Ce protocole décrit une méthode pour l’étude des protéines membranaires électrogènes en mesurant les changements dans le potentiel membranaire. Ce test fournit une plate-forme pour la lecture fonctionnelle de multiples canaux ioniques exprimés de manière endogène dans des lignées cellulaires épithéliales.
Les études basées sur la fluorescence conviennent aux essais de lecture de plaques à haut débit de cellules en culture. Ils ont été couramment utilisés pour les campagnes de découverte de médicaments ciblant les protéines des canaux ioniques recombinants surexprimées dans des cellules telles que les cellules HEK-293. Cependant, on met de plus en plus l’accent sur l’utilisation de lignées cellulaires pertinentes pour les tissus pour étudier les effets des interventions à petites molécules. Le protocole suivant décrit l’adaptation d’un test de potentiel membranaire basé sur la fluorescence pour l’étude des canaux ioniques exprimés de manière endogène dans les lignées cellulaires épithéliales. Le test de potentiel membranaire détaille un test à haut débit pour l’activité des canaux chlorures du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) dans deux lignées cellulaires épithéliales couramment étudiées, Caco-2 et Calu-3. En outre, cet article décrit une nouvelle application de ce système pour mesurer l’activité du canal sodique épithélial (ENaC) dans un format à haut débit dans les mêmes lignées cellulaires épithéliales. Ensemble, ces tests basés sur la fluorescence fournissent une plate-forme robuste et flexible pour étudier les modulateurs de petites molécules, ciblant deux canaux épithéliaux dans un contexte cellulaire pertinent.
Les essais d’activité à haut débit basés sur la fluorescence des protéines des canaux recombinants ont été très efficaces pour identifier les modulateurs de petites molécules qui ont le potentiel de devenir de futures thérapies 1,2,3,4. Une méthode courante de criblage de petites bibliothèques de molécules pour les modulateurs de canaux ioniques consiste à mesurer les changements dans le potentiel membranaire. Typiquement, ces criblages sont réalisés à l’aide de canaux recombinants exprimés de manière hétérologique dans des lignées cellulaires telles que les cellules HEK-293 5,6,7.
Cependant, il est nécessaire de valider les « résultats positifs » dans les types de cellules pertinents. Nous proposons qu’un dépistage secondaire dans les lignées cellulaires pertinentes qui expriment de manière endogène les canaux d’intérêt est souhaitable. Un tel criblage secondaire permettra d’identifier les modulateurs les plus susceptibles d’être efficaces dans les tests de validation finale qui reposent sur des tissus humains primaires moins accessibles.
Il existe également le besoin de systèmes de dosage qui ont la flexibilité de signaler l’activité de plusieurs cibles de canaux ioniques dans le même type de tissu. Par exemple, il existe une littérature publiée de fond qui appuie le concept selon lequel le CFTR et l’ENaC interagissent fonctionnellement 8,9,10. Bien que plusieurs lignées cellulaires épithéliales bien étudiées soient connues pour exprimer à la fois le CFTR et l’ENaC, à ce jour, les conditions de dosage pour étudier les deux de manière à haut débit n’ont pas été décrites.
Ce test de potentiel membranaire basé sur la fluorescence est polyvalent, car il utilise une sonde chimique exogène pour mesurer la fonction du CFTR et de l’ENaC, évitant ainsi le besoin de sondes génétiquement codées11. Comme preuve de principe, deux lignées cellulaires épithéliales couramment utilisées sont étudiées à titre d’exemples pour mettre en évidence les étapes critiques nécessaires à la mesure de l’activité des canaux CFTR et ENaC.
Ici, nous avons décrit des méthodes basées sur la fluorescence pour mesurer l’activité CFTR et ENaC dans la lignée cellulaire du cancer colorectal épithélial, Caco-2, et la lignée cellulaire du cancer du poumon épithélial humain, Calu-3. Ces essais de potentiel membranaire dans des lignées cellulaires épithéliales peuvent être utilisés pour confirmer l’efficacité de composés modulateurs de petites molécules, préalablement identifiés dans des systèmes d’expression hétérologue, avant la validation in vitro finale dans des cultures épithéliales primaires dérivées de patients.
Il est impératif de confirmer que les mesures ci-dessus sont correctement attribuées au canal d’intérêt. Par exemple, la mesure attribuée au CFTR devrait montrer une dépendance à l’expression de la protéine CFTR et à la force motrice électrochimique du chlorure, qui est modulée par la forskoline et l’inhibiteur CFTRInh-172. De même, les changements de potentiel membranaire causés par l’amiloride 10 μM peuvent être attribués à l’ENaC, s’ils dépendent de l’expression de la protéine ENaC et d’une force motrice de sodium vers l’intérieur. Bien que nous ayons confirmé ces propriétés de l’ENaC dans les cellules MDCK après transfection avec les trois sous-unités d’ENaC 2, nous n’avons pas encore formellement confirmé que la réponse amiloride mesurée dans les cellules Caco-2 et Calu-3 est conférée par ENaC. Ceci est particulièrement important, car l’amiloride peut moduler la fonction de l’échangeur sodium-proton NHE3 en plus de l’ENaC13. Il est concevable que l’hyperpolarisation induite par les amilorides observée dans ce test reflète partiellement les effets indirects de l’acidification intracellulaire sur d’autres canaux. Pour confirmer que l’hyperpolarisation induite par l’amiloride mesurée à l’aide de ce colorant sensible au potentiel membranaire est conférée par ENaC dans les lignées cellulaires ci-dessus et les systèmes cellulaires plus complexes, tels que les tissus dérivés de l’iPSC, nous confirmons que cette activité est perdue en éliminant une sous-unité ENaC obligatoire (bêta) dans ces lignées.
Le succès de ces tests nécessite une attention particulière à plusieurs facteurs. Premièrement, les cultures épithéliales doivent être confluentes et bien différenciées. Pour la mesure de la fonction CFTR et ENaC, environ 145 000 cellules doivent être plaquées par puits dans des plaques de 96 puits ou 45 000 cellules par puits dans des plaques de 384 puits. Une fois que les cellules épithéliales atteignent la confluence (dans les 3-4 jours suivant le placage), prévoyez 2-5 jours de différenciation. Ce moment a été déterminé précédemment sur la base de l’expression maximale de la protéine CFTR par immunoblot14. De même, le moment optimal a été déterminé pour l’expression fonctionnelle de l’ENaC dans les deux lignées cellulaires, Calu-3 et Caco-2.
Les monocouches non confluentes ou la prolifération cellulaire entraînent une faible reproductibilité entre les réplications techniques. Dans les cas où les cellules dans les puits individuels n’atteignent pas la confluence en même temps, ces plaques doivent être jetées. De plus, des lectures de base instables ou l’absence de réponses de stimulation peuvent être une indication d’une mauvaise qualité cellulaire, qui doit être exclue de l’analyse. Des réponses réduites à l’activateur du CFTR, la forskoline, ou à l’inhibiteur de l’ENaC, l’amiloride, pourraient potentiellement refléter l’utilisation de cellules excessivement passées15. Bien que ce ne soit pas un problème pour les cellules Calu-3 et Caco-2, d’autres cellules ou tissus peuvent ne pas adhérer bien aux plaques et peuvent nécessiter un prérevêtement des puits. Par exemple, dans des études antérieures, des cultures de cholangiocytes 2D ont été fixées aux plaques à l’aide d’un revêtement de collagène16. Alternativement, l’adhérence des tissus intestinaux 2D a été augmentée en utilisant Poly-L-Lysine2.
De plus, en testant la modulation des canaux ioniques par de petites molécules à l’aide d’un essai basé sur la fluorescence, il est essentiel que les artefacts potentiels conférés par les propriétés fluorescentes des petites molécules soient pris en compte. Pour confirmer la spécificité des réponses fonctionnelles, les essais de potentiel membranaire peuvent être validés davantage à l’aide de méthodes électrophysiologiques conventionnelles, telles que les études Ussing17.
Après avoir confirmé que la réponse détectée par les colorants sensibles au potentiel membranaire est spécifiquement conférée par le canal d’intérêt, ces essais ont un potentiel énorme pour valider les modulateurs prometteurs des canaux ioniques épithéliaux dans leur contexte cellulaire pertinent. Cette plate-forme peut combler le fossé entre les cribles modulateurs à haut débit dans les systèmes d’expression hétérologues et les mesures bioélectriques chronophages dans les tissus primaires difficiles d’accès.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs aimeraient remercier Christopher Fladd et SPARC BioCentre de l’Hospital for Sick Children pour leur aide dans la réalisation des tests de potentiel membranaire mesurant le CFTR et l’ENaC. Ce travail a été soutenu par le programme CFIT grâce au financement de CF Canada et de la Sick Kids Foundation. Ces travaux ont été financés par le gouvernement du Canada par l’entremise de Génome Canada et de l’Institut de génomique de l’Ontario (OGI-148). Cette étude a été financée par le gouvernement de l’Ontario. S.X. a reçu le soutien de la bourse de doctorat de l’Association canadienne de gastroentérologie (ACG).
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |