En fluorescensbaserad analys av membranpotential för funktionell studie med hög kapacitet av två endogena jonkanaler i två epitelcellinjer

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för studier av elektrogena membranproteiner genom att mäta förändringar i membranpotential. Denna analys ger en plattform för funktionell avläsning av flera jonkanaler endogent uttryckta i epitelcellinjer.

Abstract

Fluorescensbaserade studier är lämpliga för plattläsaranalyser med hög genomströmning av celler i odling. De har ofta använts för läkemedelsupptäcktskampanjer riktade mot rekombinanta jonkanalproteiner överuttryckta i celler såsom HEK-293-celler. Det finns dock ökad tonvikt på användningen av vävnadsrelevanta cellinjer för att studera effekterna av småmolekylära interventioner. Följande protokoll beskriver anpassningen av en fluorescensbaserad membranpotentialanalys för studier av jonkanaler som uttrycks endogent i epitelcellinjer. Membranpotentialanalysen beskriver en high-throughput-analys för kloridkanalaktivitet hos CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) i två vanligt studerade epitelcellinjer, Caco-2 och Calu-3. Dessutom beskriver detta dokument en ny tillämpning av detta system för att mäta aktiviteten hos Epitelial Sodium Channel (ENaC) i ett högkapacitetsformat i samma epitelcellinjer. Tillsammans ger dessa fluorescensbaserade analyser en robust och flexibel plattform för att studera småmolekylära modulatorer, riktade mot två epitelkanaler i ett relevant cellulärt sammanhang.

Introduction

Fluorescensbaserade aktivitetsanalyser med hög genomströmning av rekombinanta kanalproteiner har varit mycket effektiva för att identifiera småmolekylära modulatorer som har potential att bli framtida terapier 1,2,3,4. En vanlig metod för att screena småmolekylbibliotek för jonkanalmodulatorer är genom att mäta förändringar i membranpotential. Vanligtvis utförs dessa skärmar med användning av rekombinanta kanaler uttryckta heterologt i cellinjer såsom HEK-293-celler ^5,6,7.

Det finns dock ett behov av validering av “träffar” i relevanta celltyper. Vi föreslår att en sekundär skärm i relevanta cellinjer som endogent uttrycker kanalerna av intresse är önskvärd. En sådan sekundär skärm kommer att identifiera de modulatorer som mest sannolikt är effektiva i slutliga valideringsanalyser som är beroende av mindre tillgängliga primära mänskliga vävnader.

Det finns också ett behov av analyssystem som har flexibiliteten att rapportera aktiviteten hos flera jonkanalmål i samma vävnadstyp. Till exempel finns det substantiell publicerad litteratur som stöder konceptet att CFTR och ENaC funktionellt interagerar ^8,9,10. Även om flera välstuderade epitelcellinjer är kända för att uttrycka både CFTR och ENaC, har analysförhållandena för att studera båda på ett högt genomströmningssätt hittills inte beskrivits.

Denna fluorescensbaserade membranpotentialanalys är mångsidig, eftersom den använder en exogen kemisk sond för att mäta funktionen av CFTR och ENaC, vilket kringgår behovet av genetiskt kodade sonder¹¹. Som principbevis studeras två vanliga epitelcellinjer som exempel för att belysa de kritiska steg som är nödvändiga för att mäta kanalaktivitet för både CFTR och ENaC.

Protocol

1. Cellplätering och differentiering Odla Calu-3- och Caco-2-celler i EMEM innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (penna/strep) i en T-75-kolv. När cellerna når 80-100% sammanflöde, aspirera mediet från T-75-kolven. Tvätta försiktigt cellerna en gång med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 2 ml förvärmt 0,25% trypsin/0,1% EDTA till cellmonoskiktet och placera T-75-kolven vid 37 °C i cirka 5 minuter så att cellerna kan lyfta från odlingskolvens yta och dissociera till en encellssuspension. När cellerna har lyfts från kolvens yta, neutralisera reaktionen med 8 ml odlingsmedium (steg 1.1) för totalt 10 ml cellsuspension.OBS: Diskorisk dissociera cellklumpar till en encellssuspension med en 10 ml serologisk pipett. Platta cellerna på en 96-brunnsplatta (~ 140 000-150 000 celler / brunn) eller en 384-brunnsplatta (~ 45 000-50 000 celler / brunn) vid 30-40% sammanflöde.För att plätera en hel 96-brunnsplatta, tillsätt 1,5 ml av cellsuspensionen till 18,5 ml av odlingsmediet i ett 50 ml koniskt rör. Efter blandning tillsätts 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn. För att platta en hel 384-brunnsplatta, tillsätt 1 ml av cellsuspensionen till 17 ml av odlingsmediet i ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt 50 μL cellsuspension till varje brunn efter blandning.OBS: Se till att det inte finns några klumpar av celler, och enskilda celler fördelas jämnt över varje brunn. Byt medium var 2: e dag efter plätering. Om cellerna inte når sammanflöde samtidigt mellan olika brunnar, kassera plattan och upprepa steg 1.5. När du har sådd, vänta tills cellerna når 100% sammanflöde inom 3-5 dagar. Byt medium 24 timmar före funktionsstudierna. 2. Beredning av CFTR-buffertlösning för funktionell analys Bered den natriumfria, kloridfria buffertlösningen med de reagenser som anges i tabell 1. Tillsätt reagenserna till vävnadsodlingskvalitet, dubbeldestilleradH2O(ddH2O). Låt reagenserna lösas upp (i en sluten behållare för att undvika avdunstning) under omrörning över natten vid rumstemperatur. När lösningen är stabil, mät pH. Om lösningens pH överstiger 7,4, tillsätt 1 M N-metyl-D-glukamin (NMDG) lösning droppvis för att justera pH till 7,4.OBS: Justera inte lösningens pH med HCl eftersom lösningen måste förbli kloridfri. Låt lösningen blandas i ytterligare 30 minuter och mät lösningens osmolaritet.Minska buffertlösningens osmolaritet till ett fysiologiskt intervall på 300 ± 5 mOsm/kg. Filtrera och förvara buffertlösningen i sterila flaskor.OBS: Lösningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader. Om det förvaras längre än 6 månader, kontrollera pH och osmolaritet vid rumstemperatur före användning. 3. CFTR funktionell analys Lös upp det membranpotentiella färgämnet i den natriumfria, kloridfria buffertlösningen (0,5 mg färgämne/1 ml buffertlösning) och värm den till 37 °C.OBS: Undvik att utsätta membranets potentiella färgpulver för ljus. Ta bort odlingsmediet från Calu-3- eller Caco-2-cellmonolager och tillsätt den färginnehållande lösningen till varje brunn (195 μL per brunn för en 96-brunnsplatta, 95 μL per brunn för en 384-brunnsplatta).OBS: Upp till 112 μL kan tillsättas per brunn med 384-brunnsplattor. Låt cellerna ladda färgämnet i 35 minuter vid 37 °C och 5 %CO2. Flytta cellerna, laddade med färglösning, till fluorescensplattläsaren. Ta fluorescensmätningar från plattans botten, med excitation = 530 ± 5 nm, emission = 560 ± 5 nm Börja med att ta kontinuerliga baslinjeavläsningar i 5 minuter med 30 s intervall. Tillsätt 5 μl av en lågkoncentrationslösning av forskolin eller DMSO till varje brunn för en slutlig koncentration av 1 μM forskolin (1x). Ta en stimuleringsavläsning i 20 minuter med mätningar med 15 s intervall.För plattformatet med 96 brunnar, bereds lösningen av forskolin med låg koncentration (40 μM forskolin (1:25 spädning)) genom att späda 2 μL 1 mM forskolin (1 000x) stamlösning eller DMSO i 48 μL natriumfri, kloridfri buffertlösning.OBS: Den låga koncentrationen 40 μM forskolin följs av en andra utspädning (1:40 spädning) i nästa steg för en slutlig koncentration av 1 μM forskolin. För plattformat med 384 brunnar, bereds lösningen med låg koncentration (20 μM forskolin (1:50 spädning)) genom att späda 1 μL 1 mM (1 000x) forskolinlösning eller DMSO i 49 μL natriumfri, kloridfri buffertlösning.OBS: Den låga koncentrationen 20 μM forskolin följs av en andra utspädning (1:20 utspädning) i nästa steg för en slutlig koncentration av 1 μM forskolin. Tillsätt 5 μL lågkoncentrationslösning av CFTRInh172 för en slutlig koncentration på 10 μM CFTRInh172. Ta en hämningsavläsning i 15 minuter med mätningar med 30 s intervall.Bered CFTRInh172-lösningen med låg koncentration (400 μM CFTRInh172 (1:25 spädning)) genom att späda 2 μl av en stamlösning av 10 mM CFTRInh172 (1 000x) i 48 μl natriumfri, kloridfri buffertlösning.OBS: Lågkoncentrationen 400 μM CFTRInh172 följs av en andra utspädning (1:40 utspädning) i nästa steg för en slutlig koncentration på 10 μM CFTRInh172. Bered CFTRInh172-lösningen med låg koncentration (200 μM CFTRInh172 (1:50 spädning)) genom att späda 1 μL 10 mM CFTRInh172 (1 000x) stamlösning i 49 μL natriumfri, kloridfri buffertlösning.OBS: Lågkoncentrationen 200 μM CFTRInh172 följs av en andra utspädning (1:20 utspädning) i nästa steg för en slutlig koncentration på 10 μM CFTRInh172. Kvantifiera fluorescensintensitetsmätningarna för varje brunn och exportera värdena som ett kalkylblad i kolumnformat som innehåller enskilda brunnar. För att beräkna forskolin-inducerade förändringar, dela RFU (Relative Fluorescence Units) mätningar från varje brunn av 96- eller 384-brunnsplattan med den sista fluorescensintensitetsmätningen av baslinjeavläsningen och plotta dem.Alternativt kvantifiera CFTRInh172-medierad hämningsrespons för att bättre bekräfta specificiteten av CFTR-funktion 12, eftersom akut behandling med forskolin kan resultera i membrandepolarisering genom aktiviteten hos andra kloridkanaler, såsom SLC26A912. Mät toppresponsen som den maximala fluorescensintensitetsmätningen från baslinjen under forskolinstimulering. Använd denna mätning eller arean under kurvan för att kvantifiera CFTR-svaret. 4. Beredning av ENaC-buffertlösning för funktionell analys Bered den kloridfria buffertlösningen med hög natriumhalt med de reagens som anges i tabell 2. När lösningen är stabil, mät pH. Om lösningens pH är under 7,4, tillsätt 1 N NaOH-lösning droppvis för att justera pH till 7,4.OBS: Justera inte lösningens pH med HCl eftersom lösningen måste förbli kloridfri. Minska buffertlösningens osmolaritet till ett fysiologiskt intervall på 300 ± 5 mOsm/kg. Filtrera och förvara buffertlösningen i sterila flaskor vid 4 °C i upp till 6 månader.OBS: Om förvaringen är längre än 6 månader, kontrollera pH och osmolaritet vid rumstemperatur före användning. 5. Funktionell ENaC-analys Lös upp det membranpotentiella färgämnet i den kloridfria buffertlösningen med hög natriumhalt (0,5 mg färgämne/1 ml buffertlösning) och värm den till 37 °C.OBS: Undvik att utsätta membranets potentiella färgpulver för ljus. Ta bort odlingsmediet från Calu-3- eller Caco-2-cellmonolager och tillsätt den färginnehållande lösningen till varje brunn (195 μL per brunn för 96-brunnsplattor, 95 μL per brunn för 384-brunnsplattor).OBS: Undvik att utsätta färglösningen för ljus. Låt cellerna ladda färgämne i 35 minuter vid 37 °C och 5%CO2. Flytta cellerna, laddade med färglösning, till fluorescensplattläsaren. Läs fluorescensmätningar från plattans botten, med excitation = 530 ± 5 nm, emission = 560 ± 5 nm. Börja med att ta kontinuerliga baslinjeavläsningar i 5 minuter med 30 s intervall. För att hämma ENaC-funktionen, tillsätt 5 μL lågkoncentrationslösning amilorid eller lågkoncentrationslösning DMSO upplöst i den höga natrium-, nollkloridbuffertlösningen för en slutlig koncentration av 10 μM amilorid.Bered lågkoncentrationslösningen (400 μM amilorid (1:25 spädning)) av amilorid genom att späda 2 μl 10 mM amiloridlösning (1 000x) i 48 μl kloridfri buffertlösning med hög natriumhalt.Anmärkning: Lågkoncentrationen 400 μM amilorid följs av en andra utspädning (1:40 spädning) i nästa steg för en slutlig koncentration av 10 μM amilorid. Bered lågkoncentrationslösningen (200 μM amilorid (1:50 spädning)) av amilorid genom att tillsätta 1 μl 10 mM amiloridlösning (1 000x) stamlösning i 49 μl kloridfri buffertlösning med hög natriumhalt.Anmärkning: Lågkoncentrationsamiloriden på 200 μM följs av en andra utspädning (spädning 1:20) i nästa steg för en slutlig koncentration på 10 μM amilorid. Ta en hämningsavläsning i 60 min med mätningar med 45 s intervall. Upprepa steg 3.7 för dataanalys. Mät amiloridsvaret som procentuell hämning från baslinjen till platåpunkten, cirka 15-20 minuter efter tillägg av amilorid. Använd den här skillnaden för att kvantifiera ENaC-svaret.

Representative Results

För att mäta CFTR-kanalaktivitet inkuberas väldifferentierade, vidhäftade celler i en extracellulär lösning med nollklorid innehållande det membranpotentialkänsliga färgämnet. CFTR funktion detekteras konsekvent som membran depolarisering efter forskolin stimulering. Kloridutflödet detekteras som en kraftig ökning av fluorescensen jämfört med vehikelkontrollen. Fluorescenssignalen upprätthålls tills tillsatsen av CFTR-hämmare (CFTRInh172), vilket leder till en snabb minskning av fluorescensintensiteten, vilket ses i Caco-2-celler (figur 1A), och är reproducerbar i både Caco-2- och Calu-3-celler (figur 1B). Bedömningen av CFTR aktivitet som skillnaden i maximal förändring av fluorescens efter forskolin eller DMSO (vehikel). Enskilda punkter varierade mellan ± 3 standardavvikelser från medelvärdet forskolin stimulering (svarta punkter) eller DMSO kontroll (grå punkter), vilket motsvarade en Z’ faktor på 0,586. Denna utmärkta poäng indikerade reproducerbarheten av denna analys (figur 1C). Om det finns en mindre avvikelse i baslinjen kan effekten av avdriften minimeras genom att extrapolera baslinjen genom hela spåret efter aktivering fram till den punkt där inhibitorn tillförs. Svaret kan kvantifieras som arean under kurvan, med den nedre gränsen definierad av den extrapolerade linjen. ENaC-aktivitet kan också mätas i konfluenta luftvägar och kolonepitelceller odlade i 96-brunnsplattor. I motsats till analysen för CFTR-kanalaktivitet är dessa celler nedsänkta i en högnatriumhaltig lösning, vilket möjliggör natriumabsorption genom ENaC. Med akut tillsats av amilorid blockeras natriumupptaget och celler upplever relativ membranhyperpolarisering. Detta visas i Caco-2-celler vid både låga (10 μM) (figur 2A) och höga koncentrationer (50 μM) av amilorid (figur 2A,B) och i Calu-3-celler med en hög koncentration av amilorid (50 μM) (figur 2B). ENaC-analysen utökades till ett plattformat med 384 brunnar och visade stor reproducerbarhet vid ENaC-hämning. På samma sätt varierade de enskilda punkterna mellan ± 3 standardavvikelser från den genomsnittliga amiloridhämningen (svarta punkter) eller DMSO-kontrollen (grå punkter). ENaC-svaret i Calu-3-celler rapporterade en Z-faktor på 0,629 vid akut behandling med amilorid (50 μM) (figur 2C), vilket indikerar att dessa parametrar stöder screening med hög genomströmning. Figur 1: CFTR-kanalmätning som förändringar i membrandepolarisering i Caco-2- och Calu-3-celler. (A) Representativt spår av CFTR-stimulering med forskolin (1 μM) och DMSO-kontroll i Caco-2-celler. (B) Box och whisker plot av forskolin stimulering i Caco-2 och Calu-3 celler (**** P 3 biologiska replikat, n > 3 tekniska replikat). Biologiska replikat är oberoende cellinjepassager; Tekniska replikat avser oberoende brunnar på multiwellplattorna. Boxdiagram visar medianvärdet; gränser visar IQR, med morrhåren som definierar minima- och maximavärdena. (C) Bland-Altman-diagram över reproducerbart CFTR-svar med forskolinstimulering jämfört med DMSO-kontroll i Caco-2-celler. Svarta punkter representerar maximala absoluta förändringar i fluorescens som svar på forskolin stimulering. Grå punkter representerar förändringar i fluorescens som svar på DMSO-kontroll. Förkortningar: CFTR = transmembrankonduktansregulator för cystisk fibros; DMSO = dimetylsulfoxid; IQR = interkvartilintervall; Fsk = forskolin; ΔF/F0 = förändring i fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: ENaC-hämningsmätningar genom membranhyperpolarisering i Caco-2- och Calu-3-celler. (A) Representativa spår av ENaC-hämning med amilorid (10 μM) i förhållande till DMSO-kontroll i Caco-2-celler. (B) Box och whisker plot av amiloridhämning i Caco-2- och Calu-3-celler (**** P 3 biologiska replikat, n > 3 tekniska replikat). (C) Bland-Altman-diagram över reproducerbar ENaC-respons med amiloridhämning jämfört med DMSO-kontroll i Calu-3-celler. Svarta punkter representerar maximala absoluta förändringar i fluorescens som svar på amiloridhämning. Grå punkter representerar förändringar i fluorescens som svar på DMSO-kontroll. Förkortningar: ENaC = epitelial natriumkanal; DMSO = dimetylsulfoxid; Amil. = amilorid; ΔF/F0 = förändring i fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna figur. Namn Koncentration NMDG (N-metyl-D-glukamin) 150 mM Glukonsyra lakton 150 mM Kaliumglukonat 3 mM HEPES 10 mM Tabell 1: Reagenser och motsvarande koncentrationer för CFTR-funktionstest utan natrium och klorid. Förkortning: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Namn Koncentration Natriumglukonat 150 mM Kaliumglukonat 3 mM HEPES 10 mM Tabell 2: Reagenser och motsvarande koncentrationer för ENaC-funktionsanalysbuffert med hög natriumhalt, noll klorid. Förkortning: ENaC = Epitelial natrium (Na) kanal.

Discussion

Här har vi beskrivit fluorescensbaserade metoder för att mäta CFTR- och ENaC-aktivitet i den epiteliala kolorektalcancercellinjen, Caco-2, och den humana epiteliala lungcancercellinjen, Calu-3. Dessa membranpotentialanalyser i epitelcellinjer kan användas för att bekräfta effekten av småmolekylära modulatorföreningar, som tidigare identifierats i heterologa expressionssystem, före slutlig in vitro-validering i primära patient-härledda epitelkulturer.

Det är absolut nödvändigt att bekräfta att ovanstående mätningar på lämpligt sätt tillskrivs kanalen av intresse. Till exempel bör mätningen som tillskrivs CFTR visa beroende av CFTR-proteinuttryck och den elektrokemiska drivkraften för klorid, som moduleras av forskolin och hämmaren CFTRInh-172. På liknande sätt kan membranpotentialförändringar orsakade av 10 μM amilorid hänföras till ENaC, om de är beroende av ENaC-proteinuttryck och en inåtgående natriumdrivkraft. Även om vi har bekräftat dessa egenskaper hos ENaC i MDCK-celler efter transfektion med alla tre subenheterna av ENaC 2, har vi ännu inte formellt bekräftat att amiloridsvaret uppmätt i^Caco-2– och Calu-3-celler tilldelas av ENaC. Detta är särskilt viktigt, eftersom amilorid kan modulera funktionen hos natrium-protonbytaren NHE3 utöver ENaC¹³. Möjligen kan den amiloridinducerade hyperpolarisationen som observerats i denna analys delvis återspegla de indirekta effekterna av intracellulär försurning på andra kanaler. För att bekräfta att den amiloridinducerade hyperpolarisationen mätt med detta membranpotentialkänsliga färgämne tilldelas av ENaC i ovanstående cellinjer och mer komplexa cellsystem, såsom iPSC-härledda vävnader, bekräftar vi att denna aktivitet går förlorad genom att slå ut en obligatorisk ENaC-underenhet (beta) i dessa linjer.

Framgången för dessa analyser kräver uppmärksamhet på flera faktorer. För det första måste epitelkulturerna vara sammanflytande och väl differentierade. För mätning av CFTR- och ENaC-funktionen bör cirka 145 000 celler pläteras per brunn i 96-brunnsplattor eller 45 000 celler per brunn i 384-brunnsplattor. När epitelcellerna når sammanflödet (inom 3-4 dagar från plätering), tillåta 2-5 dagars differentiering. Denna tidpunkt bestämdes tidigare baserat på maximalt CFTR-proteinuttryck genom immunoblot¹⁴. På liknande sätt bestämdes optimal timing för funktionellt ENaC-uttryck i båda cellinjerna, Calu-3 och Caco-2.

Icke-konfluenta monolager eller cellöverväxt leder till låg reproducerbarhet över tekniska replikat. I de fall där celler i enskilda brunnar inte når sammanflöde samtidigt, ska dessa plattor kasseras. Dessutom kan instabila baslinjeavläsningar eller brist på stimuleringssvar vara en indikation på dålig cellkvalitet, vilket måste uteslutas från analys. Minskade svar på CFTR-aktivatorn, forskolin, eller ENaC-hämmaren, amilorid, kan potentiellt återspegla användningen av alltför passagerade celler¹⁵. Även om det inte är ett problem för Calu-3- och Caco-2-celler, kan andra celler eller vävnader inte fästa bra på plattorna och kan kräva förbeläggning av brunnarna. Till exempel, i tidigare studier, fästes 2D-kolangiocytkulturer på plattorna med användning av kollagenbeläggning¹⁶. Alternativt ökade vidhäftningen av 2D-tarmvävnader med användning av Poly-L-lysin².

Vid testning av modulering av jonkanaler med små molekyler med hjälp av en fluorescensbaserad analys är det dessutom viktigt att potentiella artefakter som tilldelas av fluorescerande egenskaper hos de små molekylerna behandlas. För att bekräfta specificiteten av funktionella svar kan membranpotentialanalyser valideras ytterligare med konventionella elektrofysiologiska metoder, såsom Ussing-studier¹⁷.

Efter att ha bekräftat att svaret detekterat av membranpotentialkänsliga färgämnen specifikt ges av kanalen av intresse, har dessa analyser enorm potential att validera lovande modulatorer av epiteljonkanaler i deras relevanta cellulära sammanhang. Denna plattform kan överbrygga klyftan mellan modulatorskärmar med hög genomströmning i heterologa uttryckssystem och tidskrävande, bioelektriska mätningar i svårtillgängliga primära vävnader.

Materials

Amiloride	Spectrum Chemical	TCI-A2599-5G	Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
CFTRInh-172	CF Foundation Therapeutics		Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
EMEM, 1xs	Wisent	320-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-450
FLIPR Membrane Potential Dye	Molecular Devices	R8042	Stored at 4 °C
Forskolin	Sigma-Aldrich	F3917	Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone)	Sigma-Aldrich	G4750	Stored at room temperature
HEPES	Bioshop	HEP001.5	Stored at room temperature
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3)	ATCC	HTB-55
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2)	ATCC	HTB-37
N-Methyl-D-glucamine (NMDG	Sigma-Aldrich	M2004	Stored at room temperature
Penicillin-Streptomycin Solution	Wisent	450-200-EL
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847	Stored at room temperature
Sodium Gluconate	Sigma-Aldrich	G9005	Stored at room temperature