Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En fluorescensbasert analyse av membranpotensial for funksjonell studie med høy gjennomstrømning av to endogene ionekanaler i to epitelcellelinjer

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63528

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for studier av elektrogene membranproteiner ved å måle endringer i membranpotensial. Denne analysen gir en plattform for funksjonell avlesning av flere ionekanaler endogent uttrykt i epitelcellelinjer.

Abstract

Fluorescensbaserte studier er egnet for plateleseranalyser med høy gjennomstrømning av celler i kultur. De har ofte blitt brukt til narkotikaoppdagelseskampanjer rettet mot rekombinante ionkanalproteiner overuttrykt i celler som HEK-293-celler. Det legges imidlertid økende vekt på bruk av vevsrelevante cellelinjer for å studere effekten av småmolekylære intervensjoner. Følgende protokoll beskriver tilpasningen av en fluorescensbasert membranpotensialanalyse for studiet av ionkanaler endogent uttrykt i epitelcellelinjer. Membranpotensialanalysen beskriver en høy gjennomstrømningsanalyse for kloridkanalaktiviteten til Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) i to ofte studerte epitelcellelinjer, Caco-2 og Calu-3. I tillegg beskriver denne artikkelen en ny anvendelse av dette systemet for å måle aktiviteten til epitelial natriumkanal (ENaC) i et høyt gjennomstrømningsformat i de samme epitelcellelinjene. Sammen gir disse fluorescensbaserte analysene en robust og fleksibel plattform for å studere småmolekylære modulatorer, rettet mot to epitelkanaler i en relevant cellulær kontekst.

Introduction

Fluorescensbaserte aktivitetsanalyser med høy gjennomstrømning av rekombinante kanalproteiner har vært svært effektive for å identifisere småmolekylære modulatorer som har potensial til å bli fremtidige terapier 1,2,3,4. En vanlig metode for screening av små molekylbiblioteker for ionkanalmodulatorer er gjennom måling av endringer i membranpotensial. Vanligvis utføres disse skjermene ved hjelp av rekombinante kanaler uttrykt heterologt i cellelinjer som HEK-293-celler 5,6,7.

Det er imidlertid behov for validering av "treff" i relevante celletyper. Vi foreslår at en sekundær skjerm i relevante cellelinjer som endogent uttrykker kanalene av interesse er ønskelig. En slik sekundær skjerm vil identifisere de modulatorene som mest sannsynlig vil være effektive i endelige valideringsanalyser som er avhengige av mindre tilgjengelige primære menneskelige vev.

Det er også behov for analysesystemer som har fleksibilitet til å rapportere aktiviteten til flere ionkanalmål i samme vevstype. For eksempel er det substansiell publisert litteratur som støtter konseptet om at CFTR og ENaC funksjonelt samhandler 8,9,10. Selv om flere godt studerte epitelcellelinjer er kjent for å uttrykke både CFTR og ENaC, er analysebetingelsene for å studere begge på en høy gjennomstrømningsmåte hittil ikke beskrevet.

Denne fluorescensbaserte membranpotensialanalysen er allsidig, da den bruker en eksogen kjemisk sonde for å måle funksjonen til CFTR og ENaC, og omgå behovet for genetisk kodede sonder11. Som prinsippbevis studeres to ofte brukte epitelcellelinjer som eksempler for å markere de kritiske trinnene som er nødvendige for å måle kanalaktiviteten til både CFTR og ENaC.

Protocol

1. Cell plating og differensiering

  1. Kultur Calu-3 og Caco-2 celler i EMEM inneholdende 20% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (penn / streptokokker) i en T-75 kolbe.
  2. Når cellene når 80-100% konfluens, aspirerer mediet fra T-75-kolben.
  3. Vask forsiktig cellene én gang med 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
  4. Tilsett 2 ml forvarmet 0,25 % trypsin/0,1 % EDTA til cellemonolaget og plasser T-75-kolben ved 37 °C i ca. 5 minutter for å la cellene løfte seg fra dyrkingskolbeoverflaten og dissosieres til en encellesuspensjon.
  5. Når cellene er løftet fra kolbeoverflaten, nøytraliser reaksjonen med 8 ml kulturmedium (trinn 1,1) for totalt 10 ml cellesuspensjon.
    MERK: Mekanisk dissosierte celleklumper til en encellesuspensjon med en 10 ml serologisk pipette.
  6. Plate cellene på en 96-brønnplate (~ 140.000-150.000 celler / brønn) eller en 384-brønnplate (~ 45.000-50.000 celler / brønn) ved 30-40% sammenløp.
    1. For å plate en full 96-brønnsplate, tilsett 1,5 ml av cellesuspensjonen til 18,5 ml av kulturmediet i et 50 ml konisk rør. Etter blanding, tilsett 200 μL av cellesuspensjonen til hver brønn.
    2. For å plate en full 384-brønnplate, tilsett 1 ml av cellesuspensjonen til 17 ml av kulturmediet i et 50 ml konisk rør. Etter blanding, tilsett 50 μL av cellesuspensjonen til hver brønn.
      MERK: Forsikre deg om at det ikke er klumper av celler, og enkeltceller fordeles jevnt over hver brønn.
  7. Bytt medium hver 2. dag etter plating. Hvis cellene ikke når sammenløp samtidig mellom forskjellige brønner, kast platen og gjenta trinn 1.5.
  8. Når de er seedet, vent til cellene når 100% sammenløp innen 3-5 dager. Bytt medium 24 timer før funksjonsstudiene.

2. Klargjøring av CFTR-bufferløsning for funksjonell analyse

  1. Klargjør den natriumfrie, kloridfrie bufferoppløsningen med reagensene listet opp i tabell 1.
  2. Tilsett reagensene til vevskulturklasse, dobbeltdestillertH2O(ddH2O). La reagensene løse seg opp (i en lukket beholder for å unngå fordampning) ved omrøring over natten ved romtemperatur.
  3. Når oppløsningen er stabil, måler du pH. Hvis oppløsningens pH overstiger 7,4, tilsett 1 M N-metyl-D-glukamin (NMDG) oppløsning dråpevis for å justere pH til 7,4.
    MERK: Ikke juster pH i oppløsningen med HCl fordi oppløsningen må forbli kloridfri.
  4. La løsningen blandes i ytterligere 30 minutter og mål oppløsningens osmolaritet.
    1. Reduser osmolariteten til bufferløsningen til et fysiologisk område på 300 ± 5 mOsm/kg.
  5. Filtrer og oppbevar bufferløsningen i sterile flasker.
    MERK: Oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder. Ved oppbevaring i mer enn 6 måneder, kontroller pH og osmolaritet ved romtemperatur før bruk.

3. CFTR funksjonell analyse

  1. Løs opp membranpotensialfargestoffet i den natriumfrie, kloridfrie bufferløsningen (0,5 mg fargestoff/1 ml bufferløsning) og varm den til 37 °C.
    NOTAT: Unngå å utsette membranpotensialet fargepulver for lys.
  2. Fjern kulturmediet fra Calu-3- eller Caco-2-cellemonolag og tilsett den fargeholdige løsningen til hver brønn (195 μL per brønn for en 96-brønnplate, 95 μL per brønn for en 384-brønnplate).
    MERK: Opptil 112 μL kan tilsettes per brønn på 384-brønnsplater.
  3. La cellene legge fargestoffet i 35 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
  4. Flytt cellene, lastet med fargestoffoppløsning, til fluorescensplateleseren. Ta fluorescensmålinger fra bunnen av platen, med eksitasjon = 530 ± 5 nm, utslipp = 560 ± 5 nm
  5. Begynn med å ta kontinuerlige grunnlinjeavlesninger i 5 minutter med 30 s intervaller.
  6. Tilsett 5 μL av en lavkonsentrasjonsløsning av forskolin eller DMSO til hver brønn for en endelig konsentrasjon på 1 μM forskolin (1x). Ta en stimuleringsavlesning i 20 min med målinger med 15 s intervaller.
    1. For 96-brønns plateformat, forberede lav-konsentrasjon (40 μM forskolin (1:25 fortynning)) oppløsning av forskolin ved å fortynne 2 μL av 1 mM forskolin (1000x) stamløsning eller DMSO i 48 mikrol natriumfri, kloridfri bufferløsning.
      MERK: Den lave konsentrasjonen 40 μM forskolin etterfølges av en andre fortynning (1:40 fortynning) i neste trinn for en endelig konsentrasjon på 1 μM forskolin.
    2. For 384-brønns plateformatet, klargjør løsningen med lav konsentrasjon (20 μM forskolin (1:50 fortynning)) ved å fortynne 1 μL 1 mM (1000x) forskolinstamløsning eller DMSO i 49 μL natriumfri, kloridfri bufferløsning.
      MERK: Den lave konsentrasjonen 20 μM forskolin etterfølges av en andre fortynning (1:20 fortynning) i neste trinn for en endelig konsentrasjon på 1 μM forskolin.
  7. Tilsett 5 μL lavkonsentrasjonsoppløsning av CFTRInh172 for en endelig konsentrasjon på 10 μM CFTRInh172. Ta en inhiberingsavlesning i 15 min med målinger med 30 s intervaller.
    1. For 96-brønns plateformat, klargjør CFTRInh172 lavkonsentrasjonsoppløsning (400 μM CFTRInh172 (1:25 fortynning)) ved å fortynne 2 μL av en 10 mM CFTRInh172 (1000x) stamløsning i 48 mikrol natriumfri, kloridfri bufferløsning.
      MERK: Den lave konsentrasjonen 400 μM CFTRInh172 etterfølges av en ny fortynning (1:40 fortynning) i neste trinn for en endelig konsentrasjon på 10 μM CFTRInh172.
    2. For 384-brønns plateformat, klargjør CFTRInh172 lavkonsentrasjonsoppløsning (200 μM CFTRInh172 (1:50 fortynning)) ved å fortynne 1 μL 10 mM CFTRInh172 (1000x) stamløsning i 49 mikrol natriumfri, kloridfri bufferløsning.
      MERK: Den lave konsentrasjonen 200 μM CFTRInh172 etterfølges av en andre fortynning (1:20 fortynning) i neste trinn for en endelig konsentrasjon på 10 μM CFTRInh172.
  8. Kvantifiser fluorescensintensitetsmålingene for hver brønn, og eksporter verdiene som et regneark i kolonneformat som inneholder individuelle brønner. For å beregne forskolininduserte endringer, del RFU-målingene (Relative Fluorescence Units) fra hver brønn på 96- eller 384-brønnplaten med den siste fluorescensintensitetsmålingen av baselineavlesningen og plott dem.
    1. Alternativt kan du kvantifisere CFTRInh172-mediert inhiberingsrespons for bedre å bekrefte spesifisiteten til CFTR-funksjon 12, da akutt behandling med forskolin kan resultere i membrandepolarisering gjennom aktiviteten til andre kloridkanaler, slik som SLC26A912.
  9. Mål toppresponsen som maksimal fluorescensintensitetsmåling fra baseline under forskolinstimulering. Bruk denne målingen eller området under kurven til å kvantifisere CFTR-responsen.

4. Klargjøring av ENaC funksjonell analysebufferløsning

  1. Klargjør kloridfri bufferløsning med høyt natrium med reagensene listet opp i tabell 2.
  2. Når oppløsningen er stabil, måler du pH. Hvis oppløsningens pH er under 7,4, tilsett 1 N NaOH-oppløsning dråpevis for å justere pH til 7,4.
    MERK: Ikke juster pH i oppløsningen med HCl fordi oppløsningen må forbli kloridfri.
  3. Reduser osmolariteten til bufferløsningen til et fysiologisk område på 300 ± 5 mOsm/kg.
  4. Filtrer og oppbevar bufferløsningen i sterile flasker ved 4 °C i opptil 6 måneder.
    MERK: Hvis oppbevaringen er lengre enn 6 måneder, kontroller pH og osmolariteten ved romtemperatur før bruk.

5. ENaC funksjonell analyse

  1. Løs opp membranpotensialfargestoffet i den kloridfrie bufferløsningen med høyt natriuminnhold (0,5 mg fargestoff/1 ml bufferløsning) og varm den til 37 °C.
    NOTAT: Unngå å utsette membranpotensialet fargepulver for lys.
  2. Fjern kulturmediet fra Calu-3- eller Caco-2-cellemonolag og tilsett den fargeholdige løsningen til hver brønn (195 μL per brønn for 96-brønnsplater, 95 μL per brønn for 384-brønnplater).
    MERK: Unngå å utsette fargestoffløsningen for lys.
  3. La cellene legge fargestoff i 35 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
  4. Flytt cellene, lastet med fargestoffoppløsning, til fluorescensplateleseren. Les fluorescensmålinger fra bunnen av platen, med eksitasjon = 530 ± 5 nm, utslipp = 560 ± 5 nm.
  5. Begynn med å ta kontinuerlige grunnlinjeavlesninger i 5 minutter med 30 s intervaller.
  6. For å hemme ENaC-funksjonen, tilsett 5 μL lavkonsentrasjonsløsning amilorid eller lavkonsentrasjonsoppløsning DMSO oppløst i nullkloridbufferløsningen med høyt natriuminnhold for en endelig konsentrasjon på 10 μM amilorid.
    1. For 96-brønns plateformatet, tilbered den lavkonsentrasjonsoppløsningen (400 μM amilorid (1:25 fortynning)) oppløsning av amilorid ved å fortynne 2 μL 10 mM amilorid (1000x) stamløsning i 48 mikrol kloridfri bufferløsning med høyt natriuminnhold.
      MERK: Det lavkonsentrasjons 400 μM amilorid etterfølges av en andre fortynning (1:40 fortynning) i neste trinn for en endelig konsentrasjon på 10 μM amilorid.
    2. For 384-brønnsplateformatet, klargjør den lavkonsentrasjonsoppløsningen (200 μM amilorid (1:50 fortynning)) oppløsning av amilorid ved å tilsette 1 μL 10 mM amilorid (1000x) stamløsning i 49 mikrol kloridfri bufferløsning med høyt natriuminnhold.
      MERK: Amilorid med lav konsentrasjon på 200 μM etterfølges av en andre fortynning (1:20 fortynning) i neste trinn for en endelig konsentrasjon på 10 μM amilorid.
  7. Ta en inhiberingsavlesning i 60 min med målinger med 45 s intervaller.
  8. Gjenta trinn 3.7 for dataanalyse.
  9. Mål amiloridresponsen som prosentvis hemming fra baseline til punktet på platået, ca. 15-20 minutter etter amiloridtillegg. Bruk denne forskjellen til å kvantifisere ENaC-responsen.

Representative Results

For å måle CFTR-kanalaktiviteten inkuberes veldifferensierte, adherde celler i en ekstracellulær nullkloridløsning som inneholder membranets potensialfølsomme fargestoff. CFTR-funksjonen påvises konsekvent som membrandepolarisering etter forskolinstimulering. Kloridutstrømning oppdages som en kraftig økning i fluorescens sammenlignet med kjøretøyets kontroll. Fluorescenssignalet opprettholdes til tillegg av CFTR-hemmer (CFTRInh172), noe som fører til en rask nedgang i fluorescensintensiteten, som sett i Caco-2-celler (figur 1A), og er reproduserbar i både Caco-2- og Calu-3-celler (figur 1B). Vurderingen av CFTR-aktivitet som forskjellen i maksimal endring i fluorescens etter forskolin eller DMSO (kjøretøy). Individuelle punkter varierte mellom ± 3 standardavvik fra gjennomsnittlig forskolinstimulering (svarte punkter) eller DMSO-kontroll (gråpunkter), som tilsvarte en Z-faktor på 0,586. Denne utmerkede poengsummen indikerte reproduserbarheten av denne analysen (figur 1C). I tilfelle det er en mindre drift i grunnlinjen, kan virkningen av driften minimeres ved å ekstrapolere baseline gjennom sporet etter aktivering opp til punktet for inhibitoraddisjon. Responsen kan kvantifiseres som arealet under kurven, med den nedre grensen definert av den ekstrapolerte linjen.

ENaC-aktivitet kan også måles i konfluente luftveier og kolonepitelceller dyrket i 96-brønnsplater. I motsetning til analysen for CFTR-kanalaktivitet, er disse cellene nedsenket i en høynatriumholdig løsning, noe som muliggjør natriumabsorpsjon gjennom ENaC. Med akutt tilsetning av amilorid blokkeres natriumopptaket, og celler opplever relativ membranhyperpolarisering. Dette er vist i Caco-2-celler ved både lave (10 μM) (figur 2A) og høye konsentrasjoner (50 μM) amilorid (figur 2A,B) og i Calu-3-celler med høy konsentrasjon av amilorid (50 μM) (figur 2B). ENaC-analysen ble utvidet til et 384-brønns plateformat og demonstrerte stor reproduserbarhet i ENaC-hemming. Tilsvarende varierte de individuelle punktene mellom ± 3 standardavvik fra gjennomsnittlig amiloridhemming (svarte punkter) eller DMSO-kontroll (gråpunkt). ENaC-responsen i Calu-3-celler rapporterte en Z-faktor på 0,629 ved akutt behandling med amilorid (50 μM) (figur 2C), noe som indikerer at disse parametrene støtter screening med høy gjennomstrømning.

Figure 1
Figur 1: CFTR-kanalmåling som endringer i membrandepolarisering i Caco-2- og Calu-3-celler. (A) Representativt spor av CFTR-stimulering med forskolin (1 μM) og DMSO-kontroll i Caco-2-celler. (B) Boks og whisker plott av forskolin stimulering i Caco-2 og Calu-3 celler (**** P < 0,0001, n > 3 biologiske replikater, n > 3 tekniske replikater). Biologiske replikater er uavhengige cellelinjepassasjer; Tekniske replikater refererer til uavhengige brønner på flerbrønnsplatene. Boksplott viser medianverdien; grenser skildrer IQR, med værhårene som definerer minima- og maksimaverdiene. (C) Bland-Altman plott av reproduserbar CFTR respons med forskolin stimulering sammenlignet med DMSO kontroll i Caco-2 celler. Svarte punkter representerer maksimale absolutte endringer i fluorescens som respons på forskolinstimulering. Gråpunkter representerer endringer i fluorescens som respons på DMSO-kontroll. Forkortelser: CFTR = Cystisk fibrose transmembran konduktansregulator; DMSO = dimetylsulfoksid; IQR = interkvartilt område; FSK = forskolin; ΔF/F0 = endring i fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: ENaC-inhiberingsmålinger gjennom membranhyperpolarisering i Caco-2- og Calu-3-celler. (A) Representativt spor av ENaC-hemming med amilorid (10 μM) i forhold til DMSO-kontroll i Caco-2-celler. (B) Boks- og whiskerplott av amiloridhemming i Caco-2- og Calu-3-celler (**** P < 0,0001, n > 3 biologiske replikater, n > 3 tekniske replikater). (C) Bland-Altman-plott av reproduserbar ENaC-respons med amiloridhemming sammenlignet med DMSO-kontroll i Calu-3-celler. Svarte punkter representerer maksimale absolutte endringer i fluorescens som respons på amiloridhemming. Gråpunkter representerer endringer i fluorescens som respons på DMSO-kontroll. Forkortelser: ENaC = epitelial natriumkanal; DMSO = dimetylsulfoksid; Amil. = amilorid; ΔF/F0 = endring i fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn Konsentrasjon
NMDG (N-metyl-D-glukamin) 150 mM
Glukonsyre lakton 150 mM
Kaliumglukonat 3 mM
HEPES 10 mM

Tabell 1: Reagenser og deres tilsvarende konsentrasjoner for CFTR-funksjonsanalyse med null natrium og klorid. Forkortelse: CFTR = Cystisk fibrose transmembran konduktansregulator.

Navn Konsentrasjon
Natriumglukonat 150 mM
Kaliumglukonat 3 mM
HEPES 10 mM

Tabell 2: Reagenser og deres tilsvarende konsentrasjoner for ENaC funksjonell analysebuffer med høyt natrium, nullklorid. Forkortelse: ENaC = Epitelial natrium (Na) Channel.

Discussion

Her har vi beskrevet fluorescensbaserte metoder for måling av CFTR- og ENaC-aktivitet i cellelinjen for kolorektal kolorektal kreft, Caco-2, og cellelinjen for humant epitellungekreft, Calu-3. Disse membranpotensialanalysene i epitelcellelinjer kan brukes til å bekrefte effekten av småmolekylære modulatorforbindelser, tidligere identifisert i heterologe ekspresjonssystemer, før endelig in vitro-validering i primære pasientderiverte epitelkulturer.

Det er viktig å bekrefte at de ovennevnte målingene er hensiktsmessig tilskrevet kanalen av interesse. For eksempel bør målingen som tilskrives CFTR vise avhengighet av CFTR-proteinuttrykk og den elektrokjemiske drivkraften til klorid, som moduleres av forskolin og hemmeren CFTRInh-172. På samme måte kan membranpotensialendringene forårsaket av 10 μM amilorid tilskrives ENaC, hvis de er avhengige av ENaC-proteinuttrykk og en innadgående natriumdrivkraft. Selv om vi har bekreftet disse egenskapene til ENaC i MDCK-celler etter transfeksjon med alle tre underenheter av ENaC 2, har vi ennå ikke formelt bekreftet at amiloridresponsen målt i Caco-2- og Calu-3-celler er gitt av ENaC. Dette er spesielt viktig, da amilorid kan modulere funksjonen til natrium-protonveksleren NHE3 i tillegg til ENaC13. Det kan tenkes at den amiloridinduserte hyperpolariseringen observert i denne analysen delvis kan gjenspeile de indirekte effektene av intracellulær forsuring på andre kanaler. For å bekrefte at den amiloridinduserte hyperpolariseringen målt ved hjelp av dette membranpotensialfølsomme fargestoffet tildeles av ENaC i de ovennevnte cellelinjene og mer komplekse cellesystemer, som iPSC-avledede vev, bekrefter vi at denne aktiviteten går tapt ved å slå ut en obligatorisk ENaC-underenhet (beta) i disse linjene.

Suksessen til disse analysene krever oppmerksomhet på flere faktorer. For det første må epitelkulturene være sammenflytende og godt differensiert. For måling av CFTR- og ENaC-funksjon bør ca. 145 000 celler belegges per brønn i 96-brønnsplater eller 45 000 celler per brønn i 384-brønnplater. Når epitelcellene når sammenløp (innen 3-4 dager fra plating), la 2-5 dager med differensiering. Denne timingen ble bestemt tidligere basert på maksimalt CFTR-proteinuttrykk ved immunoblotting14. Tilsvarende ble optimal timing bestemt for funksjonelt ENaC-uttrykk i begge cellelinjer, Calu-3 og Caco-2.

Ikke-konfluente monolag eller celleovervekst fører til lav reproduserbarhet på tvers av tekniske replikater. I tilfeller der celler i individuelle brønner ikke når samløp samtidig, bør disse platene kastes. I tillegg kan ustabile baselineavlesninger eller mangel på stimuleringsresponser være en indikasjon på dårlig cellekvalitet, som må utelukkes fra analysen. Redusert respons på CFTR-aktivatoren, forskolin eller ENaC-hemmeren, amilorid, kan potensielt gjenspeile bruk av overdrevent passerte celler15. Selv om det ikke er et problem for Calu-3- og Caco-2-celler, kan det hende at andre celler eller vev ikke fester seg godt til platene og kan kreve forbelegg av brønnene. For eksempel ble 2D-kolangiocytkulturer i tidligere studier festet til platene ved bruk av kollagenbelegg16. Alternativt ble adherensen av 2D tarmvev økt ved bruk av Poly-L-lysin2.

Videre, ved testing av modulering av ionkanaler av små molekyler ved hjelp av en fluorescensbasert analyse, er det avgjørende at potensielle gjenstander gitt av fluorescerende egenskaper til de små molekylene blir adressert. For å bekrefte spesifisiteten til funksjonelle responser, kan membranpotensialanalyser valideres ytterligere ved hjelp av konvensjonelle elektrofysiologiske metoder, for eksempel Ussing-studier17.

Etter å ha bekreftet at responsen detektert av membranpotensialfølsomme fargestoffer er spesifikt gitt av kanalen av interesse, har disse analysene et enormt potensial for å validere lovende modulatorer av epitelionkanaler i deres relevante cellulære kontekst. Denne plattformen kan bygge bro over gapet mellom modulatorskjermer med høy gjennomstrømning i heterologe ekspresjonssystemer og tidkrevende, bioelektriske målinger i vanskelig tilgjengelige primære vev.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Christopher Fladd og SPARC BioCentre ved Hospital for Sick Children for deres hjelp med å gjennomføre membranpotensialanalysene som måler CFTR og ENaC. Dette arbeidet ble støttet av CFIT-programmet med finansiering fra CF Canada og Sick Kids Foundation. Dette arbeidet ble finansiert av Canadas regjering gjennom Genome Canada og Ontario Genomics Institute (OGI-148). Denne studien ble finansiert av regjeringen i Ontario. SX ble støttet av Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amiloride Spectrum Chemical TCI-A2599-5G Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
CFTRInh-172 CF Foundation Therapeutics Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
EMEM, 1xs Wisent 320-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-450
FLIPR Membrane Potential Dye Molecular Devices R8042 Stored at 4 °C
Forskolin Sigma-Aldrich F3917 Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) Sigma-Aldrich G4750 Stored at room temperature
HEPES Bioshop HEP001.5 Stored at room temperature
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) ATCC HTB-55
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) ATCC HTB-37
N-Methyl-D-glucamine (NMDG Sigma-Aldrich M2004 Stored at room temperature
Penicillin-Streptomycin Solution Wisent 450-200-EL
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Potassium Gluconate Sigma-Aldrich P1847 Stored at room temperature
Sodium Gluconate Sigma-Aldrich G9005 Stored at room temperature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
  2. Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419 (2021).
  3. Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
  4. Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
  5. Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
  6. Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
  7. Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
  8. Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946 (2020).
  9. Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
  10. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  11. Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
  12. Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
  13. Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
  14. Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073 (2017).
  15. Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
  16. Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504 (2021).
  17. Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 184
En fluorescensbasert analyse av membranpotensial for funksjonell studie med høy gjennomstrømning av to endogene ionekanaler i to epitelcellelinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, S., Di Paola, M., Jones, N. L., More

Xia, S., Di Paola, M., Jones, N. L., Bear, C. E. A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63528, doi:10.3791/63528 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter