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Neuroscience

अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं में संलयन छिद्र गतिशीलता के तीन तरीकों को मापने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63569
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं में तीन संलयन मोड का पता लगाने के लिए एक कॉन्फोकल इमेजिंग तकनीक का वर्णन करता है। इन संलयन मोड में 1) क्लोज-फ्यूजन (जिसे चुंबन-और-रन भी कहा जाता है), जिसमें संलयन छिद्र खोलना और बंद करना शामिल है, 2) स्टे-फ्यूजन, जिसमें संलयन छिद्र खोलना और खुले छिद्र को बनाए रखना शामिल है, और 3) हटना-संलयन, जिसमें फ्यूज्ड पुटिका संकोचन शामिल है।

Abstract

गतिशील संलयन छिद्र खोलने और बंद करने से एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस की मध्यस्थता होती है और उनके कैनेटीक्स का निर्धारण होता है। यहां, यह विस्तार से प्रदर्शित किया गया है कि प्राथमिक संस्कृति गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं में तीन संलयन मोड का पता लगाने के लिए पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे किया गया था। तीन संलयन मोड में 1) क्लोज-फ्यूजन (जिसे चुंबन-और-रन भी कहा जाता है), जिसमें संलयन छिद्र खोलना और बंद करना शामिल है, 2) स्टे-फ्यूजन, जिसमें संलयन छिद्र खोलना और खुले छिद्र को बनाए रखना शामिल है, और 3) हटना-संलयन, संलयन-जनित Ω-आकार प्रोफ़ाइल का संकोचन शामिल है जब तक कि यह प्लाज्मा झिल्ली पर पूरी तरह से विलीन न हो जाए।

इन संलयन मोड का पता लगाने के लिए, प्लाज्मा झिल्ली को फॉस्फोलिपेज सी δ (पीएच-एमएनजी) के पीएच डोमेन से जुड़े एमएनग्रीन को ओवरएक्सप्रेस करके लेबल किया गया था, जो प्लाज्मा झिल्ली के साइटोसोल-फेसिंग पत्रक पर फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल -4,5-बिसफॉस्फेट (पीटीडीआईएन (4,5) पी2) को बांधता है; पुटिकाओं को फ्लोरोसेंट झूठी न्यूरोट्रांसमीटर एफएफएन 511 के साथ लोड किया गया था ताकि पुटिका सामग्री रिलीज का पता लगाया जा सके; और संलयन छिद्र बंद होने का पता लगाने के लिए एटो 655 को स्नान समाधान में शामिल किया गया था। इन तीन फ्लोरोसेंट जांच को संलयन छिद्र खोलने, सामग्री रिलीज, संलयन छिद्र बंद करने और पुटिका आकार परिवर्तनों को फ्यूज करने का पता लगाने के लिए लाइव क्रोमाफिन कोशिकाओं में ~ 20-90 एमएस प्रति फ्रेम पर एक साथ चित्रित किया गया था। विश्लेषण विधि को इन प्रतिदीप्ति मापों से तीन संलयन मोड को अलग करने के लिए वर्णित किया गया है। यहां वर्णित विधि, सिद्धांत रूप में, क्रोमाफिन कोशिकाओं से परे कई स्रावी कोशिकाओं पर लागू हो सकती है।

Introduction

झिल्ली संलयन कई जैविक कार्यों की मध्यस्थता करता है, जिसमें अन्तर्ग्रथनी संचरण, रक्त ग्लूकोज होमियोस्टेसिस, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वायरल प्रविष्टि 1,2,3 शामिल हैं। एक्सोसाइटोसिस, जिसमें प्लाज्मा झिल्ली में पुटिका संलयन शामिल है, न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधियों जैसे कई महत्वपूर्ण कार्यों को प्राप्त करने के लिए न्यूरोट्रांसमीटर और हार्मोन जारी करता है। फ्यूजन पुटिका सामग्री को जारी करने के लिए एक छिद्र खोलता है, जिसके बाद छिद्र फ्यूजिंग पुटिका को पुनः प्राप्त करने के लिए बंद हो सकता है, जिसे चुंबन-एंड-रन 1,4 कहा जाता है। दोनों अपरिवर्तनीय और प्रतिवर्ती संलयन छिद्र खोलने को एकल पुटिका संलयन के संलयन छिद्र चालकता रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त सेल-संलग्न समाई रिकॉर्डिंग के साथ मापा जा सकता है।

इसे अक्सर पूर्ण-पतन संलयन को प्रतिबिंबित करने के रूप में व्याख्या की जाती है, जिसमें फ्यूजिंग पुटिका के चपटा होने तक संलयन का फैलाव शामिल होता है, और चुंबन-और-रन, जिसमें संलयन छिद्र खोलने और बंद करना शामिल होता है, क्रमशः 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . क्रोमाफिन कोशिकाओं में हालिया कंफोकल और उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी) इमेजिंग अध्ययनों ने सीधे संलयन छिद्र खोलने और बंद करने (चुंबन-और-रन, जिसे क्लोज-फ्यूजन भी कहा जाता है), संलयन छिद्र खोलने का अवलोकन किया जो लंबे समय तक खुले छिद्र के साथ Ω-आकार बनाए रखता है, जिसे स्टे-फ्यूजन कहा जाता है, और फ्यूजिंग पुटिका का सिकुड़ना जब तक कि यह प्लाज्मा झिल्ली के साथ पूर्ण विलीन नहीं हो जाता, जो विलय के लिए पूर्ण पतन संलयन की जगह लेताहै 8,14,15,16,17.

न्यूरॉन्स में, संलयन छिद्र खोलने और बंद होने का पता इमेजिंग के साथ लगाया गया है जो पुटिकाओं में प्रीलोडेड क्वांटम डॉट्स की रिहाई दिखा रहा है जो संलयन छिद्र से बड़े हैं और तंत्रिका टर्मिनलों 5,18,19 के रिलीज चेहरे पर संलयन छिद्र चालकता माप के साथ। अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं का व्यापक रूप से एक्सो- और एंडोसाइटोसिस20,21 के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। यद्यपि क्रोमाफिन कोशिकाओं में बड़े घने-कोर पुटिकाएं होती हैं, जबकि सिनैप्स में छोटे सिनैप्टिक पुटिकाएं होती हैं, क्रोमाफिन कोशिकाओं और सिनैप्स में एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस प्रोटीन काफी अनुरूप होते हैं 10,11,12,20,21,22,23.

यहां, गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं (चित्रा 1) में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयुक्त एक कॉन्फोकल इमेजिंग विधि का उपयोग करके इन तीन संलयन मोड को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस विधि में एक्सोसाइटोसिस का पता लगाने के लिए पुटिकाओं में फ्लोरोसेंट झूठे न्यूरोट्रांसमीटर (एफएफएन 511) की लोडिंग शामिल है; संलयन-जनित Ω-आकार प्रोफ़ाइल को भरने के लिए स्नान समाधान में एटो 655 (ए 655) के अलावा, और फॉस्फोलिपेज़ सी δ (पीएच) के पीएच डोमेन के साथ प्लाज्मा झिल्ली की लेबलिंग, जो प्लाज्मा झिल्ली8,15,24 पर पीटीडीआईएन (4,5) पी 2 को बांधती है। विभिन्न फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन के माध्यम से संलयन छिद्र गतिशीलता का पता लगाया जा सकता है। यद्यपि क्रोमाफिन कोशिकाओं के लिए वर्णित है, यहां वर्णित इस पद्धति के सिद्धांत को क्रोमाफिन कोशिकाओं से परे कई स्रावी कोशिकाओं पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: पशु उपयोग प्रक्रिया ने एनआईएच दिशानिर्देशों का पालन किया और एनआईएच पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. गोजातीय क्रोमाफिन सेल संस्कृति

  1. क्रोमाफिन सेल संस्कृति से 1 दिन पहले लोके के समाधान (तालिका 1) और आटोक्लेव टूल तैयार करें।
  2. संस्कृति दिवस पर एक स्थानीय बूचड़खाने से गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों को प्राप्त करें, और विच्छेदन से पहले उन्हें बर्फ-ठंडे लोके के समाधान में डूबे रखें।
    नोट: अधिवृक्क ग्रंथियां 21-27 महीने की, स्वस्थ, या तो सेक्स (मुख्य रूप से पुरुष) के काले एंगस से होती हैं, जिनके शरीर का वजन लगभग 1,400 पाउंड (~ 635 किलोग्राम) होता है।
  3. विच्छेदन से पहले कोलेजनेज पी, ट्रिप्सिन अवरोधक, और गोजातीय सीरम एल्बुमिन (तालिका 1) युक्त ताजा एंजाइम समाधान के 30 एमएल (3 अधिवृक्क ग्रंथियों के लिए) तैयार करें और इसे कमरे के तापमान पर रखें।
  4. सतह पर कटौती या रक्तस्राव के बिना 3 बरकरार ग्रंथियों का चयन करें और कैंची (चित्रा 1 ए) के साथ वसा ऊतक को हटा दें। लोके के घोल से छिड़काव करके ग्रंथियों को तब तक धोएं जब तक कि कोई रक्त न निकले। इसे प्राप्त करने के लिए, अधिवृक्क शिरा (चित्रा 1 बी) के माध्यम से ग्रंथि को 0.22 μm फिल्टर के साथ संलग्न 30 एमएल सिरिंज का उपयोग करके25 की आवश्यकता के रूप में कई बार फुलाएं।
    नोट: लोके के समाधान के लगभग 150 मिलीलीटर आमतौर पर 3 ग्रंथियों को धोने के लिए आवश्यक है।
  5. पाचन के लिए, अधिवृक्क शिरा के माध्यम से एंजाइम समाधान को 0.22 μm फिल्टर के साथ संलग्न 30 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके इंजेक्ट करें जब तक कि ग्रंथि सूजन शुरू न हो जाए। फिर, ग्रंथियों को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें। एक बार फिर से इंजेक्ट करें और ग्रंथियों को एक और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    नोट: 3 ग्रंथियों को पचाने के लिए लगभग 30 मिलीलीटर एंजाइम समाधान की आवश्यकता होती है।
  6. पाचन के बाद, ग्रंथि (चित्रा 1 सी) को प्रकट करने के लिए कैंची के साथ नस से दूसरे छोर तक अनुदैर्ध्य रूप से ग्रंथि को काटें। सफेद मज्जा को लॉक के समाधान वाले 10 सेमी पेट्री डिश में चिमटी करके मज्जा को अलग करें।
    नोट: पाचन से पहले और बाद में ग्रंथि के इंटीरियर की तुलना चित्रा 1 सी में दिखाया गया है। पाचन और मज्जा अलगाव का विवरण पहले23,25 बताया गया है।
  7. कट और कैंची (चित्रा 1 डी) के साथ छोटे टुकड़ों में मज्जा कीमा। एक बीकर में 80-100 μm नायलॉन जाल के साथ मज्जा निलंबन फ़िल्टर करें। फिर 48 × ग्राम, कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में छानना स्थानांतरित करें, 3 की मंदी के साथ 3 मिनट के लिए।
    नोट: मज्जा की कीमा बनाने में आमतौर पर ~ 10 मिनट लगते हैं। कोशिकाओं की एक अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए, कीमा बनाया हुआ टुकड़ा बहुत छोटा होना चाहिए, जब तक कि उन्हें चिमटी नहीं किया जा सकता है।
  8. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और पाइपिंग द्वारा लोके के समाधान के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एक 80-100 μm छलनी के साथ सेल निलंबन फ़िल्टर, और अपकेंद्रित्र 48 x g, कमरे के तापमान पर, 3 की मंदी के साथ 3 मिनट के लिए।
  9. सतह पर तैरनेवाला निकालें और संस्कृति माध्यम (तालिका 1) के 30 मिलीलीटर के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। हेमेसाइटोमीटर गिनती कक्षों25 का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारित करें।

2. इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ अभिकर्मक

  1. एक 15 एमएल ट्यूब में 2.8 × 106 कोशिकाओं स्थानांतरण। 3 की मंदी के साथ 2 मिनट के लिए 48 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं गोली। सेल गोली के लिए निर्माता द्वारा प्रदान अभिकर्मक बफर के 100 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और फिर पीएच-एमएनजी प्लास्मिड के 2 μg जोड़ें।
    नोट: पीएच-एमएनजी प्लास्मिड पीएच-ईजीएफपी15 में एमएनजी के साथ बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) को बदलकर बनाया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. धीरे-धीरे समाधान को ऊपर और नीचे पाइप करके निलंबन मिश्रण करें, और मिश्रण को देरी के बिना एक इलेक्ट्रोपोरेशन क्युवेट में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 ई)। क्युवेट को तुरंत इलेक्ट्रोपोरेटर में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें), स्क्रीन सूची में ओ -005 प्रोग्राम का चयन करें और इलेक्ट्रोपोरेशन करने के लिए एंटर दबाएं।
    नोट: एक सेल संस्कृति हुड में अभिकर्मक के लिए सेल निलंबन तैयार करें। मिश्रण चरण के दौरान निलंबन में हवा के बुलबुले पेश न करें। बिना देर किए अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  3. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, क्युवेट में तुरंत 1.8 मिलीलीटर मध्यम जोड़ें और एक बाँझ टिप से लैस माइक्रोपिपेटर के साथ धीरे-धीरे मिलाएं। फिर प्रत्येक डिश में कवरस्लिप ( सामग्री की तालिका देखें) के शीर्ष पर इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं के निलंबन के 300 μL जोड़ें, एक इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रिया के लिए कुल मिलाकर 5-6 व्यंजन चढ़ाना।
  4. ध्यान से 30 मिनट के लिए 9% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर के लिए व्यंजनों को स्थानांतरित करें, और धीरे-धीरे 30 मिनट के बाद प्रत्येक पकवान में 2 मिलीलीटर प्रीवॉर्ड माध्यम जोड़ें।
  5. प्रयोग से पहले2-3 दिनों के लिए 9% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं रखें।
    नोट: सुसंस्कृत कोशिकाएं एक सप्ताह तक चलेंगी। 2-3 दिनों में सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करना सबसे अच्छा है।

3. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग की तैयारी

नोट: यह प्रोटोकॉल समाई रिकॉर्डिंग के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर के साथ वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और पैच-क्लैंप एम्पलीफायर के साथ किया गया था। एक निश्चित जेड-प्लेन (एक्सवाई / जेडफिक्स्ड स्कैनिंग) पर एक एक्सवाई प्लेन कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग सभी तीन फ्लोरोसेंट संकेतों को एक साथ चित्रित करने के लिए किया गया था। जेड-प्लेन कोशिका तल पर केंद्रित था जहां प्लाज्मा झिल्ली कवरलिप्स का पालन कर रही थी।

  1. पैच-क्लैंप और इमेजिंग प्रयोग के दिन, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन की उचित अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए सेल संस्कृति दूषित नहीं है (चित्रा 1 एफ) और एपिफ्लोरेसेंस सुनिश्चित करने के लिए ब्राइटफील्ड का उपयोग करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, पीएच-एमएनजी कोशिकाओं के ~ 20-30% के प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त किया जाता है।
  2. बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से पैच पिपेट तैयार करें। ऐसा करने के लिए, पिपेट खींचने वाले के साथ पिपेट खींचें, तरल मोम के साथ अपनी युक्तियों को कोट करें, और उन्हें माइक्रोफोर्ज के साथ पॉलिश करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  3. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर चालू करें और पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर शुरू करें (सामग्री की तालिका देखें)। सॉफ़्टवेयर में कैल्शियम वर्तमान और समाई रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त पैरामीटर सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. उत्तेजना 10 एस से शुरू होता है, जहां कुल में 60 एस अवधि का एक रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल सेट करें।
    2. -80 एमवी के लिए वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए होल्डिंग क्षमता सेट करें। कैल्शियम प्रवाह और समाई कूद को प्रेरित करने के लिए उत्तेजना के रूप में -80 एमवी से 10 एमवी तक 1 एस विध्रुवण सेट करें।
    3. समाई माप के लिए, साइनसोइडल उत्तेजना की आवृत्ति को 1,000-1,500 हर्ट्ज की सीमा पर सेट करें, जिसमें 50 एमवी से अधिक की चोटी-से-चोटी वोल्टेज नहीं है।
  4. प्रोटोकॉल सहेजें और रिकॉर्डिंग के लिए एक नई फ़ाइल बनाएँ।
  5. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम चालू करें और सॉफ़्टवेयर में उपयुक्त पैरामीटर सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. 458 एनएम, 514 एनएम और 633 एनएम सहित लेजर को चालू करें, और निम्नलिखित के रूप में प्रत्येक प्रतिदीप्ति जांच के अनुसार प्रत्येक लेजर के लिए उत्सर्जन संग्रह सीमा निर्धारित करें। एफएफएन 511: उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (ईएक्स), 458 एनएम; उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (ईएम), 468-500 एनएम। एमएनजी: ईएक्स, 514 एनएम; ईएम, 524-560 एनएम। ए 655: ईएक्स, 633 एनएम; ईएम, 650-700 एनएम।
    2. इन दो जांचों के बीच क्रॉसस्टॉक से बचने के लिए एफएफएन 511 और एमएनजी के लिए अनुक्रमिक इमेजिंग का उपयोग करें। छवि रिकॉर्डिंग (चित्रा 1 जी) के लिए 1 मिनट की अवधि का टाइमलैप्स सेट करें।

4. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. अच्छी सेल स्थिति और उचित अभिव्यक्ति के साथ एक डिश चुनें और मध्यम में फ्लोरोसेंट झूठी न्यूरोट्रांसमीटर एफएफएन 511 (10 एमएम स्टॉक, 1: 1,000 कामकाजी समाधान) के 2 μL जोड़ें। पकवान 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखो। वैकल्पिक रूप से, चरण 3.2 के बाद FFN511 लोड करें और समय बचाने के लिए प्रतीक्षा करते समय चरण 3.3-3.5 निष्पादित करें।
  2. एफएफएन 511 लोड हो रहा है समाप्त होने के बाद, रिकॉर्डिंग कक्ष तैयार करें और स्नान समाधान (चित्रा 2 ए और तालिका 1) के 500 μL में फ्लोरोसेंट डाई A655 के 2 μL जोड़ें। चिमटी के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष (सामग्री की तालिका देखें) में डिश से कवरस्लिप स्थानांतरित करें, और तुरंत ए 655 युक्त स्नान समाधान (चित्रा 2 बी) जोड़ें।
    नोट: ए 655 को 10 एमएम की एकाग्रता के साथ -20 डिग्री सेल्सियस में रखा जाता है और कामकाजी एकाग्रता 40 μM है।
    सावधानी: एफएफएन 511 या ए 655 के साथ सीधे त्वचा के संपर्क से बचने के लिए दस्ताने पहनें।
  3. 100x तेल विसर्जन उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = 1.4) पर तेल की एक बूंद (अपवर्तक सूचकांक: 1.518; सामग्री की तालिका देखें) रखें। माइक्रोस्कोप में कक्ष माउंट और तेल सिर्फ कवरस्लिप के नीचे संपर्क करने के लिए समायोजन घुंडी का उपयोग करें, तो स्नान समाधान (चित्रा 2 सी, डी) में जमीन तार टिप विसर्जित।
    नोट: कमरे के तापमान पर काम करने के लिए उपयुक्त विसर्जन तेल चुनें। कम और उच्च आवर्धन लेंस के बीच स्विच करना अनावश्यक है। रिकॉर्डिंग के दौरान कमरे का तापमान 20-22 डिग्री सेल्सियस के आसपास बनाए रखा जाता है।
  4. कोशिकाओं को फोकस में लाएं और एमएनजी अभिव्यक्ति के साथ एक अच्छी सेल खोजने के लिए ब्राइटफील्ड और कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करें। चयनित कक्ष पर ज़ूम इन करें और रिक्त क्षेत्रों को कम करने के लिए इसे दृश्य के केंद्र में समायोजित करें।
    नोट: प्रतिदीप्ति लेबलिंग की योजनाबद्ध ड्राइंग चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। एक अच्छी कोशिका में आमतौर पर एक चिकनी झिल्ली और साफ किनारा होता है (चित्रा 3 बी)। एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ, एक अच्छी कोशिका उज्ज्वल एमएनजी अभिव्यक्ति (चित्रा 3 सी) के साथ एक बड़ी और सपाट तल प्रतीत होती है।
    पिक्सेल आकार ~ 50 एनएम है, विभिन्न सेल आकार और ज़ूम कारक के अनुसार ~ 40-80 एनएम की सीमा के भीतर।
  5. एफएफएन 511, पीएच-एमएनजी और ए 655 के एक निश्चित जेड-प्लेन (एक्सवाई / जेडफिक्स्ड स्कैनिंग) पर एक्सवाई प्लेन कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए पैरामीटर सेट करें, जिसमें न्यूनतम समय अंतराल है। ठीक समायोजन घुंडी के साथ सेल के नीचे फोकस समायोजित करें।
    नोट: पीएच-एमएनजी कन्फोकल एक्सवाई-प्लेन क्रॉससेक्शन (सेल तल को छोड़कर) पर सेल प्लाज्मा झिल्ली के समोच्च को इंगित करता है। कोशिका झिल्ली तल के पास, ए 655 स्पॉट देखे जा सकते हैं, जो Ω-आकार या ]-आकार झिल्ली आक्रमणों को दर्शाते हैं। यदि जेड-फोकल विमान सेल तल से कम है, तो सभी प्रतिदीप्ति की तीव्रता कमजोर हो जाएगी।
  6. सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने और महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति विरंजन से बचने के लिए एक सेटिंग खोजने के लिए सॉफ़्टवेयर में उत्तेजना लेजर शक्ति को समायोजित करें। ऐसा करने के लिए, 458 एनएम पर उत्साहित एफएफएन 511 के लिए 2.5 मेगावाट पावर के प्रारंभिक परीक्षण मूल्य और 514 एनएम पर उत्साहित एमएनजी के लिए 1 मेगावाट के प्रारंभिक परीक्षण मूल्य से शुरू करें। हेन लेजर के साथ 633 एनएम पर उत्साहित ए 655 के लिए, उच्च लेजर पावर, ~ 12-15 मेगावाट (यानी, अधिकतम का 70% -80%) का उपयोग करें, जो निरंतर उत्तेजना पर, एक Ω आकार की प्रोफ़ाइल के अंदर सभी फ्लोरोसेंट ए 655 को ब्लीच कर सकता है जब इसका छिद्र बंद हो जाता है।
    नोट: यदि लेजर शक्ति बहुत अधिक है, तो पीएच-एमएनजी और एफएफएन 511 प्रतिदीप्ति जल्दी से प्रक्षालित हो जाएगी। यदि लेजर शक्ति बहुत कम है, तो संकेत विश्लेषण करने के लिए बहुत कमजोर या शोर होगा।
  7. एक पैच विंदुक में आंतरिक समाधान (तालिका 1) के 9 μL जोड़ें और पैच क्लैंप एम्पलीफायर चरण में धारक के लिए विंदुक संलग्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. एक सिरिंज के साथ सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू करें और एक माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ स्नान समाधान को छूने के लिए विंदुक टिप ले जाएँ। एम्पलीफायर सुनिश्चित करें कि पिपेट प्रतिरोध वोल्टेज पल्स परीक्षण के साथ ~ 2-4 एमΩ है। तरल जंक्शन को रद्द करने के लिए एलजे/ऑटो दबाएं।
  9. माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ चयनित सेल की ओर विंदुक ले जाएँ। एक सेल संलग्न मोड बनाने के लिए, सेल को छूने के लिए विंदुक टिप को स्थानांतरित करें (प्रतिरोध में वृद्धि होगी); सिरिंज के साथ धीरे-धीरे नकारात्मक दबाव लागू करना (प्रतिरोध 1 जीΩ से अधिक तक बढ़ जाएगा), होल्डिंग क्षमता को 0 से -80 एमवी तक बदलें।
  10. एक बार जब प्रतिरोध 1 जीΩ से गुजरता है, तो कॉन्फ़िगरेशन को स्थिर करने के लिए ~ 30 एस की प्रतीक्षा करें। तेजी से समाई के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए सी-फास्ट /
  11. एक पूरे सेल मोड बनाने के लिए, झिल्ली को तोड़ने के लिए सिरिंज के साथ स्पंदित छोटा लेकिन शक्तिशाली नकारात्मक दबाव लागू करें (वर्तमान नाड़ी का आकार एक चार्ज और डिस्चार्ज झिल्ली संधारित्र के साथ बदलता है)। धीमी समाई की भरपाई के लिए सी-धीमी/ऑटो दबाएं।
  12. सेल तल पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इमेजिंग फोकस को थोड़ा समायोजित करें। एक ही समय में दो अलग-अलग सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोगों में प्रारंभ बटन पर क्लिक करके कॉन्फोकल टाइमलैप्स इमेजिंग और पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग एक साथ शुरू करें ।
    नोट: कॉन्फोकल इमेजिंग सॉफ्टवेयर ~ 20-90 एमएस / फ्रेम की दर से एक फिल्म बनाता है। पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग में 10 एस के लिए आराम की स्थिति, 1 एस विध्रुवण उत्तेजना और उत्तेजना के बाद अतिरिक्त 49 एस शामिल हैं। पैच-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन कैल्शियम वर्तमान, समाई कूद, और क्षय की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है जो -80 से +10 एमवी (चित्रा 3 डी) तक 1 एस विध्रुवण से प्रेरित होता है।
  13. एक बार रिकॉर्डिंग समाप्त हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि डेटा सहेजा गया है। होल्डिंग क्षमता को वापस 0 एमवी में बदलें। स्नान समाधान से पिपेट बाहर ले जाएँ और इसे त्याग दें।
  14. डिश में किसी अन्य सेल को रिकॉर्ड करने के लिए चरण 4.7-4.13 दोहराएँ। रिकॉर्डिंग के 1 घंटे के बाद, रिकॉर्डिंग के लिए एक और डिश में बदलें।
    नोट: रिकॉर्डिंग के 1 घंटे के बाद, पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग की सफलता दर काफी कम हो जाती है। डेटा संग्रह की दक्षता बढ़ाने के लिए, प्रत्येक डिश में केवल 1 घंटे के लिए रिकॉर्डिंग की सिफारिश की जाती है।

5. पैच-क्लैंप डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। पीपीटी | क्लिक करें पल्स फ़ाइल | लोड करें .dat फ़ाइल लोड करने के लिए फ़ाइल बटन. ऐसा करें पर क्लिक करें और कैल्शियम वर्तमान और समाई निशान सहित स्वचालित रूप से एक ग्राफ में चार निशान प्लॉट किए जाएंगे।
  2. विंडोज | क्लिक करें नए ग्राफ बटन, Pulse_1_1_1 चुनें, वाई वेव (ओं) में पहली लहर, और कैल्शियम वर्तमान ग्राफ को प्लॉट करने के लिए ऐसा करें पर क्लिक करें। विंडोज | क्लिक करें नई तालिका बटन, Pulse_1_1_1 चुनें, और कैल्शियम वर्तमान के कच्चे डेटा को दिखाने के लिए ऐसा करें पर क्लिक करें, जिसका उपयोग कई कोशिकाओं के औसत ट्रेस को प्लॉट करने के लिए किया जा सकता है।
  3. कैल्शियम वर्तमान ग्राफ में तदनुसार एक वर्ग ड्रा करें, राइट क्लिक करें और बेसलाइन और कैल्शियम वर्तमान के शिखर को शामिल करने के लिए वर्तमान सिग्नल का विस्तार करें। ग्राफ़ | क्लिक करें कर्सर A और B दिखाने के लिए जानकारी दिखाएँ और उन्हें क्रमशः आधार रेखा और शिखर पर ले जाएँ. ग्राफ की जानकारी नीचे दिखाई जाएगी और मापदंडों का अनुमान लगाया जा सकता है।
  4. चरण 5.2 दोहराएं, लेकिन समाई ट्रेस को प्लॉट करने के लिए वाई वेव (ओं) में दूसरी लहर Pulse_1_1_1_Cm चुनें। चरण 5.3 दोहराएं और बेसलाइन, आयाम और क्षय दर जैसे समाई मापदंडों को मापने के लिए उचित स्थिति में ए और बी कर्सर रखें।
  5. एक स्प्रेडशीट में चरण 5.2 में कच्चे डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ, दर्ज कोशिकाओं के एक समूह के लिए मतलब का मतलब और मानक त्रुटि की गणना, और एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर में कैल्शियम वर्तमान और झिल्ली समाई (चित्रा 3 ई) के औसत निशान साजिश।

6. कॉन्फोकल इमेजिंग डेटा विश्लेषण

  1. किसी भी निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ कच्ची इमेजिंग फ़ाइलें खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: कुछ अन्य मुफ्त कार्यक्रम, जैसे कि इमेजजे या फिजी, का उपयोग डेटा प्रोसेसिंग और धारा 4 में प्राप्त छवियों को मापने के लिए किया जा सकता है।
  2. प्रक्रिया | क्लिक करें प्रोसेसटूल्स और प्रत्येक टाइमलैप्स छवि के लिए रोलिंग औसत (जैसे, प्रत्येक 4 छवियों के लिए रोलिंग औसत) फ़ाइलों को उत्पन्न करने और उन फ़ाइलों को सहेजने के लिए टूल का उपयोग करें।
    नोट: रोलिंग औसत के बाद, चमक और पृष्ठभूमि का उचित समायोजन तीन चैनलों के प्रतिदीप्ति परिवर्तनों को बेहतर ढंग से दिखाने के लिए किया जा सकता है, जो संलयन घटनाओं की पहचान करने में मदद कर सकता है। संलयन घटना के बिना कुछ क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट तीव्रता की जांच पृष्ठभूमि संकेतों से संलयन घटनाओं के फ्लोरोसेंट संकेत को अलग करने में मदद कर सकती है।
  3. | मात्रा निर्धारित करें बटन क्लिक करें उपकरण | स्टैक प्रोफाइल, प्रत्येक चैनल में प्रतिदीप्ति परिवर्तनों की पहचान करने के लिए उत्तेजना से पहले और बाद में टाइमपॉइंट्स की जांच करें। संलयन घटनाओं के लिए ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) को सर्कल करने के लिए ड्रा दीर्घवृत्त बटन पर क्लिक करें। छवि पर राइट क्लिक करें और आरओआई को बचाने के लिए आरओआई सहेजें पर क्लिक करें।
    नोट: आरओआई का आकार, जो सभी तीन फ्लोरोसेंट संकेतों को कवर करता है, क्रोमाफिन कोशिकाओं24 में पुटिका आकार के समान था। विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा का उपयोग किया गया था, जबकि सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने वाले रोलिंग औसत डेटा को तीन संकेतों को स्पष्ट रूप से दिखाने के लिए प्रदान किया गया था।
  4. कच्ची फ़ाइल का पता लगाने के लिए प्रोजेक्ट खोलें पर क्लिक करें, छवि पर राइट क्लिक करें और प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए कच्चे इमेजिंग फ़ाइलों में आरओआई फ़ाइल लोड करने के लिए आरओआई लोड करें पर क्लिक करें।
    नोट: कच्चे फ्लोरोसेंट संकेत का उपयोग विभिन्न चैनलों के निशान प्लॉट करने के लिए किया जाएगा। प्रत्येक आरओआई के लिए, बेसलाइन को उत्तेजना से पहले तीव्रता के रूप में परिभाषित किया गया है, और तीव्रता के निशान को बेसलाइन पर सामान्यीकृत किया जा सकता है।
  5. उपकरण | क्लिक करें सॉफ़्टवेयर में आरओआई सॉर्ट करें और प्रत्येक आरओआई के सभी तीन चैनलों के निशान प्लॉट करें। फ़ाइल फ़ोल्डर में प्रत्येक ROI के लिए डिजिटल डेटा और इमेजिंग निशान दोनों सहित ROI डेटा को सहेजने के लिए रिपोर्ट करें क्लिक करें।
    1. पीएच-एमएनजी(एफ पीएच) और ए 655 (एफ 655) स्पॉट फ्लोरेसेंस (एक फ्रेम केभीतर) की तीव्रता में एक साथ वृद्धि से एक संलयन घटना की पहचान करें, एफएफएन 511 स्पॉट फ्लोरेसेंस (एफएफएफएन) में कमी के साथ।
    2. एफपीएच और एफ655 की उपस्थिति की तलाश करें, जो संलयन द्वारा उत्पन्न Ω-प्रोफाइल के कारण पीएच-एमएनजी / ए 655 स्पॉट गठन को इंगित करता है, जिससे प्लाज्मा झिल्ली से पीएच-एमएनजी के प्रसार और स्नान से ए 655 के लगातार प्रसार की अनुमति मिलती है।
    3. एफएफएफएन कमी की तलाश करें, जो संलयन छिद्र खोलने के कारण पुटिका से इसकी रिहाई को इंगित करता है और इस संभावना को बाहर करता है कि एफपीएच और एफ655 उपस्थिति एंडोसाइटोसिस के कारण झिल्ली आक्रमण से हो सकती है।
    4. टाइमलैप्स एक्सवाई /जेडफिक्स्ड छवियों का निरीक्षण करें जो सेल तल पर होने वाली संलयन घटनाओं को दिखाते हैं। संलयन घटनाओं के तीन तरीकों का विश्लेषण करें: 1) क्लोज-फ्यूजन, 2) स्टे-फ्यूजन, और 3) हटना-फ्यूजन।
      नोट: विध्रुवण से पहले संलयन घटनाओं को शायद ही कभी देखा गया था, जबकि विध्रुवण के बाद दसियों संलयन घटनाओं को देखा जा सकता था। संलयन के बाद, Ω-प्रोफाइल अपने छिद्र को बंद कर सकता है, अपने खुले छिद्र को बनाए रख सकता है, या प्लाज्मा झिल्ली में विलय करने के लिए सिकुड़ सकता है।
      1. क्लोज-फ्यूजन की पहचान करने के लिए, मंद एफ655 की तलाश करें क्योंकि संलयन छिद्र बंद स्नान ए 655 के आदान-प्रदान को रोकता है, जबकि एफपीएच बनाए रखता है, पीटीडीआईएन (4,5) पी2 के निरंतर रूपांतरण को दर्शाता है पीटीडीआईएन (4) पी, या एफपीएच देरी के साथ क्षय होता है, पुटिका चुटकी-बंद (क्लोज-फ्यूजन, चित्रा 4 ए, बी) को दर्शाता है।
      2. रहने-संलयन (चित्रा 4 सी) की पहचान करने के लिए निरंतर एफपीएच और एफ655 की तलाश करें।
      3. हटना संलयन (चित्रा 4 डी) की पहचान करने के लिए Ω प्रोफ़ाइल संकोचन का संकेत देते हुए, एफपीएच और एफ655 के समानांतर कमी के लिए देखो।
        नोट: घटना प्रकार के अनिश्चित होने पर इमेजिंग निशान का निरीक्षण करने के लिए मूल इमेजिंग फ़ाइलों की जाँच करें। संलयन घटना के बिना कुछ क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट तीव्रता की जांच पृष्ठभूमि संकेतों से संलयन घटनाओं के फ्लोरोसेंट संकेत को अलग करने में मदद कर सकती है।
  6. इन तीन चैनलों के लिए तीव्रता परिवर्तन के प्लॉट प्रतिनिधि निशान: एफएफएन 511, पीएच-एमएनजी और ए 655। प्रत्येक सेल और प्लॉट के आंकड़ों में विभिन्न संलयन मोड के प्रतिशत को निर्धारित करें।

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Representative Results

चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाए गए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के बाद, गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों से क्रोमाफिन कोशिकाओं को प्लाज्मा झिल्ली को लेबल करने के लिए पीएच-एमएनजी से संक्रमित किया गया था; संलयन छिद्र बंद होने का पता लगाने के लिए स्नान समाधान में ए 655 जोड़ा गया था; और फ्लोरोसेंट झूठी न्यूरोट्रांसमीटर एफएफएन 511 को रिलीज का पता लगाने के लिए पुटिकाओं में लोड किया गया था। अगला, एफएफएन 511, पीएच-एमएनजी और ए 655 के एक्सवाई-प्लेन कॉन्फोकल टाइमलैप्स इमेजिंग को सेल तल (जेड-फोकल प्लेन ~ सेल झिल्ली के ऊपर 100-200 एनएम) पर हर 20-90 एमएस किया गया था। पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और -80 से +10 एमवी तक 1 एस विध्रुवण के आवेदन को एक्सो- और एंडोसाइटोसिस (चित्रा 3 ए-सी) पैदा करने के लिए किया गया था। इस विध्रुवण ने एक आवक कैल्शियम वर्तमान, एक समाई कूद को प्रेरित किया जो एक्सोसाइटोसिस को इंगित करता है, और कूदने के बाद एक समाई क्षय जो एंडोसाइटोसिस (चित्रा 3 डी, ई) को इंगित करता है।

सेल तल पर टाइमलैप्स एक्सवाई / जेडफिक्स्ड इमेजिंग के साथ, कई व्यक्तिगत संलयन घटनाओं को विध्रुवण (चित्रा 4 ए) के बाद 8,24 देखा गया था, जबकि विध्रुवण से पहले दुर्लभ संलयन घटनाओं को देखा गया था। 1 एस विध्रुवण प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित संलयन घटनाओं को एफएफएन 511 स्पॉट फ्लोरेसेंस (एफएफएफएन) कमी के रूप में पहचाना गया था, जो एफपीएच और ए 655 स्पॉट फ्लोरेसेंस (एफ655) के साथ प्लाज्मा झिल्ली से पीएच-एमएनजी और ए 655 प्रसार को दर्शाता है और फ्यूजिंग पुटिका (संलयन-जनित Ω-प्रोफाइल) में स्नान समाधान को दर्शाता है।

संलयन के बाद, प्लाज्मा झिल्ली के साथ पुटिका संलयन द्वारा उत्पन्न Ω-प्रोफाइल 1) अपने छिद्र को बंद कर सकता है, जिसे क्लोज-फ्यूजन कहा जाता है, 2) एक खुले संलयन छिद्र को बनाए रखता है, जिसे स्टे-फ्यूजन कहा जाता है, या 3) प्लाज्मा झिल्ली में विलय करने के लिए सिकुड़ता है, जिसे सिकुड़-संलयन कहा जाता है। क्लोज-फ्यूजन को एफ655 डिमिंग के रूप में पहचाना गया था, जबकि एफपीएच एक देरी (चित्रा 4 बी) के साथ निरंतर या क्षय हो गया था। पीएच-एमएनजी और ए 655 स्पॉट (चित्रा 4 सी) दोनों की निरंतर उपस्थिति के रूप में स्टे-फ्यूजन का पता चला था। हटना-संलयनसमानांतर एफ पीएच और एफ 655 क्षय पीएच-एमएनजी स्पॉट और ए655 स्पॉट (चित्रा 4 डी) 8,15,16,24 के समानांतर आकार में कमी के साथ पाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ( ए, बी ) बोवाइन अधिवृक्क ग्रंथियों को वसा ऊतक (ए) को हटाने के लिए कैंची के साथ छंटनी की जाती है, लोके के समाधान के साथ फ्लश किया जाता है, और अधिवृक्क शिरा (बी) के माध्यम से पचाया जाता है। (सी) पाचन के बिना अधिवृक्क ग्रंथि का इंटीरियर (बाएं) या उचित पाचन (दाएं) के बाद। (डी) धोने और पचने के बाद, मज्जा को अलग किया जाता है और छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया जाता है, और क्रोमाफिन कोशिकाओं को फ़िल्टरिंग और सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद कीमा बनाया हुआ मज्जा से अलग किया जाता है। (ई) क्रोमाफिन कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेटेड किया जाता है और इनक्यूबेशन के लिए कवरलिप्स पर चढ़ाया जाता है। (एफ) 2-3 दिनों में, प्रयोग से पहले एक माइक्रोस्कोप के तहत क्रोमाफिन कोशिकाओं की जांच करें। (जी) सेल नमूना पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए कक्ष में एम्बेडेड है। मॉनिटर पर कैल्शियम वर्तमान और समाई परिवर्तन दर्ज, प्रवर्धित और प्रदर्शित किए जाते हैं। उत्तेजना पर प्रतिदीप्ति परिवर्तन का पता लगाया जाता है और मॉनिटर पर प्रदर्शित किया जाता है। स्केल बार = 40 मिमी (ए), 20 मिमी (बी-डी), 20 μm (एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पैच-क्लैंप और कॉन्फोकल सेटअप ( ए ) प्रयोग के दिन, कवरलिप्स पर उगाए गए क्रोमाफिन कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए एफएफएन 511 के साथ ऊष्मायन किया जाता है। डाई ए 655 को स्नान समाधान में जोड़ा जाता है। (बी) कवरस्लिप पर क्रोमाफिन कोशिकाओं को एक रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित किया जाता है, और ए 655 के साथ स्नान समाधान कक्ष में जोड़ा जाता है। (सी) 100x तेल विसर्जन उद्देश्य पर तेल की एक बूंद जोड़ने के बाद, कक्ष एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के मंच पर घुड़सवार है। जमीन के तार की नोक स्नान समाधान में डूबी हुई है। पिपेट को पिपेट समाधान के साथ लोड करने के बाद स्थिति में लाया जाता है और एक पिपेट धारक द्वारा आयोजित किया जाता है, जो हेडस्टेज से जुड़ा होता है। हेडस्टेज को मोटरचालित माइक्रोमैनिपुलेटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। (डी) एक अच्छा सेल खोजने के बाद, पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग शुरू करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ स्नान समाधान में पिपेट टिप को स्थानांतरित करें। स्केल बार = 10 मिमी (ए), 5 मिमी (बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कैल्शियम धाराओं की संपूर्ण-कोशिका वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग और विध्रुवण द्वारा प्रेरित समाई परिवर्तन। (ए) पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान क्रोमाफिन कोशिकाओं की सेटअप ड्राइंग। क्रोमाफिन सेल को ए 655 युक्त स्नान समाधान (लाल) में डुबोया जाता है, और कोशिका झिल्ली और पुटिकाओं को क्रमशः पीएच-एमएनजी (हरा) और एफएफएन 511 (सियान) के साथ लेबल किया जाता है। इस छवि को 24 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। (बी) ब्राइटफील्ड द्वारा देखे गए पैच-क्लैंप किए गए क्रोमाफिन सेल की एक प्रतिनिधि छवि। (सी) सेल पदचिह्न पर अच्छा ध्यान देने के साथ एक सेल में पीएच-एमएनजी (हरा), ए 655 (लाल), और एफएफएन 511 (सियान) की प्रतिनिधि छवियां। (डी) कैल्शियम वर्तमान और समाई परिवर्तनों का एक उदाहरण -80 से +10 एमवी तक 1 एस विध्रुवण द्वारा प्रेरित होता है। (ई) कैल्शियम धाराओं (आईसीए) और समाई (सेमी) के औसत निशान 20 क्रोमाफिन कोशिकाओं से एकत्र किए गए परिवर्तन। इस छवि को 26 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। स्केल सलाखों = 5 μm (बी, सी)। संक्षिप्त नाम: आईसीए = कैल्शियम वर्तमान; सेमी = समाई; विध्रुवण = विध्रुवण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत संलयन घटनाओं का दृश्य (ए) सेल तल पर पीएच-एमएनजी (हरा), ए 655 (लाल), और एफएफएन 511 (सियान) के कॉन्फोकल एक्सवाई-प्लेन इमेजिंग के साथ कई संलयन धब्बों का पता लगाया जा सकता है। संलयन -80 से +10 एमवी (विध्रुवण 1 एस) से 1 एस विध्रुवण द्वारा उत्पन्नकिया गया था। एफएफएन स्पॉट रिलीज और क्लोज-फ्यूजन (सर्कल) से गुजरे। (-1 एस) से पहले और बाद में (+1 एस और +10 एस) विध्रुवण की छवियां दिखाई जाती हैं। (बी) क्लोज-फ्यूजन का एक उदाहरण। (सी) स्टे-फ्यूजन का एक उदाहरण। (डी) हटना-संलयन का एक उदाहरण। इस छवि को 24 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। स्केल सलाखों = 1 μm (ए), 0.5 μm (बी-डी)। संक्षिप्त नाम: विध्रुवण = विध्रुवण; एफ = फ्लोरोसेंट तीव्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मध्यम/समाधान वर्णन
लोके का समाधान 145 एमएम एनएसीएल, 5.4 एमएम केसीएल, 2.2 एमएम एनए2एचपीओ4, 0.9 एमएम एनएएच2पीओ4, 5.6 एमएम ग्लूकोज, और 10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.3, एनएओएच के साथ समायोजित
एंजाइम समाधान लोके के समाधान में 1.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज पी, 0.325 मिलीग्राम / एमएल ट्रिप्सिन अवरोधक, और 5 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन
संस्कृति का माध्यम डीएमईएम मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक
आंतरिक समाधान 130 एमएम सीएस-ग्लूटामेट, 0.5 एमएम सीएस-ईजीटीए, 12 एमएम एनएसीएल, 30 एमएम एचईपीईएस, 1 एमएम एमजीसीएल2, 2 एमएम एटीपी, और 0.5 एमएम जीटीपी, पीएच 7.2, सीएसओएच के साथ समायोजित
स्नान का समाधान 125 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम एचईपीईएस, 5 एमएम सीएसीएल2, 1 एमएम एमजीसीएल2, 4.5 एमएम केसीएल, और 20 एमएम टीईए, पीएच 7.3, एनएओएच के साथ समायोजित

तालिका 1: संस्कृति माध्यम और समाधान की संरचना के बारे में विवरण।

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Discussion

संलयन छिद्र और ट्रांसमीटर रिलीज की गतिशीलता का पता लगाने के लिए एक कंफोकल माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग विधि का वर्णन किया गया है, साथ ही गोजातीय अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं4,24 में तीन संलयन मोड, क्लोज-फ्यूजन, स्टे-फ्यूजन और हटना-संलयन। कोशिका को विध्रुवण करने के लिए एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि और इस तरह एक्सो- और एंडोसाइटोसिस का वर्णन किया गया है। व्यवस्थित कॉन्फोकल इमेज प्रोसेसिंग संलयन और विखंडन घटनाओं के लिए ताकना व्यवहार के विभिन्न तरीकों के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन के साथ एक ही सेल में कैल्शियम वर्तमान और समाई परिवर्तनों की एक साथ निगरानी एक्सो- और एंडोसाइटोसिस के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करती है, जिसका अर्थ है कि किसी भी समय पूरे सेल स्तर पर छिद्र खोलने और बंद करने का अनुपात। ये विधियां, सिद्धांत रूप में, प्राथमिक संस्कृति में अन्य उत्तेजक कोशिकाओं और गैर-विद्युत रूप से उत्तेजित कोशिकाओं पर लागू होती हैं या ~ 200-1,600 एनएम15 के पुटिकाओं वाली सेल लाइनों में लागू होती हैं। क्रोमाफिन कोशिकाओं के अलावा, यहां वर्णित विधि को चूहे अग्नाशयी बीटा-सेल लाइन, आईएनएस -1 कोशिकाओं पर लागू किया गयाहै 4.

सिद्धांत रूप में, विधि को स्रावी कोशिकाओं पर भी लागू किया जा सकता है जिसमें 200 एनएम से छोटे पुटिकाएं होती हैं। हालांकि, जैसा कि पुटिका का आकार कम हो जाता है, विश्वसनीय पहचान के लिए सिग्नल-टू-शोर-अनुपात बहुत कम हो सकता है। कॉन्फोकल इमेजिंग के बजाय सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग आवश्यक हो सकती है। अब तक, यहां वर्णित विधियों को ~ 40 एनएम सिनैप्टिक पुटिकाओं वाले सिनैप्स पर लागू नहीं किया गया है।

यहां वर्णित विधि का सफल कार्यान्वयन कई सामान्य चरणों पर गंभीर रूप से निर्भर करता है, जैसे कि संस्कृति सेल की गुणवत्ता, प्लास्मिड अभिकर्मक दक्षता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग सफलता दर। सबसे पहले, पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग दोनों के लिए स्वस्थ कोशिकाएं महत्वपूर्ण हैं। संस्कृति के दौरान जीवाणुरोधी या एंटिफंगल एजेंटों का उपयोग करने की सलाह नहीं दी जाती है क्योंकि ये रसायन क्रोमाफिन कोशिकाओं की उत्तेजना को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, बाँझ तकनीक का मेहनती व्यायाम और ताजा तैयार मीडिया का उपयोग महत्वपूर्ण है। यद्यपि प्राथमिक संस्कृति क्रोमाफिन कोशिकाएं कम से कम एक सप्ताह25 तक व्यंजनों में जीवित रह सकती हैं, नए उपयोगकर्ताओं के लिए प्रयोगों के लिए 2 से 3 दिनों में कोशिकाओं का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। जैसे-जैसे फाइब्रोब्लास्ट धीरे-धीरे बढ़ते हैं, पूरे सेल पैच-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन को स्थापित करना अधिक कठिन हो जाता है। दूसरा, क्रोमाफिन कोशिकाओं में प्लास्मिड की इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता लगभग 20-30% है। इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता को अनुकूलित करने की आवश्यकता है यदि यह बहुत कम है या पीएच-एमएनजी प्रतिदीप्ति बहुत मंद है। तीसरा, कोशिकाओं को तीन फ्लोरोसेंट जांच में परिवर्तन से संकेतित पर्याप्त घटनाओं को प्राप्त करने के लिए 100x तेल उद्देश्य के साथ उनकी बोतलों पर चित्रित किया गया था: एफएफएन 511, पीएच-एमएनजी, और ए 655। यद्यपि डीआईसी पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की स्थापना करते समय उज्ज्वल क्षेत्र या नग्न आंखों की इमेजिंग की तुलना में एक स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है, कोई भी विज़ुअलाइज़ेशन तकनीक जो उपयोगकर्ता को कॉन्फ़िगरेशन स्थापित करने की अनुमति देती है वह पर्याप्त है।

लाइव कोशिकाओं में कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए उपयुक्त लेजर पावर ताकत महत्वपूर्ण है। चूंकि एफएफएन 511 और एमएनजी को उच्च लेजर शक्ति द्वारा प्रक्षालित किया जा सकता है, इसलिए कॉन्फोकल लेजर के साथ विज़ुअलाइज़ेशन से पहले एपिफ्लोरेसेंस के साथ एक अच्छी सेल की तलाश करना बेहतर है। ए 655 के लिए, पुटिकाओं के अंदर डाई को ब्लीच करने के लिए उच्च शक्ति लेजर उत्तेजना की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस प्रयोग के असफल होने का सबसे आम कारण पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग की विफलता है। उचित आकार का एक साफ और पॉलिश विंदुक टिप और क्रोमाफिन कोशिकाओं पर पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन उत्पन्न करने का अभ्यास महत्वपूर्ण कारक हैं। यद्यपि सफल होने में कुछ समय और प्रयास लग सकता है, एक बार स्थापित होने के बाद, ये प्रयोग संलयन और विखंडन दोनों घटनाओं के बारे में पर्याप्त डेटा प्रदान करते हैं, जो एक घटना स्तर पर झिल्ली छिद्र खोलने और बंद होने का संकेत देते हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक लक्ष्यों को आगे बढ़ाने के लिए कुछ संशोधनों के साथ किया जा सकता है। हालांकि, प्रयोगात्मक लक्ष्यों की परवाह किए बिना, पहले उच्च पोटेशियम समाधान (जैसे 70 एमएम केसीएल) का उपयोग उत्तेजना के रूप में करने की सलाह दी जाती है ताकि झिल्ली को विध्रुवीकृत होने पर होने वाले परिवर्तनों को देखा जा सके, इन तीन रंगों, एफएफएन, पीएच और ए 655 में तीव्रता परिवर्तन सुनिश्चित किया जा सके। प्लाज्मा झिल्ली को अन्य झिल्ली बाध्यकारी फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किया जा सकता है, जैसे कि एमसीएलआईएनजी (झिल्ली-बाध्यकारी फ्लोरोफोर-सिस्टीन-लाइसिन-पामिटॉयल समूह)4,27 या सीएएएक्स (एक प्रोटीन आकृति जो सिस्टीन अवशेष आइसोप्रेनिलेशन के माध्यम से साइटोसोल-सामना करने वाले प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित करती है)4,28। ए 655 को विभिन्न स्पेक्ट्रा के साथ अन्य रंगों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जैसे कि एटो 532 (ए 532), कुछ प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट अणुओं के संयोजन के आधार पर15. फ्लोरोसेंट झूठी न्यूरोट्रांसमीटर16 के बजाय न्यूरोपेप्टाइड वाई का उपयोग किया जा सकता है।

एफएफएन 511 इस प्रयोग में 405 एनएम के बजाय 458 एनएम पर उत्साहित था, भले ही एफएफएन 511 का शिखर उत्तेजना स्पेक्ट्रम लगभग 405 एनएम है। समाई रिकॉर्डिंग के साथ अध्ययन ने पीएच-एमएनजी के साथ या बिना क्रोमाफिन कोशिकाओं में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि पीएच-एमएनजी की अधिकता एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस15,24 को प्रभावित नहीं करती है। संलयन घटनाओं के लिए समान प्रतिशत केवल पीएच-एमएनजी और ए 532 के साथ लेबल किए गए क्रोमाफिन कोशिकाओं में या एफएफएन 511 के साथ सत्यापित किए गए थे, यह दर्शाता है कि क्रोमाफिन पुटिकाओं में एफएफएन 511 की लोडिंग सामग्री रिलीज और विभिन्न संलयन मोड16 को प्रभावित नहीं करती है। 1 एस विध्रुवण उत्तेजना को उच्च पोटेशियम समाधान या विध्रुवण के अन्य पैटन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इन संशोधनों का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक उद्देश्यों के अनुकूल होने के लिए किया जा सकता है।

इस शक्तिशाली विधि के फायदों के बावजूद, इसकी कुछ सीमाएं हैं। सबसे बड़ी सीमा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के विवर्तन-सीमित रिज़ॉल्यूशन (~ 230 एनएम) से संबंधित है, जिसे अधिक उन्नत सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपीतकनीक29द्वारा दूर किया जा सकता है। गोजातीय क्रोमाफिन कोशिकाओं में ग्रेन्युल व्यास ~ 300 एनएम6 है, जिससे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प के भीतर झिल्ली छिद्र खोलने और बंद होने का निरीक्षण करना संभव हो जाता है। हालांकि, सिनैप्टिक पुटिकाएं ~ 30-60 एनएम30 हैं, जो कॉन्फोकल रिज़ॉल्यूशन से परे है। इन लाइव-सेल इमेजिंग मापों को छोटे सिनैप्टिक पुटिकाओं तक बढ़ाना कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ मुश्किल साबित होता है।

या स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ लाइव-सेल इमेजिंग तकनीक, जैसे एसटीईडी माइक्रोस्कोपी, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम), कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी, और न्यूनतम फोटॉन फ्लक्स (मिनफ्लक्स) नैनोस्कोपी विकसित की गई है और इस पद्धति पर लागू किया जा सकता है 31,32,33,34 . दरअसल, क्रोमाफिन कोशिकाओं में संलयन ताकना गतिशीलता को प्रकट करने के लिए एसटीईडी माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया है। संलयन घटनाओं के विभिन्न तरीकों और पूर्वनिर्मित Ω-प्रोफाइल क्लोजर को एसटीईडी माइक्रोस्कोपी24 जैसे सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके आगे सत्यापित किया जा सकता है। अन्य सीमाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन और रंगों की फोटोब्लीचिंग और साइटोटॉक्सिसिटी शामिल है।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के इस संयोजन को कई स्रावी कोशिकाओं पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है। यहां वर्णित विधियों के साथ सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का संयोजन भविष्य में तंत्रिका सर्किट में संलयन ताकना गतिशीलता को मापने के लिए एक मूल्यवान उपकरण होगा, बशर्ते कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी इस हद तक विकसित हो कि यह तंत्रिका टर्मिनलों पर संलयन छिद्र को हल कर सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस काम का समर्थन करने के लिए एनआईएनडीएस इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम (जेडआईए एनएस 003009-13 और जेडआईए एनएस 003105-08) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 11213873001 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 181
अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं में संलयन छिद्र गतिशीलता के तीन तरीकों को मापने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
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Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu,… More

Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. G. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

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