Denne protokollen beskriver løsningsmiddelbasert proteinutfelling under kontrollerte forhold for robust og rask gjenvinning og rensing av proteomprøver før massespektrometri.
Mens flere fremskritt innen massespektrometri (MS) instrumenter har forbedret kvalitativ og kvantitativ proteomanalyse, er mer pålitelige front-end tilnærminger for å isolere, berike og behandle proteiner foran MS avgjørende for vellykket proteomkarakterisering. Lav, inkonsekvent proteingjenvinning og gjenværende urenheter som overflateaktive stoffer er skadelig for MS-analyse. Proteinutfelling anses ofte som upålitelig, tidkrevende og teknisk utfordrende å utføre sammenlignet med andre prøveprepareringsstrategier. Disse bekymringene overvinnes ved å bruke optimale proteinutfellingsprotokoller. For acetonutfelling er kombinasjonen av spesifikke salter, temperaturkontroll, løsningsmiddelsammensetning og utfellingstid kritisk, mens effektiviteten av kloroform / metanol / vannutfelling avhenger av riktig pipettering og manipulering av hetteglass. Alternativt er disse nedbørsprotokollene strømlinjeformet og halvautomatisert i en engangsspinnpatron. De forventede resultatene av løsningsmiddelbasert proteinutfelling i konvensjonelt format og bruk av en engangs, to-trinns filtrerings- og ekstraksjonspatron er illustrert i dette arbeidet. Dette inkluderer detaljert karakterisering av proteomiske blandinger ved bottom-up LC-MS / MS-analyse. Den overlegne ytelsen til SDS-baserte arbeidsflyter er også demonstrert i forhold til ikke-forurenset protein.
Proteomanalyse ved massespektrometri har blitt stadig strengere på grunn av den forbedrede følsomheten, oppløsningen, skannehastigheten og allsidigheten til moderne MS-instrumenter. MS-fremskritt bidrar til større proteinidentifikasjonseffektivitet og mer presis kvantifisering 1,2,3,4,5. Med forbedret MS-instrumentering krever forskere en tilsvarende konsistent front-end prøveprepareringsstrategi som er i stand til kvantitativ utvinning av proteiner med høy renhet på minimal tid på tvers av alle stadier av arbeidsflyten 6,7,8,9,10,11 . For å nøyaktig gjenspeile proteomstatusen til et biologisk system, må proteiner isoleres fra den opprinnelige prøvematrisen på en effektiv og objektiv måte. For dette formål, inkludert et denaturerende overflateaktivt middel, slik som natriumdodecylsulfat (SDS), sikrer effektiv proteinekstraksjon og oppløsning12. SDS forstyrrer imidlertid sterkt elektrosprayionisering, noe som forårsaker alvorlig MS-signalundertrykkelse hvis den ikke elimineres riktig13.
Ulike SDS-uttømmingsstrategier er tilgjengelige for påfølgende proteomanalyse, for eksempel oppbevaring av proteiner over et molekylvekt cutoff filter inneholdt i engangsspinnpatroner 14,15,16. Den filterstøttede prøveprepareringsmetoden (FASP) favoriseres da den effektivt tømmer SDS under 10 ppm, noe som letter optimal MS. Imidlertid er proteinutvinning med FASP variabel, noe som førte til utforskning av andre teknikker. Kromatografiske tilnærminger som selektivt fanger protein (eller overflateaktivt middel) har utviklet seg til forskjellige praktiske patroner eller perlebaserte formater 17,18,19,20,21. Gitt disse enkle og (ideelt) konsistente strategiene for proteinrensing, blir den klassiske tilnærmingen til proteinutfelling med organiske løsningsmidler ofte oversett som en lovende tilnærming til proteinisolasjon. Mens løsningsmiddelutfelling er vist å tømme SDS under kritiske nivåer med hell, har proteinutvinning vært en langvarig bekymring for denne tilnærmingen. Flere grupper har observert en proteinutvinningsskjevhet, med uakseptabelt lave nedbørsutbytter som en funksjon av proteinkonsentrasjon, molekylvekt og hydrofobisitet22,23. På grunn av mangfoldet av nedbørsprotokoller rapportert i litteraturen, ble standardiserte nedbørsforhold utviklet. I 2013 rapporterte Crowell og medarbeidere først avhengigheten av ionstyrke på nedbørseffektiviteten til proteiner i 80% aceton24. For alle undersøkte proteiner ble tilsetningen av opptil 30 mM natriumklorid vist å være avgjørende for å maksimere utbyttet (opptil 100% utvinning). Mer nylig viste Nickerson og medarbeidere at kombinasjonen av enda høyere ionstyrke (opptil 100 mM) med forhøyet temperatur (20 °C) under acetonutfelling ga nær kvantitativ utvinning i 2-5 min25. En liten nedgang i utvinningen av proteiner med lav molekylvekt (LMW) ble observert. Derfor viste en påfølgende rapport fra Baghalabadi og medarbeidere vellykket gjenvinning av LMW-proteiner og peptider (≤5 kDa) ved å kombinere spesifikke salter, spesielt sinksulfat, med et høyere nivå av organisk løsningsmiddel (97% aceton)26.
Mens raffinering av nedbørsprotokollen gir en mer pålitelig proteinrensingsstrategi for MS-basert proteomikk, er suksessen til konvensjonell nedbør avhengig av brukerteknikk. Et hovedmål med dette arbeidet er å presentere en robust nedbørsstrategi som letter isoleringen av proteinpelleten fra den forurensende supernatanten. En engangsfiltreringspatron ble utviklet for å eliminere pipettering ved å isolere aggregert protein over et porøstPTFE-membranfilter 27. MS-forstyrrende komponenter i supernatanten fjernes effektivt i et kort sentrifugeringstrinn med lav hastighet. Engangsfilterpatronen tilbyr også en utskiftbar SPE-patron, som muliggjør påfølgende prøveopprydding etter resolubilisering og valgfri proteinfordøyelse, i forkant av massespektrometri.
En rekke anbefalte arbeidsflyter for proteomutfelling presenteres her, inkludert modifiserte aceton- og kloroform/metanol/vann28-protokoller , i et konvensjonelt (hetteglassbasert) og et halvautomatisk format i en engangs to-tilstandsfiltrerings- og ekstraksjonspatron. De resulterende proteingjenvinningene og SDS-uttømmingseffektivitetene fremheves, sammen med bottom-up LC-MS / MS proteomdekning, for å demonstrere det forventede resultatet fra hver protokoll. De praktiske fordelene og ulempene forbundet med hver tilnærming diskuteres.
Optimal MS-karakterisering oppnås når gjenværende SDS tømmes under 10 ppm. Mens alternative tilnærminger, som FASP og fordøyelse på perler, tilbyr kvantitativ SDS-uttømming med variabel utvinning 31,32,33, er hovedmålet med nedbør å maksimere renhet og utbytte samtidig. Dette avhenger av å effektivt isolere supernatanten (som inneholder SDS) uten å forstyrre proteinpelleten. Med hetteglassbasert nedbør, når hovedd…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Forfatterne takker Bioinformatics Solutions (Waterloo, Canada) og SPARC BioCentre (Molecular Analysis) ved Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) for deres bidrag til oppkjøpet av MS-data.
Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |