यह प्रोटोकॉल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन को मापकर इलेक्ट्रोजेनिक झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यह परख उपकला कोशिका लाइनों में अंतर्जात रूप से व्यक्त कई आयन चैनलों के कार्यात्मक रीडआउट के लिए एक मंच प्रदान करती है।
प्रतिदीप्ति-आधारित अध्ययन संस्कृति में कोशिकाओं के उच्च-थ्रूपुट प्लेट रीडर परख के लिए उपयुक्त हैं। उन्हें आमतौर पर एचईके -293 कोशिकाओं जैसे कोशिकाओं में पुनः संयोजक आयन चैनल प्रोटीन को लक्षित करने वाले दवा खोज अभियानों के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, छोटे अणु हस्तक्षेप के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए ऊतक-प्रासंगिक सेल लाइनों के उपयोग पर जोर बढ़ रहा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल उपकला कोशिका लाइनों में अंतर्जात रूप से व्यक्त आयन चैनलों के अध्ययन के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित झिल्ली संभावित परख के अनुकूलन का वर्णन करता है। झिल्ली संभावित परख दो सामान्य रूप से अध्ययन किए गए उपकला कोशिका लाइनों, काको -2 और कालू -3 में सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) की क्लोराइड चैनल गतिविधि के लिए एक उच्च-थ्रूपुट परख का विवरण देती है। इसके अलावा, यह पेपर एक ही उपकला कोशिका लाइनों में उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में उपकला सोडियम चैनल (ईएनसी) की गतिविधि को मापने के लिए इस प्रणाली के एक नए अनुप्रयोग का वर्णन करता है। साथ में, ये प्रतिदीप्ति-आधारित परख छोटे अणु मॉड्यूलेटर का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और लचीला मंच प्रदान करते हैं, जो एक प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ में दो उपकला चैनलों को लक्षित करते हैं।
पुनः संयोजक चैनल प्रोटीन के प्रतिदीप्ति-आधारित, उच्च-थ्रूपुट गतिविधि परख छोटे-अणु मॉड्यूलेटर की पहचान करने में अत्यधिक प्रभावी रहे हैं जिनमें भविष्य के उपचार 1,2,3,4 बनने की क्षमता है। आयन चैनल मॉड्यूलेटर के लिए छोटे अणु पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग का एक सामान्य तरीका झिल्ली क्षमता में परिवर्तन को मापने के माध्यम से है। आमतौर पर, इन स्क्रीन को पुनः संयोजक चैनलों का उपयोग करके आयोजित किया जाता है जो एचईके -293 कोशिकाओं 5,6,7 जैसे सेल लाइनों में विषम रूप से व्यक्त किए जाते हैं।
हालांकि, प्रासंगिक सेल प्रकारों में “हिट्स” के सत्यापन की आवश्यकता है। हम प्रस्ताव करते हैं कि प्रासंगिक सेल लाइनों में एक माध्यमिक स्क्रीन जो अंतर्जात रूप से रुचि के चैनलों को व्यक्त करती है, वांछनीय है। इस तरह की एक माध्यमिक स्क्रीन उन मॉड्यूलेटर की पहचान करेगी जो अंतिम सत्यापन परख में प्रभावी होने की संभावना है जो कम सुलभ प्राथमिक मानव ऊतकों पर भरोसा करते हैं।
परख प्रणालियों की भी आवश्यकता है जिनके पास एक ही ऊतक प्रकार में कई आयन चैनल लक्ष्यों की गतिविधि की रिपोर्ट करने का लचीलापन है। उदाहरण के लिए, वास्तविक प्रकाशित साहित्य है जो इस अवधारणा का समर्थन करता है कि सीएफटीआर और ईएनएसी कार्यात्मक रूप से 8,9,10 बातचीत करते हैं। यद्यपि कई अच्छी तरह से अध्ययन किए गए उपकला कोशिका लाइनों को सीएफटीआर और ईएनएसी दोनों को व्यक्त करने के लिए जाना जाता है, आज तक, उच्च-थ्रूपुट तरीके से दोनों का अध्ययन करने के लिए परख स्थितियों का वर्णन नहीं किया गया है।
यह प्रतिदीप्ति-आधारित झिल्ली संभावित परख बहुमुखी है, क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांचकी आवश्यकता को दरकिनार करते हुए सीएफटीआर और ईएनएसी के कार्य को मापने के लिए एक बहिर्जात रासायनिक जांच को नियोजित करता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, सीएफटीआर और ईएनएसी दोनों की चैनल गतिविधि को मापने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों को उजागर करने के लिए उदाहरण के रूप में दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले उपकला कोशिका लाइनों का अध्ययन किया जाता है।
यहां, हमने उपकला कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन, काको -2, और मानव उपकला फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन, कालू -3 में सीएफटीआर और ईएनएसी गतिविधि को मापने के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित तरीकों का वर्णन किया है। उपकला कोशिका लाइनों में इन झिल्ली संभावित परखों का उपयोग छोटे अणु मॉड्यूलेटर यौगिकों की प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है, जो पहले हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में पहचाने जाते थे, प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न उपकला संस्कृतियों में अंतिम इन विट्रो सत्यापन से पहले।
यह पुष्टि करना अनिवार्य है कि उपरोक्त माप उचित रूप से रुचि के चैनल के लिए जिम्मेदार हैं। उदाहरण के लिए, सीएफटीआर को दिए गए माप को सीएफटीआर प्रोटीन अभिव्यक्ति और क्लोराइड के इलेक्ट्रोकेमिकल ड्राइविंग बल पर निर्भरता दिखानी चाहिए, जिसे फोर्सकोलिन और अवरोधक सीएफटीआरआईएनएच -172 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसी तरह, 10 μM amiloride के कारण झिल्ली संभावित परिवर्तनों को ENAC के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, अगर वे ENAC प्रोटीन अभिव्यक्ति और एक आंतरिक सोडियम ड्राइविंग बल पर निर्भर हैं। यद्यपि हमने ईएनएसी 2 के सभी तीन सबयूनिट्स के साथ अभिकर्मक के बाद एमडीसीके कोशिकाओं में ईएनएसी के इन गुणों की पुष्टि की है, हमने अभी तक औपचारिक रूप से पुष्टि नहीं की है कि कैको –2 और कैलू -3 कोशिकाओं में मापा गया एमिलोराइड प्रतिक्रिया ईएनएसी द्वारा प्रदान की जाती है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि एमिलोराइड ईएनएसी13 के अलावा सोडियम-प्रोटॉन एक्सचेंजर एनएचई 3 के कार्य को संशोधित कर सकता है। संभावित रूप से, इस परख में देखा गया एमिलोराइड-प्रेरित हाइपरपोलराइजेशन आंशिक रूप से अन्य चैनलों पर इंट्रासेल्युलर अम्लीकरण के अप्रत्यक्ष प्रभावों को प्रतिबिंबित कर सकता है। यह पुष्टि करने के लिए कि इस झिल्ली संभावित-संवेदनशील डाई का उपयोग करके मापा गया एमिलोराइड-प्रेरित हाइपरपोलराइजेशन उपरोक्त सेल लाइनों और अधिक जटिल सेल सिस्टम, जैसे आईपीएससी-व्युत्पन्न ऊतकों में ईएनएसी द्वारा प्रदान किया जाता है, हम पुष्टि कर रहे हैं कि यह गतिविधि इन लाइनों में एक बाध्य ईएनएसी सबयूनिट (बीटा) को खटखटाकर खो जाती है।
इन परखों की सफलता के लिए कई कारकों पर ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, उपकला संस्कृतियों को सुसंगत और अच्छी तरह से विभेदित किया जाना चाहिए। सीएफटीआर और ईएनएसी फ़ंक्शन के माप के लिए, लगभग 145,000 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में प्रति कुएं या 384-वेल प्लेटों में 45,000 कोशिकाओं को प्रति कुएं चढ़ाया जाना चाहिए। एक बार जब उपकला कोशिकाएं कंफ्लुएंसी (चढ़ाना से 3-4 दिनों के भीतर) तक पहुंच जाती हैं, तो भेदभाव के 2-5 दिनों की अनुमति दें। यह समय पहले इम्यूनोब्लॉटिंग14 द्वारा अधिकतम सीएफटीआर प्रोटीन अभिव्यक्ति के आधार पर निर्धारित किया गया था। इसी तरह, दोनों सेल लाइनों, कालू -3 और काको -2 में कार्यात्मक ईएनएसी अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम समय निर्धारित किया गया था।
नॉनकॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर या सेल अतिवृद्धि तकनीकी प्रतिकृति में कम प्रजनन क्षमता की ओर ले जाती है। ऐसे मामलों में जहां अलग-अलग कुओं में कोशिकाएं एक ही समय में कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंचती हैं, इन प्लेटों को छोड़ दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, अस्थिर बेसलाइन रीडिंग या उत्तेजना प्रतिक्रियाओं की कमी खराब सेल गुणवत्ता का संकेत हो सकती है, जिसे विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। सीएफटीआर एक्टिवेटर, फोर्सकोलिन, या ईएनएसी अवरोधक, एमिलोराइड के लिए कम प्रतिक्रियाएं, संभावित रूप से अत्यधिकपारित कोशिकाओं के उपयोग को प्रतिबिंबित कर सकती हैं। हालांकि कालू -3 और कैको -2 कोशिकाओं के लिए कोई समस्या नहीं है, अन्य कोशिकाएं या ऊतक प्लेटों का अच्छी तरह से पालन नहीं कर सकते हैं और कुओं की प्रीकोटिंग की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों में, कोलेजन कोटिंग16 का उपयोग करके 2 डी कोलेंजियोसाइट संस्कृतियों को प्लेटों से जोड़ा गया था। वैकल्पिक रूप से, पॉली-एल-लाइसिन 2 का उपयोग करके2 डी आंतों के ऊतकों का पालन बढ़ाया गया था।
इसके अलावा, प्रतिदीप्ति-आधारित परख का उपयोग करके छोटे अणुओं द्वारा आयन चैनलों के मॉड्यूलेशन का परीक्षण करने में, यह महत्वपूर्ण है कि छोटे अणुओं के फ्लोरोसेंट गुणों द्वारा प्रदत्त संभावित कलाकृतियों को संबोधित किया जाए। कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, झिल्ली संभावित परख को पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधियों का उपयोग करके आगे मान्य किया जा सकता है, जैसे कि यूसिंग अध्ययन17।
यह पुष्टि करने के बाद कि झिल्ली संभावित-संवेदनशील रंगों द्वारा पता लगाई गई प्रतिक्रिया विशेष रूप से रुचि के चैनल द्वारा प्रदान की जाती है, इन परखों में उनके प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ में उपकला आयन चैनलों के आशाजनक मॉड्यूलेटर को मान्य करने की जबरदस्त क्षमता है। यह मंच हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में उच्च-थ्रूपुट मॉड्यूलेटर स्क्रीन और मुश्किल-से-पहुंच वाले प्राथमिक ऊतकों में समय लेने वाली, बायोइलेक्ट्रिक माप के बीच की खाई को पाट सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक सीएफटीआर और ईएनएसी को मापने वाले झिल्ली संभावित परख के संचालन में उनकी मदद के लिए बीमार बच्चों के अस्पताल में क्रिस्टोफर फ्लैड और एसपीएआरसी बायोसेंटर को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम सीएफ कनाडा और सिक किड्स फाउंडेशन द्वारा प्रदान किए गए धन के साथ सीएफआईटी कार्यक्रम द्वारा समर्थित था। इस काम को जीनोम कनाडा और ओंटारियो जीनोमिक्स इंस्टीट्यूट (ओजीआई -148) के माध्यम से कनाडा सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस अध्ययन को ओंटारियो सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एसएक्स को कैनेडियन एसोसिएशन ऑफ गैस्ट्रोएंटरोलॉजी (सीएजी) पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |