Summary
La destruction de cellules spécifiques dans l’embryon est un outil puissant pour étudier les interactions cellulaires impliquées dans le destin cellulaire. Le présent protocole décrit les techniques d’ablation au laser de cellules ciblées dans l’embryon précoce de l’algue brune Saccharina latissima.
Abstract
Chez Saccharina latissima, l’embryon se développe sous la forme d’une feuille cellulaire monocouche appelée la lame ou lame. Chaque cellule embryonnaire est facile à observer, facilement reconnaissable de ses voisines et peut être ciblée individuellement. Pendant des décennies, l’ablation au laser a été utilisée pour étudier le développement embryonnaire. Ici, un protocole d’ablation au laser spécifique aux cellules a été développé pour les embryons précoces de l’algue brune S. latissima. Les travaux présentés comprennent: (1) la préparation d’embryons de Saccharina , avec une description des paramètres critiques, y compris les conditions de culture, (2) les paramètres d’ablation au laser, et (3) la surveillance de la croissance ultérieure de l’embryon irradié à l’aide de la microscopie time-lapse. En outre, des détails sont fournis sur les conditions optimales pour le transport des embryons de la plate-forme d’imagerie vers le laboratoire, ce qui peut affecter profondément le développement ultérieur des embryons. Les algues appartenant à l’ordre des Laminariales présentent des schémas d’embryogenèse similaires à saccharina; ce protocole peut ainsi être facilement transféré à d’autres espèces de ce taxon.
Introduction
L’ablation au laser est utilisée depuis des décennies pour étudier le développement embryonnaire. L’irradiation des cellules embryonnaires à l’aide d’un faisceau laser permet de surveiller le potentiel de régénération et la modification de la lignée cellulaire au cours de l’embryogenèse et d’étudier l’impact de l’ablation ciblée sur la division cellulaire et le devenir cellulaire. Les organismes modèles utilisés dans les méthodes d’ablation au laser sont généralement des animaux, tels que les insectes 1,2, les nématodes 3,4, les vertébrés 5,6 et parfois les plantes 7,8. De plus, une approche de micro-ablation au laser a été utilisée sur l’algue brune Fucus en 1994 et 1998 pour démontrer le rôle de la paroi cellulaire dans la photopolarisation de l’embryon précoce 9,10.
Les algues brunes appartiennent au groupe des Stramenopiles, qui ont divergé à la racine de l’arbre eucaryote il y a 1,6 milliard d’années. En conséquence, ils sont phylogénétiquement indépendants des autres organismes multicellulaires, tels que les animaux et les plantes11. Saccharina latissima appartient à l’ordre des Laminariales, plus communément appelés varechs, et ils sont parmi les plus grands organismes sur terre, atteignant des tailles de plus de 30 m. Saccharina sp. est une grande algue utilisée pour de nombreuses applications telles que l’alimentation humaine et animale, et ses polysaccharides sont extraits pour être utilisés dans les industries agricoles, pharmacologiques et cosmétiques du monde entier12, 13. Sa culture, principalement en Asie et plus récemment en Europe, nécessite la préparation d’embryons dans des écloseries avant de relâcher des juvéniles en pleine mer. Comme tous les varechs, il a un cycle de vie biphasique composé d’une phase gamétophytique microscopique, au cours de laquelle un gamétophyte haploïde se développe et produit des gamètes pour la fécondation, et d’une phase sporophytique macroscopique diploïde, où une grande lame plane se développe à partir de sa retenue attachée au fond marin ou aux rochers. Le sporophyte libère des spores haploïdes à maturité, complétant ainsi le cycle de vie 14,15,16.
S. latissima présente des caractéristiques morphologiques intéressantes17. Son embryon se développe sous la forme d’une feuille plane monocouche 15,18,19 avant d’acquérir une structure multicouche coïncidant avec l’émergence de différents types de tissus. De plus, Laminariales est l’un des seuls taxons d’algues brunes dont les embryons restent attachés à leur tissu gamétophyte maternel (Desmarestiales et Sporochnales en font trop15). Cette fonctionnalité offre l’occasion d’étudier le rôle du tissu maternel dans ce processus de développement et de comparer les mécanismes de contrôle maternel chez les algues brunes avec ceux des animaux et des plantes.
Cet article présente le premier protocole complet pour l’ablation au laser dans un embryon de varech précoce. Ce protocole impliquant la technique UV ns-pulsed entraîne la destruction spécifique de cellules embryonnaires individuelles pour étudier leurs rôles respectifs au cours de l’embryogenèse. La procédure offre une approche fiable pour étudier les interactions cellulaires et le devenir cellulaire au cours de l’embryogenèse chez les laminariales.
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Protocol
1. Production de Saccharina latissima gametophytes
- Recueillir des sporophytes matures de S. latissima dans la nature comme décrit précédemment20,21. Assurez-vous que les sporophytes sélectionnés sont dépourvus d’épiphytes (petits organismes visibles à la surface de la lame) ou de parasites internes (présents dans les zones blanchies ou les taches sur la lame).
- À l’aide d’un scalpel, coupez la partie la plus sombre au centre de la lame (tissu fertile producteur despores 22) en 1 à 5 morceaux carrés (1 cm²), en évitant toute tache blanchie, le cas échéant.
- Enlevez les épiphytes restants en nettoyant doucement les morceaux coupés avec le dos d’un scalpel et du papier absorbant.
- Placez les morceaux nettoyés dans un plat en verre rempli d’eau de mer naturelle stérile (voir tableau des matériaux) pendant 45 minutes pour libérer des spores à la suite du rapport22 publié précédemment.
- Retirez les morceaux de lame et filtrez l’eau de mer à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour éliminer les débris ou les organismes indésirables.
- Diluer les spores dans le filtrat à une concentration de 20-40 spores/mL dans des boîtes de Petri en plastique22.
- Placer la solution de spores dans une armoire de culture (voir Tableau des matériaux) configurée avec les conditions de culture optimales (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, photopériode 16:8 L:D).
- Laissez les spores germer et se développer en gamétophytes.
REMARQUE: La germination des spores est visible après 2 jours dans l’armoire et la première division cellulaire des cellules gamétophytes se produit généralement dans les 48 heures suivantes. - Remplacer le milieu de croissance après 5 jours par de l’eau de mer naturelle microfiltrée enrichie d’une solution de Provasoli 0,5x (NSW1/2) (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Pour éviter de répéter ces étapes, des gamétophytes mâles et femelles spécifiques peuvent être sélectionnés et propagés végétativement pendant plusieurs mois. Les gamétophytes restent végétatifs lorsqu’ils sont cultivés sous lumière rouge (4 μE.m-2.s-1 avec une longueur d’onde d’au moins 580 nm)23 dans les mêmes conditions de culture décrites ci-dessus (étape 1.7).
2. Fragmentation et induction de l’oogenèse
- Récoltez les gamétophytes avec un grattoir cellulaire.
- À l’aide d’un petit pilon en plastique, écrasez les gamétophytes collectés dans un tube de 1,5 mL en morceaux de 4 à 5 cellules.
- Remplissez le tube avec 1 mL NSW1/2 (étape 1.9).
- Ajouter 2,5 μL de la solution de gamétophyte broyée dans 3 mL d’eau de mer naturelle enrichie de 1x solution de Provasoli (NSW) et les placer dans une boîte de Pétri.
REMARQUE: Une boîte de Petri à fond de verre de 25 mm est recommandée pour une manipulation plus facile. - Placer les plats préparés dans une armoire de culture et induire la gamétogenèse à 13 °C sous une lumière blanche d’une intensité de 24 μE.m-2.s-1 (lumière tamisée, photopériode 16:8 L:D).
REMARQUE: La première gametangia (oogonie femelle et archégonie mâle) peut être observée après 5 jours. Le mâle est hyper-ramifié avec de petites cellules, et la femelle est composée de cellules plus grandes formant de longs filaments15,22. Les premiers œufs sont observés ~ 10 jours plus tard, et la première division de zygotes se produit généralement dans les 2 jours suivants. - Six jours après avoir observé les premiers œufs, transférer la vaisselle dans des conditions de lumière blanche plus vive : 50 μE.m-2.s-1, photopériode 16:8 L:D, toujours à 13 °C.
3. Acquisition d’images pour la sélection d’embryons à ablation et le suivi de la croissance ultérieure
- Imagez l’ensemble de la boîte de Pétri pour (re)localiser les embryons sélectionnés lors de l’étape d’ablation (pas besoin de renvoyer la boîte au microscope oculaire) et surveiller le développement ultérieur des embryons sélectionnés.
REMARQUE: Utilisez un microscope confocal à balayage laser inversé (voir tableau des matériaux) pour l’imagerie (Figure 1), et l’ablation au laser est décrite à l’étape 5. - Placez la boîte de Petri sur la scène et orientez-la avec une marque visuelle (par exemple, tracez une ligne avec un marqueur permanent).
- Utilisez l’objectif 10x/0,45 pour vous concentrer sur un embryon. Notez la position des quatre points cardinaux de la boîte de Pétri.
- Lancez l’analyse des vignettes. Acquérir des images transmises/fluorescentes de l’ensemble de la boîte de Petri à basse résolution : 256 x 256 pixels, un temps de séjour en pixels de 1,54 μs avec balayage bidirectionnel et un zoom numérique de 0,6x à l’aide d’un laser de 561 nm à 1,2 % de transmission.
REMARQUE: Le temps de numérisation pour une boîte de Petri entière de 2,5 cm est d’environ 6 min pour 225 tuiles (Figure 2). Ici, le laser 561 nm a été utilisé pour l’imagerie par transmission et fluorescence. Le signal de fluorescence a été collecté entre 580 et 720 nm sur les photomultiplicateurs confocaux (PMT) et la lumière transmise a été collectée sur les PMT transmis. Le laser 561 nm peut également surveiller la chlorophylle à cette étape, mais il est inutile car il aide seulement à distinguer correctement le bruit du signal et les organismes. - Enregistrez l’image de numérisation par vignette et gardez-la ouverte dans la fenêtre du logiciel d’acquisition d’images (voir Tableau des matériaux).
- Changez l’objectif, ne retirez pas la boîte de Pétri.
REMARQUE: L’objectif d’eau 40x / 1.2 a été déplacé sur le côté de la scène afin que le milieu d’immersion (eau) puisse être ajouté à l’objectif sans déplacer la boîte de Petri de sa position initiale. - Parcourez l’image de numérisation de tuile précédemment acquise pour sélectionner l’embryon approprié. Une fois qu’un embryon a été identifié sur cette image, déplacez la scène à la position exacte de l’embryon et acquérez des images transmises / fluorescentes de cet embryon à haute résolution.
REMARQUE: Paramètres haute résolution: 512 x 512 pixels, 0,130 μm / pixel, temps de séjour de 0,208 μs pixel avec balayage monodirectionnel et zoom numérique 2x à l’aide d’un laser 561 nm à 0,9% de transmission. - Annotez l’image de balayage par tuile pour chaque embryon candidat à l’ablation au laser (Figure 2B) et passez à l’étape d’ablation au laser.
4. Calibrage laser
- Calibrez le laser et synchronisez le logiciel d’acquisition d’images avec le logiciel du pilote laser en mode " Click & Fire " et un laser pulsé de 355 nm.
REMARQUE: Cette étape est cruciale pour assurer une synchronisation parfaite entre la position du curseur de la souris dans le logiciel du pilote laser (voir Tableau des matériaux) et la position dans l’image en direct du logiciel d’acquisition. - Ouvrez le progiciel du pilote laser et cliquez sur Live in the image acquisition software package.
- Synchronisez les deux progiciels en cliquant sur Démarrer l’acquisition dans le progiciel du pilote laser. L’image en direct est désormais également enregistrée dans le logiciel de pilote laser UV.
- Définissez une zone d’intérêt (AOI) en cliquant sur le bouton Choisir AOI et en cliquant sur les bords de l’image (droite, gauche, haut et bas) dans le progiciel du pilote laser UV.
REMARQUE: Après cette étape d’étalonnage, les paramètres de taille de pixel, de format d’image et de zoom dans le progiciel d’acquisition doivent rester constants. - Sélectionnez une zone vide sur le plat et abaissez le niveau de la scène à 20 μm sous le plan focal de l’échantillon pour vous concentrer sur le fond en verre.
- Réglez les trajectoires du laser d’ablation et du laser d’imagerie en cliquant sur Démarrer l’étalonnage et choisissez Étalonnage manuel.
- Sélectionnez une puissance laser suffisamment élevée pour voir un point noir au centre de l’image en direct correspondant au trou dans le couvercle en verre (tous les volets doivent être ouverts).
- Cliquez sur ce point noir central avec le curseur de la souris et cliquez sur 18 points supplémentaires proposés par le logiciel pour compléter la procédure d’alignement.
- Vérifiez l’étalonnage en « Mode Click & Fire » sur le même couvercle.
REMARQUE: L’étalonnage laser dépend des paramètres d’imagerie. Une fois le laser étalonné, assurez-vous que les paramètres d’imagerie (c.-à-d. 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel avec balayage monodirectionnel et zoom numérique 2x) n’ont pas changé.
5. Ablation au laser
- Sélectionnez un embryon d’intérêt. Démarrez un enregistrement en accéléré dans le logiciel d’acquisition d’images.
- Acquérir des images transmises/fluorescence avec un objectif de 40x/1,2 W à haute résolution (c.-à-d. 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel de temps d’arrêt avec balayage monodirectionnel et zoom numérique 2x à l’aide d’un laser de 561 nm à 0,9 % de transmission). Acquérir l’enregistrement en accéléré à la vitesse maximale.
- Effectuez un zoom arrière sur la zone au début de l’enregistrement en accéléré. Zoomez sur l’AOI.
- Utilisez la fonction « Click & Fire » du logiciel de pilote laser pour appliquer l’irradiation dommageable sur la cellule d’intérêt de l’embryon. Utilisez les paramètres suivants : 45 % de transmission laser (correspondant à un maximum de 40 μW) et une durée d’impulsion de 1 ms (étape 4).
REMARQUE: L’enregistrement vidéo pendant la prise de vue laser est recommandé. - Sous 688 nm, surveiller l’éjection des chloroplastes autofluorescents du cytoplasme.
- Si le contenu de la cellule reste dans la cellule, utilisez à nouveau la fonction « Click & Fire » pour augmenter la taille de la brèche dans la cellule. Répétez l’opération, en maintenant le nombre de tirs au minimum jusqu’à ce que la plupart du contenu de la cellule ait été libéré.
- Arrêtez l’enregistrement en accéléré une fois que l’embryon s’est stabilisé (c’est-à-dire qu’aucun autre mouvement intracellulaire ne peut être détecté (~ 1-5 min).
- Mettez à jour l’annotation sur l’image de numérisation de vignette, si nécessaire.
6. Surveillance de la croissance des embryons irradiés
REMARQUE: La surveillance est effectuée sur plusieurs jours.
- Déterminez le taux de survie en surveillant le nombre d’embryons qui se développent après l’ablation au laser et comparez-les à ceux qui meurent.
REMARQUE: Certains embryons meurent immédiatement après l’ablation pour diverses raisons. Un taux de mortalité élevé et rapide est généralement le signe de paramètres laser inappropriés ou d’une exposition plus élevée ou plus longue au stress pendant l’expérience ou le transport ultérieur. - Déterminez le retard de croissance en mesurant la longueur des embryons tirés au laser chaque jour et en la comparant à des embryons intacts.
REMARQUE: Le taux de croissance des organismes à tir laser est généralement plus lent que celui des organismes non traités. Cependant, certains réglages laser (inappropriés) peuvent inhiber la croissance pendant plus d’une semaine, la croissance reprenant après cela. - Découvrez les dommages adjacents en surveillant la réaction des cellules adjacentes aux cellules ablées. Dans certains cas, la dépressurisation post-éclatement peut provoquer l’éclatement des cellules voisines.
- Vérifiez s’il y a des contaminations microbiennes. Surveiller la croissance des microalgues et des bactéries dans le milieu. Si un niveau inhabituel de microbes est présent dans le plat, jetez-le et répétez le protocole de l’étape 2 ou de l’étape 3.
REMARQUE: Après l’ablation au laser, les embryons de S. latissima endommagés sont déjà très stressés et un stress externe supplémentaire peut entraîner une mortalité accrue. Des épidémies bactériennes ou virales sont possibles parce que les embryons traités ne peuvent pas se développer dans des conditions axeniques. - Vérifier le développement global des organismes grenailleux en étudiant le phénotype et en comprenant le rôle dans le développement de la région ciblée.
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Representative Results
Des gamétophytes de S. latissima ont été cultivés et la gamétogenèse a été induite pour produire des zygotes et des embryons. Douze jours après l’induction de la gamétogenèse, les embryons ont subi une ablation au laser. Ici, l’expérience visait à évaluer le rôle de cellules spécifiques dans le développement global des embryons de S. latissima . Les cellules les plus apicales, les cellules les plus basales et les cellules médianes ont été ciblées. Après le balayage des carreaux, l’ensemble de la boîte de Petri (Figure 2A), un embryon d’intérêt, a été identifié comme un candidat approprié pour la prise de vue au laser (Figure 2B). Une cellule spécifique de cet embryon a été choisie, ciblée et filmée avec un faisceau laser UV pulsé d’une puissance laser maximale de 40 μW (correspondant à 45% de la puissance maximale pour l’équipement utilisé ici) pendant 1 ms (film 1). La cellule a libéré son contenu (chloroplastes et cytoplasme). Fait intéressant, les cellules adjacentes ont réagi à l’éclatement de la cellule irradiée en s’étendant dans l’espace intercellulaire. La position des embryons irradiés a été enregistrée pour une surveillance ultérieure sur 10 jours (figure 3). La plupart des embryons irradiés ont continué à se développer, mais ont montré une altération de la croissance (forme de l’embryon). Une analyse détaillée des changements morphologiques doit être entreprise avant qu’une fonction spécifique puisse être attribuée à chaque cellule irradiée dans le contrôle du mécanisme global de développement.
En revanche, les embryons ont été testés avec d’autres paramètres laser (par exemple, 33 ms pour la durée de prise de vue de 60% à 80% de puissance laser; Le film 2) a rapidement montré des signes de stress sévère tels que le blanchiment des cellules, la décoloration ou les changements de forme (arrondi). Presque tous les embryons ainsi abattus sont morts dans les cinq jours suivant l’expérience (Figure 4).
Figure 1: Photographie de la configuration du microscope d’ablation laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Balayage annoté des carreaux d’une boîte de Pétri entière. (A) Balayage par tuiles de l’ensemble de la boîte de Pétri utilisée pour l’ablation au laser. La transmission PMT a été utilisée pour obtenir un balayage en champ clair. Une fois qu’un embryon d’intérêt a été localisé, l’utilisateur clique sur la position de l’embryon dans le scan de tuiles, et le logiciel positionne la scène directement sur l’embryon. (B) Le scan de tuiles peut ensuite être annoté spécifiquement pour localiser l’embryon dans les étapes suivantes, pour suivre et surveiller l’embryon. Ici, l’image montre un embryon attaché au fond de la boîte de Pétri, qui peut être facilement localisé à l’aide du laser 561 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Série chronologique de l’embryon de S. latissima en croissance après irradiation. Ceci est montré dans le film 1. L’ablation au laser de la cellule la plus apicale de l’embryon n’a pas blanchi les cellules adjacentes de l’embryon. Ils ont continué à grandir et à se diviser, formant un embryon normal après quelques jours. Des images ont été prises toutes les 24 heures, 2 à 9 jours après l’ablation. La barre d’échelle est de 50 μm et est la même pour toutes les photos. D2-D9 correspond au jour 2 au jour 9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Série chronologique de la mort embryonnaire de S. latissima après ablation au laser à l’aide de paramètres sous-optimaux. La surexposition à l’irradiation laser peut facilement entraîner des taux de mortalité plus élevés de l’embryon cible et des embryons voisins. Une série chronologique de l’embryon filmé dans le film 2 est montrée, avec le temps après l’ablation indiqué au-dessus de chaque photo (3-6 jours après l’ablation). La barre d’échelle est de 30 μm et s’applique à chaque photo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film 1: Ablation au laser de la cellule la plus apicale d’un embryon à 8 cellules de S. latissima. L’accent a d’abord été mis sur l’embryon sélectionné parmi un bouquet de sporophytes de Saccharina (à différents champs, d’abord larges, puis étroits). La cellule la plus apicale de l’embryon a ensuite été abattue en utilisant une puissance laser de 45% pendant 1 ms. La cellule apicale a rapidement éclaté et a libéré son contenu. Les cellules adjacentes, libérées de la turgescence de la cellule éclatée, remplissaient l’espace vide. Après 5 min, la cellule et son contenu ont cessé de bouger et ont atteint un état d’équilibre. Le film a été accéléré 4 fois (de 1 image par 632 ms à 6 ips). Le suivi du développement embryonnaire est illustré à la figure 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 2: Blanchiment important des cellules adjacentes à une cellule éclatée causé par des réglages laser sous-optimaux. L’utilisation d’une puissance laser de 60% à 80% pendant 1 ms ou d’une puissance laser de 45% pendant 10 ms a entraîné un blanchiment significatif des cellules adjacentes et un taux de survie beaucoup plus faible. Les réglages utilisés pour le laser ne doivent pas causer de blanchiment ou de dommages partiels aux cellules adjacentes. Les meilleurs résultats ont été obtenus en réduisant la puissance et/ou la durée de l’impulsion laser et en ciblant le point le plus éloigné des cellules adjacentes. Ici, la cellule la plus apicale d’un embryon à 4 cellules de S. latissima estabattue (80% de puissance laser, 1 ms) (vue latérale / supérieure). Le surblanchiment des cellules inférieures et latérales est facilement observable. Le développement ultérieur de l’embryon est illustré à la figure 4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Figure supplémentaire 1 : Organigramme schématique de l’ensemble du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’ablation laser cellulaire locale permet une ablation temporelle et spatiale avec un haut niveau de précision. Cependant, son efficacité peut être entravée par la non-accessibilité des cellules cibles; par exemple, toutes les cellules sont d’un embryon tridimensionnel. Ce protocole a été développé sur l’embryon de l’algue Saccharina latissima, qui développe une lame monocouche dans laquelle toutes les cellules peuvent être facilement distinguées et détruites individuellement avec un faisceau laser.
Puissance et longueur d’onde du laser
Le laser nIR à impulsion fs est couramment utilisé dans les études de développement sur les animaux24,25. Cependant, dans le cas d’algues brunes telles que Saccharina, le laser ne pouvait pas éclater la cellule sans brûler l’embryon entier. Cette réaction peut être liée à la forte activité des moissonneuses-batteuses de lumière chloroplaste.
En utilisant le laser UV à impulsion ns pour l’ablation, deux approches ont été testées: (1) en utilisant une impulsion de haute puissance sur une courte période de temps ou (2) en utilisant une exposition laser plus faible sur une plus longue période de temps. L’énergie délivrée par le laser, une combinaison de puissance laser et de durée d’impulsion, a un impact sur l’énergie délivrée à la cellule irradiée. L’énergie délivrée peut également affecter les cellules environnantes par réflexion et diffraction. Par conséquent, les paramètres les plus bas des deux paramètres qui ont donné des résultats reproductibles ont été sélectionnés pour réduire les effets collatéraux indésirables. La puissance laser entre 25-40 μ W.cm-2 avec une impulsion de 1 ms semblait optimale. En utilisant ces paramètres, l’effet du laser UV a été contenu à un niveau très local sans blanchiment visible dans les cellules environnantes, mais suffisamment efficace pour provoquer l’éclatement de la cellule cible. Ces paramètres ont été appliqués à plusieurs reprises sans aucun effet létal direct sur les embryons. Des temps d’impulsion plus longs ou une puissance laser plus élevée ont provoqué le blanchiment des cellules environnantes ou même la mort de l’embryon, alors que des valeurs plus faibles étaient insuffisantes pour briser la paroi cellulaire.
Matériel algal et conditions de culture
Bien que permettant une prise de vue précise au niveau subcellulaire, cette technique nécessite que l’expérimentateur aborde quatre facteurs critiques pour permettre une interprétation fiable des résultats. Ces points doivent être pris en compte avant et après l’expérience d’ablation au laser.
Le premier facteur à prendre en compte est la densité de la population embryonnaire. L’encombrement négatif a un impact sur le taux de développement de S. latissima26. De faibles densités permettent (1) une meilleure répétabilité du pouls car la présence d’autres embryons dans le trajet laser peut diminuer sa puissance, et (2) une surveillance plus facile des embryons tirés par le laser, qui se développent légèrement plus lentement que les embryons intacts; ce dernier recouvrant rapidement les embryons abattus. Le deuxième facteur critique de ce protocole est la température à laquelle l’expérience est réalisée. Le faisceau laser lui-même chauffe l’échantillon, mais la température de la pièce et l’environnement local du microscope s’ajoutent aux conditions de température globales vécues par l’échantillon, près de 18-22 ° C. Ici, la salle du microscope n’a pas été réfrigérée car cet équipement est principalement utilisé pour les cellules animales qui tolèrent les températures ambiantes. Heureusement, les embryons de Saccharina ont pu résister à des températures de 22 °C (9 °C de plus que la température de culture optimale de 13 °C) jusqu’à 4 h. Cependant, les dispositifs permettant de maintenir une température ambiante basse, tels qu’une ventilation adéquate ou un support de plaque de refroidissement, peuvent aider à atténuer le risque d’effets indésirables sur la survie et le développement des embryons d’algues. De plus, la lente pré-acclimatation des gamétophytes à 16 °C sous la lumière rouge peut aider les embryons à résister aux pics de température pendant le processus d’ablation. Troisièmement, en plus de l’augmentation de la température, les embryons sont privés d’une source de lumière appropriée pendant toute la durée de l’expérience. De plus, les chloroplastes peuvent être partiellement blanchis par le laser 561 nm. L’utilisation de la puissance la plus faible possible sur le laser 561 nm permet de réduire cet effet. Quatrièmement, le transport est également un facteur critique à prendre en compte car les équipements d’ablation au laser ne sont pas disponibles dans tous les laboratoires. Les pics de température et les mouvements ou chocs externes doivent être évités pour éviter le délogement, la perte ou la mort du matériau algal. Dans la mesure du possible, les boîtes de transport doivent être réfrigérées, résistantes aux vibrations (p. ex., mousse absorbant les chocs) et équipées de lumières. Plusieurs boîtes de transport qui répondent à ces exigences sont disponibles dans le commerce.
Même si tous ces facteurs sont contrôlés autant que possible, un stress environnemental faible mais potentiellement important peut encore se produire. Cette possibilité doit être prise en compte dans l’analyse et l’interprétation de la réponse embryonnaire à l’ablation au laser.
En plus des conditions environnementales qui doivent être maintenues stables tout au long de l’expérience, il est également difficile de suivre les organismes irradiés tout au long de l’étape de surveillance. La croissance des différents embryons modifie le paysage d’origine au fil du temps. À moins qu’un microscope automatisé ne puisse être dédié à la surveillance de l’expérience, suivre l’embryon après l’ablation au laser peut facilement prendre beaucoup de temps et générer de grandes quantités de données. Les enregistrements vidéo pendant l’impulsion initiale d’ablation au laser sont fortement recommandés pour suivre la réaction immédiate de l’embryon au pouls. Cette surveillance rapide de l’impact du pouls est d’une importance significative car, dans certains cas, le pouls, lorsqu’il est ciblé au milieu de la cellule, a provoqué l’éclatement rapide de la cellule cible, probablement en raison de la différence d’osmolarité entre l’intérieur de la cellule et le milieu (eau de mer). Lorsque la fuite était trop rapide, les cellules voisines éclataient également. Tirer sur la région la plus distale de la cellule ciblée s’est avéré être un moyen efficace de tamponner l’effet d’éclatement sur toutes les cellules adjacentes. Un autre moyen efficace d’éviter les rafales violentes est d’augmenter l’osmolarité du milieu avec du saccharose27. Cependant, la différence d’osmolarité est nécessaire pour éliminer le contenu de la cellule ciblée. Ainsi, le maintien d’un potentiel d’osmolarité suffisant est nécessaire. Dans quelques cas, les chloroplastes et autres composés ont obstrué l’ouverture faite par l’ablation au laser, ce qui a entraîné la récupération des cellules du tir au laser, la croissance reprenant après quelques jours. Des impulsions supplémentaires visant à déboucher l’ouverture se sont avérées suffisantes pour empêcher l’obstruction.
Limitations
Un compromis doit être trouvé entre la puissance laser, qui doit être suffisamment élevée pour que les cellules vident leur contenu, et la survie des cellules voisines, qui, dans les embryons d’algues, sont particulièrement sensibles au stress thermique et au photoblanchiment. Par conséquent, une surveillance étroite des cellules après le tir laser est la clé pour contrôler cette étape et s’assurer que les cellules cibles sont mortes. Sinon, l’interprétation des cellules ciblées sur le sort des cellules voisines, et donc le développement ultérieur de l’embryon, peut être trompeuse.
Percer les cellules avec une aiguille peut sembler être une alternative dans laquelle les cellules algales ne subiraient aucun stress thermique ou léger. Cependant, cette approche serait difficile car les cellules embryonnaires d’algues brunes se développent immergées dans l’eau de mer et n’ont aucun contact avec une surface solide. La paroi cellulaire épaisse et élastique résiste à la pénétration de l’aiguille même lorsque l’embryon est en contact avec une surface de verre solide à l’aide d’un micromanipulateur dans un système de micro-injection standard.
En résumé, ce protocole décrit la procédure expérimentale complète et les paramètres pour l’ablation au laser et la surveillance des embryons d’algues brunes et les étapes critiques pour une expérience réussie (figure supplémentaire 1). Cette approche unique est une méthode prometteuse pour étudier les interactions cellulaires et le devenir cellulaire dans les embryons précoces d’algues brunes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La bourse de doctorat de S.B. est financée par la Région Bretagne (numéro de subvention ARED COH20020) et la Sorbonne Université. I.T.is bourse de doctorat est financée par la Région Bretagne (numéro de subvention ARED COH18020) et l’Université norvégienne NMBU. Ce projet a reçu le soutien financier du CNRS à travers les programmes interdisciplinaires du MITI. MRic est membre de l’infrastructure nationale France-BioImagerie soutenue par l’Agence nationale de la recherche Français (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
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