Förstörelsen av specifika celler i embryot är ett kraftfullt verktyg för att studera cellulära interaktioner som är involverade i cellens öde. Detta protokoll beskriver tekniker för laserablation av riktade celler i det tidiga embryot till brunalgen Saccharina latissima.
I Saccharina latissima utvecklas embryot som ett monolagerat cellark som kallas lamina eller bladet. Varje embryocell är lätt att observera, lätt att skilja från sina grannar och kan riktas individuellt. I årtionden har laserablation använts för att studera embryoutveckling. Här utvecklades ett protokoll för cellspecifik laserablation för tidiga embryon av brunalgen S. latissima. Det presenterade arbetet inkluderar: (1) beredning av Saccharina-embryon , med en beskrivning av de kritiska parametrarna, inklusive odlingsförhållanden, (2) laserablationsinställningarna och (3) övervakningen av den efterföljande tillväxten av det bestrålade embryot med hjälp av time-lapse-mikroskopi. Dessutom ges detaljer om de optimala förhållandena för att transportera embryona från bildplattformen tillbaka till laboratoriet, vilket kan påverka efterföljande embryoutveckling djupt. Alger som tillhör ordningen Laminariales uppvisar embryogenesmönster som liknar Saccharina; detta protokoll kan således enkelt överföras till andra arter i detta taxon.
Laserablation har använts i årtionden för att studera embryoutveckling. Bestrålning av embryoceller med en laserstråle gör det möjligt att övervaka den regenerativa potentialen och modifieringen av celllinjen under embryogenesen och undersöka effekten av riktad ablation på celldelning och cellöde. Modellorganismerna som används i laserablationsmetoder är vanligtvis djur, såsom insekter 1,2, nematoder 3,4, ryggradsdjur 5,6 och ibland växter 7,8. Dessutom användes en lasermikroablationsmetod på brunalgen Fucus 1994 och 1998 för att demonstrera cellväggens roll i fotopolariseringen av det tidiga embryot 9,10.
Bruna alger tillhör gruppen Stramenopiles, divergerade vid roten av det eukaryota trädet för 1,6 miljarder år sedan. Som ett resultat är de fylogenetiskt oberoende av andra multicellulära organismer, såsom djur och växter11. Saccharina latissima tillhör ordningen Laminariales, mer allmänt känd som kelps, och de är bland de största organismerna på jorden och når storlekar på över 30 m. Saccharina sp. är en stor tång som används för många applikationer som mat och foder, och dess polysackarider extraheras för användning i jordbruks-, farmakologiska och kosmetiska industrier över hela världen12, 13. Dess odling, främst i Asien och på senare tid i Europa, kräver beredning av embryon i kläckerier innan ungdomar släpps ut i det öppna havet. Liksom alla kelps har den en bifasisk livscykel som består av en mikroskopisk gametofytisk fas, under vilken en haploid gametofyt växer och producerar gameter för befruktning och en diploid makroskopisk sporofytisk fas, där ett stort planblad utvecklas från sitt hållfast fäst vid havsbotten eller stenarna. Sporofyten frigör haploida sporer vid mognad och fullbordar därmed livscykeln 14,15,16.
S. latissima presenterar några intressanta morfologiska egenskaper17. Dess embryo utvecklas som ett monolagerat planark 15,18,19 innan det förvärvar en flerskiktad struktur som sammanfaller med framväxten av olika vävnadstyper. Dessutom är Laminariales en av de enda taxa av bruna alger vars embryon förblir fästa vid sin moders gametofytiska vävnad (Desmarestiales och Sporochnales gör också15). Denna funktion ger möjlighet att studera moderns vävnads roll i denna utvecklingsprocess och jämföra moderns kontrollmekanismer i bruna alger med de hos djur och växter.
Denna artikel presenterar det första kompletta protokollet för laserablation i ett tidigt kelpembryo. Detta protokoll som involverar UV-ns-pulserad teknik resulterar i specifik förstörelse av enskilda embryoceller för att studera deras respektive roller under embryogenesen. Förfarandet erbjuder ett tillförlitligt tillvägagångssätt för att undersöka cellinteraktioner och cellöden under embryogenes i Laminariales.
Lokal cellulär laserablation möjliggör tidsmässig och rumslig ablation med hög precision. Dess effektivitet kan emellertid hämmas av målcellernas bristande tillgänglighet; till exempel är alla celler av ett tredimensionellt embryo. Detta protokoll utvecklades på embryot av algen Saccharina latissima, som utvecklar en monolayered lamina där alla celler lätt kan särskiljas och förstöras individuellt med en laserstråle.
Laserkraft och våglängd
NIR fs…
The authors have nothing to disclose.
S.B.:s doktorandstipendium finansieras av Region Bretagne (ARED-anslagsnummer COH20020) och Sorbonne Université. I.T.is doktorandbidrag finansieras av Region Bretagne (ARED-anslagsnummer COH18020) och Norvegian NMBU University. Detta projekt har fått ekonomiskt stöd från CNRS genom MITI:s tvärvetenskapliga program. MRic är medlem i den nationella infrastrukturen France-BioImaging som stöds av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-10-INBS-04).
25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |