Este protocolo describe un método para el estudio de proteínas de membrana electrogénicas midiendo los cambios en el potencial de membrana. Este ensayo proporciona una plataforma para la lectura funcional de múltiples canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales.
Los estudios basados en fluorescencia son adecuados para ensayos de lectores de placas de alto rendimiento de células en cultivo. Se han empleado comúnmente para campañas de descubrimiento de fármacos dirigidas a proteínas recombinantes del canal iónico sobreexpresadas en células como las células HEK-293. Sin embargo, hay un énfasis creciente en el uso de líneas celulares relevantes para el tejido para estudiar los efectos de las intervenciones de moléculas pequeñas. El siguiente protocolo describe la adaptación de un ensayo de potencial de membrana basado en fluorescencia para el estudio de canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales. El ensayo de potencial de membrana detalla un ensayo de alto rendimiento para la actividad del canal de cloruro del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) en dos líneas celulares epiteliales comúnmente estudiadas, Caco-2 y Calu-3. Además, este documento describe una aplicación novedosa de este sistema para medir la actividad del canal epitelial de sodio (ENaC) en un formato de alto rendimiento en las mismas líneas celulares epiteliales. Juntos, estos ensayos basados en fluorescencia proporcionan una plataforma robusta y flexible para estudiar moduladores de moléculas pequeñas, dirigidos a dos canales epiteliales en un contexto celular relevante.
Los ensayos de actividad de alto rendimiento basados en fluorescencia de proteínas de canales recombinantes han sido altamente efectivos en la identificación de moduladores de moléculas pequeñas que tienen el potencial de convertirse en terapias futuras 1,2,3,4. Un método común para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de moduladores de canales iónicos es medir los cambios en el potencial de membrana. Típicamente, estos cribados se realizan utilizando canales recombinantes expresados heterólogamente en líneas celulares como las células HEK-293 5,6,7.
Sin embargo, existe la necesidad de validar los “hits” en los tipos de células relevantes. Proponemos que es deseable un cribado secundario en líneas celulares relevantes que expresen endógenamente los canales de interés. Dicha pantalla secundaria identificará aquellos moduladores con mayor probabilidad de ser efectivos en los ensayos de validación final que dependen de tejidos humanos primarios menos accesibles.
También existe la necesidad de sistemas de ensayo que tengan la flexibilidad de informar la actividad de múltiples objetivos de canales iónicos en el mismo tipo de tejido. Por ejemplo, existe una literatura publicada sustancial que apoya el concepto de que CFTR y ENaC interactúan funcionalmente 8,9,10. Aunque se sabe que varias líneas celulares epiteliales bien estudiadas expresan tanto CFTR como ENaC, hasta la fecha, no se han descrito las condiciones de ensayo para estudiar ambos de una manera de alto rendimiento.
Este ensayo de potencial de membrana basado en fluorescencia es versátil, ya que emplea una sonda química exógena para medir la función de CFTR y ENaC, evitando la necesidad de sondas codificadas genéticamente11. Como prueba de principio, se estudian dos líneas celulares epiteliales de uso común como ejemplos para resaltar los pasos críticos necesarios para medir la actividad del canal tanto de CFTR como de ENaC.
Aquí, hemos descrito métodos basados en fluorescencia para medir la actividad de CFTR y ENaC en la línea celular de cáncer colorrectal epitelial, Caco-2, y la línea celular de cáncer de pulmón epitelial humano, Calu-3. Estos ensayos de potencial de membrana en líneas celulares epiteliales se pueden utilizar para confirmar la eficacia de compuestos moduladores de moléculas pequeñas, previamente identificados en sistemas de expresión heterólogos, antes de la validación final in vitro en cultivos epiteliales primarios derivados de pacientes.
Es imperativo confirmar que las mediciones anteriores se atribuyen adecuadamente al canal de interés. Por ejemplo, la medición atribuida a CFTR debe mostrar dependencia de la expresión de la proteína CFTR y la fuerza impulsora electroquímica del cloruro, que es modulada por forskoline y el inhibidor CFTRInh-172. Del mismo modo, los cambios potenciales de membrana causados por amilorida de 10 μM pueden atribuirse a ENaC, si dependen de la expresión de proteínas ENaC y de una fuerza impulsora de sodio hacia adentro. Aunque hemos confirmado estas propiedades de ENaC en células MDCK después de la transfección con las tres subunidades de ENaC 2, aún no hemos confirmado formalmente que la respuesta de amilorida medida en célulasCaco-2 y Calu-3 sea conferida por ENaC. Esto es particularmente importante, ya que la amilorida puede modular la función del intercambiador de sodio-protones NHE3 además de ENaC13. Posiblemente, la hiperpolarización inducida por amilorida observada en este ensayo podría reflejar parcialmente los efectos indirectos de la acidificación intracelular en otros canales. Para confirmar que la hiperpolarización inducida por amilorida medida con este colorante sensible al potencial de membrana es conferida por ENaC en las líneas celulares anteriores y sistemas celulares más complejos, como los tejidos derivados de iPSC, estamos confirmando que esta actividad se pierde al eliminar una subunidad ENaC obligada (beta) en estas líneas.
El éxito de estos ensayos requiere atención a varios factores. En primer lugar, los cultivos epiteliales deben ser confluentes y bien diferenciados. Para la medición de la función CFTR y ENaC, se deben colocar aproximadamente 145,000 celdas por pocillo en placas de 96 pocillos o 45,000 celdas por pocillo en placas de 384 pocillos. Una vez que las células epiteliales alcanzan la confluencia (dentro de los 3-4 días posteriores a la placa), permita 2-5 días de diferenciación. Este momento se determinó previamente en función de la expresión máxima de la proteína CFTR mediante inmunotransferencia14. Del mismo modo, se determinó el momento óptimo para la expresión funcional de ENaC en ambas líneas celulares, Calu-3 y Caco-2.
Las monocapas no confluentes o el sobrecrecimiento celular conducen a una baja reproducibilidad entre réplicas técnicas. En los casos en que las células en pocillos individuales no alcanzan la confluencia al mismo tiempo, estas placas deben descartarse. Además, las lecturas basales inestables o la falta de respuestas de estimulación pueden ser una indicación de mala calidad celular, que debe excluirse del análisis. La reducción de las respuestas al activador de CFTR, forskolina, o al inhibidor de ENaC, amilorida, podría reflejar potencialmente el uso de células excesivamente transitadas15. Aunque no es un problema para las células Calu-3 y Caco-2, otras células o tejidos pueden no adherirse bien a las placas y pueden requerir un recubrimiento previo de los pocillos. Por ejemplo, en estudios previos, los cultivos de colangiocitos 2D se unieron a las placas utilizando recubrimiento de colágeno16. Alternativamente, la adherencia de los tejidos intestinales 2D se incrementó utilizando Poly-L-Lisina2.
Además, al probar la modulación de los canales iónicos por moléculas pequeñas utilizando un ensayo basado en fluorescencia, es fundamental que se aborden los artefactos potenciales conferidos por las propiedades fluorescentes de las moléculas pequeñas. Para confirmar la especificidad de las respuestas funcionales, los ensayos de potencial de membrana pueden validarse aún más utilizando métodos electrofisiológicos convencionales, como los estudios de Ussing17.
Después de confirmar que la respuesta detectada por los colorantes sensibles al potencial de membrana es conferida específicamente por el canal de interés, estos ensayos tienen un enorme potencial para validar moduladores prometedores de canales iónicos epiteliales en su contexto celular relevante. Esta plataforma puede cerrar la brecha entre las pantallas moduladoras de alto rendimiento en sistemas de expresión heteróloga y las mediciones bioeléctricas que requieren mucho tiempo en tejidos primarios de difícil acceso.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Christopher Fladd y SPARC BioCentre en el Hospital para Niños Enfermos por su ayuda en la realización de los ensayos de potencial de membrana que miden CFTR y ENaC. Este trabajo fue apoyado por el Programa CFIT con fondos proporcionados por CF Canadá y la Fundación Sick Kids. Este trabajo fue financiado por el Gobierno de Canadá a través de Genome Canada y el Instituto de Genómica de Ontario (OGI-148). Este estudio fue financiado por el Gobierno de Ontario. S.X. fue apoyado por la Asociación Canadiense de Gastroenterología (CAG) Ph.D. beca.
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |