Summary
我々は、(i)光子吸収後の光色素分子内の電荷変位と光受容体におけるそれらの膨大な量を利用すること、および(ii)ロドプシンおよびメタロドプシン光顔料状態の吸収スペクトルの違いを利用すること、の電気生理学的に双安定光顔料を特徴付けるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、双安定な光色素系に影響を及ぼす変異をスクリーニングするのに有用である。
Abstract
ショウジョウバエGタンパク質結合光色素ロドプシン(登録商標)は、タンパク質(オプシン)と発色団で構成されています。ロドプシンの活性化プロセスは、発色団の光子吸収誘導異性化によって開始され、オプシンの立体構造変化を促進し、第2の暗安定な光色素状態(メタロドプシン、M)をもたらす。ランダム変異誘発を用いたこの双安定光色素の調査には、変異ハエをスクリーニングするための簡単で堅牢な方法が必要である。したがって、機能性光顔料レベルの低下を測定するためのいくつかの方法が設計されている。そのような方法の1つは、光子吸収後の光顔料内の電荷変位および感光体に発現する膨大な量の光顔料分子を利用する。初期受容体電位(または初期受容体電流)と名付けられたこの電気信号は、様々な電気生理学的方法(例えば、網膜電図および全細胞記録)によって測定され、機能的光色素レベルに直線的に比例する。この方法の利点は、高い信号対雑音比、光顔料レベルの直接線形測定、およびロドプシンまたはメタロドプシン活性化の下流の光形質導入機構の独立性である。長期脱分極後電位(PDA)と呼ばれる追加の電気生理学的方法は、ショウジョウバエ光色素の二重安定性およびハエRおよびM色素状態の吸収スペクトルの違いを利用する。PDAは強い青色光によって誘導され、飽和量のロドプシンをメタロドプシンに変換し、暗闇の中で長時間にわたって光応答終端が失敗するが、強いオレンジ色の光を用いたメタロドプシンからロドプシンへの変換によって終了させることができる。PDAは大量の光色素変換を必要とする堅牢なシグナルであるため、光色素の生合成における小さな欠陥であっても、容易に検出可能な異常なPDAにつながる。実際、欠陥のあるPDA変異体は、光導入に重要な新規シグナル伝達タンパク質の同定につながった。
Introduction
Gタンパク質共役型受容体(GPCR)である光活性化ロドプシン(R)は、7膜貫通タンパク質(オプシン)と発色団で構成されています。ショウジョウバエのメラノガスター(ショウジョウバエ)では、光子吸収は11-cis-3-OH-網膜発色団のオールトランス-3-OH-網膜1への異性化を誘導し、ロドプシンのメタロドプシンへの立体構造変化を促進する(M、図1A)。脊椎動物のロドプシンとは異なり、無脊椎動物の発色団の優勢な画分はオプシンから解離せず、生理活性な暗安定色素状態Mをもたらす。次に、全トランス-3-OH-網膜発色団による追加の光子吸収は、発色団2,3の異性化を誘導し、11-シス-3-OH-網膜発色団を有するR色素状態を生成する。R状態は、暗く、安定で、生理学的に非活性な光色素である。脊椎動物の光色素と同様に、発色団4の極めて速い光子再生経路に加えて、発色団再生のための代替酵素的遅経路が無脊椎動物に存在し、その中で、いくつかの段階が視受容体細胞5,6を取り囲む網膜細胞において行われる。
ショウジョウバエは、無脊椎動物の光受容体を研究するためのモデル生物として大きな利点を伴う。特に、調製物のアクセシビリティと分子遺伝学を適用する能力は、ショウジョウバエを強力なモデルシステム7にしました。したがって、一般的な光形質導入および光色素レベルを研究するためのいくつかのインビボおよびエキソビボ実験方法、特に、確立されている。最も単純なインビボ法は、ショウジョウバエの眼の光に対する比較的大きな細胞外記録電圧応答を利用する。したがって、光刺激は、脊椎動物の眼の光に対するERG応答よりも〜3桁大きい細胞外網膜電図(ERG)記録を用いて測定することができる眼全体における電気電圧応答を呼び起こす8、9。ショウジョウバエのERG応答は頑健で容易に得られるため、変異による光応答の異常を特定するのに便利な方法である。光に対するERG応答は、主に光受容体、色素(グリア)細胞、および薄層の二次ニューロンから生じる(図1B参照)。ERGの主な構成要素は、(i)光受容体の細胞外電圧応答、(ii)薄層ニューロンから生じる光刺激の開始時および終了時の「オン」および「オフ」一過性(図2A、インセット、ON、OFF)、(iii)グリア細胞の遅い応答(図2A、差し込み図、矢印)、および(iv)短時間および一過性応答、 過渡10のONに先行する光顔料活性化中の電荷変位から生じる(図2C[挿入図]、D、E)。この短い応答は、2つの相(M1およびM2、図2C[差し込み図])で構成され、数百万の光色素分子を同時に活性化する非常に強い光刺激によってのみ誘導することができる。青色刺激下では観察されない(図2D、青色トレース)し、光色素レベルが高度に低下した変異体(図2E、赤色トレース)では観察されないが、PLC活性を消失させる変異体(図2E、オレンジ痕跡)では、その振幅が軽度に増強される。M1相は、光受容体におけるMの活性化から生じるハエの典型的なERPである。正の極性(細胞内)を有するM1期は、通常の方法で神経伝達物質を符号反転シナプスで放出し、薄層ニューロンを活性化し、シナプス的に増幅されたM2相を生成することによって光受容体の脱分極に応答する。したがって、M1およびM2相の両方がM活性化10、11を反映する。
感光体の脱分極は、光受容体軸索と薄層10,11の単極性ニューロンとの間の符号反転シナプスから生じる角膜正の「オン」一過性を生成する(図1B)。ERGの緩慢な上昇および崩壊は、主に一過性受容器電位(TRP)およびTRP様(TRPL)チャネル13、14、15を介した視細胞12からのK+流出に起因する色素細胞の脱分極(図2A、差し込み図、矢印)から生じる。これらの遅い動力学成分は、光に対する感光体応答の細胞内または全細胞記録と比較すると、感光体応答の波形を大きくマスクし、歪める9,10。さらに、非常に強い照明では、「オン」過渡に先行し、部分的に融合する追加の過渡応答が観察されることがあります(図2C [差し込み図],D,E)。この信号は、光顔料10の大規模な活性化から直接生じる。
中性濃度(ND)およびカラーフィルター、ならびに強力な照明フラッシュを使用するいくつかの光レジームプロトコルは、一般に、特に光形質導入カスケードを調査するために開発されている。これらのプロトコルはまた、光色素の特性を調査するためにも使用されている。
強度応答プロトコルは、光強度の増加に対する眼全体のERG電圧応答のピーク振幅を測定します(図2A、B)。このプロトコルは、光9に対する光受容体細胞の感度の変化を検出するのを助ける。
長期脱分極後電位(PDA)プロトコルは、ロドプシンとメタロドプシンの吸収スペクトルの違いを利用して、 ショウジョウバエにおいて、Rの生理活性で暗く安定な中間体M状態への大規模な光色素変換を可能にする2。ERG電圧応答では、飽和光の比較的短いパルスが与えられ、結果として生じる電圧応答が記録される。この条件下では、膨大な量のロドプシン分子の1パーセント(〜1 x 108)のほんの一部(〜1 x108)の活性化が天井に到達するのに十分であるため、脱分極信号によって天井(反転電位)に達する。光形質導入成分が非常に豊富に存在することは、光形質導入成分の濃度の大幅な低下または微妙な誤動作を伴う変異体においても、この天井に達することを確実にする。この状況は、これらの変異体の単離を排除する。Pakらは、視覚的変異体を単離するための信頼性が高く、明らかにする試験を求めてPDAスクリーニング7 を導入した。 ショウジョウバエ では、PDA応答は、光顔料変換を可能にする赤色スクリーニング色素を遺伝的に除去し、ロドプシンによって優先的に吸収される青色光の適用(図3A)によってもたらされ、したがって、RのM光顔料状態への大きな正味変換をもたらす。光形質導入終端は、RからMへの大きな正味変換によってフォト顔料のレベルで破壊され、その結果、光がオフになってからずっと持続的な励起が得られる(図2C、 図4A [上])。PDA期間中、光受容体はその後のテスト光に対する感度が低く、部分的に脱感作(不活性化)される。PDAは、ロドプシン生合成の軽微な欠陥も検出し、長期間にわたって興奮を維持する視細胞の最大能力を試験する。高濃度のロドプシンの存在に厳密に依存するので、光形質導入成分の不十分な補充について容易にスコアリングする。驚くべきことに、PDAスクリーンは多くの新しく非常に重要な視覚変異体を生み出した(Pak et al.7でレビュー)。したがって、Pakら7 によって単離されたPDA変異体は、 ショウジョウバエ の視覚系を分析するのに依然として非常に有用である。
PDAは青色光を飽和させることによって ショウジョウバエ に誘導され、光オフセットのずっと後に連続的な偏光解除をもたらす(図4A [上])。PDA誘導青色光を飽和させた後、周辺光受容体(R1-6)は、その最大容量で暗闇の中で連続的に活性のままであり、飽和に達する。PDA中の追加の飽和青色光は、R1-6細胞において何秒間も追加の応答を生じないが、PDAに重畳されたR7-8細胞において応答を誘導する。重ね合わせられた応答は、これらの細胞で発現される光色素(R7-8)16の異なる吸収スペクトルによって説明される。PDAは、飽和オレンジ色の光でMをRに戻す光変換によって抑制することができる(図4A [上])。PDAが視細胞を最大活性能力(強烈な白色光では達成できない状況)にもたらす能力は、 ショウジョウバエの視覚変異体をスクリーニングするための主要なツールであった理由を説明している。これは、正常な光色素レベルの生合成に関与するタンパク質の軽微な欠陥の検出も可能にするからである17、18。PDA欠損変異体の2つのグループが単離されている:不活性化も後電位(nina)変異体も、不活性化も後電位(ina) 変異体でもない。前者の表現型は、PDAの欠如および光色素レベルの大きな低下から生じる関連する不活性化である(図4A [中央])。後者の表現型は、正常なロドプシンレベルを有するがTRPチャネルと相互作用するタンパク質を欠いている変異体において、まだ未知のメカニズムのために、青色光後の不活性化を示すが暗い脱分極を示さない(図4A [下])。
PDAは、M活性19、20、21に結合して終了するアレスチン(ARR2)に対する光顔料の量の違いから生じる(図1A)。ショウジョウバエの感光体において、光色素の量はARR219の量よりも約5倍大きい。したがって、ARR2レベルは、RからMへの大きな正味光変換によって生成されたすべてのM分子を不活性化するには不十分であり、過剰のMを暗所で常に活性なままにする17、19、20、22、23。このメカニズムは、突然変異またはカロテノイド剥奪によるPDA応答の排除を説明し24,25、光色素レベルの低下を引き起こすが、アレスチンレベルには影響しない。さらに、この説明はまた、ヌルARR2(arr23)変異対立遺伝子21の表現型も説明しており、その中でPDAは、19、20、21の〜10倍調光青色光強度で達成することができた(図4B、C)。PDAはフライ感光体のユニークな特徴ではなく、R状態とは異なる吸収スペクトルを有する暗く安定なMを有するすべての試験種に現れ、R状態からM状態への光顔料の十分な光変換を可能にする。PDA現象学が発見された徹底的に調査された種はフジツボ(Balanus)光受容体であり、R状態の吸収スペクトルはM状態2よりも長い波長にある(図3B)。したがって、フライ内の状況とは異なり、フジツボでは、橙赤色光がPDAを誘導し、青色光がPDA2を抑制する。
早期受容体電位(ERP)プロトコルは、RまたはM活性化の間に生じる電荷変位を利用する。視覚色素は、脊椎動物および無脊椎動物膜3の両方のシグナル伝達区画の表面膜の不可欠な部分である。したがって、光顔料分子が1つの中間状態から次の中間状態に変化する活性化プロセスは、電荷変位4,26を伴う。光顔料分子が膜容量4と平行に電気的に整列するにつれて、急速な同期立体構造変化は表面膜の速い偏光変化を生じ、これは、ハエでは、ラブドミアと呼ばれる〜30,000〜50,000マイクロビリのスタックからなるシグナル伝達区画で起こる。この分極は、次いで、細胞膜が等しく分極されるまで、細胞体の膜容量を介して受動的に放電する。ERPは電荷変位の細胞外記録である。細胞内に記録されたERPは、細胞膜4、27、28の時定数によって組み込まれた細胞外ERPを顕在化させる。視覚的色素電荷変位によって活性化される電流は、全細胞電圧クランプ記録29,30(図5A-D)でも測定することができ、(初期の受容体電流(ERC)記録において)信号の動力学に対する膜容量の影響を最小限に抑えるという大きな利点がある。
プロトコルセクションは、ショウジョウバエ眼9からのERG測定およびショウジョウバエ単離オンマチジア31、32からの全細胞記録によるERC測定を行う方法を記載する。また、一般的な光形質導入、特に光色素を調査するために使用される特定のプロトコルについても説明します。
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Protocol
1. 網膜電図を用いた強度応答関係、長時間脱分極後電位(PDA)、初期受容体電位(ERP)の測定
- D.メラノガスター製剤に適した飼育条件
- D.メラノガスターハエを、24°Cの温度に維持されたインキュベーター内で、12時間の暗/光サイクルで食物を含む標準的な黄色のトウモロコシを含むボトルに入れて上げる
- 実験の少なくとも24時間前にハエのボトルを暗闇の中に保管してください。
- 一般的なセットアップ
- 1 mm x 0.58 mm (O.D x I.D) の繊維充填ホウケイ酸ガラスキャピラリーを引っ張って、記録ピペットを準備します(図6L、O)。ピペットの抵抗は5-10MΩでなければなりません。任意の適切なプーラーを使用することができる。
- 2本の銀線をAgCl2で被覆し、0.25mmの銀線をカスタムメイドの5V電源に接続された3M KCl溶液に挿入します。
- コーティングされた銀線を電極ホルダーに挿入します(図6N)。
- 細長い先端シリンジ(図6M)を使用して、ろ過されたリンゲル溶液(表1参照)でガラスキャピラリーを満たします。
- ワイヤ電極をガラスキャピラリーに挿入します。キャピラリー内の溶液が銀線と接触していることを確認します。
- 電極ホルダー(図7P、N)を2つの電極マイクロマニピュレータ(図7G)に挿入します。
- 電気記録のためにフライを準備する手順
メモ: フライを暗く適合した状態に保つには、次の手順では、薄暗い赤色の照明のみを使用してください。- フライスリーパーシステム(図6A、B)を使用してボトル内のハエをCO2ガスで麻酔し、スリーパー容器に注ぎます。
- 1つのフライを選択し、鋭いピンセットを使用して翼のそばに慎重に保持します。残りのハエをペトリ皿で覆う。
- フライホルダーのフライを適切な向きに置き、背中を手に向けて横向きにします(図6P)。
- はんだごての電源を入れます。電流を~2.25 Aに設定します。この電流は、0.25mmの白金イリジウムフィラメントを~55~56°Cに加熱するはずです( 補足ファイルを参照)。
- 溶融温度の低いワックス(~55~56°C)をはんだごての上に置きます(図6F)。
- ピンセットを使用してフライを翼から持ち上げ、はんだごてを使用して翼をフライホルダー(図6I)に固定します。
- はんだごてを使用して、フライの背中をワックスでスタンド面に接続します(図6P)。
- はんだごての先端を脚の接合点に下ろし、ワックスを溶かしてすべての脚を一緒に覆います(図6P)。
- 首の部分の頭と背中の間にワックスを少し滴置きます(図6P)。
メモ: フライヘッドが過熱しないように特に注意してください。フライが適切に固定され、実験中に移動できないことを確認します。小さな動きは、録音にアーティファクトを作成することがあります。胸郭と腹部の気管開口部(呼吸入口)がワックスで覆われていないことを確認してください。 - フライホルダー(図7Q)をマグネットブロック(図7I)の上の暗いファラデーケージに置き、フライがライトガイドの端から約5mm離れていることを確認します(図7L)。
- マイクロマニピュレータを使用して、記録電極(図7P)をフライの目の上に、グランド電極(図7N)をフライの背中の上に置きます。
- マイクロマニピュレータを使用して、接地電極をフライの背面に挿入します。
- 記録電極をフライズアイの外周に挿入し、好ましくは、マイクロマニピュレータを使用する。
注:電極を目に挿入した後、小さなディンプルが観察されます。ディンプルが消えるまで、電極を目から取り外さずに上に引っ張ります。電極はまた、胴体および眼に塗布された電極ゼリーの小さな液滴に浸漬することもできる。
- 強度応答プロトコル
- 高圧キセノンランプの前にオレンジフィルター(590エッジフィルター)を置きます。大型(6桁)減衰ニュートラル密度(ND)フィルタを使用します。
- 暗闇の中で60秒待ってから、5秒の光パルスを与えます。
- NDフィルタを減衰率の低いNDフィルタに1桁ずつ交換します。
- 暗闇の中で60秒待ってから、2番目の5秒の光パルスを与えます。
- 手順1.4.1.-1.4.4を繰り返し、減衰の少ないNDフィルタを使用して光強度を徐々に増加させます(最後のパルスはNDフィルタをまったく使用せずに生成する必要があります)。一連のNDフィルタは、大きな減衰から始めて低減衰に達するまで、適切な方向に使用してください。
- PDAプロトコル(このプロトコルは白い目のハエでのみ実行できます)
- オレンジフィルター(最大フォトピグメントをR状態に変換する590エッジフィルター)を使用して、最大強度の5秒光パルスを与えます。
- オレンジ色のフィルターを広帯域の青色(BP450/40 nm)フィルターに交換し、最大強度で3つの5秒光パルスを与えます。
メモ:定常状態の電圧応答に達するまで、長い連続的な最大強度の青色光パルスを与えることもできます。 - 暗闇の中で60秒待ち、青色フィルターを前のオレンジ色のフィルターに交換し、60秒間隔で2つの5秒光パルスを与えます。
- Mの光平衡スペクトルを測定するためのERP/M電位プロトコル(このプロトコルは、白い目のハエ10,25でのみ実行できます)
- 定常状態の電圧応答に達するまで連続的な青色(バンドパス(BP)450/40nm)光パルスを与え、光顔料の最大量をR状態からR1-6細胞のM状態に変換する。
- 狭い(〜20nm)バンドパスフィルタを用いて、350〜700nm(R1-6細胞光色素の既知の吸収スペクトル)の波長の短時間(<3ms)の強烈な光フラッシュを与え、M電位応答(これは光平衡10,25におけるこの特定の波長におけるメタロドプシン吸収を反映する)のM1相のピーク振幅を測定する。
注:光顔料分子の大きなプールの同期活性化のためには、光子含有量が短時間でパックされるように、短時間、強い光のフラッシュが必要である。 M電位は、感光体におけるメタロドプシンの電荷変位を反映するM1(角膜陰相)と、薄層9,10,11における感光体の増幅されたM1応答を反映するM2(角膜正相11,33)の2つの成分からなる。.これらの各成分は、識別および測定することができます。ただし、M準位の直接的な線形発現であるため、M1電位を測定することが好ましい。M2を使用する場合は、軽度のカロテノイド剥奪24,25を使用して、その振幅が線形範囲にあることを確認してください。 - 再び連続的な青色(BP450/40nm)光パルスを与え、続いて異なる波長の短時間(<1ms)の強い光フラッシュを行う。
- 光平衡におけるMの吸収スペクトル全体が覆われるまで、このプロトコルを繰り返す。
2. 全セル電圧クランプ記録を使用してR1-6セルのRおよびM状態の作用スペクトルを測定するためのERCプロトコル
メモ: 全セル電圧クランプ記録を使用するための詳細なプロトコルについては、Katz et al.34 を参照してください。M電位はERGを使用してM状態の活性化を測定しますが、それはR状態の寄与が膜容量によって抑制されるためです。対照的に、ERCは、電圧クランプ記録が膜容量の影響を除去するため、R(正のERC)とM(負のERC)の両方の状態の活性化を測定します(はじめにを参照)。
- フォト顔料を所望の状態(RまたはM)に変換する。RからMへの変換のために、まず、短い(<1ms)適応青色(BP450/40nm)フラッシュによってハエを適応させる。M から R への変換では、短いアダプティブ オレンジ(OG590 エッジ フィルタ)フラッシュを用意します。
- 350~700nmの波長の短時間の光フラッシュ(<1ms)を行い、この特定の波長でのM/R吸収を反映するERC応答の最大負または正の振幅を測定します。
注:光顔料分子の大きなプールの同期活性化のためには、短時間で光子含有量をパックするために、短時間の強い閃光が必要である。青色フラッシュによるRからMへの最大光顔料変換は、RとMの吸収スペクトルの重なりのために、全光顔料分子の約80%に達することができる(図3A)。したがって、〜550nm未満の波長では、ERCは、メタロドプシンの応答を反映する負相と、残りのロドプシンの応答を反映する正相の2つの成分を有する。ERCは光強度に直線的に依存します(図5D)。したがって、R状態およびM状態のスペクトル感度を導出するために、ERCの各相は、等しいエネルギー29に対して様々な波長で正規化される必要がある。 - 手順 2.1.-2.2 を繰り返します。異なる波長のフラッシュを使用します。
- 正規化された正と負のERCを波長の関数としてプロットします。
注:強い閃光は、光に敏感なチャネルを介して大量の電流を誘導し、光受容体に代謝ストレスをもたらし、それが光に依存しないチャネルの開放を引き起こす。ERCはこの構成電流に重畳されます。
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Representative Results
図2は、ERG技術の堅牢性と使いやすさを例示しています。それは簡単な電気生理学的セットアップを必要とする細胞外電圧記録の簡単な技術によって事実上無傷のフライで記録されるので堅牢である。堅牢性は、突然変異が光応答を強く減少または歪める場合でも、比較的大きな振幅(ミリボルト範囲)の光応答の記録を得ることによって現れる。したがって、経験の浅い実験者でも、非常に単純な実験セットアップを使用して、数日で意味のある結果を得る方法を学ぶことができます。光顔料レベルを測定するために設計された技術の主な目的は、PDA(図2C)およびERP(図2C-E)の非常に単純化された方法によって達成される。代替手段、すなわち微分光光度法には、高価な光学機器とかなりの訓練とスキルが必要です(図3B)。ERC(図5A-D)は、技術的には困難ですが、細胞保存に対する感度は低くなります。これは、高い信号対雑音比と膜容量の排除によって特徴付けられます。
図1:光化学サイクル:光色素の活性化と不活性化(A)飽和青色照明(波状の青色矢印)は、ロドプシン(R)をメタロドプシン(M)に光変換する。ロドプシンキナーゼによるMの多重リン酸化およびそれに続くアレスチン2(ARR2)の結合は、Mを不活性化する。非リン酸化Mはヘテロ三量体Gタンパク質(Gqαβγ)を活性化し、GqβγからGq αの解離を引き起こし、結合したGDPを細胞質GTPと交換する。Gqα-GTPはホスホリパーゼC(PLC)を活性化し、PIP2をジアシルグリセロール(DAG)およびイノシトール三リン酸(IP3)に加水分解し、TRP / TRPLチャネルをまだ不明瞭な方法で活性化する。Ca2+カルモジュリン依存性キナーゼ(CaMKII)は、M pp-ARR2複合体をリン酸化し、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよび分解を受ける。オレンジ色の光(波状の赤色矢印)による照明は、Mpp−ARR2複合体をリン酸化R(Rpp)に光変換し、ARR2を細胞質ゾルに放出する。リン酸化R(Rpp)は、ロドプシンホスファターゼ(rdgC)による脱リン酸化を受け、光色素の別のサイクルの準備ができたRを生成する。(B)1秒の白色刺激(中央列)または白色ストロボフラッシュ(右列)に対する白色目ハエのERGの深さプロファイル。刺激は、痕跡の下のバーまたはドットで示されます。痕跡は深さの順に垂直に配置され、上部の痕跡は角膜より約10μm下に記録され、その後の各痕跡は最後のものよりも25μm深く記録される。左側には、網膜、基底膜(BM)、層状外皮、層状カートリッジ(斜めに切片)、および髄質外皮を示す、別の目を通る対応するセクションのカメラルシダ図面があります。この図は、Stephenson と Pak11 から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:白目野生型(w1118)および変異ショウジョウバエの光応答の網膜電図(ERG)記録は、強度 - 応答関係、長期脱分極後電位(PDA)、およびメタロドプシン電位(M電位)を示す。 (a)一連のオレンジ色の光(OG590エッジフィルタ、オレンジフィルタを用いて導光体のエッジから放出される総エネルギーは4mWであった)によって得られたWT(w1118)フライの強度応答関係は、-logスケールで示された光強度の増加を伴う。挿入図は、より速いタイムスケールで示された応答を示します。インセット:ERGの主成分は、光受容体の細胞外電圧応答(受容体電位)、光刺激の開始時および終了時の「オン」および「オフ」過渡現象(ON、OFF応答)、およびグリア細胞の遅い応答(矢印)である。(B)ERG応答の平均ピーク振幅は、相対光強度の関数としてプロットされる。(C)WT(w1118)フライのERPは、最初にPDAを誘導する飽和青色(BP450/4nm、青色フィルタを用いて導光路の端から放出される総エネルギーは1mWであった)光の適用によって得られた。ERP(差し込み図)は、PDAを抑制した以下の強烈な(〜70J、2ms持続時間)緑色フラッシュ(矢印、広帯域550nm干渉フィルタ)によって得られた。インセット:ERPのさまざまなコンポーネントには、示されているように、角膜負のM1電位と正のM2電位が含まれます。過渡時の残差(「ON」応答)も示されます。(D-E)M電位の誘導に必要とされる光顔料変換:(D)M電位は、青色適応後の緑色(広帯域550nm干渉フィルター)フラッシュによって得られたが、WT(w1118)フライにおける青色適応後の青色(BP450/4nm)フラッシュによって得られなかった。(e)Dのプロトコールを、WT(w1118、ブラックトレース)および2つの突然変異ハエ(PLCヌル変異体、norpAP24、オレンジトレース、および低型ロドプシン突然変異体、ninaEP318、赤色トレース)において繰り返した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ハエおよびフジツボ光顔料の吸収スペクトル(A)差分スペクトルおよび光平衡スペクトルの測光測定から計算されたハエロドプシン(R)およびメタロドプシン(M)の相対吸収スペクトル。この図は、Selinger and Minke35 から修正されています。(B)ピーク波長が492nmおよび532nmにピーク波長を有する2つのダートノールノモグラムで、ピーク吸収の比がそれぞれ1.63:1である。これらの曲線の差は、単色青色(442nm)およびオレンジ(596nm)の適応を飽和させた後に400〜650nmの範囲の透過測定によって得られる、フジツボバラヌスエボルネウスのオセリから測定された差スペクトルに最も適合する。この図は、ミンクとキルシュフェルト36から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ニーナ、イナ、およびArr2変異体のPDA表現型。 (A)ショウジョウバエにおけるPDAの誘導および抑制のプロトコル。PDA誘導プロトコルは、最大強度のオレンジ色の光パルス(590エッジフィルタ、オレンジ色のフィルタを使用して導光体のエッジから放出される総エネルギーは4mW、オレンジ色のバー)を使用した初期照明で構成され、続いて最大強度の青色光の3つのパルス(2番目と3番目のパルスは最大PDAに到達することの検証用であり、 BP450/40nmフィルタ、青色フィルタを用いて導光体の端から放出された総エネルギーは1mW、青色バー3本であった)。PDA抑制は、オレンジ色の光パルスの印加とそれに続く追加のオレンジ色の光(2本のオレンジ色のバー)の印加によって得られた。PDA誘導および抑制プロトコルを、R1−6光色素の構造遺伝子、ninaEP318 7(中央)の白目変異体において繰り返した。PDA誘導および抑制プロトコールを、眼特異的プロテインキナーゼC(PKC32)inaCP209(下段)の白目ヌル変異体においても繰り返した。(B)白眼WT(W1118)とヌルArr2変異体(Arr23)との間のPDAの誘導に必要な青色光量の比較。オレンジ色(飽和590個のエッジフィルタ)と青色(BP450/40nm)の交互の光パルスの列で、光強度(相対対数スケールでのND)の増加。-log 1強度の青色光では、PDAが誘導される(上)。上部トレースのパラダイムをArr23変異体において繰り返し、PDAが〜10倍の調光光(−log2)強度(下部)の青色光で誘導されたことを示した。(C) 一定の強度の薄暗い(-log 2)青色光パルスの列は、W1118フライ(左)ではPDAを誘導できなかったが、同じ薄暗い青色光の列は、Arr23 変異体(右)の1番目の光パルスによってPDAを誘導した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:白目WT(w1118)から記録された単離されたommatidiaの光応答のパッチクランプ全細胞記録は、初期受容体電流(ERC)の発生とその強度-応答関係を示す。 (A)マイクロ秒未満のレイテンシを伴う二相性ERC応答のWTフライ(w1118)の単離されたオンマチジウムからのパッチクランプ全細胞記録。光刺激は、黄緑色への強い適応(546nm光にピーク吸収を有する広帯域フィルタ、黒色トレース)に強く適応した後に加えられた強烈な(〜220J、0.8ms持続時間)青色光フラッシュ(425nmにピーク吸収を有する広帯域フィルタ、矢印)刺激からなる。光の開始時に、高速陰性の電気アーチファクトが観察される。負相はMの活性化から生じ、正相はRの活性化から生じる。光誘起電流(LIC)の活性化は、光に敏感なチャネルの開口部から生じる遅延負相によって現れる。 ninaEI17ヌル変異体は、単離されたオンマチジウム(赤色痕跡)に加えられたのと同じ光フラッシュに対するERC応答の欠如を示した。(B)(A)と同じ細胞から記録したRh1光色素のERC測定。黒い痕跡は、青色光への強い適応後のWT(w1118)フライのオレンジ色のフラッシュ刺激に対する単相性の陰性応答(M状態)を示す。(c)トランスジェニック ショウジョウバエ (opn4;ninaEI17)の単一光受容体細胞から測定された二相性ERC微量のサンプル、R1-6ハエ光受容体中のメラノプシン光色素(opn4)を異所性発現しているマウスの白色フラッシュ光の強度の増加に応答して(相対-log Iスケールで;NDは中性濃度フィルタを示す)。フラッシュ開始は矢印で示されます。(D)光強度の増加は、 opn4;ninaEI17のERC振幅の線形増加によって現れた。ERC応答の負位相の平均ピーク振幅(対数スケール)を相対光強度(I/Imax、対数スケールでも)の関数としてプロットしたもの。連続直線は、実験点に最も適合する線形回帰曲線を表す(R2 =0.99、エラーバーはSEM、n=5)。この図はYasinら29から修正されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:フライ固定および記録ピペットの準備に必要なツールおよび装置。(B)フライスリーパーシステムペダル;(C)冷光源;(d)実体顕微鏡;(E)ワックスフィラメントヒーター;(F)はんだごて;(G)ワックスフィラメントヒーターペダル;(H)粗いピンセット;(I)磁気フライスタンド;(j)溶融温度の低いワックス;(K)繊細なワイプ;(L)垂直ピペットプーラー;(M)細長い先端を有するシリンジ;(n)電極ホルダー;(o)ホウケイ酸ガラスキャピラリー;(P) 固定フライ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ERGセットアップの概要 (A)パルス発生器。(B) コンピュータ(C)A / Dコンバータ;(D)増幅器;(e)実体顕微鏡;(F)マイクロマニピュレータ(機械的微細);(G)ヘッドステージを備えたマイクロ電極プリアンプシステム;(H)防振テーブル;(I)オン/オフマグネットブロック;(j)マイクロマニピュレータ(機械的粗い);(K)ファラデーケージ;(L)キセノン光源からのライトガイド;(M)フラッシュライトシステムからのライトガイド。(n)接地電極ホルダー;(o)光検出器;(p)記録電極ホルダー;(Q)磁気フライスタンド;(R)キセノンランプ電源;(S)カラーおよびNDフィルタースタンド;(T)光学ベンチ;(U)フラッシュランプシステム;(V) シャッタードライバー(W)ランプ電源;(X) キセノンフラッシュライトシステム この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| リンガーの解決策 | |
| 試薬 | 濃度 (mM) |
| ナクル | 130 |
| ティッカー | 2 |
| マグネシウム2 | 5 |
| CaCl2 | 2 |
| ヘペス | 10 |
| NaOHおよびHClを使用したpHを7.15まで滴定する | |
表1:リンゲル溶液の組成
補足ファイル1:ワックス溶融レギュレータの回路図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ショウジョウバエ光受容体製剤を使用する主な利点は、そのアクセシビリティ、光刺激の容易さと精度、そして最も重要なのは、分子遺伝学の力を適用する能力です7。広範な遺伝学的研究により、ショウジョウバエは複雑な生物学的プロセスの遺伝的解剖のための非常に有用なモデルシステムとして確立されています7。ショウジョウバエゲノムの比較的単純な構造(X染色体とY性染色体、2つの大きな常染色体要素、2番染色体と3番染色体、小さなドット4番染色体を含む4つの染色体のみからなる)、増殖の容易さ、および迅速な生成時間(24°Cで〜2週間)により、ショウジョウバエは膨大な数の変異原性個体ハエのスクリーニングに適しています。さらに、単離された変異の単離および維持は、優性マーカーおよび複数の逆位を含むバランサー染色体の生成により可能となり、天然染色体との再結合を防止する。利用可能な分子ツールは、それらの天然の細胞環境におけるインビトロ改変遺伝子産物の研究を可能にした37。この強力な方法論は、そうでなければ予測が困難であったであろう新しいタンパク質に欠陥を有する多数の変異ハエを生み出しました7。
光顔料レベルと光に対する感度の測定にERGを使用する主な利点は、そのシンプルさと適用の容易さ、および大きな信号対雑音比です。ERGを使用することの欠点は、そのヘテロゲン性細胞起源が、光受容体9から生じる光応答の波形を歪めることである。電圧クランプ全セル記録の主な利点は、電流-電圧(I-V)関係を測定することによってコンダクタンス変化を導出できることです。照明中および照明後のTRPチャネルおよびTRPLチャネルの開閉は、この測定13によって反射される。さらに、記録ピペットの低抵抗(〜10MΩ)と電流の測定のために高い信号対雑音比が得られ、量子バンプ(単一光子応答)の信頼性の高い測定が可能になり、有効な光強度38の較正に有用である。パッチクランプ全細胞記録の大きな欠点は、ERG記録は極端な光強度下でも何時間も維持できるのに対し、15~30分以上は信頼性の高いパッチクランプ全細胞記録を行うことが難しく、長時間の録音には薄暗い光刺激が必要であることです。全細胞記録を得るためには、記録ピペットと感光体膜との間の直接接触が必要である。直接接触は、オンマチジア34を取り囲む色素(グリア)細胞を除去することによって達成される(図1B)。色素細胞の除去は、光受容体細胞がアデノシン三リン酸(ATP)産生に必要な代謝産物を合成できず、代謝供給を破壊するため、代謝ストレスを引き起こす39。TRPおよびTRPLチャネルは無酸素症に脆弱であり、ATP枯渇のために暗闇の中で容易に自発的に開くので、単離されたommatidiaの使用は大きな困難を課す40,12。光応答はATP34の大きな消費を誘発するため、手順全体は薄暗い赤色光の下で行う必要があります。
光形質導入カスケードにおける変異のほとんどは、光に対する感受性の低下を誘導する。光に対する感度のこの低下は、強度−応答関係の測定に基づくスクリーンによって容易に検出することができる。強度 - 応答パラダイムは、対数スケールで強度を増大させて光刺激を繰り返すことによって達成される。光への適応を防ぐためには、オレンジ色の光の強度を増大させる(減少させるのではなく)必要があります。ERG(M電位)およびPDAは、光顔料レベルを測定する非常に簡単な方法です。代替案、すなわち微分光光度法36は、高価な光学機器およびかなりの訓練および技能を必要とする。
結論として、ERGは適用が簡単ですが、比較的不正確なツールです。全細胞記録31 は、ERCを用いて光色素レベルを測定するのに正確であり、かつERGの不正確さおよび限界を補償するために不可欠である。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、イスラエル科学財団(ISF)と米国・イスラエル二国間科学財団(BSF)からの助成金によって支援されました。ワックスフィラメントヒーターの建設についてアナトリー・シャポチニコフ氏に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
| 1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
| 2 condenser lenses | |||
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
| Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
| Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
| Clampex | Molecular Device | Software | |
| CO2 tank | |||
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
| Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
| Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
| Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
| Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
| Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
| Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
| Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
| Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
| Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
| Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
| Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
| Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
| Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
| Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
| Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
| pCLAMP | Molecular Device | Software | |
| Petri dish | 60 mm | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
| Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
| Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
| Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
| Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
| Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |
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