Summary
Denne protokol beskriver en metode til undersøgelse af elektrogene membranproteiner ved at måle ændringer i membranpotentiale. Dette assay giver en platform for funktionel aflæsning af flere ionkanaler, der endogent udtrykkes i epitelcellelinjer.
Abstract
Fluorescensbaserede undersøgelser er velegnede til analyser af celler i kultur med høj kapacitet. De har været almindeligt anvendt til lægemiddelforskningskampagner rettet mod rekombinante ionkanalproteiner, der er overudtrykt i celler, såsom HEK-293-celler. Der lægges dog stigende vægt på brugen af vævsrelevante cellelinjer til at studere effekten af små molekyleinterventioner. Følgende protokol beskriver tilpasningen af et fluorescensbaseret membranpotentialeassay til undersøgelse af ionkanaler, der endogent udtrykkes i epitelcellelinjer. Membranpotentialeanalysen beskriver et assay med høj kapacitet for chloridkanalaktivitet af Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) i to almindeligt undersøgte epitelcellelinjer, Caco-2 og Calu-3. Derudover beskriver dette papir en ny anvendelse af dette system til måling af aktiviteten af epitelnatriumkanalen (ENaC) i et high-throughput format i de samme epitelcellelinjer. Sammen giver disse fluorescensbaserede assays en robust og fleksibel platform til at studere små molekylemodulatorer, der er målrettet mod to epitelkanaler i en relevant cellulær sammenhæng.
Introduction
Fluorescensbaserede analyser med høj kapacitet af rekombinante kanalproteiner har været yderst effektive til at identificere småmolekylemodulatorer, der har potentiale til at blive fremtidige terapier 1,2,3,4. En almindelig metode til screening af små molekylebiblioteker for ionkanalmodulatorer er ved at måle ændringer i membranpotentialet. Disse skærme udføres typisk ved hjælp af rekombinante kanaler udtrykt heterologt i cellelinjer såsom HEK-293-celler 5,6,7.
Der er dog behov for validering af "hits" i relevante celletyper. Vi foreslår, at en sekundær skærm i relevante cellelinjer, der endogent udtrykker interessekanalerne, er ønskelig. En sådan sekundær screening vil identificere de modulatorer, der med størst sandsynlighed vil være effektive i endelige valideringsassays, der er afhængige af mindre tilgængeligt primært humant væv.
Der er også behov for analysesystemer, der har fleksibilitet til at rapportere aktiviteten af flere ionkanalmål i samme vævstype. For eksempel er der væsentlig offentliggjort litteratur, der understøtter konceptet om, at CFTR og ENaC funktionelt interagerer 8,9,10. Selvom flere velundersøgte epitelcellelinjer vides at udtrykke både CFTR og ENaC, er analysebetingelserne for at studere begge på en høj gennemstrømningsmåde til dato ikke blevet beskrevet.
Denne fluorescensbaserede membranpotentialeanalyse er alsidig, da den anvender en eksogen kemisk sonde til at måle funktionen af CFTR og ENaC og omgå behovet for genetisk kodede sonder11. Som bevis for princippet undersøges to almindeligt anvendte epitelcellelinjer som eksempler for at fremhæve de kritiske trin, der er nødvendige for at måle kanalaktivitet af både CFTR og ENaC.
Protocol
1. Cellebelægning og differentiering
- Kultur Calu-3 og Caco-2 celler i EMEM indeholdende 20% føtalt bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (pen / strep) i en T-75 kolbe.
- Når cellerne når 80-100% sammenløb, aspireres mediet fra T-75-kolben.
- Vask forsigtigt cellerne en gang med 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
- Tilsæt 2 ml forvarmet 0,25% trypsin/0,1% EDTA til cellemonolaget, og T-75-kolben anbringes ved 37 °C i ca. 5 minutter, så cellerne kan løfte sig fra dyrkningskolbens overflade og dissociere til en enkeltcellesuspension.
- Når cellerne er løftet fra kolbeoverfladen, neutraliseres reaktionen med 8 ml dyrkningsmedium (trin 1.1) for i alt 10 ml cellesuspension.
BEMÆRK: Mekanisk dissociere celleklumper i en enkeltcellesuspension med en 10 ml serologisk pipette. - Plade cellerne på en 96-brøndplade (~ 140.000-150.000 celler / brønd) eller en 384-brøndplade (~ 45.000-50.000 celler / brønd) ved 30-40% sammenløb.
- For at plade en fuld 96-brønds plade tilsættes 1,5 ml af cellesuspensionen til 18,5 ml af dyrkningsmediet i et 50 ml konisk rør. Efter blanding tilsættes 200 μL af cellesuspensionen til hvert hul.
- For at plade en fuld 384-brøndplade tilsættes 1 ml cellesuspension til 17 ml af dyrkningsmediet i et 50 ml konisk rør. Efter blanding tilsættes 50 μL af cellesuspensionen til hvert hul.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er klumper af celler, og at enkelte celler fordeles jævnt over hver brønd.
- Skift mediet hver 2. dag efter plettering. Hvis cellerne ikke når sammenløbet på samme tid mellem forskellige huller, kasseres pladen, og trin 1.5 gentages.
- Når du er podet, skal du vente på, at cellerne når 100% sammenløb inden for 3-5 dage. Skift mediet 24 timer før funktionsundersøgelserne.
2. Forberedelse af CFTR-funktionel assaybufferopløsning
- Den natriumfrie, chloridfrie stødpudeopløsning fremstilles med de reagenser, der er anført i tabel 1.
- Der tilsættes reagenser til vævskulturkvalitet, dobbeltdestilleretH2O(ddH2O). Reagenserne opløses (i en lukket beholder for at undgå fordampning) ved omrøring natten over ved stuetemperatur.
- Når opløsningen er stabil, måles pH-værdien. Hvis opløsningens pH-værdi overstiger 7,4, tilsættes dråbevis 1 M N-methyl-D-glucamin (NMDG)-opløsning for at justere pH-værdien til 7,4.
BEMÆRK: Opløsningens pH-værdi må ikke justeres med HCI, da opløsningen skal forblive chloridfri. - Lad opløsningen blandes i yderligere 30 minutter, og opløsningens osmolaritet måles.
- Bufferopløsningens osmolaritet reduceres til et fysiologisk område på 300 ± 5 mOsm/kg.
- Bufferopløsningen filtreres og opbevares i sterile flasker.
BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder. Hvis den opbevares i mere end 6 måneder, skal du kontrollere pH og osmolariteten ved stuetemperatur før brug.
3. CFTR funktionel analyse
- Det membranpotentielle farvestof opløses i den natriumfrie, chloridfrie bufferopløsning (0,5 mg farvestof/1 ml bufferopløsning) og opvarmes til 37 °C.
BEMÆRK: Undgå at udsætte membranens potentielle farvepulver for lys. - Dyrkningsmediet fjernes fra Calu-3- eller Caco-2-cellemonolag, og den farvestofholdige opløsning tilsættes til hvert hul (195 μL pr. hul for en 96-brøndplade, 95 μL pr. hul for en 384-brøndplade).
BEMÆRK: Der kan tilføjes op til 112 μL pr. brønd på 384-brøndplader. - Lad cellerne fylde farvestoffet i 35 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
- Flyt cellerne, fyldt med farvestofopløsning, til fluorescenspladelæseren. Tag fluorescensmålinger fra bunden af pladen med excitation = 530 ± 5 nm, emission = 560 ± 5 nm
- Begynd med at tage kontinuerlige baseline-aflæsninger i 5 minutter med 30 s intervaller.
- Tilsæt 5 μL af en lavkoncentrationsopløsning af forskolin eller DMSO til hver brønd for en endelig koncentration på 1 μM forskolin (1x). Tag en stimuleringsaflæsning i 20 min med målinger med 15 s intervaller.
- Til 96-brønds pladeformat fremstilles lavkoncentrationsopløsningen (40 μM forskolin (1:25 fortynding)) opløsning af forskolin ved fortynding af 2 μL 1 mM forskolin (1.000x) stamopløsning eller DMSO i 48 μL natriumfri, chloridfri bufferopløsning.
BEMÆRK: Den lave koncentration 40 μM forskolin efterfølges af en anden fortynding (1:40 fortynding) i næste trin for en endelig koncentration på 1 μM forskolin. - Til 384-brønd pladeformat, forberede lav-koncentration (20 μM forskolin (1:50 fortynding)) opløsning ved fortynding 1 μL af 1 mM (1.000x) forskolin stamopløsning eller DMSO i 49 μL natriumfri, chlorid-fri bufferopløsning.
BEMÆRK: Den lave koncentration 20 μM forskolin efterfølges af en anden fortynding (1:20 fortynding) i næste trin for en endelig koncentration på 1 μM forskolin.
- Til 96-brønds pladeformat fremstilles lavkoncentrationsopløsningen (40 μM forskolin (1:25 fortynding)) opløsning af forskolin ved fortynding af 2 μL 1 mM forskolin (1.000x) stamopløsning eller DMSO i 48 μL natriumfri, chloridfri bufferopløsning.
- Der tilsættes 5 μL lavkoncentrationsopløsning af CFTRInh172 til en slutkoncentration på 10 μM CFTRInh172. Tag en hæmningsaflæsning i 15 min med målinger med 30 s intervaller.
- Til pladeformatet med 96 huller fremstilles CFTRInh172-opløsningen med lav koncentration (400 μM CFTRInh172 (1:25 fortynding)) ved at fortynde 2 μL af en 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stamopløsning i 48 μL natriumfri, chloridfri bufferopløsning.
BEMÆRK: Den lave koncentration 400 μM CFTRInh172 efterfølges af en anden fortynding (1:40 fortynding) i næste trin for en endelig koncentration på 10 μM CFTRInh172. - Til pladeformatet med 384 huller fremstilles CFTRInh172-opløsningen med lav koncentration (200 μM CFTRInh172 (1:50 fortynding)) ved at fortynde 1 μL 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stamopløsning i 49 μL natriumfri, chloridfri bufferopløsning.
BEMÆRK: Den lave koncentration på 200 μM CFTRInh172 efterfølges af en anden fortynding (1:20 fortynding) i næste trin for en endelig koncentration på 10 μM CFTRInh172.
- Til pladeformatet med 96 huller fremstilles CFTRInh172-opløsningen med lav koncentration (400 μM CFTRInh172 (1:25 fortynding)) ved at fortynde 2 μL af en 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stamopløsning i 48 μL natriumfri, chloridfri bufferopløsning.
- Kvantificer fluorescensintensitetsmålingerne for hvert hul, og eksporter værdierne som et regneark i kolonneformat, der indeholder individuelle huller. For at beregne forskolin-inducerede ændringer divideres RFU-målingerne (relative fluorescensenheder) fra hver brønd i 96- eller 384-brøndpladen med den sidste fluorescensintensitetsmåling af baselineaflæsningen og plottes dem.
- Alternativt kan CFTRInh172-medieret hæmningsrespons kvantificeres for bedre at bekræfte specificiteten af CFTR-funktion 12, da akut behandling med forskolin kan resultere i membrandepolarisering gennem aktiviteten af andre chloridkanaler, såsom SLC26A912.
- Mål peak respons som den maksimale fluorescens intensitet måling fra baseline under forskolin stimulation. Brug denne måling eller dette område under kurven til at kvantificere CFTR-responsen.
4. Forberedelse af ENaC-funktionel assaybufferopløsning
- Den chloridfri bufferopløsning med højt natriumindhold fremstilles med de reagenser, der er anført i tabel 2.
- Når opløsningen er stabil, måles pH-værdien. Hvis opløsningens pH-værdi er under 7,4, tilsættes 1 N NaOH-opløsning dråbevis for at justere pH-værdien til 7,4.
BEMÆRK: Opløsningens pH-værdi må ikke justeres med HCI, da opløsningen skal forblive chloridfri. - Bufferopløsningens osmolaritet reduceres til et fysiologisk område på 300 ± 5 mOsm/kg.
- Bufferopløsningen filtreres og opbevares i sterile flasker ved 4 °C i op til 6 måneder.
BEMÆRK: Hvis opbevaringen varer længere end 6 måneder, skal du kontrollere pH og osmolariteten ved stuetemperatur før brug.
5. ENaC funktionel analyse
- Det membranpotentielle farvestof opløses i chloridfri bufferopløsning med højt natriumindhold (0,5 mg farvestof/1 ml bufferopløsning) og opvarmes til 37 °C.
BEMÆRK: Undgå at udsætte membranens potentielle farvepulver for lys. - Dyrkningsmediet fjernes fra Calu-3- eller Caco-2-cellemonolag, og den farvestofholdige opløsning tilsættes til hvert hul (195 μL pr. hul for plader med 96 brønde, 95 μL pr. hul for plader med 384 brønde).
BEMÆRK: Undgå at udsætte farvestofopløsningen for lys. - Lad cellerne fylde farvestof i 35 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
- Flyt cellerne, fyldt med farvestofopløsning, til fluorescenspladelæseren. Aflæs fluorescensmålinger fra bunden af pladen med excitation = 530 ± 5 nm, emission = 560 ± 5 nm.
- Begynd med at tage kontinuerlige baseline-aflæsninger i 5 minutter med 30 s intervaller.
- For at hæmme ENaC-funktionen tilsættes 5 μL lavkoncentrationsopløsning amilorid eller lavkoncentrationsopløsning DMSO opløst i bufferopløsningen med højt natriumindhold og nulchlorid til en slutkoncentration på 10 μM amilorid.
- Til pladeformatet med 96 huller fremstilles amiloridopløsningen med lav koncentration (400 μM amilorid (1:25 fortynding)) ved fortynding af 2 μL 10 mM amilorid (1.000x) stamopløsning i 48 μliter chloridfri bufferopløsning med højt natriumindhold.
BEMÆRK: Den lave koncentration 400 μM amilorid efterfølges af en anden fortynding (1:40 fortynding) i næste trin for en slutkoncentration på 10 μM amilorid. - Til pladeformatet med 384 huller fremstilles amiloridopløsningen med lav koncentration (200 μM amilorid (1:50 fortynding)) ved tilsætning af 1 μL 10 mM amilorid (1.000x) stamopløsning i 49 μL chloridfri bufferopløsning med højt natriumindhold.
BEMÆRK: Lavkoncentrations-200 μM amilorid efterfølges af en anden fortynding (1:20 fortynding) i næste trin for en slutkoncentration på 10 μM amilorid.
- Til pladeformatet med 96 huller fremstilles amiloridopløsningen med lav koncentration (400 μM amilorid (1:25 fortynding)) ved fortynding af 2 μL 10 mM amilorid (1.000x) stamopløsning i 48 μliter chloridfri bufferopløsning med højt natriumindhold.
- Tag en hæmningsaflæsning i 60 min med målinger med 45 s intervaller.
- Gentag trin 3.7 for dataanalyse.
- Mål amiloridresponsen som den procentvise hæmning fra baseline til plateaupunktet, ca. 15-20 minutter efter tilsætning af amilorid. Brug denne forskel til at kvantificere ENaC-responsen.
Representative Results
For at måle CFTR-kanalaktivitet inkuberes veldifferentierede, klæbende celler i en ekstracellulær nulchloridopløsning indeholdende membranpotentialefølsomt farvestof. CFTR-funktion detekteres konsekvent som membrandepolarisering efter forskolinstimulering. Kloridudstrømning detekteres som en kraftig stigning i fluorescens sammenlignet med køretøjets kontrol. Fluorescenssignalet opretholdes indtil tilsætning af CFTR-hæmmer (CFTRInh172), hvilket fører til et hurtigt fald i fluorescensintensiteten, som det ses i Caco-2-celler (figur 1A), og er reproducerbart i både Caco-2- og Calu-3-celler (figur 1B). Vurderingen af CFTR-aktivitet som forskellen i den maksimale ændring i fluorescens efter forskolin eller DMSO (køretøj). Individuelle punkter varierede mellem ± 3 standardafvigelser fra den gennemsnitlige forskolinstimulering (sorte punkter) eller DMSO-kontrol (grå punkter), hvilket svarede til en Z'-faktor på 0,586. Denne fremragende score indikerede reproducerbarheden af dette assay (figur 1C). Hvis der er en mindre afvigelse i basislinjen, kan virkningen af afdriften minimeres ved at ekstrapolere basislinjen gennem hele sporingen efter aktivering op til punktet for inhibitortilsætning. Responsen kan kvantificeres som arealet under kurven, hvor den nedre grænse defineres af den ekstrapolerede linje.
ENaC-aktivitet kan også måles i sammenflydende luftvejs- og colonepitelceller dyrket i 96-brøndplader. I modsætning til analysen for CFTR-kanalaktivitet nedsænkes disse celler i en opløsning med højt natriumindhold, hvilket muliggør natriumabsorption gennem ENaC. Ved akut tilsætning af amilorid blokeres natriumoptagelsen, og celler oplever relativ membranhyperpolarisering. Dette er vist i Caco-2-celler ved både lave (10 μM) (figur 2A) og høje koncentrationer (50 μM) amilorid (figur 2A, B) og i Calu-3-celler med en høj koncentration af amilorid (50 μM) (figur 2B). ENaC-analysen blev udvidet til et pladeformat med 384 brønde og viste stor reproducerbarhed i ENaC-hæmning. Tilsvarende varierede de enkelte punkter mellem ± 3 standardafvigelser fra den gennemsnitlige amiloridhæmning (sorte punkter) eller DMSO-kontrol (grå punkter). ENaC-responset i Calu-3-celler rapporterede en Z'-faktor på 0,629 ved akut behandling med amilorid (50 μM) (figur 2C), hvilket indikerer, at disse parametre understøtter screening med høj kapacitet.
Figur 1: CFTR-kanalmåling som ændringer i membrandepolarisering i Caco-2- og Calu-3-celler. (A) Repræsentativt spor af CFTR-stimulering med forskolin (1 μM) og DMSO-kontrol i Caco-2-celler. (B) Box og whisker plot af forskolin stimulering i Caco-2 og Calu-3 celler (**** P < 0,0001, n > 3 biologiske replikater, n > 3 tekniske replikater). Biologiske replikater er uafhængige cellelinjepassager; Tekniske replikater henviser til uafhængige brønde i multibrøndpladerne. Box plot viser medianværdien; grænser skildrer IQR, hvor knurhårene definerer minima og maxima værdier. (C) Bland-Altman plot af reproducerbar CFTR respons med forskolin stimulering sammenlignet med DMSO kontrol i Caco-2 celler. Sorte punkter repræsenterer maksimale absolutte ændringer i fluorescens som reaktion på forskolin stimulering. Grå punkter repræsenterer ændringer i fluorescens som reaktion på DMSO-kontrol. Forkortelser: CFTR = cystisk fibrose transmembran konduktansregulator; DMSO = dimethylsulfoxid; IQR = interkvartilt område; Fsk = forskolin; ΔF/F0 = ændring i fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: ENaC-hæmningsmålinger gennem membranhyperpolarisering i Caco-2- og Calu-3-celler. (A) Repræsentativt spor af ENaC-hæmning med amilorid (10 μM) i forhold til DMSO-kontrol i Caco-2-celler. (B) Box og whisker plot af amilorid hæmning i Caco-2 og Calu-3 celler (**** P < 0,0001, n > 3 biologiske replikater, n > 3 tekniske replikater). (C) Bland-Altman-plot af reproducerbar ENaC-respons med amiloridhæmning sammenlignet med DMSO-kontrol i Calu-3-celler. Sorte punkter repræsenterer maksimale absolutte ændringer i fluorescens som reaktion på amiloridhæmning. Grå punkter repræsenterer ændringer i fluorescens som reaktion på DMSO-kontrol. Forkortelser: ENaC = epitelnatriumkanal; DMSO = dimethylsulfoxid; Amil. = amilorid; ΔF/F0 = ændring i fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn | Koncentration |
| NMDG (N-methyl-D-glucamine) | 150 mM |
| Gluconsyre lacton | 150 mM |
| Kaliumgluconat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tabel 1: Reagenser og deres tilsvarende koncentrationer for CFTR-funktionelt assay med nulnatrium og chlorid. Forkortelse: CFTR = Cystisk fibrose transmembran konduktansregulator.
| Navn | Koncentration |
| Natriumgluconat | 150 mM |
| Kaliumgluconat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tabel 2: Reagenser og deres tilsvarende koncentrationer for ENaC-funktionel assaybuffer med højt natriumindhold, nulchlorid. Forkortelse: ENaC = Epitelnatrium (Na) kanal.
Discussion
Her har vi beskrevet fluorescensbaserede metoder til måling af CFTR- og ENaC-aktivitet i epitelkolorektal cancercellelinjen, Caco-2, og den humane epitellungekræftcellelinje, Calu-3. Disse membranpotentialeanalyser i epitelcellelinjer kan anvendes til at bekræfte effekten af små molekylemodulatorforbindelser, der tidligere er identificeret i heterologe ekspressionssystemer, forud for endelig in vitro-validering i primære patientafledte epitelkulturer.
Det er bydende nødvendigt at bekræfte, at ovenstående målinger passende tilskrives interessekanalen. For eksempel bør målingen, der tilskrives CFTR, vise afhængighed af CFTR-proteinekspression og den elektrokemiske drivkraft af chlorid, som moduleres af forskolin og inhibitoren CFTRInh-172. På samme måde kan membranpotentielle ændringer forårsaget af 10 μM amilorid tilskrives ENaC, hvis de er afhængige af ENaC-proteinekspression og en indadgående natriumdrivkraft. Selvom vi har bekræftet disse egenskaber af ENaC i MDCK-celler efter transfektion med alle tre underenheder af ENaC 2, har vi endnu ikke formelt bekræftet, at amiloridresponset målt iCaco-2- og Calu-3-celler tildeles af ENaC. Dette er især vigtigt, da amilorid kan modulere funktionen af natrium-protonbytteren NHE3 ud over ENaC13. Det kan tænkes, at den amilorid-inducerede hyperpolarisering, der observeres i dette assay, delvis kunne afspejle de indirekte virkninger af intracellulær forsuring på andre kanaler. For at bekræfte, at den amiloridinducerede hyperpolarisering målt ved hjælp af dette membranpotentialefølsomme farvestof tildeles af ENaC i ovenstående cellelinjer og mere komplekse cellesystemer, såsom iPSC-afledte væv, bekræfter vi, at denne aktivitet går tabt ved at slå en obligatorisk ENaC-underenhed (beta) ud i disse linjer.
Succesen med disse analyser kræver opmærksomhed på flere faktorer. For det første skal epitelkulturerne være sammenflydende og godt differentierede. Til måling af CFTR- og ENaC-funktion skal ca. 145.000 celler belægges pr. brønd i plader med 96 brønde eller 45.000 celler pr. brønd i plader med 384 brønde. Når epitelcellerne når sammenløbet (inden for 3-4 dage efter plettering), tillad 2-5 dages differentiering. Denne timing blev tidligere bestemt baseret på maksimal CFTR-proteinekspression ved immunoblotting14. Tilsvarende blev optimal timing bestemt for funktionel ENaC-ekspression i begge cellelinjer, Calu-3 og Caco-2.
Ikke-sammenflydende monolag eller celleovervækst fører til lav reproducerbarhed på tværs af tekniske replikater. I tilfælde, hvor celler i individuelle brønde ikke når sammenløb på samme tid, skal disse plader kasseres. Derudover kan ustabile baselineaflæsninger eller manglende stimuleringsrespons være en indikation af dårlig cellekvalitet, som skal udelukkes fra analyse. Reduceret respons på CFTR-aktivatoren, forskolin, eller ENaC-hæmmeren, amilorid, kan potentielt afspejle brugen af overdrevent passerede celler15. Selvom det ikke er et problem for Calu-3- og Caco-2-celler, klæber andre celler eller væv muligvis ikke godt til pladerne og kan kræve forbelægning af brøndene. For eksempel blev 2D cholangiocytkulturer i tidligere undersøgelser fastgjort til pladerne ved hjælp af kollagenbelægning16. Alternativt blev vedhæftningen af 2D tarmvæv øget under anvendelse af Poly-L-lysin2.
Ved test af modulering af ionkanaler med små molekyler ved hjælp af et fluorescensbaseret assay er det afgørende, at potentielle artefakter tildelt af de små molekylers fluorescerende egenskaber behandles. For at bekræfte specificiteten af funktionelle responser kan membranpotentialeanalyser valideres yderligere ved hjælp af konventionelle elektrofysiologiske metoder, såsom Ussing-undersøgelser17.
Efter at have bekræftet, at responsen detekteret af membranpotentialefølsomme farvestoffer specifikt tildeles af interessekanalen, har disse analyser et enormt potentiale til at validere lovende modulatorer af epitelionkanaler i deres relevante cellulære sammenhæng. Denne platform kan bygge bro mellem modulatorskærme med høj kapacitet i heterologe ekspressionssystemer og tidskrævende, bioelektriske målinger i vanskeligt tilgængelige primære væv.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Christopher Fladd og SPARC BioCentre på Hospital for Sick Children for deres hjælp med at udføre membranpotentialeassays, der måler CFTR og ENaC. Dette arbejde blev støttet af CFIT-programmet med finansiering fra CF Canada og Sick Kids Foundation. Dette arbejde blev finansieret af Canadas regering gennem Genome Canada og Ontario Genomics Institute (OGI-148). Denne undersøgelse blev finansieret af regeringen i Ontario. S.X. blev støttet af Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
| EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
| FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
| HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
| Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
| Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
| Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |
References
- Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
- Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419 (2021).
- Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
- Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
- Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
- Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946 (2020).
- Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
- Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
- Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
- Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073 (2017).
- Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
- Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504 (2021).
- Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).
