このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。
蛍光ベースの研究は、培養中の細胞のハイスループットプレートリーダーアッセイに適しています。これらは、HEK-293細胞などの細胞で過剰発現している組換えイオンチャネルタンパク質を標的とする創薬キャンペーンに一般的に使用されています。しかし、低分子介入の効果を研究するための組織関連細胞株の使用にますます重点が置かれています。以下のプロトコルは、上皮細胞株において内因的に発現されるイオンチャネルの研究のための蛍光ベースの膜電位アッセイの適応を記載する。膜電位アッセイでは、一般的に研究されている2つの上皮細胞株であるCaco-2とCalu-3における嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)の塩化物チャネル活性のハイスループットアッセイについて詳しく説明しています。さらに、この論文では、同じ上皮細胞株でハイスループットフォーマットで上皮ナトリウムチャネル(ENaC)の活性を測定するためのこのシステムの新しいアプリケーションについて説明します。これらの蛍光ベースのアッセイを組み合わせることで、低分子モジュレーターを研究するための堅牢で柔軟なプラットフォームが提供され、関連する細胞コンテキストで2つの上皮チャネルを標的としています。
組換えチャネルタンパク質の蛍光ベースのハイスループット活性アッセイは、将来の治療法になる可能性のある低分子モジュレーターを特定するのに非常に効果的です1、2、3、4。イオンチャネルモジュレーター用の低分子ライブラリーをスクリーニングする一般的な方法の1つは、膜電位の変化を測定することです。典型的には、これらのスクリーニングは、HEK-293細胞5、6、7などの細胞株において異質に発現する組換えチャネルを用いて実施される。
ただし、関連する細胞型における「ヒット」の検証が必要です。我々は、目的のチャネルを内因的に発現する関連細胞株における二次スクリーニングが望ましいことを提案する。このような二次スクリーニングは、アクセスしにくい一次ヒト組織に依存する最終検証アッセイにおいて有効である可能性が最も高いモジュレーターを特定するであろう。
また、同じ組織タイプ内の複数のイオンチャネルターゲットの活性を報告する柔軟性を備えたアッセイシステムも必要です。たとえば、CFTRとENaCが機能的に相互作用するという概念を支持する実質的な公開文献があります8,9,10。いくつかのよく研究された上皮細胞株がCFTRおよびENaCの両方を発現することが知られているが、今日まで、両方をハイスループット様式で研究するためのアッセイ条件は記載されていない。
この蛍光ベースの膜電位アッセイは、CFTRおよびENaCの機能を測定するために外因性の化学プローブを採用し、遺伝的にコードされたプローブの必要性をバイパスするため、用途が広い11。原理の証明として、CFTRとENaCの両方のチャネル活性を測定するために必要な重要なステップを強調するために、一般的に使用される2つの上皮細胞株が例として研究されています。
ここでは、上皮性大腸癌細胞株Caco-2およびヒト上皮性肺癌細胞株Calu-3におけるCFTRおよびENaC活性を測定するための蛍光ベースの方法について説明しました。上皮細胞株におけるこれらの膜電位アッセイは、初代患者由来の上皮培養における最終的な in vitro 検証の前に、異種発現系で以前に同定された低分子モジュレーター化合物の有効性を確認するために使用できます。
上記の測定値が関心のあるチャネルに適切に起因することを確認することが不可欠です。例えば、CFTRに起因する測定は、CFTRタンパク質発現およびフォルスコリンおよび阻害剤CFTRInh-172によって調節される塩化物の電気化学的駆動力への依存性を示すはずである。同様に、10 μMアミロライドによって引き起こされる膜電位の変化は、ENaCタンパク質の発現と内向きのナトリウム駆動力に依存している場合、ENaCに起因する可能性があります。我々は、ENaC 2の3つのサブユニットすべてでトランスフェクションした後、MDCK細胞におけるENaCのこれらの特性を確認しましたが、Caco-2およびCalu-3細胞で測定されたアミロリド応答がENaCによって付与されることはまだ正式に確認されていません。アミロリドはENaC13に加えてナトリウム – プロトン交換体NHE3の機能を調節することができるので、これは特に重要である。おそらく、このアッセイで観察されたアミロリド誘発過分極は、他のチャネルに対する細胞内酸性化の間接的な影響を部分的に反映している可能性があります。.この膜電位感受性色素を用いて測定したアミロリド誘発過分極が、上記の細胞株やiPS細胞由来組織などのより複雑な細胞系においてENaCによって付与されることを確認するために、これらの系統の偏性ENaCサブユニット(β)をノックアウトすることにより、この活性が失われることを確認しています。
これらのアッセイの成功には、いくつかの要因に注意を払う必要があります。第一に、上皮培養物はコンフルエントでよく分化していなければなりません。CFTRおよびENaC機能の測定には、96ウェルプレートではウェルあたり約145,000細胞、384ウェルプレートではウェルあたり約45,000セルをプレーティングする必要があります。上皮細胞がコンフルエントに達したら(メッキから3〜4日以内)、2〜5日間の分化を待ちます。このタイミングは、イムノブロッティングによる最大CFTRタンパク質発現に基づいて予め決定した14。同様に、Calu-3およびCaco-2の両方の細胞株における機能的ENaC発現について最適なタイミングが決定された。
非コンフルエントな単分子膜または細胞の異常増殖は、技術的な反復全体での再現性の低下につながります。個々のウェル内の細胞が同時にコンフルエントに達しない場合は、これらのプレートを廃棄する必要があります。さらに、不安定なベースライン測定値または刺激応答の欠如は、細胞品質の低下を示している可能性があり、分析から除外する必要があります。CFTRアクチベーターであるフォルスコリン、またはENaC阻害剤であるアミロリドに対する応答の低下は、過剰に継代された細胞の使用を反映している可能性があります15。Calu-3およびCaco-2細胞では問題ではありませんが、他の細胞または組織がプレートにうまく接着しない可能性があり、ウェルのプレコーティングが必要になる場合があります。例えば、以前の研究では、2D胆管細胞培養物をコラーゲンコーティング16を用いてプレートに付着させた。あるいは、2D腸組織の接着を、Poly-L-リジン2を用いて増加させた。
さらに、蛍光ベースのアッセイを用いて低分子によるイオンチャネルの調節を試験する際には、低分子の蛍光特性によって生じる潜在的なアーチファクトに対処することが重要である。機能的応答の特異性を確認するために、膜電位アッセイは、Ussing研究17などの従来の電気生理学的方法を使用してさらに検証することができる。
膜電位感受性色素によって検出される応答が目的のチャネルによって特異的に付与されることを確認した後、これらのアッセイは、関連する細胞状況において上皮イオンチャネルの有望なモジュレーターを検証する大きな可能性を秘めています。このプラットフォームは、異種発現システムにおけるハイスループットモジュレータースクリーンと、アクセスが困難な一次組織における時間のかかる生体電気測定との間のギャップを埋めることができます。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、CFTRとENaCを測定する膜電位アッセイの実施に協力してくれた病気の子供のための病院のChristopher FladdとSPARC BioCentreに感謝したいと思います。この作業は、CFITカナダとシックキッズ財団から提供された資金提供を受けて、CFITプログラムによってサポートされました。この研究は、Genome CanadaとOntario Genomics Institute(OGI-148)を通じてカナダ政府から資金提供を受けた。この研究はオンタリオ州政府によって資金提供されました。S.X.は、カナダ消化器病学会(CAG)博士号奨学金の支援を受けました。
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |