Este protocolo descreve um método para o estudo de proteínas de membrana eletrogênicas através da medição de mudanças no potencial de membrana. Este ensaio fornece uma plataforma para a leitura funcional de múltiplos canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais.
Estudos baseados em fluorescência são adequados para ensaios de leitores de placas de alto rendimento de células em cultura. Eles têm sido comumente empregados para campanhas de descoberta de drogas visando proteínas de canais iônicos recombinantes superexpressas em células como as células HEK-293. No entanto, há uma ênfase crescente no uso de linhagens celulares relevantes para o tecido para estudar os efeitos de intervenções em pequenas moléculas. O protocolo a seguir descreve a adaptação de um ensaio de potencial de membrana baseado em fluorescência para o estudo de canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais. O ensaio de potencial de membrana detalha um ensaio de alto rendimento para a atividade do canal de cloreto do Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) em duas linhagens celulares epiteliais comumente estudadas, Caco-2 e Calu-3. Além disso, este trabalho descreve uma nova aplicação deste sistema para medir a atividade do Canal de Sódio Epitelial (ENaC) em um formato de alto rendimento nas mesmas linhagens celulares epiteliais. Juntos, esses ensaios baseados em fluorescência fornecem uma plataforma robusta e flexível para estudar moduladores de moléculas pequenas, visando dois canais epiteliais em um contexto celular relevante.
Ensaios de alta atividade de proteínas de canais recombinantes baseados em fluorescência e alto rendimento têm sido altamente eficazes na identificação de moduladores de moléculas pequenas que têm o potencial de se tornarem terapias futuras 1,2,3,4. Um método comum de triagem de pequenas bibliotecas de moléculas para moduladores de canais iônicos é através da medição de mudanças no potencial de membrana. Tipicamente, essas telas são conduzidas utilizando canais recombinantes expressos de forma heterológica em linhagens celulares como as células HEK-2935,6,7.
No entanto, há necessidade de validação de “acertos” em tipos celulares relevantes. Propomos que uma tela secundária em linhagens celulares relevantes que expressem endogenamente os canais de interesse é desejável. Essa triagem secundária identificará os moduladores com maior probabilidade de serem eficazes em ensaios finais de validação que dependem de tecidos humanos primários menos acessíveis.
Há também a necessidade de sistemas de ensaio que tenham a flexibilidade de relatar a atividade de múltiplos alvos de canais iônicos no mesmo tipo de tecido. Por exemplo, há literatura substantiva publicada que apoia o conceito de que CFTR e ENaC interagem funcionalmente 8,9,10. Embora várias linhagens celulares epiteliais bem estudadas sejam conhecidas por expressar CFTR e ENaC, até o momento, as condições do ensaio para estudar ambas de maneira de alto rendimento não foram descritas.
Este ensaio de potencial de membrana baseado em fluorescência é versátil, pois emprega uma sonda química exógena para medir a função de CFTR e ENaC, ignorando a necessidade de sondas codificadas geneticamente11. Como prova de princípio, duas linhagens celulares epiteliais comumente usadas são estudadas como exemplos para destacar as etapas críticas necessárias para medir a atividade do canal de CFTR e ENaC.
Aqui, descrevemos métodos baseados em fluorescência para medir a atividade de CFTR e ENaC na linhagem celular de câncer colorretal epitelial, Caco-2, e na linhagem celular de câncer de pulmão epitelial humano, Calu-3. Estes ensaios de potencial de membrana em linhagens celulares epiteliais podem ser usados para confirmar a eficácia de compostos moduladores de pequenas moléculas, previamente identificados em sistemas de expressão heteróloga, antes da validação final in vitro em culturas epiteliais primárias derivadas de pacientes.
É imperativo confirmar que as medidas acima são apropriadamente atribuídas ao canal de interesse. Por exemplo, a medida atribuída ao CFTR deve mostrar dependência da expressão da proteína CFTR e da força motriz eletroquímica do cloreto, que é modulada pela forskolina e pelo inibidor CFTRInh-172. Da mesma forma, as alterações no potencial de membrana causadas pela amilorida 10 μM podem ser atribuídas ao ENaC, se dependerem da expressão da proteína ENaC e de uma força motriz interna de sódio. Embora tenhamos confirmado essas propriedades do ENaC em células MDCK após transfecção com as três subunidades do ENaC 2, ainda não confirmamos formalmente que a resposta amilorida medida em células Caco-2 e Calu-3 é conferida pelo ENaC. Isso é particularmente importante, pois a amilorida pode modular a função do trocador sódio-prótons NHE3, além do ENaC13. Concebivelmente, a hiperpolarização induzida por amilorídeos observada neste ensaio poderia refletir parcialmente os efeitos indiretos da acidificação intracelular em outros canais. Para confirmar que a hiperpolarização induzida por amilorídeos medida por esse corante sensível ao potencial de membrana é conferida pelo ENaC nas linhagens celulares acima e em sistemas celulares mais complexos, como tecidos derivados de iPSC, estamos confirmando que essa atividade é perdida ao nocautear uma subunidade obrigatória do ENaC (beta) nessas linhagens.
O sucesso desses ensaios requer atenção a vários fatores. Primeiro, as culturas epiteliais devem ser confluentes e bem diferenciadas. Para a medição da função CFTR e ENaC, aproximadamente 145.000 células devem ser plaqueadas por poço em placas de 96 poços ou 45.000 células por poço em placas de 384 poços. Uma vez que as células epiteliais atingem a confluência (dentro de 3-4 dias do plaqueamento), permitir 2-5 dias de diferenciação. Esse tempo foi determinado previamente com base na expressão máxima da proteína CFTR por immunoblotting14. Similarmente, o tempo ótimo foi determinado para a expressão funcional de ENaC em ambas as linhagens celulares, Calu-3 e Caco-2.
Monocamadas não confluentes ou supercrescimento celular leva a baixa reprodutibilidade entre réplicas técnicas. Nos casos em que as células de poços individuais não atingem a confluência ao mesmo tempo, essas placas devem ser descartadas. Além disso, leituras basais instáveis ou falta de respostas de estimulação podem ser um indício de má qualidade celular, que deve ser excluída da análise. Respostas reduzidas ao ativador do CFTR, forskolina, ou ao inibidor do ENaC, amilorida, poderiam potencialmente refletir o uso de células excessivamente passageiras15. Embora não seja um problema para as células Calu-3 e Caco-2, outras células ou tecidos podem não aderir bem às placas e podem exigir o pré-revestimento dos poços. Por exemplo, em estudos anteriores, culturas de colangiócitos 2D foram fixadas às placas usando revestimento de colágeno16. Alternativamente, a aderência dos tecidos intestinais 2D foi aumentada usando Poli-L-Lisina2.
Além disso, ao testar a modulação de canais iônicos por pequenas moléculas usando um ensaio baseado em fluorescência, é fundamental que potenciais artefatos conferidos pelas propriedades fluorescentes das pequenas moléculas sejam abordados. Para confirmar a especificidade das respostas funcionais, ensaios de potencial de membrana podem ser validados por métodos eletrofisiológicos convencionais, como os estudos deUssing17.
Depois de confirmar que a resposta detectada por corantes sensíveis ao potencial de membrana é especificamente conferida pelo canal de interesse, esses ensaios têm um enorme potencial para validar moduladores promissores de canais iônicos epiteliais em seu contexto celular relevante. Essa plataforma pode preencher a lacuna entre telas moduladoras de alto rendimento em sistemas de expressão heteróloga e medições bioelétricas demoradas em tecidos primários de difícil acesso.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Christopher Fladd e ao SPARC BioCentre do Hospital for Sick Children por sua ajuda na condução dos ensaios de potencial de membrana medindo CFTR e ENaC. Este trabalho foi apoiado pelo Programa CFIT com financiamento fornecido pela CF Canada e pela Sick Kids Foundation. Este trabalho foi financiado pelo Governo do Canadá através da Genome Canada e do Ontario Genomics Institute (OGI-148). O presente estudo foi financiado pelo Governo de Ontário. S.X. foi apoiado pela Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Scholarship.
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |