Этот протокол описывает метод исследования электрогенных мембранных белков путем измерения изменений мембранного потенциала. Этот анализ обеспечивает платформу для функционального считывания нескольких ионных каналов, эндогенно экспрессируемых в эпителиальных клеточных линиях.
Флуоресцентные исследования подходят для высокопроизводительных анализов клеток в культуре. Они обычно использовались для кампаний по открытию лекарств, нацеленных на белки рекомбинантных ионных каналов, сверхэкспрессируемые в клетках, таких как клетки HEK-293. Тем не менее, все больше внимания уделяется использованию тканезависимых клеточных линий для изучения эффектов вмешательств с использованием малых молекул. Следующий протокол описывает адаптацию анализа мембранного потенциала на основе флуоресценции для исследования ионных каналов, эндогенно экспрессируемых в эпителиальных клеточных линиях. Анализ мембранного потенциала детализирует высокопроизводительный анализ активности хлоридных каналов трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR) в двух широко изучаемых линиях эпителиальных клеток, Caco-2 и Calu-3. Кроме того, в этой статье описывается новое применение этой системы для измерения активности эпителиального натриевого канала (ENaC) в формате с высокой пропускной способностью в тех же линиях эпителиальных клеток. Вместе эти флуоресцентные анализы обеспечивают надежную и гибкую платформу для изучения низкомолекулярных модуляторов, нацеленных на два эпителиальных канала в соответствующем клеточном контексте.
Основанные на флуоресценции высокопроизводительные анализы активности белков рекомбинантных каналов оказались очень эффективными в идентификации низкомолекулярных модуляторов, которые могут стать будущими методами лечения 1,2,3,4. Одним из распространенных методов скрининга библиотек малых молекул для модуляторов ионных каналов является измерение изменений мембранного потенциала. Как правило, эти скрининги проводятся с использованием рекомбинантных каналов, экспрессируемых гетерологически в клеточных линиях, таких как клетки HEK-293 5,6,7.
Тем не менее, существует необходимость в проверке «попаданий» в соответствующие типы клеток. Мы предполагаем, что желателен вторичный скрининг в соответствующих клеточных линиях, которые эндогенно экспрессируют интересующие каналы. Такой вторичный скрининг позволит определить те модуляторы, которые, скорее всего, будут эффективны в окончательных валидационных анализах, которые полагаются на менее доступные первичные ткани человека.
Существует также потребность в системах анализа, которые обладают гибкостью, позволяющей сообщать об активности нескольких мишеней ионных каналов в одном и том же типе ткани. Например, существует обширная опубликованная литература, которая поддерживает концепцию, согласно которой CFTR и ENaC функционально взаимодействуют 8,9,10. Хотя известно, что несколько хорошо изученных линий эпителиальных клеток экспрессируют как CFTR, так и ENaC, на сегодняшний день условия анализа для изучения обоих с высокой пропускной способностью не были описаны.
Этот анализ мембранного потенциала на основе флуоресценции является универсальным, поскольку в нем используется экзогенный химический зонд для измерения функции CFTR и ENaC, минуя необходимость в генетически кодируемых зондах11. В качестве доказательства принципа в качестве примеров изучаются две широко используемые линии эпителиальных клеток, чтобы выделить критические шаги, необходимые для измерения активности каналов как CFTR, так и ENaC.
Здесь мы описали основанные на флуоресценции методы измерения активности CFTR и ENaC в эпителиальной клеточной линии колоректального рака Caco-2 и клеточной линии эпителиального рака легких человека Calu-3. Эти анализы мембранного потенциала в эпителиальных клеточных линиях могут быть использованы для подтверждения эффективности низкомолекулярных модуляторных соединений, ранее идентифицированных в гетерологичных системах экспрессии, до окончательной валидации in vitro в первичных эпителиальных культурах, полученных от пациентов.
Крайне важно подтвердить, что вышеуказанные измерения надлежащим образом отнесены к интересующему каналу. Например, измерение, приписываемое CFTR, должно показывать зависимость от экспрессии белка CFTR и электрохимической движущей силы хлорида, которая модулируется форсколином и ингибитором CFTRInh-172. Аналогичным образом, изменения мембранного потенциала, вызванные амилоридом 10 мкМ, могут быть отнесены к ENaC, если они зависят от экспрессии белка ENaC и внутренней движущей силы натрия. Хотя мы подтвердили эти свойства ENaC в клетках MDCK после трансфекции всеми тремя субъединицами ENaC 2, мы еще официально не подтвердили, что амилоридный ответ, измеренный в клетках Caco-2 и Calu-3, обеспечивается ENaC. Это особенно важно, так как амилорид может модулировать функцию натрий-протонного обменника NHE3 в дополнение к ENaC13. Можно предположить, что гиперполяризация, индуцированная амилоридом, наблюдаемая в этом анализе, может частично отражать косвенные эффекты внутриклеточного подкисления на другие каналы. Чтобы подтвердить, что гиперполяризация, индуцированная амилоридом, измеренная с использованием этого мембранного потенциал-чувствительного красителя, обеспечивается ENaC в вышеуказанных клеточных линиях и более сложных клеточных системах, таких как ткани, полученные из iPSC, мы подтверждаем, что эта активность теряется путем выбивания облигатной субъединицы ENaC (бета) в этих линиях.
Успех этих анализов требует внимания к нескольким факторам. Во-первых, эпителиальные культуры должны быть сливающимися и хорошо дифференцированными. Для измерения функции CFTR и ENaC примерно 145 000 ячеек должны быть нанесены на лунку в 96-луночных планшетах или 45 000 ячеек на лунку в 384-луночных планшетах. Как только эпителиальные клетки достигнут слияния (в течение 3-4 дней после покрытия), дайте 2-5 дней дифференцировки. Это время было определено ранее на основе максимальной экспрессии белка CFTR путем иммуноблоттинга14. Аналогичным образом, оптимальное время было определено для функциональной экспрессии ENaC в обеих клеточных линиях, Calu-3 и Caco-2.
Несливающиеся монослои или чрезмерный рост клеток приводит к низкой воспроизводимости технических реплик. В тех случаях, когда ячейки в отдельных лунках не достигают слияния одновременно, эти пластины следует выбросить. Кроме того, нестабильные исходные показания или отсутствие реакций стимуляции могут указывать на плохое качество клеток, что должно быть исключено из анализа. Снижение реакции на активатор CFTR, форсколин, или ингибитор ENaC, амилорид, потенциально может отражать использование чрезмерно пассированных клеток15. Хотя это не проблема для клеток Calu-3 и Caco-2, другие клетки или ткани могут плохо прилипать к пластинам и могут потребовать предварительного покрытия лунок. Например, в предыдущих исследованиях 2D-культуры холангиоцитов прикреплялись к пластинам с помощью коллагенового покрытия16. В качестве альтернативы, адгезия 2D-тканей кишечника была увеличена с помощью поли-L-лизина2.
Кроме того, при тестировании модуляции ионных каналов малыми молекулами с использованием анализа на основе флуоресценции крайне важно учитывать потенциальные артефакты, обусловленные флуоресцентными свойствами малых молекул. Чтобы подтвердить специфичность функциональных реакций, анализы мембранного потенциала могут быть дополнительно подтверждены с использованием обычных электрофизиологических методов, таких как исследования Ussing17.
После подтверждения того, что ответ, обнаруженный мембранными потенциал-чувствительными красителями, специфически придается интересующим каналом, эти анализы обладают огромным потенциалом для проверки перспективных модуляторов эпителиальных ионных каналов в их соответствующем клеточном контексте. Эта платформа может преодолеть разрыв между высокопроизводительными экранами модуляторов в гетерологичных системах экспрессии и трудоемкими биоэлектрическими измерениями в труднодоступных первичных тканях.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность Кристоферу Флэдду (Christopher Fladd) и Биоцентру SPARC в Госпитале для больных детей за помощь в проведении анализов мембранного потенциала для измерения CFTR и ENaC. Эта работа была поддержана программой CFIT при финансировании, предоставленном CF Canada и Sick Kids Foundation. Эта работа финансировалась правительством Канады через Genome Canada и Институт геномики Онтарио (OGI-148). Это исследование финансировалось правительством Онтарио. S.X. был поддержан Канадской ассоциацией гастроэнтерологов (CAG) Ph.D. Стипендия.
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |