Summary
Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.
Abstract
Abertura dinâmica de poros de fusão e fechamento mediam exocitese e endocitose e determinam sua cinética. Aqui, é demonstrado em detalhes como a microscopia confocal foi usada em combinação com a gravação de grampo de remendo para detectar três modos de fusão em células adrenal adrenal de cultura primária. Os três modos de fusão incluem 1) fusão de perto (também chamada de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) estadia-fusão, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento do perfil de forma Ω gerada por fusão até que se funda completamente na membrana plasmática.
Para detectar esses modos de fusão, a membrana plasmática foi rotulada pela superexpressão mNeonGreen anexada ao domínio PH de fosfolipase C δ (PH-mNG), que se liga ao fosfaticicylinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) no folheto voltado para o citosol da membrana plasmática; vesículas foram carregadas com o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 para detectar a liberação de conteúdo vesicular; e Atto 655 foi incluído na solução de banho para detectar o fechamento de poros de fusão. Estas três sondas fluorescentes foram imagens simultaneamente a ~20-90 ms por quadro em células de cromaffin ao vivo para detectar abertura de poros de fusão, liberação de conteúdo, fechamento de poros de fusão e mudanças de tamanho vesícula. O método de análise é descrito para distinguir três modos de fusão dessas medidas de fluorescência. O método aqui descrito pode, em princípio, aplicar-se a muitas células secretas além das células cromafinas.
Introduction
A fusão de membranas media muitas funções biológicas, incluindo transmissão sináptica, homeostase de glicemia, resposta imune e entrada viral 1,2,3. A excitose, envolvendo a fusão vesícula na membrana plasmática, libera neurotransmissores e hormônios para alcançar muitas funções importantes, como atividades da rede neuronal. Fusion abre um poro para liberar conteúdo vesicular, após o qual o poro pode fechar para recuperar a vesícula fusível, que é chamada de beijo e fuga 1,4. Tanto a abertura irreversível quanto a reversível dos poros de fusão podem ser medidas com gravações de capacitância ligadas a células combinadas com gravações de conduance de poros de fusão de fusão única de fusão vesícula.
Isso é frequentemente interpretado como reflexo da fusão de colapso total, envolvendo a dilatação da fusão até o achatamento da vesícula fusível, e beijo-e-fuga, envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, respectivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estudos recentes de esgotamento de emissões confocal e estimulados (STED) em células cromafina observaram diretamente abertura e fechamento de poros de fusão (beijo-e-fuga, também chamada de fusão estreita), abertura de poros de fusão que mantém uma forma de Ω com um poro aberto por um longo tempo, denominada fusão de estadia, e encolhimento da vesícula fusória até que se funda com a membrana plasmática, que substitui a fusão de colapso total para a fusão de vesículas fusíveis com a membrana plasmática4, 8,14,15,16,17.
Nos neurônios, a abertura e o fechamento de poros de fusão foram detectados com imagens mostrando a liberação de pontos quânticos pré-carregados em vesículas maiores que o poro de fusão e com medições de condutância de poros de fusão na face de liberação dos terminais nervosos 5,18,19. As células cromafinas adrenal são amplamente utilizadas como modelo para o estudo da exo-e endocitose20,21. Embora as células cromatofinas contenham grandes vesículas densas, enquanto as sinapses contêm pequenas vesículas sinapáticas, as proteínas excitose e endocitose em células cromafinas e sinapses são bastante análogas 10,11,12,20,21,22,23.
Aqui, um método é descrito para medir esses três modos de fusão usando um método de imagem confocal combinado com eletrofisiologia em células adrenal chromaffin bovina (Figura 1). Este método envolve o carregamento de falsos neurotransmissores fluorescentes (FFN511) em vesículas para detectar exocitose; adição de Atto 655 (A655) na solução de banho para preencher o perfil de forma Ω gerado pela fusão, e rotulagem da membrana plasmática com o domínio PH de fosfolipase C δ (PH), que se liga a PtdIns(4,5)P2 na membrana plasmática 8,15,24. A dinâmica dos poros de fusão pode ser detectada através de alterações em diferentes intensidades fluorescentes. Embora descrito para células cromafinas, o princípio deste método descrito aqui pode ser amplamente aplicado a muitas células secretary muito além das células cromafinas.
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Protocol
NOTA: O procedimento de uso animal seguiu as diretrizes do NIH e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIH.
1. Cultura celular cromafina bovina
- Prepare a solução do Locke (Tabela 1) e as ferramentas de autoclave 1 dia antes da cultura celular cromafina.
- Obtenha glândulas adrenal bovinas de um matadouro local no dia da cultura, e mantenha-as submersas na solução gelada de Locke antes da dissecação.
NOTA: As glândulas suprarrenais são de 21-27 meses de idade, saudável, angus preto de ambos os sexos (principalmente masculino) com peso corporal em torno de 1.400 libras (~635 kg). - Prepare 30 mL (para 3 glândulas suprarrenais) de solução de enzima fresca contendo colagenase P, inibidor de trippsina e albumina de soro bovino (Tabela 1) antes da dissecção e mantenha-a à temperatura ambiente.
- Escolha 3 glândulas intactas sem cortes ou sangramentos na superfície e remova o tecido adiposo com uma tesoura (Figura 1A). Lave as glândulas por perfusão com a solução de Locke até que não saia sangue. Para isso, infle a glândula através da veia adrenal (Figura 1B) usando uma seringa de 30 mL anexada com um filtro de 0,22 μm quantas vezes necessário25.
NOTA: Aproximadamente 150 mL da solução locke geralmente é necessário para lavar 3 glândulas. - Para digestão, injete a solução enzimática através da veia adrenal usando uma seringa de 30 mL anexada com um filtro de 0,22 μm até que a glândula comece a inchar. Em seguida, deixe as glândulas a 37 °C por 10 min. Injete mais uma vez e deixe as glândulas a 37 °C por mais 10 minutos.
NOTA: Aproximadamente 30 mL de solução enzimápica são necessários para digerir 3 glândulas. - Após a digestão, corte a glândula longitudinalmente da veia para a outra extremidade com uma tesoura para desdobrar a glândula (Figura 1C). Isole a medula, tweezing a medula branca em uma placa de Petri de 10 cm contendo a solução de Locke.
NOTA: A comparação do interior da glândula antes e depois da digestão é mostrada na Figura 1C. Os detalhes da digestão e isolamento da medula são relatados anteriormente23,25. - Corte e pique a medula em pequenos pedaços com tesoura (Figura 1D). Filtre a suspensão da medula com uma malha de nylon de 80-100 μm em um béquer. Em seguida, transfira o filtrado para um tubo cônico de 50 mL para centrifugação a 48 × g, temperatura ambiente, por 3 minutos com desaceleração de 3.
NOTA: O picar o medullae geralmente leva ~10 min. Para obter um bom rendimento de células, as peças picadas devem ser muito pequenas, até que não possam ser tweezed up. - Após a centrifugação, remova o supernascedor e resuspenque a pelota celular com a solução de Locke por pipetação. Filtre a suspensão celular com um coador de 80-100 μm e centrífuga a 48 x g, temperatura ambiente, por 3 minutos com desaceleração de 3.
- Remova o supernatante e resuspense a pelota celular com 30 ml de meio de cultura (Tabela 1). Determine o número da célula usando as câmaras de contagem de hemacítmetros25.
2. Transfecção com eletroporação
- Transfira 2,8 × 106 células para um tubo de 15 mL. Pelota as células por centrifugação a 48 × g por 2 min com desaceleração de 3. Adicione 100 μL de tampão de transfecção (ver a Tabela de Materiais) fornecida pelo fabricante à pelota celular e, em seguida, adicione 2 μg do plasmídeo PH-mNG.
NOTA: O plasmídeo PH-mNG foi criado substituindo a proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) por mNG em PH-EGFP15 (ver a Tabela de Materiais). - Misture suavemente a suspensão ao escoar a solução para cima e para baixo, e transfira a mistura para um cuvette de eletroporação sem demora (Figura 1E). Transfira imediatamente o cuvette para o eletroporador (veja a Tabela de Materiais), selecione o programa O-005 na lista de tela e pressione Enter para realizar a eletroporação.
NOTA: Prepare a suspensão da célula para transfecção em uma capa de cultura celular. Não introduza bolhas de ar na suspensão durante a etapa de mistura. Prossiga para o próximo passo sem demora. - Após a eletroporação, adicione 1,8 mL de meio imediatamente ao cuvette e misture suavemente com um micropipettor equipado com uma ponta estéril. Em seguida, adicione 300 μL da suspensão das células eletroporadas em cima do deslizamento (ver a Tabela de Materiais) em cada prato, emplacando 5-6 pratos no total para uma reação de eletroporação.
- Transfira cuidadosamente os pratos para uma incubadora umidificada a 37 °C com 9% de CO2 por 30 min, e adicione suavemente 2 mL de meio pré-enlatado a cada prato após 30 min.
- Mantenha as células transfeinadas na incubadora umidificada a 37 °C com 9% de CO2 durante 2-3 dias antes do experimento.
NOTA: As células cultivadas durarão uma semana. É melhor usar células cultivadas nos dias 2-3.
3. Preparação para gravação de grampos e imagens confocal
NOTA: Este protocolo foi realizado com um microscópio confocal de varredura a laser e amplificador de grampo de remendo com gravação de tensão-grampo juntamente com um amplificador de travamento para gravação de capacitância. Uma imagem confocal de plano XY em um plano Z fixo (digitalizaçãofixa XY/Z) foi usada para fotografar todos os três sinais fluorescentes simultaneamente. O plano Z estava focado no fundo da célula onde a membrana plasmática estava aderindo às tampas.
- No dia do patch-clamp e experimento de imagem, observe as células sob um microscópio de fluorescência. Use o campo brilhante para garantir que a cultura celular não esteja contaminada (Figura 1F) e epifluorescência para verificar se há uma expressão adequada da proteína com marca fluorescente.
NOTA: Por exemplo, PH-mNG é expresso na membrana plasmática de ~20-30% das células. - Prepare pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato. Para isso, puxe as pipetas com um puxador de pipeta, cubra suas pontas com cera líquida e poli-as com um microforge (veja a Tabela de Materiais).
- Ligue o amplificador de gravação de grampo de remendo e inicie o software de gravação de grampo de correção (veja a tabela de materiais). Defina os parâmetros apropriados para a gravação de corrente de cálcio e capacitância no software (consulte a Tabela de Materiais).
- Defina um protocolo de gravação de 60 s de duração total, onde a estimulação começa em 10 s.
- Defina o potencial de retenção para gravação do grampo de tensão para -80 mV. Defina uma despolarização de 1 s de -80 mV para 10 mV como o estímulo para induzir o fluxo de cálcio e o salto de capacitância.
- Para medições de capacitância, defina a frequência do estímulo sinusoidal para uma faixa de 1.000-1.500 Hz com uma tensão de pico a pico de no máximo 50 mV.
- Salve o protocolo e crie um novo arquivo para gravação.
- Ligue o sistema de microscópio confocal e defina os parâmetros apropriados no software (consulte a Tabela de Materiais).
- Ligue os lasers, incluindo 458 nm, 514 nm e 633 nm, e defina a faixa de coleta de emissões para cada laser de acordo com cada sonda de fluorescência como no seguinte. FFN511: comprimento de onda de excitação (EX), 458 nm; comprimento de onda de emissão (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
- Use imagens sequenciais para FFN511 e mNG para evitar o crosstalk entre essas duas sondas. Defina um timelapse de 1 minuto de duração para gravação de imagem (Figura 1G).
4. Gravação de grampo de remendo e imagem confocal
- Escolha um prato com bom estado celular e expressão adequada e adicione 2 μL de neurotransmissor falso fluorescente FFN511 (estoque de 10 mM, solução de trabalho de 1:1.000) no meio. Coloque o prato de volta na incubadora por 20 minutos. Alternativamente, carregue FFN511 após a etapa 3.2 e execute as etapas 3.3-3.5 enquanto espera para economizar tempo.
- Após o carregamento FFN511 concluído, prepare a câmara de gravação e adicione 2 μL de corante fluorescente A655 em 500 μL da solução de banho (Figura 2A e Tabela 1). Transfira o deslizamento do prato para a câmara de gravação (veja a tabela de materiais) com pinças e adicione imediatamente a solução de banho contendo A655 (Figura 2B).
NOTA: O A655 é mantido em -20 °C com concentração de 10 mM e a concentração de trabalho é de 40 μM.
ATENÇÃO: Use luvas para evitar contato direto com a pele com FFN511 ou A655. - Coloque uma gota de óleo (índice de refração: 1.518; consulte a Tabela de Materiais) no objetivo de imersão de óleo 100x (Abertura Numérica = 1,4). Monte a câmara no microscópio e use o botão de ajuste para fazer com que o óleo entre em contato com a parte inferior do deslizamento de cobertura, depois mergulhe a ponta do fio moído na solução do banho (Figura 2C, D).
NOTA: Escolha um óleo de imersão apropriado para trabalhar em temperatura ambiente. Alternar entre a lente de baixa e alta ampliação é desnecessário. A temperatura ambiente é mantida em torno de 20-22 °C durante a gravação. - Leve as células ao foco e use imagens brightfield e confocal para encontrar uma boa célula com expressão mNG. Amplie a célula selecionada e ajuste-a para o centro da vista para minimizar regiões em branco.
NOTA: O desenho esquemático da rotulagem de fluorescência é mostrado na Figura 3A. Uma boa célula geralmente tem uma membrana lisa e borda limpa (Figura 3B). Com epifluorescência ou imagem confocal, uma boa célula parece ter um fundo grande e plano com expressão mNG brilhante (Figura 3C).
O tamanho do pixel é de ~50 nm, dentro de um alcance de ~40-80 nm de acordo com diferentes tamanhos de célula e fator de zoom. - Configure parâmetros para imagens confocal de plano XY em um plano Z fixo (digitalizaçãofixa XY/Z) de FFN511, PH-mNG e A655, com um intervalo de tempo minimizado. Ajuste o foco na parte inferior da célula com o botão de ajuste fino.
NOTA: PH-mNG sinaliza o contorno da membrana plasmática celular na seção confocal XY-plano (exceto o fundo da célula). Perto do fundo da membrana celular, podem ser observadas manchas A655, que refletem invaginações de membrana em forma de Ω ou Λ. Se o plano Z-focal for menor que o fundo da célula, a intensidade de toda a fluorescência ficará mais fraca. - Ajuste a potência do laser de excitação no software para encontrar uma configuração para obter a melhor relação sinal-ruído e evitar branqueamento significativo de fluorescência. Para isso, comece com um valor inicial de teste de 2,5 mW de potência para FFN511 animado em 458 nm e 1 mW para mNG animado em 514 nm. Para A655 animado a 633 nm com um laser HeNe, use alta potência laser, ~12-15 mW (ou seja, 70%-80% do máximo), que, após excitação contínua, pode branquear todo o A655 fluorescente dentro de um perfil de Ω-forma quando seu poro está fechado.
NOTA: Se a potência do laser for muito alta, a fluorescência PH-mNG e FFN511 será branqueada rapidamente. Se a potência do laser estiver muito baixa, os sinais serão muito fracos ou barulhentos para serem analisados. - Adicione 9 μL de solução interna (Tabela 1) em uma pipeta de remendo e conecte a pipeta ao suporte no estágio do amplificador de grampo de correção (veja a tabela de materiais).
- Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva com uma seringa e mova a ponta da pipeta para tocar a solução de banho com um micromanipulador. Certifique-se de que o amplificador mostra que a resistência à pipeta é ~2-4 MΩ com um teste de pulso de tensão. Pressione LJ/Auto para cancelar a junção líquida.
- Mova a pipeta para a célula selecionada com o micromanipulador. Para formar um modo conectado à célula, mova a ponta da pipeta para tocar a célula (a resistência aumentará); aplicando pressão negativa suavemente com a seringa (a resistência aumentará para mais de 1 GΩ), alterando o potencial de exploração de 0 para -80 mV.
- Uma vez que a resistência passe 1 GΩ, espere ~30 s para que a configuração se estabilize. Pressione C-fast/Auto para compensar a capacidade rápida.
- Para formar um modo de célula inteira, aplique pressão negativa curta e poderosa pulsada com a seringa para romper a membrana (a forma do pulso atual muda com um capacitor de membrana carregado e descarregado). Pressione C-slow/Auto para compensar a capacidade lenta.
- Ajuste o foco de imagem ligeiramente para se concentrar na parte inferior da célula. Inicie a gravação de imagens de timelapse confocal e patch-clamp simultaneamente clicando nos botões Iniciar nos dois aplicativos de software diferentes ao mesmo tempo.
NOTA: O software de imagem confocal faz um filme a uma taxa de ~20-90 ms/frame. A gravação do grampo de remendo inclui o estado de repouso para 10 s, a estimulação de despolarização de 1 s e um adicional de 49 s após a estimulação. A configuração do grampo permite o registro da corrente de cálcio, salto de capacitância e decomposição induzido pela despolarização de 1 s de -80 a +10 mV (Figura 3D). - Uma vez que a gravação esteja concluída, certifique-se de que os dados sejam salvos. Mude o potencial de retenção para 0 mV. Tire a pipeta da solução do banho e descarte-a.
- Repita as etapas 4.7-4.13 para gravar outra célula no prato. Depois de 1h de gravação, mude para outro prato para gravação.
NOTA: Após 1h de gravação, a taxa de sucesso da gravação de patch-clamp diminui significativamente. Para aumentar a eficiência da coleta de dados, o registro por apenas 1h é recomendado em cada prato.
5. Análise de dados de patch-clamp
- Abra software apropriado (consulte a Tabela de Materiais) para análise de dados. Clique no | PPT Carregar | de arquivo PULSE Botões de arquivo para carregar o arquivo .dat. Clique em Fazê-lo e quatro traços serão plotados em um gráfico automaticamente, incluindo os traços de corrente de cálcio e capacitância.
- Clique no | do Windows Novos botões gráficos , escolha o Pulse_1_1_1, a primeira onda em Y Wave(s) e clique em Fazê-lo para traçar o gráfico de corrente de cálcio. Clique no | do Windows Novos botões de tabela , escolha o Pulse_1_1_1 e clique em Fazê-lo para mostrar os dados brutos da corrente de cálcio, que poderiam ser usados para traçar o traço médio de múltiplas células.
- Desenhe um quadrado de acordo no gráfico de corrente de cálcio, clique com o botão direito do mouse e expanda o sinal atual para incluir a linha de base e o pico de corrente de cálcio. Clique em gráfico | Mostre informações para mostrar os cursores A e B e movê-los para a linha de base e pico, respectivamente. As informações do gráfico serão mostradas na parte inferior e os parâmetros podem ser estimados.
- Repita o passo 5.2, mas escolha o Pulse_1_1_1_Cm, a segunda onda em Y Wave(s), para traçar o traço de capacitância. Repita os passos 5.3 e coloque os cursores A e B na posição apropriada para medir os parâmetros de capacitância, como linha de base, amplitude e taxa de decomposição.
- Copie dados brutos na etapa 5.2 em uma planilha, calcule o erro médio e padrão de média para um grupo de células registradas e plote os traços médios de corrente de cálcio e capacitância de membrana (Figura 3E) em um software apropriado.
6. Análise de dados de imagem confocal
- Abra os arquivos de imagem bruto com qualquer software fornecido pelo fabricante (consulte a tabela de materiais).
NOTA: Alguns outros programas gratuitos, como ImageJ ou Fiji, poderiam ser utilizados para o processamento de dados e quantificação das imagens obtidas na seção 4. - Clique em process | Processetos e use as ferramentas para gerar arquivos de média de rolamento (por exemplo, média de rolamento para cada 4 imagens) para cada imagem timelapse e salvar esses arquivos.
NOTA: Após a média de rolamento, o ajuste adequado do brilho e do fundo poderia ser feito para mostrar melhor as mudanças de fluorescência de três canais, o que pode ajudar a identificar eventos de fusão. Verifique a intensidade fluorescente em algumas regiões sem evento de fusão pode ajudar a distinguir o sinal fluorescente de eventos de fusão de sinais de fundo. - Clique nos botões Quantify | Ferramentas | Stack Profile, verifique os pontos de tempo antes e depois da estimulação para identificar alterações de fluorescência em cada canal. Clique no botão Draw elipse para circular as regiões de interesse (ROIs) para eventos de fusão. Clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Salvar ROIs para salvar os ROIs.
NOTA: O tamanho do ROI, que cobre todos os três sinais fluorescentes, foi semelhante com o tamanho da vesícula nas célulascroomaffin 24. Os dados brutos foram utilizados para a análise, enquanto os dados de média de rolamento que aumentam a relação sinal-ruído foram fornecidos para mostrar claramente os três sinais. - Clique em Criar projetos para localizar o arquivo bruto, clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Carregar ROIs para carregar o arquivo ROI nos arquivos de imagem bruta para medir as intensidades de fluorescência.
NOTA: O sinal fluorescente bruto será usado para traçar traços de diferentes canais. Para cada ROI, a linha de base é definida como a intensidade antes da estimulação, e os traços de intensidade podem ser normalizados à linha de base. - Clique em Ferramentas | Classifique ROIs no software e plote os traços para os três canais de cada ROI. Clique em Reportar para salvar os dados do ROI, incluindo dados digitais e rastreamentos de imagem para cada ROI, em uma pasta de arquivos.
- Identifique um evento de fusão pelo aumento simultâneo na intensidade da fluorescência spot PH-mNG (FPH) eA655 (F 655) (dentro de um único quadro), acompanhada de uma diminuição na fluorescência spot FFN511 (FFFN).
- Procure o aparecimento de FPH e F655, o que indica a formação de manchas PH-mNG/A655 devido a um perfil de Ω gerado pela fusão, permitindo a difusão de PH-mNG da membrana plasmática e difusão persistente de A655 do banho.
- Procure por fffn diminuição, que indica sua liberação de uma vesícula devido à abertura de poros de fusão e exclui a possibilidade de que fph e f655 aparência pode ser de invaginação de membrana causada por endocitose.
- Inspecione as imagensfixas timelapse XY/Z que mostram eventos de fusão acontecendo na parte inferior da célula. Analise três modos de eventos de fusão: 1) fusão próxima, 2) stay-fusion e 3) shrink-fusion.
NOTA: Eventos de fusão raramente eram observados antes da despolarização, enquanto dezenas de eventos de fusão podiam ser observados após a despolarização. Após a fusão, o perfil de Ω pode fechar seu poro, manter seu poro aberto ou encolher para se fundir na membrana plasmática.- Para identificar a fusão próxima, procure o escurecimento F655 porque o fechamento de poros de fusão impede a troca de banho A655, enquanto fPH sustenta, refletindo a conversão contínua de PtdIns(4,5)P2 em PtdIns(4)P, ou FPH decai com um atraso, refletindo a pinça-off vesícula (close-fusion, Figura 4A,B).
- Procure por FPH e F655 sustentados para identificar a fusão de estadia (Figura 4C).
- Procure por reduções paralelas de FPH e F655, indicando Ω-perfil de encolhimento para identificar a fusão de encolhimento (Figura 4D).
NOTA: Verifique os arquivos de imagem originais para inspecionar os traços de imagem se não houver certeza do tipo de evento. Verificar a intensidade fluorescente em algumas regiões sem evento de fusão pode ajudar a distinguir o sinal fluorescente de eventos de fusão dos sinais de fundo.
- Traços representativos de mudanças de intensidade para esses três canais: FFN511, PH-mNG e A655. Quantifique a porcentagem de diferentes modos de fusão em cada célula e figuras de enredo.
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Representative Results
Seguindo os procedimentos experimentais mostrados na Figura 1 e Figura 2, as células cromafinas das glândulas suprarrenais bovinas foram transfectadas com PH-mNG para rotular a membrana plasmática; O A655 foi adicionado à solução de banho para detectar o fechamento dos poros de fusão; e o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 foi carregado em vesículas para detecção de liberação. Em seguida, a imagem de timelapse confocal de plano XY de FFN511, PH-mNG e A655 foi realizada a cada 20-90 ms na parte inferior da célula (plano Z-focal ~100-200 nm acima da membrana celular). Foi realizada gravação de grampo de remendo de células inteiras e aplicação de uma despolarização de 1 s de -80 a +10 mV para evocar exo e endocitose (Figura 3A-C). Essa despolarização induziu uma corrente de cálcio interior, um salto de capacitância que indica exocitose, e uma decadência de capacitância após o salto que indica endocitose (Figura 3D, E).
Com imagensfixas timelapse XY/Z no fundo da célula, muitos eventos individuais de fusão foram observados 8,24 após a despolarização (Figura 4A), enquanto eventos raros de fusão foram observados antes da despolarização. Eventos de fusão induzidos pelo protocolo de despolarização 1 foram identificados como fluorescência spot FFN511 (FFFN) diminuindo refletindo a liberação do FFN511, acompanhados por fph e fluorescência de manchas A655 (F655) aumentam refletindo a difusão PH-mNG e A655 da membrana plasmática e a solução de banho na vesícula fusora (o perfil de Ω gerado pela fusão)15.
Após a fusão, o perfil de Ω gerado pela fusão vesícula com a membrana plasmática pode 1) fechar seu poro, chamado de fusão próxima, 2) manter um poro de fusão aberta, chamado de stay-fusion, ou 3) encolher para se fundir na membrana plasmática, chamada de redução de fusão. A fusão próxima foi identificada como F655, enquanto fPH sustentada ou deteriorada com um atraso (Figura 4B). A fusão de estadia foi detectada como a presença sustentada de ambos os pontos PH-mNG e A655 (Figura 4C). A redução da fusão foi detectada como decadência paralela FPH e F655 acompanhada de uma redução de tamanho paralelo do ponto PH-mNG e da mancha A655 (Figura 4D)8,15,16,24.
Figura 1: Representação esquemática do protocolo experimental. (A, B) As glândulas adrenal bovinas são aparadas com tesouras para remover tecido adiposo (A), lavadas com a solução de Locke e digeridas através da veia adrenal (B). (C) O interior de uma glândula suprarrenal sem digestão (esquerda) ou após a digestão adequada (direita). (D) Após serem lavadas e digeridas, as medulas são isoladas e picadas em pequenos pedaços, e as células cromafinas são separadas da medula picada após filtragem e centrifugação. (E) As células chromaffin são eletroporadas e banhadas em tampas para incubação. (F) Nos dias 2-3, verifique as células de cromafina sob um microscópio antes da experimentação. (G) A amostra celular está embutida na câmara para gravação de grampos e imagens confocal. As alterações de corrente de cálcio e capacitância são registradas, amplificadas e exibidas no monitor. Alterações de fluorescência após a estimulação são detectadas e exibidas no monitor. Barras de escala = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fixação de remendo e configuração confocal. (A) No dia da experimentação, as células de cromafina cultivadas em deslizamentos de tampa são incubadas com FFN511 por 20 minutos. O corante A655 é adicionado à solução de banho. (B) As células Chromaffin no deslizamento de cobertura são transferidas para uma câmara de gravação, e a solução de banho com A655 é adicionada à câmara. (C) Depois de adicionar uma gota de óleo no objetivo de imersão de óleo de 100x, a câmara é montada no estágio de um microscópio confocal invertido. A ponta do fio moído está imersa na solução de banho. A pipeta é colocada em posição após o carregamento com solução de pipeta e mantida por um porta-pipetas, que é anexado a um headstage. O headstage é controlado por um micromanipulador motorizado. (D) Depois de encontrar uma boa célula, mova a ponta da pipeta para a solução de banho com o micromanipulador para iniciar a gravação de grampos de remendo de células inteiras e imagens confocal. Barras de escala = 10 mm (A), 5 mm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gravações de tensão de células inteiras de correntes de cálcio e alterações de capacitância induzidas pela despolarização. (A) Desenho de configuração de células cromafina durante a gravação de tensão de células inteiras. A célula cromafina está imersa em solução de banho contendo A655 (vermelha), e a membrana celular e vesículas são rotuladas com PH-mNG (verde) e FFN511 (ciano), respectivamente. Esta imagem foi modificada com permissão de 24. (B) Uma imagem representativa de uma célula de cromafina remendada observada por brightfield. (C) Imagens representativas de PH-mNG (verde), A655 (vermelho) e FFN511 (ciano) em uma célula com bom foco na pegada celular. (D) Um exemplo de mudanças de corrente de cálcio e capacitância induzidas pela despolarização de 1 s de -80 para +10 mV. (E) Os traços médios das correntes de cálcio (ICa) e da capacitância (Cm) coletados a partir de 20 células cromafinas. Esta imagem foi modificada com permissão de 26. Barras de escala = 5 μm (B, C). Abreviaturas: ICa = corrente de cálcio; Cm = capacitância; Depol = despolarização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visualização de eventos de fusão sob o microscópio confocal. (A) Muitos pontos de fusão podem ser detectados com imagens confocal XY-plane de PH-mNG (verde), A655 (vermelho) e FFN511 (ciano) na parte inferior da célula. A fusão foi evocada por uma despolarização de 1 s de -80 a +10 mV (depol1s). As manchas de FFN foram liberadas e próximas (círculos). Imagens antes (-1 s) e depois (+1 s e +10 s) despolarização são mostradas. (B) Um exemplo de fusão próxima. (C) Um exemplo de fusão de estadias. (D) Um exemplo de redução de fusão. Esta imagem foi modificada com permissão de 24. Barras de escala = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Abreviaturas: Depol = despolarização; F = intensidade fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Média/Solução | Descrição | ||
| Solução de Locke | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM de glicose, e 10 mM HEPES, pH 7.3, ajustado com NaOH | ||
| Solução enzimápica | 1,5 mg/mL colagenase P, 0,325 mg/mL inibidor de trippsina e 5 mg/mL de colagem bovina na solução de Locke | ||
| Meio de cultura | MMEM médio suplementado com soro bovino fetal de 10% | ||
| Solução interna | 130 mM Cs-glutamato, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP, e 0,5 mM GTP, pH 7.2, ajustado com CsOH | ||
| Solução de banho | 125 mM NaCl, 10 mM de glicose, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl, e 20 mM TEA, pH 7.3, ajustado com NaOH | ||
Tabela 1: Detalhes sobre a composição do meio cultural e soluções.
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Discussion
Um método de imagem microscópica confocal é descrito para detectar a dinâmica da liberação de poros de fusão e transmissor, bem como três modos de fusão, fusão de perto, fusão de estadia e redução de fusão em células adrenalrnafina bovina 4,24. Um método eletrofisiológico para despolarizar a célula e, assim, evocar exo-e endocitose é descrito. O processamento sistemático de imagens confocal fornece informações sobre diferentes modos de comportamentos de poros para eventos de fusão e fissão.
O monitoramento simultâneo da corrente de cálcio e das mudanças de capacitância na mesma célula com a configuração de células inteiras fornece informações adicionais sobre exo-e endocitose, implicando a razão de abertura e fechamento de poros a nível de células inteiras a qualquer momento. Esses métodos são, em princípio, aplicáveis a outras células excitáveis e células não estelamticamente excitáveis na cultura primária ou em linhas celulares contendo vesículas de ~200-1.600 nm15. Além das células cromafinas, o método descrito aqui foi aplicado a uma linha de células beta pancreáticas de ratos, células INS-14.
Em princípio, o método também pode ser aplicado a células secretas contendo vesículas menores que 200 nm. No entanto, à medida que o tamanho da vesícula é diminuído, a relação sinal-ruído pode ser muito baixa para detecção confiável. Imagens de super-resolução em vez de imagens confocal podem se tornar necessárias. Até agora, os métodos descritos aqui não foram aplicados a sinapses contendo ~40 nm de vesículas sinápticas.
A implementação bem-sucedida do método aqui descrito depende criticamente de várias etapas gerais, como a qualidade da célula de cultura, a eficiência da transfecção plasmida e a taxa de sucesso do registro eletrofisiológico. Em primeiro lugar, as células saudáveis são vitais tanto para a gravação de grampos quanto para imagens confocal. Não é aconselhável usar agentes antibacterianos ou antifúngicos durante a cultura porque esses produtos químicos podem afetar a excitabilidade das células cromafinas. Assim, o exercício diligente da técnica estéril e o uso de mídias recém-preparadas são importantes. Embora as células de cromafina da cultura primária possam sobreviver em pratos por pelo menos uma semana25, é importante que novos usuários usem células nos dias 2 a 3 para os experimentos. À medida que os fibroblastos crescem gradualmente, torna-se mais difícil estabelecer a configuração de grampo de remendo de células inteiras. Em segundo lugar, a eficiência de eletroporação de plasmídeos em células cromafinas é de aproximadamente 20-30%. A eficiência da eletroporação precisa ser otimizada se for muito baixa ou a fluorescência PH-mNG for muito fraca. Em terceiro lugar, as células foram imagens em suas partes inferiores com um objetivo de óleo de 100x para obter eventos substanciais indicados por alterações em três sondas fluorescentes: FFN511, PH-mNG e A655. Embora o DIC forneça uma visão mais clara do que o campo brilhante ou imagens a olho nu ao estabelecer a configuração de toda a célula, qualquer técnica de visualização que permita ao usuário estabelecer a configuração é suficiente.
A força de energia do laser apropriada é vital para imagens confocal em células vivas. Como FFN511 e mNG podem ser branqueados por alta potência laser, é melhor procurar uma boa célula com epifluorescência antes da visualização com lasers confocal. Para A655, a excitação a laser de alta potência é necessária para branquear o corante dentro das vesículas. Além disso, a razão mais comum deste experimento não ter sucesso é uma falha na gravação do grampo de remendo. Uma ponta de pipeta limpa e polida do tamanho e prática adequada gerando a configuração de células inteiras em células cromafinas são fatores-chave. Embora possa levar algum tempo e esforço para ter sucesso, uma vez estabelecido, esses experimentos fornecem dados substanciais sobre eventos de fusão e fissão, indicando abertura e fechamento de poros de membrana em um único nível de evento.
O protocolo descrito aqui pode ser usado com algumas modificações para outros objetivos experimentais diferentes. No entanto, independentemente das metas experimentais, é aconselhável primeiro usar solução de potássio alto (como 70 mM KCl) como estímulo para ver as mudanças que a membrana sofre ao ser despolarizada, garantindo que as mudanças de intensidade nesses três corantes, FFN, PH e A655, possam ser visualizadas. A membrana plasmática pode ser rotulada com outros fluoroforos de ligação de membrana, como o mCLING (grupo de fluorohore-cisteína-lysina-palmitoyl de ligação de membrana)4,27 ou CAAX (um motivo proteico que tem como alvo a membrana plasmática com cara de citosol através da isobrilação do resíduo de cisteína)4,28. O A655 pode ser substituído por outros corantes por diferentes espectros, como o Atto 532 (A532), dependendo da combinação de moléculas fluorescentes usadas em certos experimentos15. Neuropeptídeo Y pode ser usado em vez de neurotransmissores falsos fluorescentes16.
FFN511 estava animado em 458 nm em vez de 405 nm neste experimento, embora o espectro de excitação máxima de FFN511 seja de cerca de 405 nm. Estudo com registro de capacitância não mostrou diferença significativa nas células cromafinas com ou sem PH-mNG, indicando que a superexpressão do PH-mNG não afeta exocitose e endocitose15,24. Percentuais semelhantes para eventos de fusão foram verificados em células de cromafina rotuladas apenas com PH-mNG e A532 ou com FFN511, demonstrando que o carregamento de FFN511 em vesículas cromafina não afeta a liberação de conteúdo e diferentes modos de fusão16. A estimulação de despolarização de 1 s pode ser substituída por solução de potássio alta ou outros pattens de despolarização. Essas modificações podem ser usadas para se adaptar a diferentes objetivos experimentais.
Apesar das vantagens desse método poderoso, ele tem algumas limitações. A maior limitação está relacionada à resolução limitada de difração (~230 nm) da microscopia confocal, que pode ser superfida por técnicas de microscopia de super resolução mais avançadas29. O diâmetro do grânulo nas células de cromafina bovina é de ~300 nm6, possibilitando observar a abertura e o fechamento dos poros da membrana dentro da resolução espacial da microscopia confocal. No entanto, as vesículas sinápticas são ~30-60 nm30, o que está além da resolução confocal. Estender essas medidas de imagem de células vivas a pequenas vesículas sinápticas mostra-se difícil com a imagem confocal.
Técnicas de imagem de células vivas com melhor resolução temporal e/ou espacial, como microscopia sted, microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), microscopia de localização fotoativada (PALM), fluorescência de reflexão interna total (TIRF) microscopia e nanoscopia de fótons mínimos (MINFLUX) foram desenvolvidas e podem ser aplicadas a este método 31,32,33,34 . De fato, a microscopia STED tem sido usada para revelar a dinâmica dos poros de fusão em células cromafinas. Os diferentes modos de eventos de fusão e fechamento pré-formado de Ω-perfil podem ser verificados ainda usando microscopia de super-resolução, como a microscopia STED24. Outras limitações incluem fotobleaching e citotoxicidade de proteínas fluorescentes e corantes.
Esta combinação de eletrofisiologia e microscopia confocal pode ser aplicada amplamente em muitas células secretary. A combinação de microscopia de super resolução com os métodos descritos aqui seria uma ferramenta valiosa para medir a dinâmica dos poros de fusão em circuitos neurais no futuro, desde que a microscopia de super resolução se desenvolva a tal ponto que possa resolver o poro de fusão nos terminais nervosos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos aos Programas de Pesquisa Intramuros do NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) por apoiarem este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
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