Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63514
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Summary

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Abstract

Drosophila G-proteinine bağlı fotopigment rodopsin ( R ) bir protein (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Rodopsinin aktivasyon süreci, kromoforun foton emilimine neden olan izomerizasyonu ile başlatılır, opsinin konformasyonel değişikliklerini teşvik eder ve ikinci bir koyu kararlı fotopigment durumu (metarhodopsin, M) ile sonuçlanır. Bu iki kararlı fotopigmentin rastgele mutajenez kullanılarak araştırılması, mutant sineklerin taranması için basit ve sağlam yöntemler gerektirir. Bu nedenle, fonksiyonel fotopigment seviyelerindeki azalmaları ölçmek için çeşitli yöntemler tasarlanmıştır. Böyle bir yöntem, foton emilimini takiben fotopigment içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerde eksprese edilen büyük miktarda fotopigment molekülünü kullanır. Erken reseptör potansiyeli (veya erken reseptör akımı) olarak adlandırılan bu elektrik sinyali, çeşitli elektrofizyolojik yöntemlerle (örneğin, elektroretinogram ve tüm hücre kayıtları) ölçülür ve fonksiyonel fotopigment seviyeleri ile doğrusal olarak orantılıdır. Bu yöntemin avantajları, yüksek sinyal-gürültü oranı, fotopigment seviyelerinin doğrudan doğrusal ölçümü ve rodopsin veya metarodopsin aktivasyonuna kadar aşağı akış fototransdüksiyon mekanizmalarının bağımsızlığıdır. Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) adı verilen ek bir elektrofizyolojik yöntem, Drosophila fotopigmentinin bi-stabilitesini ve sinek R ve M pigment durumlarının emilim-spektral farklılıklarını kullanır. PDA, yoğun mavi ışık tarafından indüklenir, doygun miktarda rodopsinin metarodopsine dönüştürülmesi, karanlıkta uzun bir süre boyunca ışık tepkisi sonlandırmasının başarısız olmasına neden olur, ancak yoğun turuncu ışık kullanılarak metarodopsin'den rodopsine dönüşüm ile sonlandırılabilir. PDA, büyük fotopigment dönüşümü gerektiren sağlam bir sinyal olduğundan, fotopigmentin biyogenezindeki küçük kusurlar bile kolayca tespit edilen anormal PDA'ya yol açar. Gerçekten de, kusurlu PDA mutantları, fototransdüksiyon için önemli olan yeni sinyal proteinlerinin tanımlanmasına yol açmıştır.

Introduction

Bir G-proteinine bağlı reseptör (GPCR) olan ışıkla aktive olmuş rodopsin ( R ), bir 7 transmembran proteini (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Drosophila melanogaster'de (meyve sineği), foton absorpsiyonu, 11-cis-3-OH-retinal kromoforun all-trans-3-OH-retinal1'e izomerizasyonunu indükleyerek rodopsinin metarodopsine konformasyonel değişimini teşvik eder (M, Şekil 1A). Omurgalı rodopsinin aksine, omurgasız kromoforun baskın fraksiyonu opsin'den ayrışmaz, bu da fizyolojik olarak aktif koyu kararlı pigment durumu M ile sonuçlanır. Buna karşılık, all-trans-3-OH-retinal kromofor tarafından ilave foton emilimi, kromofor 2,3'ün izomerizasyonunu indükleyerek 11-cis-3-OH-retinal kromofor ile R pigment durumunu oluşturur. R durumu karanlık, stabil ve fizyolojik olarak aktif olmayan bir fotopigmenttir. Kromozom4'ün son derece hızlı foton rejenerasyon yoluna ek olarak, omurgalı fotopigmentleri gibi, omurgasızlarda kromofor rejenerasyonu için alternatif bir enzimatik yavaş yol vardır, burada bazı aşamalar fotoreseptör hücrelerini çevreleyen retinal hücrelerde gerçekleştirilir 5,6.

Drosophila, omurgasız fotoreseptörleri incelemek için model bir organizma olarak büyük avantajlar sağlar. Özellikle, preparatın erişilebilirliği ve moleküler genetiği uygulama yeteneği, Drosophila'yı güçlü bir model sistem haline getirmiştir7. Bu nedenle, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigment seviyelerini incelemek için çeşitli in vivo ve ex vivo deneysel yöntemler oluşturulmuştur. En basit in-vivo yöntem, Drosophila gözünün ışığına nispeten büyük hücre dışı olarak kaydedilen voltaj tepkisinden yararlanır. Buna göre, ışık stimülasyonu, tüm gözde, omurgalı gözlerinin ışığına verilen ERG tepkisinden ~ 3 kat daha büyük olan hücre dışı elektroretinogram (ERG) kaydı kullanılarak ölçülebilen bir elektriksel voltaj tepkisi uyandırır 8,9. Drosophila ERG yanıtı sağlamdır ve kolayca elde edilir, bu da mutasyonlara bağlı ışık tepkisindeki anormallikleri tanımlamak için uygun bir yöntemdir. Işığa karşı ERG yanıtı esas olarak fotoreseptörlerden, pigment (glia) hücrelerinden ve laminanın ikincil nöronlarından kaynaklanır (bkz. Şekil 1B). ERG'nin ana bileşenleri (i) fotoreseptörlerin hücre dışı voltaj tepkisi, (ii) lamina nöronlarından kaynaklanan ışık uyaranının başlangıcındaki ve sonundaki "açık" ve "kapalı" geçicilerdir (Şekil 2A, giriş, AÇIK, KAPALI), (iii) glia hücrelerinin yavaş tepkisi (Şekil 2A, giriş, oklar) ve (iv) kısa ve geçici yanıt, fotopigment aktivasyonu sırasında ON geçici10'dan önce gelen yük yer değiştirmesinden kaynaklanır (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu kısa yanıt iki fazdan oluşur (M1 ve M2, Şekil 2C [giriş]) ve sadece milyonlarca fotopigment molekülünü aynı anda aktive eden son derece güçlü ışık stimülasyonu ile indüklenebilir. Ne mavi stimülasyon altında (Şekil 2D, mavi iz) ne de fotopigment seviyeleri oldukça azalmış mutantlarda (Şekil 2E, kırmızı iz) gözlenmez, ancak PLC aktivitesini ortadan kaldıran bir mutantta genliği hafifçe artar (Şekil 2E, turuncu iz). M1 fazı, fotoreseptörlerde M'nin aktivasyonundan kaynaklanan sineğin tipik bir ERP'sidir. Pozitif bir polariteye sahip olan M1 fazı (hücre içi), işaret ters çeviren bir sinapsta normal şekilde bir nörotransmitter salgılar ve sinaptik olarak güçlendirilmiş M2 fazını üreterek fotoreseptör depolarizasyonuna yanıt veren lamina nöronlarını aktive eder. Böylece, hem M1 hem de M2 fazları M aktivasyonu10,11'i yansıtır.

Fotoreseptörün depolarizasyonu, fotoreseptör akson ile lamina10,11'in monopolar nöronları arasındaki işaret ters çeviren sinapstan kaynaklanan kornea pozitif "on" geçicisini üretir (Şekil 1B). ERG'nin yavaş yükselmesi ve çürümesi, esas olarak geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve TRP benzeri (TRPL) kanallar 13,14,15 aracılığıyla fotoreseptör hücrelerinden 12 K+ efflux nedeniyle pigment hücrelerinin depolarizasyonundan kaynaklanır (Şekil 2A, iç kısım, oklar). Bu yavaş kinetik bileşenler, fotoreseptör yanıtınınışık 9,10'a verdiği yanıtın hücre içi veya tüm hücre kayıtlarıyla karşılaştırıldığında, fotoreseptör yanıtının dalga formunu büyük ölçüde maskeler ve bozar. Ek olarak, çok güçlü aydınlatmalarda, "açık" geçiciden önce gelen ve kısmen kaynaşan ek bir geçici tepki gözlenebilir (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu sinyal doğrudan fotopigment10'un masif aktivasyonundan kaynaklanır.

Genel olarak gözü ve özellikle fototransdüksiyon kaskadını araştırmak için nötr yoğunluk (ND) ve renk filtrelerinin yanı sıra güçlü aydınlatıcı flaşlar kullanan çeşitli ışık rejimi protokolleri geliştirilmiştir. Bu protokoller fotopigmentin özelliklerini araştırmak için de kullanılmıştır.

Yoğunluk-yanıt protokolü, tüm gözün artan ışık yoğunluklarına karşı ERG voltaj tepkisinin tepe genliğini ölçer (Şekil 2A, B). Bu protokol, fotoreseptör hücrelerin ışığa duyarlılığındaki değişiklikleri tespit etmeye yardımcıolur 9.

Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) protokolü, rodopsin ve metarodopsinin absorpsiyon spektrumlarındaki farklılıklardan yararlanır ve bu da Drosophila'da, R'nin fizyolojik olarak aktif ve koyu kararlı ara M durumu2'ye büyük bir fotopigment dönüşümüne izin verir. ERG voltaj tepkisinde, nispeten kısa bir doygunluk ışığı darbesi verilir ve ortaya çıkan voltaj tepkisi kaydedilir. Bu durumda, depolarizasyon sinyali ile bir tavana (tersine çevirme potansiyeli) ulaşılır, çünkü büyük miktarda rodopsin molekülünün (~ 1 x 108) yüzde birinin aktivasyonu tavana ulaşmak için yeterlidir. Fototransdüksiyon bileşenlerinin bolca bulunması, bu tavana, konsantrasyonda önemli bir azalma veya fototransdüksiyon bileşenlerinin ince bir arızası ile mutantlarda bile ulaşılmasını sağlar. Bu durum bu mutantların izolasyonunu engellemektedir. Pak ve ark., görsel mutantları izole etmek için güvenilir ve açıklayıcı bir test arayan PDA tarama7'yi tanıttı. Drosophila'da , PDA yanıtı, fotopigment dönüşümüne izin veren kırmızı tarama pigmentinin genetik olarak çıkarılması ve tercihen rodopsin tarafından emilen mavi ışığın uygulanması (Şekil 3A) ile ortaya çıkar ve böylece R'nin M fotopigment durumuna büyük bir net dönüşümü ile sonuçlanır. Fototransdüksiyon sonlandırması, fotopigment seviyesinde, R'nin M'ye büyük bir net dönüşümü ile bozulur ve bu da ışık kapatıldıktan çok sonra sürekli uyarılma ile sonuçlanır (Şekil 2C, Şekil 4A [üst]). PDA döneminde, fotoreseptörler sonraki test ışıklarına karşı daha az hassastır ve kısmen duyarsızlaştırılır (inaktive edilir). PDA, rodopsin biyogenezindeki küçük kusurları bile tespit eder ve uzun süre uyarılmayı sürdürmek için fotoreseptör hücrenin maksimum kapasitesini test eder. Kesinlikle yüksek konsantrasyonlarda rodopsin varlığına bağlı olduğundan, fototransdüksiyon bileşenlerinin eksik yenilenmesi için kolayca puan alır. Dikkat çekici bir şekilde, PDA ekranı birçok yeni ve çok önemli görsel mutant vermiştir (Pak ve ark.7'de gözden geçirilmiştir). Bu nedenle, Pak ve ark.7 tarafından izole edilen PDA mutantları, Drosophila görsel sistemini analiz etmek için hala son derece yararlıdır.

PDA, Drosophila'da mavi ışığı doyurarak indüklenir ve ışık ofsetinden çok sonra sürekli depolarizasyona neden olur (Şekil 4A [üst]). PDA ile indükleyen mavi ışığı doyurduktan sonra, periferik fotoreseptörler (R1-6) karanlıkta maksimum kapasitelerinde sürekli aktif kalır ve doygunluğa ulaşır. PDA sırasında ilave doygun mavi ışıklar, R1-6 hücrelerinde saniyeler boyunca herhangi bir ek yanıt üretmez, ancak PDA üzerine bindirilmiş R7-8 hücrelerinde bir yanıt indükler. Üst üste binen tepkiler, bu hücrelerde eksprese edilen fotopigmentlerin farklı absorpsiyon spektrumları ile açıklanmaktadır (R7-8)16. PDA, M'nin doygun turuncu ışıkla R'ye geri fotodönüşümü ile bastırılabilir (Şekil 4A [üst]). PDA'nın fotoreseptör hücrelerini maksimum aktif kapasitelerine getirme yeteneği, yoğun beyaz ışıkla elde edilemeyen bir durum, Drosophila'nın görsel mutantlarını taramak için neden önemli bir araç olduğunu açıklıyor. Bunun nedeni, normal fotopigment seviyelerinin biyogenezinde rol oynayan proteinlerdeki küçük kusurların bile tespit edilmesine izin vermesidir17,18. İki grup PDA kusurlu mutantı izole edilmiştir: ne inaktivasyon ne de postpotansiyel (nina) mutantlar ve inaktivasyon, ancak postpotansiyel (ina) mutantlar değil. İlkinin fenotipi, bir PDA eksikliği ve fotopigment seviyelerindeki büyük bir azalmadan kaynaklanan ilişkili inaktivasyondur (Şekil 4A [orta]). İkincisinin fenotipi, mutantta normal rodopsin seviyelerine sahip, ancak TRP kanallarıyla etkileşime giren proteinlerden yoksun olan hala bilinmeyen bir mekanizma nedeniyle mavi ışıktan sonra inaktivasyon gösterir, ancak karanlık depolarizasyon yoktur (Şekil 4A [alt]).

PDA, M aktivitesi 19,20,21'i bağlayan ve sonlandıran arrestine (ARR2) göre fotopigment miktarındaki farktan kaynaklanır (Şekil 1A). Drosophila fotoreseptörlerinde, fotopigment miktarı ARR219 miktarından yaklaşık beş kat daha büyüktür. Bu nedenle, ARR2 seviyeleri, R'den M'ye büyük bir net fotodönüşümü ile üretilen tüm M moleküllerini etkisiz hale getirmek için yetersizdir ve karanlıkta 17,19,20,22,23 sürekli aktif olan M fazlalığını bırakır. Bu mekanizma, PDA yanıtının mutasyonlarla veya karotenoid yoksunluğu24,25 ile ortadan kaldırılmasını açıklar, fotopigment seviyesinde bir azalmaya neden olur, ancak arrestin seviyelerini etkilemez. Dahası, bu açıklama aynı zamanda null ARR2 (arr23) mutant alel21'in fenotiplerini de açıklamaktadır, burada PDA, ~ 10 kat daha kısık mavi ışık yoğunluklarında19,20,21'de elde edilebilir (Şekil 4B, C). PDA, sinek fotoreseptörlerinin benzersiz bir özelliği değildir ve R durumundan farklı bir absorpsiyon spektrumuna sahip karanlık kararlı M'ye sahip test edilen her türde ortaya çıkar ve fotopigmentin R'den M durumuna yeterli fotodönüşümüne izin verir. PDA fenomenolojisinin keşfedildiği iyice araştırılmış bir tür, R durumunun absorpsiyon spektrumunun M durumu2'den daha uzun bir dalga boyunda olduğu barnacle (Balanus) fotoreseptörüdür (Şekil 3B). Buna göre, sinekteki durumun aksine, ahırda, turuncu-kırmızı ışık bir PDA'yı indüklerken, mavi ışık PDA2'yi bastırır.

Erken reseptör potansiyeli (ERP) protokolü, R veya M aktivasyonu sırasında meydana gelen yük yer değiştirmesinden yararlanır. Görsel pigment, hem omurgalı hem de omurgasız membranların sinyal bölmesinin yüzey zarının ayrılmaz bir parçasıdır3. Buna göre, fotopigment moleküllerinin bir ara durumdan diğerine değiştiği aktivasyon sürecine, 4,26'lık bir yük yer değiştirmesi eşlik eder. Fotopigment molekülleri, membran kapasitansı4'e paralel olarak elektriksel olarak hizalandığından, hızlı bir senkronize konformasyonel değişim, yüzey zarının hızlı bir polarizasyon değişimini üretir; bu, sineklerde, rabdomere adı verilen ~ 30.000-50.000 mikrovillusluk bir yığından oluşan sinyal bölmesinde meydana gelir. Bu polarizasyon daha sonra hücre zarı eşit derecede polarize olana kadar hücre gövdesinin membran kapasitansından pasif olarak boşalır. ERP, yük yer değiştirmesinin hücre dışı kaydıdır. Hücre içi olarak kaydedilen ERP,hücre zarının zaman sabiti 4,27,28 ile entegre edilmiş hücre dışı ERP'yi gösterir. Görsel pigment yükü deplasmanı tarafından aktive edilen akım, membran kapasitansının sinyalin kinetik üzerindeki etkisini en aza indirmenin en büyük avantajı (erken reseptör akımı (ERC) kayıtları) ile tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtlarında29,30 (Şekil 5A-D) olarak da ölçülebilir.

Protokol bölümü, Drosophila göz9'dan ERG ölçümlerinin ve Drosophila izole ommatidia 31,32'den tüm hücre kayıtlarıyla ERC ölçümlerinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigmentleri araştırmak için kullanılan spesifik protokolleri de açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Elektroretinogram kullanılarak yoğunluk yanıtı ilişkisinin, uzamış depolarizan artçı potansiyelin (PDA) ve erken reseptör potansiyelinin (ERP) ölçülmesi

  1. D. melanogaster hazırlığı için uygun yetiştirme koşulları
    1. D. melanogaster sineklerini, 24 ° C sıcaklıkta ve 12 saatlik karanlık / ışık döngüsünde tutulan bir inkübatörde yiyecek içeren standart sarı mısır içeren şişelerde yükseltin
    2. Sinek şişelerini deneyden en az 24 saat önce karanlıkta tutun.
  2. Genel kurulum
    1. Kayıt pipetlerini 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) fiber dolgulu borosilikat cam kılcal damarları çekerek hazırlayın (Şekil 6L, O). Pipetlerin direnci 5-10 MΩ olmalıdır; uygun herhangi bir çektirme kullanılabilir.
    2. İki gümüş teli AgCl2 ile kaplayın ve 0,25 mm gümüş teli özel yapım 5 V güç kaynağına bağlı 3 M KCl çözeltisine yerleştirin.
    3. Kaplanmış her gümüş teli elektrot tutuculara yerleştirin (Şekil 6N).
    4. Cam kılcal damarı, uzun uçlu bir şırınga (Şekil 6M) kullanarak filtrelenmiş Ringer çözeltisi (bakınız Tablo 1) ile doldurun.
    5. Tel elektrodu cam kılcal damara yerleştirin. Kılcal damar içindeki çözeltinin gümüş tel ile temas halinde olduğundan emin olun.
    6. Elektrot tutucuları (Şekil 7P, N) iki elektrot mikromanipülatörüne (Şekil 7G) yerleştirin.
  3. Sineği elektrik kayıtları için hazırlama prosedürü
    NOT: Sineği karanlığa uyarlanmış koşullar altında tutmak için, aşağıdaki adımlar sırasında yalnızca loş kırmızı ışık aydınlatmasını kullanın.
    1. Sinek yataklı sistemini kullanarak şişedeki sinekleri CO2 gazı ile uyuşturun (Şekil 6A, B) ve uyuyan kaba dökün.
    2. Bir sinek seçin ve keskin bir cımbız kullanarak kanadından dikkatlice tutun. Sineklerin geri kalanını bir Petri kabı ile örtün.
    3. Sineği sinek tutucunun üzerine, sırtı ele doğru olacak şekilde, yan yatarak doğru yönde yerleştirin (Şekil 6P).
    4. Havyanın güç kaynağını AÇIN. Geçerli değeri ~2,25 A olarak ayarlayın. Bu akım 0,25 mm platin-iridyum filamentini ~55-56 ° C'ye ısıtmalıdır (Ek Dosyaya bakınız).
    5. Havya üzerine düşük erime sıcaklığına (~ 55-56 ° C) sahip bir damla balmumu yerleştirin (Şekil 6F).
    6. Cımbız kullanarak, sineği kanatlarından kaldırın ve havyayı kullanarak kanatlarını sinek tutucusuna sabitleyin (Şekil 6I).
    7. Lehimleme demirini kullanarak, sineğin sırtını balmumu ile stand yüzeyine bağlayın (Şekil 6P).
    8. Havyanın ucunu bacakların birleşme noktasına indirin ve tüm bacakları birlikte örtmek için balmumunu eritin (Şekil 6P).
    9. Boyun bölgesinde baş ve sırt arasına küçük bir damla balmumu yerleştirin (Şekil 6P).
      NOT: Sinek kafasının aşırı ısınmasını önlemek için özel dikkat gösterin. Sineğin düzgün bir şekilde sabitlendiğinden ve deney sırasında hareket edemediğinden emin olun; küçük hareketler kayıtlarda eserler oluşturabilir. Toraks ve karın bölgesindeki trakea açıklıklarının (solunum girişleri) balmumu ile kaplanmadığından emin olun.
    10. Sinek tutucuyu (Şekil 7Q) bir mıknatıs bloğu üzerindeki karanlık bir Faraday kafesine yerleştirin (Şekil 7I) ve sineğin ışık kılavuzunun ucundan ~ 5 mm uzakta olduğundan emin olun (Şekil 7L).
    11. Kayıt elektrodunu (Şekil 7P) sinek gözünün üzerine ve toprak elektrodunu (Şekil 7N) mikromanipülatörleri kullanarak sineğin üst sırtına yerleştirin.
    12. Mikromanipülatörleri kullanarak toprak elektrodunu sineğin arkasına yerleştirin.
    13. Kayıt elektrodunu sinek gözünün dış çevresine, tercihen mikromanipülatörleri kullanarak yerleştirin.
      NOT: Elektrodu göze yerleştirdikten sonra, küçük bir çukur gözlenecektir; gamzesi kaybolana kadar elektrodu gözden çıkarmadan yukarı doğru çekin. Elektrotlar ayrıca gövdeye ve göze uygulanan küçük elektrot jölesi damlacıklarına daldırılabilir.
  4. Yoğunluk-tepki protokolü
    1. Yüksek basınçlı Xenon lambasının önüne turuncu bir filtre (590 kenarlı filtre) yerleştirin. Büyük (altı büyüklük sırasıyla) zayıflatıcı nötr yoğunluk (ND) filtresi kullanın.
    2. Karanlıkta 60 s bekleyin ve 5 s ışık darbesi verin.
    3. ND filtresini, büyüklük artışlarının bir sırasına göre daha az zayıflatıcı bir ND filtresiyle değiştirin.
    4. Karanlıkta 60 s bekleyin ve ikinci bir 5 s ışık darbesi verin.
    5. Daha az zayıflatıcı ND filtreleri kullanarak ışık yoğunluğunu kademeli olarak artırarak Adım 1.4.1.-1.4.4'ü tekrarlayın (son darbe hiç ND filtresi olmadan oluşturulmalıdır). ND filtre serisini, büyük zayıflamadan başlayarak ve düşük zayıflamaya ulaşan doğru yönde kullandığınızdan emin olun.
  5. PDA protokolü (bu protokol sadece beyaz gözlü sineklerde yapılabilir)
    1. Turuncu bir filtre kullanarak maksimum yoğunlukta 5 sn ışık darbesi verin (maksimum fotopigmenti R durumuna dönüştürmek için 590 kenarlı filtre).
    2. Turuncu filtreyi geniş bantlı mavi (BP450/40 nm) bir filtreyle değiştirin ve maksimum yoğunlukta üç adet 5 s ışık darbesi verin.
      NOT: Kararlı durum voltaj tepkisine ulaşılana kadar uzun bir sürekli maksimum yoğunlukta mavi ışık darbesi vermek de mümkündür.
    3. Karanlıkta 60 s bekleyin, mavi filtreyi önceki turuncu filtreyle değiştirin ve 60 s aralıklarla iki adet 5 s ışık darbesi verin.
  6. M'nin foto-denge spektrumunu ölçmek için ERP / M potansiyel protokolü (bu protokol sadece beyaz gözlü sineklerde gerçekleştirilebilir10,25)
    1. Kararlı durum voltaj tepkisine ulaşana kadar sürekli mavi (bandpass (BP) 450/40 nm) ışık darbesi verin, bu da maksimum fotopigment miktarını R durumundan R1-6 hücrelerinin M durumuna dönüştürür.
    2. Dar (~ 20 nm) bandpass filtreleri kullanarak 350-700 nm (R1-6 hücreleri fotopigmentinin bilinen absorpsiyon spektrumu) arasındaki bir dalga boyunda kısa (<3 ms) yoğun bir ışık parlaması verin ve M potansiyel yanıtının M1 fazının tepe genliğini ölçün (foto-denge 10,25'te bu spesifik dalga boyundaki metarodopsin absorpsiyonunu yansıtır).
      NOT: Büyük bir fotopigment molekülü havuzunun senkron aktivasyonu için, foton içeriğinin kısa sürede paketlenmesi için kısa, yoğun bir ışık parlaması gereklidir. M potansiyeli iki bileşenden oluşur: Fotoreseptördeki metarodopsinin yük yer değiştirmesini yansıtan M1 (kornea negatif faz) ve laminadaki fotoreseptörlerin yükseltilmişM1 tepkisini yansıtan M2 (kornea pozitif faz 11,33)9,10,11 . Bu bileşenlerin her biri tanımlanabilir ve ölçülebilir. Bununla birlikte, M1 potansiyelinin ölçülmesi tercih edilir, çünkü M seviyelerinin doğrudan doğrusal bir tezahürüdür. M2 kullanılıyorsa, hafif karotenoid yoksunluğu24,25 kullanarak genliğinin doğrusal aralıkta olduğundan emin olun.
    3. Tekrar sürekli mavi (BP450/40 nm) ışık darbesi verin, ardından farklı dalga boyunda kısa (<1 ms) yoğun bir ışık parlaması izleyin.
    4. Fotoğraf dengesinde M'nin tüm absorpsiyon spektrumu kaplanana kadar bu protokolü tekrarlayın.

2. Tüm hücre voltaj kelepçeli kayıtları kullanarak R'nin etki spektrumunu ve R1-6 hücrelerinin M durumlarını ölçmek için ERC protokolü

NOT: Tüm hücre voltaj kelepçeli kayıtları kullanmak için ayrıntılı bir protokol için, Katz ve ark.34'e bakınız. M-potansiyeli, M durumunun aktivasyonunu ölçmek için ERG'yi kullanır, çünkü R durumunun katkısı membran kapasitansı tarafından bastırılır. Buna karşılık, ERC hem R (pozitif ERC) hem de M (negatif ERC) durumlarının aktivasyonunu ölçer, çünkü voltaj kelepçeli kayıtlar membran kapasitansının etkisini ortadan kaldırır (girişe bakınız).

  1. Fotopigmenti istenen duruma (R veya M) dönüştürün. R'den M'ye dönüşüm için, önce sinekleri kısa (<1 ms) uyarlanabilir mavi (BP450/40 nm) flaşla uyarlayın. M'den R'ye dönüştürme için, kısa bir uyarlanabilir turuncu (OG590 kenar filtresi) flaş verin.
  2. 350-700 nm arasında bir dalga boyunda kısa bir ışık parlaması (<1 ms) verin ve bu spesifik dalga boyunda M / R absorpsiyonunu yansıtan ERC yanıtının maksimum negatif veya pozitif genliğini ölçün.
    NOT: Büyük bir fotopigment molekülü havuzunun senkron aktivasyonu için, foton içeriğini kısa sürede paketlemek için kısa, yoğun bir ışık parlaması gerekir. Mavi flaşla R'den M'ye maksimum fotopigment dönüşümü, R ve M'nin absorpsiyon spektrumundaki örtüşme nedeniyle toplam fotopigment moleküllerinin ~% 80'ine ulaşabilir (Şekil 3A). Bu nedenle, ~ 550 nm'nin altındaki dalga boylarında, ERC'nin iki bileşeni vardır: metarodopsinin tepkisini yansıtan negatif bir faz ve kalan rodopsinin tepkisini yansıtan pozitif bir faz. ERC doğrusal olarak ışık yoğunluğuna bağlıdır (Şekil 5D). Buna göre, R ve M durumlarının spektral duyarlılığını elde etmek için, ERC'nin her fazının eşit enerji29 için çeşitli dalga boylarında normalleştirilmesi gerekir.
  3. 2.1.-2.2 numaralı adımları yineleyin. farklı dalga boylarındaki flaşları kullanarak.
  4. Normalleştirilmiş pozitif ve negatif ERC'yi dalga boyunun bir fonksiyonu olarak çizin.
    NOT: Güçlü ışık parlaması, ışığa duyarlı kanallar boyunca fotoreseptör üzerinde metabolik strese yol açan büyük bir akım indükler ve bu da ışıktan bağımsız kanal açılmasına neden olur. ERC bu kurucu akım üzerine bindirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2, ERG tekniğinin sağlamlığını ve kullanım kolaylığını örneklemektedir. Sağlamdır, çünkü basit bir elektrofizyolojik kurulum gerektiren basit bir hücre dışı voltaj kayıtları tekniği ile neredeyse bozulmamış sinekte kaydedilir. Sağlamlık, mutasyonlar ışık tepkisini güçlü bir şekilde azalttığında veya bozduğunda bile, nispeten büyük genliklere sahip (milivolt aralığında) ışık tepkilerinin kayıtlarının elde edilmesiyle kendini gösterir. Bu nedenle, deneyimsiz bir deneyci bile son derece basit deney düzeneğini kullanabilir ve birkaç gün içinde anlamlı sonuçlar elde etmeyi öğrenebilir. Fotopigment seviyelerini ölçmek için tasarlanan tekniğin temel amacı, PDA (Şekil 2C) ve ERP'nin (Şekil 2C-E) son derece basitleştirilmiş yöntemleriyle elde edilir. Alternatif, yani mikrospektrofotometri, pahalı optik ekipman ve önemli eğitim ve beceri gerektirir (Şekil 3B). ERC (Şekil 5A-D), teknik olarak zor olmasına rağmen, hücre korumasına karşı daha az hassastır; yüksek sinyal-gürültü oranı ve membran kapasitansının ortadan kaldırılması ile karakterizedir.

Figure 1
Şekil 1: Fotokimyasal döngü: fotopigmentin aktivasyonu ve deaktivasyonu. (A) Doygun mavi aydınlatma (dalgalı mavi ok) fotodopsini ( R ) metarodopsine ( M ) dönüştürür. M'nin rodopsin kinaz tarafından çoklu fosforilasyonu ve ardından arrestin 2'nin (ARR2) bağlanması M. Turuncu ışık (dalgalı kırmızı ok) foto-fosforile olmayan M'yi R'ye geri dönüştürür. Fosforile edilmemiş M, heterotrimerik G-proteinini (Gqαβγ) aktive eder, bu da Gqα Gq βγ'dan ayrışmasına ve bağlıGSYİH'nın sitoplazmatik GTP ile değişimine neden olur. Gqα-GTP daha sonra PIP2'yi diasilgliserol (DAG) ve inositol trisfosfata (IP3) hidrolize hidrolize eden fosfolipaz C'yi (PLC) aktive eder, böylece TRP / TRPL kanallarını hala belirsiz bir şekilde aktive eder. Ca2+ kalmodüline bağımlı kinaz (CaMKII), M pp-ARR2 kompleksini fosforile eder ve klatrin bağımlı endositoz ve bozunmaya uğrar. Turuncu ışıklı aydınlatma (dalgalı kırmızı ok), M pp-ARR2 kompleksini fosforile R'ye (Rpp) fotodönüştürerek ARR2'yi sitosola bırakır. Fosforile R (Rpp), rodopsin fosfataz (rdgC) tarafından defosforilasyona uğrar ve fotopigmentin başka bir döngüsü için hazır R üretir. (B) Beyaz gözlü sineğin ERG'sinin derinlik profili, 1 s beyaz uyarana (orta sütun) veya beyaz flaşa (sağ sütun). Uyaranlar, izlerin altındaki çubuklar veya noktalarla gösterilir. İzler derinlik sırasına göre dikey olarak düzenlenir, üst iz korneanın ~ 10 μm altında kaydedilir ve sonraki her kayıt bir öncekinden 25 μm daha derindir. Solda, retina, bazal membran (BM), laminer kabuk, laminer kartuşlar (eğik kesitli) ve medullar kabuğu gösteren başka bir gözden karşılık gelen bir bölümün kamera lucida çizimi vardır. Bu rakam Stephenson ve Pak11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Beyaz gözlü vahşi tip (w1118) ve mutant Drosophila'nın yoğunluk-yanıt ilişkisini, uzamış depolarizan artçı potansiyeli (PDA) ve metarodopsin potansiyelini (M-potansiyeli) gösteren ışık tepkilerinin elektroretinogram (ERG) kayıtları. (A) Bir dizi turuncu ışıkla (OG590 kenar filtresi, turuncu filtre kullanılarak ışık kılavuzunun kenarından yayılan toplam enerji 4 mW idi) elde edilen bir WT (w1118) sineğinin yoğunluk-tepki ilişkisi, -log ölçeğinde belirtilen artan ışık yoğunluğu ile. İç kısım, belirtilen yanıtı daha hızlı bir zaman ölçeğinde gösterir. Giriş: ERG'nin ana bileşenleri, fotoreseptörün hücre dışı voltaj tepkisidir (reseptör potansiyeli), ışık uyaranının başındaki ve sonundaki "açık" ve "kapalı" geçicileri (AÇIK, KAPALI yanıtı) ve glia hücrelerinin (oklar) yavaş tepkisidir. (B) ERG yanıtlarının ortalama tepe genliği, göreceli ışık yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak çizilir. (C) Bir WT (w1118) sineğinin ERP'si, başlangıçta bir PDA'yı indükleyen doygun mavi (BP450/4 nm, mavi filtre kullanılarak ışık kılavuzunun kenarından yayılan toplam enerji 1 mW idi) ışığın uygulanmasıyla elde edildi. ERP (giriş), PDA'yı baskılayan aşağıdaki yoğun (~ 70 J, 2 ms süreli) yeşil flaş (ok, geniş bant 550 nm parazit filtresi) ile elde edildi. Giriş: ERP'nin çeşitli bileşenleri, belirtildiği gibi kornea negatif M1 potansiyelini ve pozitif M2 potansiyelini içerir. Geçici ("AÇIK" yanıtı) üzerinde bir kalıntı da belirtilir. (D-E) M potansiyelinin indüksiyonu için fotopigment dönüşümü gereklidir: (D) M potansiyeli, mavi adaptasyonu takiben yeşil (geniş bant 550 nm girişim filtresi) bir flaşla elde edildi, ancak WT (w1118) sineğinde mavi adaptasyondan sonra mavi (BP450/4 nm) flaşla elde edilmedi. (E) D protokolü WT (w1118, siyah iz) ve iki mutant sinek (PLC null mutant, norpAP24, turuncu iz ve hipomorfik rodopsin mutant, ninaEP318, kırmızı iz) olarak tekrarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sinek ve barnacle fotopigmentlerinin absorpsiyon spektrumları. (A) Sinek rodopsinin (R) ve metarodopsinin (M) nispi absorpsiyon spektrumları, fark spektrumunun ve foto-denge spektrumunun fotometrik ölçümlerinden hesaplanmıştır. Bu rakam Selinger ve Minke35'ten değiştirilmiştir. (B) Tepe dalga boyları 492 nm ve 532 nm olan iki Dartnall nomogramı, sırasıyla 1.63: 1'lik bir tepe absorpsiyonu oranıyla. Bu eğriler arasındaki fark, tek renkli mavi (442 nm) ve turuncu (596 nm) adaptasyonun doyurulmasından sonra 400-650 nm aralığında iletim ölçümleriyle elde edilen barnacle Balanus eborneus'un ocellisinden ölçülen fark spektrumuna en iyi uyumu sağlar. Bu rakam Minke ve Kirschfeld36'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: Nina, ina ve Arr2 mutantlarının PDA fenotipi. (A) Drosophila'da PDA'nın indüksiyonu ve baskılanması protokolü. PDA indüksiyon protokolü, maksimum yoğunluklu turuncu ışık darbesi (590 kenar filtresi, turuncu filtre kullanılarak ışık kılavuzunun kenarından yayılan toplam enerji 4 mW, turuncu çubuk idi) kullanılarak yapılan bir ilk aydınlatmadan oluşur ve ardından maksimum yoğunlukta mavi ışığın üç darbesinin uygulanmasından (2. ve 3. darbeler maksimumPDA'ya ulaşmanın doğrulanması içindir, BP450/40 nm filtre, mavi filtre kullanılarak ışık kılavuzunun kenarından yayılan toplam enerji 1 mW, üç mavi çubuk idi). PDA bastırması, turuncu ışık darbesinin uygulanması ve ardından ek bir turuncu ışığın (iki turuncu çubuk) uygulanmasıyla elde edildi. PDA indüksiyon ve baskılama protokolü, R1-6 fotopigmentinin yapısal geni ninaEP318 7'nin (orta) beyaz gözlü mutantında tekrarlandı. PDA indüksiyon ve baskılama protokolü, göze özgü protein kinaz C (PKC32) inaCP209'un (altta) beyaz gözlü null mutantında da tekrarlandı. (B) Beyaz gözlü WT (W1118) ile boş Arr2 mutantı (Arr23) arasında bir PDA'nın indüksiyonu için gereken mavi ışık miktarı arasındaki karşılaştırma. Alternatif turuncu (doygun 590 kenar filtresi) ve mavi (BP450/40 nm) ışık yoğunluklarının (göreceli günlük ölçeğinde ND) ışık darbelerinden oluşan bir tren. -log 1 yoğunluğundaki mavi ışıkta, bir PDA indüklenir (üstte). Üst iz paradigması, PDA'nın ~ 10 kat kısık ışık (-log 2) yoğunluğunun (altta) mavi ışığında indüklendiğini gösteren Arr23 mutantında tekrarlandı. (C) Sabit yoğunluktaki loş (-log 2) mavi ışık darbelerinden oluşan bir tren, W1118 fly'da (solda) bir PDA'yı indükleyemezken, aynı loş mavi ışık treni, Arr23 mutantındaki (sağda) 1. ışık darbesiyle bir PDA'yı indükledi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Beyaz gözlü WT'den (w1118) kaydedilen izole ommatidianın ışık yanıtlarının yama-kelepçeli tüm hücre kayıtları, erken reseptör akımının (ERC) oluşumunu ve yoğunluk-yanıt ilişkisini göstermektedir. (A) WT sineğinin izole ommatidiyumundan (w1118) bifazik ERC yanıtının mikrosaniyenin altında gecikme ile yama-kelepçeli tüm hücre kayıtları. Işık uyaranı, sarı-yeşile (546 nm ışıkta pik emilimli geniş bant filtresi, siyah iz) güçlü adaptasyondan sonra uygulanan yoğun (~ 220 J, 0.8 ms süreli) mavi ışık flaşı (425 nm'de pik emilimli geniş bant filtresi, ok) stimülasyonundan oluşur. Işık başlangıcında, hızlı-negatif bir elektrik artefaktı gözlenir. Negatif faz M'nin aktivasyonundan kaynaklanır ve pozitif faz R'nin aktivasyonundan kaynaklanır. Işık kaynaklı akımın (LIC) aktivasyonu, ışığa duyarlı kanalların açılmasından kaynaklanan gecikmiş negatif faz ile kendini gösterir. NinaEI17 null mutant, izole ommatidiuma (kırmızı iz) uygulanan aynı ışık parlamasına ERC yanıtının eksikliğini gösterdi. (B) (A) ile aynı hücreden kaydedilen Rh1 fotopigmentlerinin ERC ölçümü. Siyah iz, mavi ışığa güçlü adaptasyondan sonra WT (w1118) sineğinin turuncu flaş uyarımına monofazik negatif yanıt (M durumu) gösterir. (C) Beyaz flaş ışıklarının artan yoğunluğuna yanıt olarak R1-6 sinek fotoreseptörlerinde farelerin melanopsin fotopigmentini (opn4) ektopik olarak eksprese eden transgenik Drosophila'nın (opn4; ninaEI17) tek bir fotoreseptör hücresinden ölçülen bifazik ERC izlerinin örneği (göreceli -log I ölçeğinde; ND, nötr yoğunluk filtrelerini gösterir). Flaş başlangıcı ok ile gösterilir. (D) Işık yoğunluğundaki artış, opn4;ninaEI17'nin ERC genliğindeki doğrusal bir artışla kendini gösterdi. ERC yanıtlarının negatif fazının (log ölçeği) ortalama tepe genliğinin göreceli ışık yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak grafiği (I / Imax, ayrıca log ölçeğinde). Sürekli düz çizgi, deney noktalarına en iyi uyan doğrusal bir regresyon eğrisini temsil eder (R2 = 0.99, hata çubukları SEM, n = 5'tir). Bu rakam Yasin ve ark.29'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Sinek fiksasyonu ve kayıt pipeti hazırlığı için gerekli alet ve cihazlar. (A) Fly sleeper sistemi; (B) Sinek yataklı sistem pedalı; (C) Soğuk ışık kaynağı; (D) Stereoskopik mikroskop; (E) Balmumu filamentli ısıtıcı; (F) Lehimleme demiri; (G) Balmumu filament ısıtıcı pedalı; (H) Kaba cımbız; (I) Manyetik sinek standı; (J) Düşük erime sıcaklığı balmumu; (K) Hassas mendiller; (L) Dikey pipet çektirme; (M) Uzun uçlu şırınga; (N) Elektrot tutucular; (O) Borosilikat cam kılcal damarlar; (P) Sabit sinek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: ERG kurulumuna genel bakış. (A) Darbe jeneratörü; (B) Bilgisayar; (C) A/D dönüştürücü; (D) Yükselteç; (E) Stereoskopik mikroskop; (F) Mikromanipülatör (mekanik incelik); (G) Baş ayaklı mikroelektrot preamplifikatör sistemi; (H) Titreşim önleyici masa; (I) Açık / Kapalı mıknatıs bloğu; (J) Mikromanipülatör (mekanik kaba); (K) Faraday kafesi; (L) Xenon ışık kaynağından ışık kılavuzu; (M) Flaş ışığı sisteminden ışık kılavuzu; (N) Topraklama elektrot tutucusu; (O) Işık dedektörü; (P) Kayıt elektrot tutucusu; (Q) Manyetik sinek standı; (R) Ksenon lamba güç kaynağı; (S) Renk ve ND filtreleri standı; (T) Optik tezgah; (U) Flaş Lambası sistemi; (V) Deklanşör sürücüsü; (W) Lamba güç kaynağı; (X) Xenon flaş ışığı sistemi Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ringer'ın çözümü
Reaktif Konsantrasyon (mM)
Arjantin 130
Kartal 2
MgCl2 5
CaCl2 2
HEPES 10
NaOH ve HCl kullanarak 7,15'e kadar pH titrasyonu

Tablo 1: Ringer çözeltisinin bileşimi.

Ek Dosya 1: Balmumu eriyik regülatörünün devre şeması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila fotoreseptör preparatını kullanmanın en büyük avantajı, erişilebilirliği, ışık stimülasyonunun kolaylığı ve doğruluğu ve en önemlisi, moleküler genetiğin gücünü uygulama yeteneğidir7. Kapsamlı genetik çalışmalar, Drosophila'yı karmaşık biyolojik süreçlerin genetik diseksiyonu için son derece yararlı bir model sistem olarak kurmuştur7. Drosophila genomunun nispeten basit yapısı (X ve Y cinsiyet kromozomları, iki büyük otozomal element, kromozom 2 ve 3 ve küçük nokta dördüncü kromozom dahil olmak üzere sadece dört kromozomdan oluşur), büyüme kolaylığı ve hızlı üretim süresi (24 ° C'de ~ 2 hafta), Drosophila'yı çok sayıda mutajenize bireysel sineği taramak için uygun hale getirir. Dahası, izole edilmiş herhangi bir mutasyonun izolasyonu ve bakımı, baskın belirteçler ve çoklu inversiyonlar içeren, doğal kromozomlarla rekombinasyonu önleyen dengeleyici kromozomların üretilmesi nedeniyle mümkün hale gelir. Mevcut moleküler araçlar, in vitro modifiye gen ürünlerinin doğal hücresel ortamlarında incelenmesine izin vermiştir37. Bu güçlü metodoloji, aksi takdirde tahmin edilmesi zor olacak yeni proteinlerdeki kusurları olan çok sayıda mutant sinek üretti7.

Fotopigment seviyelerinin ve ışığa duyarlılığın ölçümleri için ERG'yi kullanmanın en büyük avantajı, basitliği ve uygulama kolaylığı ve büyük sinyal-gürültü oranıdır. ERG kullanmanın dezavantajı, fotoreseptörlerden kaynaklanan ışık tepkisinin dalga formunu bozan heterojenik hücresel kökenidir9. Gerilim-kelepçeli tüm hücre kayıtlarının en büyük avantajı, akım-gerilim (I-V) ilişkisini ölçerek iletkenlik değişimini elde etme yeteneğidir. Aydınlatma sırasında ve sonrasında TRP ve TRPL kanallarının açılması ve kapanması bu ölçümle yansıtılır13. Ek olarak, kayıt pipetinin düşük direnci (~ 10 MΩ) ve akımların ölçümü nedeniyle yüksek bir sinyal-gürültü oranı elde edilir ve bu da etkili ışık yoğunluğunu kalibre etmek için yararlı olan kuantum çarpmalarının (tek foton tepkileri) güvenilir ölçümlerine izin verir38. Yama kelepçeli tüm hücre kayıtlarının önemli bir dezavantajı, ERG kayıtları aşırı ışık yoğunlukları altında bile saatlerce saklanabilirken, 15-30 dakikadan fazla güvenilir yama kelepçeli tüm hücre kayıtlarını gerçekleştirmenin zor olması ve uzun süreli kayıtlar için loş ışık stimülasyonunun gerekli olmasıdır. Tüm hücre kayıtlarını elde etmek için, kayıt pipeti ile fotoreseptör membranı arasında doğrudan temas gereklidir. Ommatidia34'ü çevreleyen pigment (glial) hücrelerinin çıkarılmasıyla doğrudan temas sağlanır (Şekil 1B). Pigment hücresinin çıkarılması metabolik strese neden olur, çünkü fotoreseptör hücre adenozin trifosfat (ATP) üretimi için gerekli metabolitleri sentezleyemez ve metabolik arzı bozar39. TRP ve TRPL kanalları anoksiye karşı savunmasız olduğundan ve ATP tükenmesi nedeniyle karanlıkta kendiliğinden kolayca açıldığından, izole ommatidia kullanımı büyük zorluk doğurmaktadır40,12. Tüm prosedür loş kırmızı ışık altında yapılmalıdır, çünkü ışık tepkisi büyük miktarda ATP34 tüketimine neden olur.

Fototransdüksiyon kaskadındaki mutasyonların çoğu, ışığa duyarlılıkta bir azalmaya neden olur. Işığa duyarlılıktaki bu azalma, yoğunluk-tepki ilişkisinin ölçülmesine dayanan bir ekran tarafından kolayca tespit edilebilir. Yoğunluk-tepki paradigmaları, logaritmik ölçekte artan yoğunlukta tekrarlanan ışık stimülasyonları ile elde edilir. Işığa adaptasyonu önlemek için turuncu ışığın yoğunluğunun arttırılması (ve azalmaması) gerekir. ERG (M-potansiyeli) ve PDA, fotopigment seviyelerini ölçmek için oldukça basit yöntemlerdir. Alternatif, yani mikrospektrofotometri36, pahalı optik ekipman ve önemli eğitim ve beceri gerektirir.

Sonuç olarak, ERG uygulanması basit ancak nispeten yanlış bir araçtır. Tüm hücre kaydı31 , ERC kullanarak fotopigment seviyelerini ölçmek için doğrudur ve ERG'nin yanlışlığını ve sınırlamalarını telafi etmek için gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu araştırma, İsrail Bilim Vakfı (ISF) ve Amerika Birleşik Devletleri-İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı (BSF) tarafından desteklenmiştir. Balmumu filament ısıtıcısının yapımı için Bay Anatoly Shapochnikov'a teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Tags

Nörobilim Sayı 184
<em>Drosophila</em> Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B.… More

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter