşu bu endişeyi ortadan kaldırır, çünkü filtre pipetleme olmadan çökelmiş proteinin yüksek geri kazanımını sağlar.
LMW proteinlerini ve peptitlerini verimli bir şekilde geri kazanmak için, aseton çökeltme protokolü, ZnSO4 yerine NaCl ikame edilerek ve çözücü yüzdesini% 97'ye yükselterek değiştirilir. LMW proteinlerinin ve peptitlerin yüksek geri kazanımı için bu spesifik tuz ve daha yüksek organik çözücü seviyelerinin birleştirilmesigereklidir 26. Şekil 7'de görüldüğü gibi, kartuş bazlı protein çökelmesi, pepsin sindirilmiş sığır plazması örneğinin şişe bazlı çökelmeye göre üstün geri kazanımını göstermektedir. Tek kullanımlık spin kartuşu, LMW peptitlerinin% 90'ından fazlasını geri kazanabilir. NaCl kullanılırken kartuşta verimdeki daha önemli farklılıklar not edilir ve bu da verimi en üst düzeye çıkarmak için tuz tipinin önemini doğrular. NaCl'nin aksine ZnSO4'ün dahil edilmesi, spin kartuş filtresi tarafından daha kolay yakalanan toplanmış bir protein peleti ile sonuçlanır.
Çökelen proteinlerin geniş bir dinamik aralıktaki etkinliğini değerlendirmek için, üç standart proteinin bir karışımı işlendi: E. coli'den β-galaktosidaz (β-gal), sığırdan sitokrom c (Cyt c) ve S. cerevisiae'den enolaz (Eno). β-gal:Cyt c:Eno'nun kütle oranı 10.000:10:1 idi. Numuneler başlangıçta kartuş bazlı çökeltmeden önce SDS'nin% 2'sini içeriyordu (adım 5) ve tripsin ile yeniden çözündürüldü ve sindirildi (adım 6 ve 7). Şişelerde hazırlanan numuneler, SDS'ye sahip olmayan ve yağışı atlayan bir kontrol görevi gördü. Tüm örnekler eşdeğer SPE temizliğine tabi tutuldu (adım 8). Aşağıdan yukarıya MS yürütüldü, MS / MS spektrumları, ilgili üç türün tüm proteinlerini içeren birleşik bir veritabanına karşı arandı (enstrüman ve yazılım platformları için Malzeme Tablosuna bakınız). % 1'lik bir peptid yanlış keşif oranı kullanıldı. Her üç protein de MS tarafından sırasıyla β-gal, Cyt c ve Eno için 666, 28 ve 35 benzersiz peptit ile tanımlanmıştır. Şekil 8 , her numuneden elde edilen bağıl oranı (peptid tepe yoğunluğu) ölçer ve 1'in üzerindeki bir oran, tek kullanımlık filtre kartuşlarında işlenen numuneler için daha yüksek bir peptid bolluğunu yansıtır. Sonuçlar, SDS'yi proteomik bir iş akışına dahil etmenin, protein kaybını en aza indirmenin (örneğin, potansiyel adsorpsiyondan numune şişesine) ve peptid verimini en üst düzeye çıkarmanın faydalarını göstermektedir.
Sığır karaciğeri yerel bir marketten temin edildi. Proteinler, dokunun% 1'lik bir SDS çözeltisi ile çıkarılmasıyla izole edildi. Daha sonra, geri kazanılan proteom çökeltildi, yeniden çözündürüldü (üre) ve tripsin ile sindirildi, hepsi tek kullanımlık bir kartuş içinde. Aşağıdan yukarıya LC-MS / MS gerçekleştirildi ve ortalama ~ 8.000 proteinin (~ 30.000 peptid) tanımlanmasıyla sonuçlandı. Sığır veri tabanında peptit spektrumları ve protein grupları için %0.5 ve %1.0 yanlış keşif oranları kullanılmıştır. Bu kartuş tabanlı iş akışının teknik olarak yeniden üretilebilirliği, çakışan protein tanımlamalarıyla değerlendirilir. Ortak bir sindirilmiş numunenin çoğaltılmış MS enjeksiyonları, tanımlanan proteinlerle ortalama 78 ±% 0.5 örtüşme elde eder. Buna karşılık, ayrı kartuşlarda bağımsız olarak hazırlanan numuneler 76 ± %0,5 örtüşme elde etti. Bu veriler, numune hazırlamanın analizin toplam değişkenliğine katkısının, LC-MS enstrümantal yaklaşımının katkıda bulunduğuna kıyasla küçük olduğunu göstermektedir. Üç teknik replikasyondan (üç tek kullanımlık kartuşta bağımsız olarak işlenmiş) tanımlanan sığır proteinleri, Şekil 9'da gösterilen moleküler ağırlıkları, hidrofobiklikleri ve izoelektrik noktaları ile ilgili olarak daha da karakterize edilmiştir. İki yönlü bir ANOVA, teknik replikalar boyunca tanımlanan proteomlardaki istatistiksel farklılıkları belirleyemedi. Son olarak, Şekil 10 , üç replikasyon numune preparatı boyunca protein başına tanımlanmış peptitlerin sayısını karşılaştırmaktadır. Bu grafiklerdeki korelasyon katsayıları (0.94-0.95), aşağıdan yukarıya MS analizi için numune hazırlama yaklaşımının yüksek tutarlılığını göstermektedir.
Şekil 1: Aseton çökeltilmiş proteinler. 100 mM NaCl ile birleştirilen ve %80 aseton (A) ile çökeltilmiş 100 ve 1.000 μg protein içeren numuneler, 5 dakikalık yağış süresini takiben ve (B) yağış ve müteakip santrifüjlemeyi takiben. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kloroform/metanol/su ile protein çökeltisi. Adım 4'e göre çökeltilmiş 50 μg protein içeren bir numune. (A) Adım 4.4'ün hemen ardından. (B) Adım 4.8'in hemen ardından. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Protein çökeltmesi için tek kullanımlık iki aşamalı filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunun fotoğrafları. 100 μg protein içeren bir numune, (A) monte edilmiş filtrasyon ve SPE kartuşunda 100 mM NaCl ve% 80 aseton ile birleştirildi ve (B) protein agregaları görünür hale gelene kadar 5 dakika boyunca çökeltildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Protein çökelmesini takiben SDS tükenme verimliliği. Çıkarılan SDS yüzdesi, geleneksel protokolle (gece boyunca -20 ° C'de), hızlı protokolle (oda sıcaklığında 2 dakikalık inkübasyon) veya bir S. cerevisiae lizatının kloroform / metanol / su (CMW) çökelmesinden hem geleneksel (şişe) hem de kartuş formatında aseton çökeltmesinden gösterilir. Bu örnekler başlangıçta% 0.5 SDS (5.000 ppm) içeriyordu ve optimal MS analizi için% >99.8 SDS çıkarılması gerektiği sonucuna vardı. Artık SDS, metilen mavisi aktif maddeler (MBAS) testi ile ölçülür. Hata çubukları, teknik çoğaltmalardan standart sapmayı temsil eder (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yağış yoluyla toplam proteom geri kazanımı. SDS PAGE, (A) konvansiyonel aseton çökeltmesi, (B) kloroform / metanol / su çökeltmesi ve (C) hızlı aseton çökeltmesi ile çökelen S. cerevisiae toplam protein lizatının geri kazanımını gösterir. Protein bantları sadece pelet fraksiyonunda gözlenir, süpernatantta (Super.) görünür bantlar yoktur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bir filtrasyon kartuşu içinde üstün protein geri kazanımı. S. cerevisiae total protein lizatının çökelmesi için, tek kullanımlık spin kartuşu aseton ve CMW çökeltisi ile kantitatif geri kazanımı kolaylaştırır. Şişe bazlı çökelti ile yüksek geri kazanım da mümkündür, ancak dikkatli numune manipülasyonu ve pipetleme gereklidir. Peletin soğuk formik asit ile çözündürülmesini takiben LC-UV tarafından değerlendirilmiş protein geri kazanımı burada gösterilmiştir. Hata çubukları, teknik çoğaltmalardan standart sapmayı temsil eder (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Düşük moleküler ağırlıklı peptitler için yüksek yağış verimi. Peptitler ve proteinler için modifiye edilmiş bir aseton çökeltme protokolü ≤5 kDa, en yüksek verimi elde etmek için 100 mM ZnSO4'ün % 97 aseton ile birleştirilmesini içerir. Tek kullanımlık bir filtreleme kartuşu tarafından kolaylaştırılan yağış, her üç yağış koşulunda da geleneksel flakon bazlı yağışlara kıyasla daha iyi bir iyileşme gösterir. Hata çubukları, teknik çoğaltmalardan standart sapmayı temsil eder (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: SDS tabanlı iş akışında standart proteinlerin daha yüksek geri kazanımı. Tukey Box-and-Whisker, bir kontrol numunesine göre tek kullanımlık bir filtreleme kartuşunda işlenen SDS içeren proteinlerden geri kazanılan peptitler için göreceli MS sinyal yoğunluğunun30'unu çizer (SDS yok, yağış yok). Kullanılan proteinler geniş konsantrasyonlu dinamik bir aralık β-galaktosidaz: sitokrom c: enolaz = 10.000: 10: 1'i kapsar. Kutulardaki her çeyrek dağılımın %25'ini içerirken, hata çubukları dağılımın %95'ini kapsar. Ortalama "+" ile ve medyan yatay bir çizgi ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Teknik replikalardan tanımlanmış protein dağılımları. Tukey Box-and-Whisker plots, (A) moleküler ağırlığı, (B) hidrofobikliği ve (C) iki aşamalı bir filtreleme ve ekstraksiyon kartuşunda bir sığır karaciğer lizatının üçlü preparatlarını takiben aşağıdan yukarıya LC-MS / MS tarafından tanımlanan proteinlerin izoelektrik noktasını karakterize eder. Bu özelliklerde iki yönlü ANOVA ile istatistiksel olarak fark saptanmadı (p < 0.05). Kutulardaki her çeyrek dağılımın %25'ini içerirken, hata çubukları dağılımın %95'ini kapsar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Protein başına peptid kimliklerinin, hazırlayıcı replikalar arasında SDS tabanlı hazırlama iş akışı aracılığıyla korelasyonu. (A) numune 1 ve 2, (B) numune 2 ve 3 ve (C) numune 1 ve 3 arasında aşağıdan yukarıya proteom tekrarlanabilirliğinin analizi, protein başına peptid MS tanımlamalarının sayısına dayanmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimal MS karakterizasyonu, artık SDS 10 ppm'nin altında tükendiğinde elde edilir. FASP ve boncuk üzerinde sindirim gibi alternatif yaklaşımlar, değişken geri kazanım31,32,33 ile kantitatif SDS tükenmesi sunarken, yağışın birincil amacı saflığı ve verimi aynı anda en üst düzeye çıkarmaktır. Bu, protein peletini rahatsız etmeden süpernatantın (SDS içeren) etkili bir şekilde izole edilmesine bağlıdır. Şişe bazlı çökeltme ile, süpernatantın büyük kısmı pipetleme ile uzaklaştırıldığında, toplanan peletlerin bir kısmının yanlışlıkla kaybolması giderek daha olasıdır. Bu nedenle, artık çözücünün (~ 20 μL) daha önemli bir kısmını geride bırakmak ve bir yıkama adımı34 eklemek önemlidir. Yıkama adımı, artık çözücüyü şişeden seyreltir ve uzaklaştırır. Özellikle CMW ile, pelet oluştuktan sonra numune şişesini vortekse etmek gereksizdir. Peletin kuvvetli ajitasyon yoluyla bozulması, kazara pipetlemeden kaynaklanan kayıp olasılığını artırmanın istenmeyen etkisine sahiptir. Vorteks dahil edilirse (önceki protokoller tarafından önerildiği gibi)35, CMW peletinin bazı kısımlarının şişe kapağının alt tarafına yapışma potansiyeli vardır; Santrifüj edildikten sonra, pelet şişe kapağına sabit kalır ve ~% 50 kayba neden olabilir.
Hızlı çökeltme, seyreltik proteom numunelerinin yüksek geri kazanımıyla, ideal olarak 0.01-2 mg / mL arasında veya 1-200 μg arasında karşılık gelen bir protein kütlesi ile gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, 0.01 mg / mL'nin altından başlayan kantitatif ve tekrarlanabilir geri kazanımlar, 10 dakika ila 1 saat arasında değişen daha uzun yağış sürelerinden yararlanabilir ve bu da yağış iş akışının verim sınırlamalarını gösterir. Şaşırtıcı bir şekilde, daha konsantre numuneler (10 mg / mL), muhtemelen kazara pipetleme kayıplarından kaynaklanan verimde istatistiksel bir azalma göstermektedir. >10 μg protein olduğunu varsayarsak, şişenin yan tarafında görünür bir pelet gözlenmelidir (Şekil 1B). 1 μg'a kadar olan daha küçük miktarları görmek zordur. Bu, protein peletini bozmadan süpernatantı pipet etme kapasitesine meydan okur. Flakon, çözücüyü peletten ayırmak için asetonla (yavaşça) ters çevrilebilir. CMW için, pelet şişeye yeterince güvenilir bir şekilde yapışmaz, böylece süpernatanın boşaltılması yerine pipetlemeyi tercih eder. Şişe bazlı çökeltme için, amaçlanan numune ve çözücü hacimlerini kolaylaştırmak için mümkün olan en küçük mikrosantrifüj tüpü ile çalışılması önerilir. Bu çalışmada kullanılan tek kullanımlık filtrasyon kartuşundaki çökeltme, maksimum 500 μL'lik bir hacim kapasitesi sağlayarak 100 μL'ye kadar numune hacimlerinde% 80 aseton ile protein çökeltmesini sağlar.
Organik çözücü bazlı çökelmeden geri kazanılan protein peletinin saflığı, numune matrisinin, tampon bileşenlerinin ve çökeltme koşullarının karmaşıklığı ile sınırlıdır. Örneğin, glisin (SDS PAGE ayırmaları için kullanılır) gibi spesifik tampon bileşenlerinin% 80 aseton kullanarak protein ile birlikte çökeldiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, glisin CMW yağışı yoluyla çözünür kalır. Asetonun DNA fragmanlarını36,37 çökelttiği ve potansiyel olarak geri kazanılan pelete istenmeyen arka plan safsızlıkları eklediği bildirilmiştir. Düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin ve peptitlerin çökelmesi, verimi en üst düzeye çıkarmak için yüksek düzeyde organik çözücü ve spesifik bir tuz türü gerektirir. Birkaç tuz keşfedilmiş olsa da, ZnSO4 sürekli olarak yüksek ürünler sunmaktadır. Bu tuz, protein yokluğunda% 97 asetonda çökelecektir. Böylece, elde edilen protein peleti yüksek konsantrasyonda tuz içerir. Hacimce% 90 aseton kullanılmasının da yüksek peptit verimi elde edeceği belirtilmektedir, ancak iyileşmede istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş (~% 5) beklenmektedir. Bununla birlikte, bu, her 2 mL şişede daha önemli bir numune hacminin (180 μL'ye kadar, 20 μL 1 M ZnSO4 ile) işlenmesine izin verir. Protein peleti ile birlikte çökelen matris safsızlıklarının ötesinde, çözücü çökelmesinin doğal olarak numunenin denatürasyonuna neden olduğu belirtilmelidir38,39. Bu nedenle, bu protokol fonksiyonel proteinlerin preparatları veya doğal MS iş akışları için geçerli değildir. Asetonun ayrıca glisin kalıntıları40'ta kovalent protein modifikasyonlarına neden olduğu ve aldol yoğuşma asetonunun41'in bir yan ürünü olduğu tahmin edilen +98 u kütle kaymasına neden olduğu bildirilmiştir.
Protein çökeltmesi için bir filtreleme kartuşu kullanıldığında, protein peletinin izolasyonu, agregaların bir PTFE membran filtresinin üzerinde tutulmasına dayanır. Bu zarın gözenekliliği, moleküler ağırlıklı bir kesme filtresinin (FASP'de görüldüğü gibi) gözenekliliğini aşarak protein izolasyonuna daha kısa spin süreleri ile izin verir. Düşük spin hızlarında hızlı çözelti transferi, PTFE membranının uygun şekilde ıslatılmasına dayanır; organik çözücüler kolayca akar, ancak kuru bir PTFE filtresi sulu çözücüleri engeller. Filtrasyon kartuşu tıkanmış gibi görünüyorsa, membran filtreye doğrudan az miktarda organik çözücü (örneğin, izopropanol) uygulanarak yeniden ıslatılmalıdır. Protein peletinin boyutuna ve kullanılan numunenin hacmine bağlı olarak, tüm çözücülerin filtrasyon kartuşundan geçtiğinden emin olmak için daha yüksek hızlarda (3.000 x g'a kadar) ek santrifüjleme veya spinler gerekebilir.
Yağıştan optimum koşullarla protein geri kazanımı, pelet yeniden çözündürme zorluğu ile sınırlıdır ve az sayıda çözücü seçeneği çıkış yönündeki işleme ve LC-MS ile uyumludur. Ek olarak, düşük sıcaklıklara uzun süre maruz kalma ve sıkıca paketlenmiş bir peletin aşırı kurutulması gibi çeşitli yağış koşulları, yeniden çözündürme zorluklarına katkıda bulunur40. CMW protein peletlerinin genellikle aseton peletlerinden daha az çözünür olduğu belirtilmektedir. Çökeltilmiş proteinin% 80 soğuk formik asit (adım 6.2.2) ile maksimize edilmiş yeniden çözünürleştirme etkinliği daha önce bildirilmiştir42; soğuk sıcaklık, aksi takdirde konsantre formik asit43,44'te meydana gelen protein modifikasyonunu önler. Asit konsantrasyonunun seyreltilmesi de modifikasyon reaksiyonunu yavaşlatır. Formik asit, yukarıdan aşağıya MS yaklaşımları için veya pepsin ile enzimatik sindirimden önce önerilir. Bu çözücünün kullanılması çok az fiziksel işlem gerektirir; sadece 5 μL'nin eklenmesi (protein peletini örtmek için yeterli), vorteks, kısa sonikasyon veya tekrarlanan pipetleme ile birleştirildiğinde yeterli olabilir. Benzer şekilde, SDS PAGE tarafından analiz edilmesi amaçlanan numuneler için, SDS içeren Laemmli tamponunda yeniden çözünme, ısıtmadan önce numunenin mütevazı bir şekilde karıştırılmasıyla birleştirildiğinde oldukça etkilidir. Bununla birlikte, bu çözücülerin her ikisi de tripsin ile uyumlu değildir. Tripsin sindiriminden önce 8 M üre ile çözündürme önerilir ve ürenin taze olarak hazırlandığından emin olunur (aynı gün). Kaotropik çözücü ve pelet arasındaki teması en üst düzeye çıkarmak ve ayrıca sonikasyon sırasında çözünmeye yardımcı olmak, pipetleme ve / veya vortekslemeyi tekrarlamak için filtrasyon kartuşu içindeki protein yeniden çözündürme için minimum 50 μL tampon hacmi önerilir. Alternatif yaklaşımlar, proteini yeniden çözündürmek için tripsinden yararlanır, yani enzim ilavesinden önce proteinin tamamen yeniden çözünmesine gerek yoktur. Bununla birlikte, bu yaklaşım sindirimi önyargılı hale getirebilir, daha çözünür türleri tercih ederken, hidrofobik proteinler daha kısa sindirim süresiyaşar 45. Tris veya amonyum bikarbonat gibi bazik tamponlarla birlikte 8 M üre ilavesi, sindirim sonrası numune temizleme adımı gerektirir. Bu tür numune katkı maddeleri için, ters fazlı kolon temizliği idealdir. Bu çalışmada kullanılan tek kullanımlık filtrasyon kartuşu, değiştirilebilir ters fazlı SPE kartuşu ile desteklenmiştir. Bu kartuş, formik asit çözünürlük protokolü söz konusu olduğunda çözücü değişimi için de idealdir. Herhangi bir katı faz ekstraksiyon yaklaşımının numune geri kazanımındaki doğal kayıpla ilişkili olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, kullanıcı geri kazanımın faydalarını ve deneyleri için ek saflaştırmayı tartmalıdır.
Bu protokollerin, proteomik araştırmacıların proteom ekstraksiyonu için SDS'den yararlanarak deterjan bazlı iş akışlarını kolaylaştırmalarını sağlayacağı tahmin edilmektedir. Tam proteomun tutarlı bir şekilde iyileşmesini kolaylaştıran hazırlık stratejileri kritik öneme sahiptir. İki aşamalı sıkma kartuşu, hızlı, sağlam ve tekrarlanabilir proteom numune izolasyonu fırsatını basitleştirir. Böyle bir yaklaşım, klinik ortamlar veya büyük ölçekli araştırma girişimleri gibi numune verimlerinden ödün vermeden titiz analiz gerektiren uygulamalar için uygun olacaktır46. Bu yaklaşımların gelecekteki uygulamaları arasında biyobelirteç keşfi, tespiti, doğru kantitasyon ve ilaç ve ilaç hedefi keşfi yer alabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Doucette laboratuvarı, bu çalışmada kullanılan ProTrap XG'yi tasarladı ve patentini aldı. AAD ayrıca numune hazırlama kartuşunu ticarileştiren Proteoform Scientific'in kurucu ortağıdır.
Acknowledgments
Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, MS verilerinin elde edilmesine katkılarından dolayı Hasta Çocuklar Hastanesi'ndeki (Toronto, Kanada) Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) ve SPARC BioCentre'a (Moleküler Analiz) teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
References
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
- Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
- Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
- Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
- Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
- Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
- Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
- Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
- Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
- Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
- Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
- Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
- Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
- Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
- Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
- Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
- Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
- Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
- Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
- Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
- Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
- Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
- Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
- Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
- Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
- Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
- Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
- Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
- Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
- Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
- Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
- Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
- Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).
