基于荧光的膜电位测定，用于两个上皮细胞系中两个内源性离子通道的高通量功能研究

Summary

该协议描述了通过测量膜电位变化来研究电源膜蛋白的方法。该测定为上皮细胞系中内源性表达的多个离子通道的功能读数提供了一个平台。

Abstract

基于荧光的研究适用于培养细胞的高通量酶标仪测定。它们通常用于靶向在HEK-293细胞等细胞中过表达的重组离子通道蛋白的药物发现活动。然而，人们越来越重视使用组织相关细胞系来研究小分子干预的效果。以下协议描述了基于荧光的膜电位测定的适应性，用于研究上皮细胞系中内源性表达的离子通道。膜电位测定详细介绍了囊性纤维化跨膜电导调节剂 （CFTR） 在两种常用研究的上皮细胞系 Caco-2 和 Calu-3 中的氯通道活性的高通量测定。此外，本文还描述了该系统的新应用，以高通量形式测量相同上皮细胞系中上皮钠通道（ENaC）的活性。总之，这些基于荧光的检测方法为研究小分子调节剂提供了一个强大而灵活的平台，靶向相关细胞环境中的两个上皮通道。

Introduction

基于荧光的高通量重组通道蛋白活性测定在鉴定有可能成为未来疗法的小分子调节剂方面非常有效1，²，^3，4。筛选离子通道调节剂小分子文库的一种常用方法是测量膜电位的变化。通常，这些筛选是使用在细胞系（例如HEK-293细胞⁵，^6，7）中异源表达的重组通道进行的。

但是，需要验证相关细胞类型的“命中”。我们建议在相关细胞系中进行内源性表达目标通道的二次筛选是可取的。这种二次筛选将识别那些最有可能在依赖于不易接近的初级人体组织的最终验证测定中有效的调节剂。

还需要能够灵活地报告同一组织类型中多个离子通道靶标活性的检测系统。例如，有实质性的已发表文献支持CFTR和ENaC^{功能相互作用的概念}8，^9，10。尽管已知几种经过充分研究的上皮细胞系同时表达CFTR和ENaC，但迄今为止，尚未描述以高通量方式研究两者的测定条件。

这种基于荧光的膜电位测定是通用的，因为它采用外源化学探针来测量CFTR和ENaC的功能，绕过了对基因编码探针的需求¹¹。作为原理证明，研究了两种常用的上皮细胞系作为示例，以突出测量CFTR和ENaC通道活性所需的关键步骤。

Protocol

1. 细胞电镀和分化 在 T-75 烧瓶中含有 20% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素（笔/链球菌）的 EMEM 中培养 Calu-3 和 Caco-2 细胞。 一旦细胞达到80-100%汇合度，从T-75烧瓶中吸出培养基。 用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻洗涤细胞一次。 向细胞单层中加入2mL预热的0.25%胰蛋白酶/ 0.1TA，并将T-75烧瓶置于37°C约5分钟，以使细胞从培养瓶表面提起并解离成单细胞悬液。 将细胞从烧瓶表面提起后，用8 mL培养基（步骤1.1）中和反应，总共10 mL细胞悬液。注意：用 10 mL 血清移液器将细胞团块机械解离成单细胞悬液。 将细胞接种在96孔板（~140，000-150，000个细胞/孔）或384孔板（~45，000-50，000个细胞/孔）上，汇合度为30-40%。要接种一个完整的 96 孔板，请将 1.5 mL 细胞悬液加入 50 mL 锥形管中的 18.5 mL 培养基中。混合后，向每个孔中加入 200 μL 细胞悬液。 要接种一个完整的 384 孔板，将 1 mL 细胞悬液加入 50 mL 锥形管中的 17 mL 培养基中。混合后，向每个孔中加入 50 μL 细胞悬液。注意：确保没有细胞团块，并且单个细胞均匀分布在每个孔中。 电镀后每2天更换一次介质。如果细胞在不同孔之间没有同时达到汇合，则丢弃板并重复步骤1.5。 接种后，等待细胞在 3-5 天内达到 100% 汇合度。在功能研究前24小时更换培养基。 2. CFTR功能测定缓冲液制备 使用 表1中列出的试剂制备无钠、无氯化物的缓冲溶液。 将试剂添加到组织培养级，双蒸 H2O （ddH2O）。通过在室温下搅拌过夜，使试剂溶解（在密闭容器中以避免蒸发）。 溶液稳定后，测量pH值。如果溶液的pH值超过7.4，滴加1M N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）溶液以将pH调节至7.4。注意：不要用HCl调节溶液的pH值，因为溶液必须保持无氯化物。 让溶液再混合30分钟并测量溶液的渗透压。将缓冲溶液的渗透压降低到300±5mOsm / kg的生理范围。 过滤并将缓冲溶液储存在无菌瓶中。注意：溶液可以在4°C下储存长达6个月。如果储存超过 6 个月，请在使用前在室温下检查 pH 值和渗透压。 3. CFTR功能测定 将膜电位染料溶解在无钠，无氯化物的缓冲溶液（0.5mg染料/ 1mL缓冲溶液）中，并将其加热至37°C。注意：避免将膜电位染料粉末暴露在光线下。 从Calu-3或Caco-2细胞单层中取出培养基，并向每个孔中加入含染料的溶液（96孔板每孔195μL，384孔板每孔95μL）。注意：每孔 112 孔最多可以添加 384 μL。 让细胞在37°C和5%CO2下加载染料35分钟。 将装有染料溶液的细胞移至荧光板读数器。从板底部进行荧光测量，激发= 530 ± 5 nm，发射= 560 ± 5 nm 首先以30秒的间隔连续基线读数5分钟。 向每个孔中加入 5 μL 低浓度佛司可林或 DMSO 溶液，最终浓度为 1 μM 佛司可林 （1x）。以15秒的间隔测量刺激读数20分钟。对于 96 孔板形式，通过将 2 μL 1 mM 毛喉素（1，000x）储备溶液或 DMSO 稀释到 48 μL 无钠、无氯化物缓冲溶液中，制备低浓度（40 μM 毛喉素（1：25 稀释））佛司可林溶液。注意：低浓度的40μM佛司可林之后进行第二次稀释（1：40稀释）在下一步中，最终浓度为1μM佛司可林。 对于 384 孔板形式，通过在 49 μL 无钠、无氯化物缓冲溶液中稀释 1 μL 1 mM （1，000x） 佛司可林储备溶液或 DMSO 来制备低浓度（20 μM 佛司可林（1：50 稀释））溶液。注意：低浓度的20μM佛司可林之后在下一步中进行第二次稀释（1：20稀释），最终浓度为1μM佛司可林。 加入 5 μL CFTRInh172 的低浓度溶液，最终浓度为 10 μM CFTRInh172。以30秒的间隔测量抑制读数15分钟。对于 96 孔板形式，通过将 2 μL 的 10 mM CFTRInh172 （1，000x） 储备溶液稀释在 48 μL 无钠、无氯化物缓冲溶液中，制备 CFTRInh172 低浓度（400 μM CFTRInh172（1：25 稀释））溶液。注意：低浓度的400μM CFTRInh172之后在下一步中进行第二次稀释（1：40稀释），最终浓度为10μM CFTRInh172。 对于 384 孔板形式，通过在 49 μL 无钠、无氯化物缓冲溶液中稀释 1 μL 10 mM CFTRInh172 （1，000x） 储备溶液来制备 CFTRInh172 低浓度（200 μM CFTRInh172（1：50 稀释））溶液。注意：低浓度的200μM CFTRInh172之后在下一步中进行第二次稀释（1：20稀释），最终浓度为10μM CFTRInh172。 量化每个孔的荧光强度测量值，并将值导出为包含单个孔的列格式电子表格。要计算佛司可林诱导的变化， 将 RFU （相对荧光单位） 测量值除以基线读数的最后一次荧光强度测量值， 并绘制它们.或者，量化CFTRInh172介导的抑制反应以更好地确认CFTR功能12的特异性，因为用佛司可林急性治疗可能通过其他氯离子通道的活性导致膜去极化，例如SLC26A912。 测量峰反应作为佛司可林刺激期间基线的最大荧光强度测量.使用此测量值或曲线下面积来量化 CFTR 响应。 4. ENaC功能测定缓冲液制备 使用 表2中列出的试剂制备高钠，无氯化物缓冲溶液。 溶液稳定后，测量pH值。如果溶液的pH值低于7.4，则滴加1N NaOH溶液以将pH调节至7.4。注意：不要用HCl调节溶液的pH值，因为溶液必须保持无氯化物。 将缓冲溶液的渗透压降低到300±5mOsm / kg的生理范围。 过滤并将缓冲溶液储存在无菌瓶中，在4°C下长达6个月。注意：如果储存时间超过 6 个月，请在使用前在室温下检查 pH 值和渗透压。 5. ENaC功能测定 将膜电位染料溶解在高钠，无氯化物的缓冲溶液（0.5mg染料/ 1mL缓冲溶液）中，并将其加热至37°C。注意：避免将膜电位染料粉末暴露在光线下。 从Calu-3或Caco-2细胞单层中取出培养基，并向每个孔中加入含染料的溶液（96孔板每孔195μL，384孔板每孔95μL）。注意：避免将染料溶液暴露在光线下。 让细胞在37°C和5%CO2下加载染料35分钟。 将装有染料溶液的细胞移至荧光板读数器。从板底部读取荧光测量值，激发= 530 ± 5 nm，发射= 560 ± 5 nm。 首先以30秒的间隔连续基线读数5分钟。 为了抑制ENaC功能，加入5μL低浓度阿米洛利溶液或低浓度溶液DMSO溶解在高钠，零氯化物缓冲溶液中，最终浓度为10μM阿米洛利。对于 96 孔板形式，通过将 2 μL 10 mM 阿米洛利 （1，000x） 储备溶液稀释在 48 μL 高钠、无氯缓冲溶液中，制备低浓度（400 μM 阿米洛利（1：25 稀释））阿米洛利溶液。注意：低浓度400μM阿米洛利之后在下一步中进行第二次稀释（1：40稀释），最终浓度为10μM阿米洛利。 对于 384 孔板形式，通过在 49 μL 高钠、无氯化物缓冲溶液中加入 1 μL 10 mM 阿米洛利 （1，000x） 储备溶液来制备低浓度（200 μM 阿米洛利（1：50 稀释））阿米洛利溶液。注意：低浓度的200μM阿米洛利之后，在下一步中进行第二次稀释（1：20稀释），最终浓度为10μM阿米洛利。 以45秒的间隔测量抑制读数60分钟。 重复步骤 3.7 进行数据分析。 测量阿米洛利反应作为从基线到平台点的抑制百分比，在加入阿米洛利后约15-20分钟。使用此差异来量化 ENaC 响应。

Representative Results

为了测量CFTR通道活性，将分化的良好粘附细胞在含有膜电位敏感染料的零氯化物细胞外溶液中孵育。CFTR功能一致检测为毛喉素刺激后的膜去极化。 与载体对照相比，氯化物外排被检测为荧光急剧增加。荧光信号持续到加入CFTR抑制剂（CFTRInh172），导致荧光强度迅速下降，如Caco-2细胞所示（图1A），并且在Caco-2和Calu-3细胞中均可重现（图1B）。评估CFTR活性作为佛司可林或DMSO（载体）后荧光最大变化的差异。单个点的范围在平均佛司可林刺激（黑点）或DMSO对照（灰点）的±3个标准差之间，对应于Z’因子0.586。这一优异的分数表明该测定的重现性（图1C）。如果基线有轻微的漂移，可以通过在激活后在整个迹线中外推基线直到抑制剂添加点来最小化漂移的影响。响应可以量化为曲线下的面积，下限由外推线定义。 ENaC活性也可以在96孔板中生长的融合气道和结肠上皮细胞中测量。与CFTR通道活性测定相反，这些细胞浸没在高钠溶液中，使钠能够通过ENaC吸收。随着阿米洛利的急性添加，钠摄取被阻断，细胞经历相对膜超极化。这显示在低（10μM）（图2A）和高浓度（50μM）阿米洛利（图2A，B）的Caco-2细胞中，以及在具有高浓度阿米洛利（50μM）的Calu-3细胞中（图2B）。ENaC测定扩展到384孔板形式，并在ENaC抑制方面显示出很高的重现性。同样，各个点的范围在平均阿米洛利抑制（黑点）或DMSO对照（灰点）±3个标准差之间。Calu-3细胞中的ENaC反应报告使用阿米洛利（50μM）进行急性治疗时Z’因子为0.629（图2C），这表明这些参数支持高通量筛选。 图 1：作为 Caco-2 和 Calu-3 细胞中膜去极化变化的 CFTR 通道测量。 （A）在Caco-2细胞中用毛喉素（1μM）和DMSO控制进行CFTR刺激的代表性痕迹。（B）Caco-2和Calu-3细胞中佛司可林刺激的箱状和晶须图（****P 3个生物学重复，n > 3个技术重复）。生物复制是独立的细胞系传代;技术重复是指多孔板的独立孔。箱形图描绘了中值;边界表示 IQR，晶须定义最小值和最大值。（C） 与 Caco-2 细胞中 DMSO 对照相比，毛喉素刺激可重复的 CFTR 反应的平淡-奥特曼图。黑点代表荧光响应佛司可林刺激的最大绝对变化.灰点表示响应DMSO控制的荧光变化。缩写：CFTR =囊性纤维化跨膜电导调节剂;DMSO = 二甲基亚砜;IQR = 四分位距;Fsk = 毛喉素;ΔF/F0 = 荧光变化。请点击此处查看此图的大图。 图 2：通过 Caco-2 和 Calu-3 细胞中的膜超极化进行 ENaC 抑制测量。 （A）阿米洛利（10μM）相对于Caco-2细胞中DMSO对照的ENaC抑制的代表性痕迹。（B）Caco-2和Calu-3细胞中阿米洛利抑制的箱形图和晶须图（****P 3个生物学重复，n > 3个技术重复）。（C） 与 Calu-3 细胞中 DMSO 对照相比，阿米洛利抑制可重复的 ENaC 反应的 Bland-Altman 图。黑点代表响应阿米洛利抑制的荧光的最大绝对变化。灰点表示响应DMSO控制的荧光变化。缩写：ENaC = 上皮钠通道;DMSO = 二甲基亚砜;阿米尔。=阿米洛利;ΔF/F0 = 荧光变化。请点击此处查看此图的大图。 名字 浓度 NMDG （N-甲基-D-葡糖胺） 150 毫米 葡萄糖酸内酯 150 毫米 葡萄糖酸钾 3 毫米米 赫佩斯 10 毫米 表1：用于零钠和氯化物的CFTR功能测定的试剂及其相应浓度。 缩写：CFTR = 囊性纤维化跨膜电导调节剂。 名字 浓度 葡萄糖酸钠 150 毫米 葡萄糖酸钾 3 毫米米 赫佩斯 10 毫米 表2：高钠零氯化物ENaC功能测定缓冲液的试剂及其相应浓度。 缩写：ENaC = 上皮钠 （Na） 通道。

Discussion

在这里，我们描述了基于荧光的方法，用于测量上皮结直肠癌细胞系Caco-2和人上皮肺癌细胞系Calu-3中的CFTR和ENaC活性。这些上皮细胞系中的膜电位测定可用于确认先前在异源表达系统中鉴定的小分子调节剂化合物的功效，然后再在原发性患者来源的上皮培养物中进行最终 体外 验证。

必须确认上述测量值是否适当地归因于感兴趣的通道。例如，归因于CFTR的测量应显示对CFTR蛋白表达和氯化物的电化学驱动力的依赖性，氯化物由毛喉素和抑制剂CFTRInh-172调节。同样，由10μM阿米洛利引起的膜电位变化可归因于ENaC，如果它们依赖于ENaC蛋白表达和向内钠驱动力。尽管我们已经在与ENaC 2的所有三个亚基转染后证实了MDCK细胞中ENaC的这些特性，但我们尚未正式确认在Caco-2和Calu-3细胞中测量的阿米洛利反应是由ENaC赋予的。这一点尤其重要，因为除了ENaC¹³之外，阿米洛利还可以调节钠质子交换剂NHE3的功能。可以想象，在该测定中观察到的阿米洛利诱导的超极化可以部分反映细胞内酸化对其他通道的间接影响。为了确认使用这种膜电位敏感染料测量的阿米洛利诱导的超极化是由ENaC在上述细胞系和更复杂的细胞系统（例如iPSC衍生的组织）中赋予的，我们正在确认这种活性通过敲除这些细胞系中的专性ENaC亚基（β）而丢失。

这些测定的成功需要注意几个因素。首先，上皮培养物必须融合且分化良好。为了测量CFTR和ENaC功能，在96孔板中每孔应接种约145，000个细胞，或在384孔板中每孔接种45，000个细胞。一旦上皮细胞达到汇合（接种后3-4天内），允许2-5天的分化。该时间先前是通过免疫印迹¹⁴根据最大CFTR蛋白表达确定的。同样，确定了两种细胞系Calu-3和Caco-2中功能性ENaC表达的最佳时机。

非融合单层或细胞过度生长导致技术重复的重现性低。如果单个孔中的细胞不能同时达到汇合，则应丢弃这些板。此外，不稳定的基线读数或缺乏刺激反应可能表明细胞质量差，必须将其排除在分析之外。对CFTR激活剂佛司可林或ENaC抑制剂阿米洛利的反应降低可能反映了过度传代细胞的使用¹⁵。虽然对于Calu-3和Caco-2细胞来说不是问题，但其他细胞或组织可能无法很好地粘附在板上，并且可能需要对孔进行预包衣。例如，在以前的研究中，使用胶原涂层¹⁶将2D胆管细胞培养物附着在平板上。或者，使用聚-L-赖氨酸²增加2D肠组织的粘附性。

此外，在使用基于荧光的测定法测试小分子对离子通道的调制时，解决小分子荧光特性赋予的潜在伪影至关重要。为了确认功能反应的特异性，可以使用常规电生理方法进一步验证膜电位测定，例如Ussing研究¹⁷。

在确认膜电位敏感染料检测到的响应是由感兴趣的通道特异性赋予的后，这些测定具有巨大的潜力来验证上皮离子通道在其相关细胞环境中的有前途的调节剂。该平台可以弥合异源表达系统中的高通量调节剂筛选与难以接近的原代组织中耗时的生物电测量之间的差距。

Materials

Amiloride	Spectrum Chemical	TCI-A2599-5G	Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
CFTRInh-172	CF Foundation Therapeutics		Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
EMEM, 1xs	Wisent	320-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-450
FLIPR Membrane Potential Dye	Molecular Devices	R8042	Stored at 4 °C
Forskolin	Sigma-Aldrich	F3917	Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone)	Sigma-Aldrich	G4750	Stored at room temperature
HEPES	Bioshop	HEP001.5	Stored at room temperature
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3)	ATCC	HTB-55
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2)	ATCC	HTB-37
N-Methyl-D-glucamine (NMDG	Sigma-Aldrich	M2004	Stored at room temperature
Penicillin-Streptomycin Solution	Wisent	450-200-EL
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847	Stored at room temperature
Sodium Gluconate	Sigma-Aldrich	G9005	Stored at room temperature