Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63569
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

Abstract

פתיחת נקבוביות היתוך דינמיות וסגירתן מתווכות אקסוציטוזה ואנדוציטוזה וקובעות את הקינטיקה שלהן. כאן, הוא מודגם בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם רישום מהדק טלאי כדי לזהות שלושה מצבי היתוך בתאי כרומפין יותרת הכליה של התרבית הראשונית. שלושת מצבי ההיתוך כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבובית שנפתחה, ו-3) היתוך-כיווץ, הכרוך בהתכווצות של פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך עד שהוא מתמזג לחלוטין בקרום הפלזמה.

כדי לזהות מצבי היתוך אלה, קרום הפלזמה סומן על ידי ביטוי יתר של mNeonGreen המחובר לתחום PH של פוספוליפאז C δ (PH-mNG), הנקשר לפוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (PtdIns(4,5)P2) בעלון הפונה לציטוזול של קרום הפלזמה; שלפוחיות היו עמוסות עם נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי FFN511 כדי לזהות שחרור תוכן שלפוחית; ואטו 655 נכלל בתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך. שלוש בדיקות פלואורסצנטיות אלה צולמו בו-זמנית במהירות של כ-20-90 אלפיות השנייה לפריים בתאי כרומפין חיים כדי לזהות פתיחת נקבוביות היתוך, שחרור תוכן, סגירת נקבוביות היתוך ושינויים בגודל השלפוחית. שיטת הניתוח מתוארת כדי להבחין בין שלושה מצבי היתוך לבין מדידות פלואורסצנטיות אלה. השיטה המתוארת כאן יכולה, באופן עקרוני, לחול על תאים מפרישים רבים מעבר לתאי כרומפין.

Introduction

היתוך ממברנה מתווך תפקודים ביולוגיים רבים, כולל העברה סינפטית, הומאוסטזיס של גלוקוז בדם, תגובה חיסונית וכניסה ויראלית 1,2,3. אקסוציטוזה, הכוללת איחוי שלפוחית בקרום הפלזמה, משחררת נוירוטרנסמיטורים והורמונים כדי להשיג פונקציות חשובות רבות, כגון פעילויות רשת עצבית. היתוך פותח נקבובית לשחרור תכולת השלפוחית, ולאחר מכן הנקבובית עשויה להיסגר כדי לאחזר את שלפוחית ההתמזגות, המכונה נשיקה והפעלה 1,4. ניתן למדוד גם את פתיחת נקבוביות ההיתוך הבלתי הפיכה וגם את פתיחת נקבוביות ההיתוך ההפוכה באמצעות הקלטות קיבוליות המחוברות לתאים בשילוב עם הקלטות מוליכות נקבוביות היתוך של נקבוביות היתוך שלפוחית בודדת.

זה מתפרש לעתים קרובות כמשקף היתוך של קריסה מלאה, הכולל התרחבות של ההיתוך עד שיטוח של שלפוחית ההתמזגות, ונשיקה וריצה, הכוללת פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, בהתאמה 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . מחקרי הדמיה אחרונים של דלדול פליטה קונפוקלית ומעוררת (STED) בתאי כרומפין צפו ישירות בפתיחת נקבוביות היתוך וסגירתן (נשיקה וריצה, הנקראת גם היתוך קרוב), פתיחת נקבוביות היתוך השומרת על צורת Ω עם נקבובית פתוחה במשך זמן רב, המכונה היתוך שהייה, וכיווץ שלפוחית ההתמזגות עד להשלמת התמזגותה עם קרום הפלזמה, המחליף היתוך קריסה מלאה למיזוג שלפוחית התמזגות עם קרום הפלזמה4, 8,14,15,16,17.

בתאי עצב, פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך זוהו עם הדמיה המציגה שחרור של נקודות קוונטיות הטעונות מראש בשלפוחיות גדולות יותר מנקבוביות ההיתוך ועם מדידות מוליכות נקבוביות היתוך בפני שחרור של מסופי עצבים 5,18,19. תאי כרומפין יותרת הכליה נמצאים בשימוש נרחב כמודל לחקר אקסו ואנדוציטוזה20,21. אף על פי שתאי כרומפין מכילים בועיות גדולות בעלות ליבה צפופה, בעוד שסינפסות מכילות בועיות סינפטיות קטנות, חלבוני האקסוציטוזה והאנדוציטוזה בתאי כרומפין וסינפסות מקבילים למדי ל-10,11,12,20,21,22,23.

כאן מתוארת שיטה למדידת שלושת מצבי ההיתוך האלה באמצעות שיטת הדמיה קונפוקלית בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר (איור 1). שיטה זו כוללת העמסה של נוירוטרנסמיטורים כוזבים פלואורסצנטיים (FFN511) לתוך שלפוחית כדי לזהות אקסוציטוזה; תוספת של Atto 655 (A655) בתמיסת האמבטיה כדי למלא את פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך, ותיוג של קרום הפלזמה עם תחום PH של פוספוליפאז C δ (PH), הנקשר ל- PtdIns(4,5)P2 בקרום הפלזמה 8,15,24. ניתן לזהות דינמיקה של נקבוביות היתוך באמצעות שינויים בעוצמות פלואורסצנטיות שונות. למרות שהיא מתוארת עבור תאי כרומפין, העיקרון של שיטה זו המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הליך השימוש בבעלי חיים פעל בהתאם להנחיות NIH ואושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIH.

1. תרבית תאי כרומפין בקר

  1. הכינו את התמיסה של לוק (טבלה 1) ואת כלי האוטוקלבה האוטומטית יום אחד לפני תרבית תאי הכרומפין.
  2. השיגו בלוטות יותרת הכליה של בקר מאבטואר מקומי ביום התרבית, ושמרו אותן שקועות בתמיסה הקרה כקרח של לוק לפני הנתיחה.
    הערה: בלוטות יותרת הכליה הן בנות 21-27 חודשים, אנגוס שחור בריא ושחור משני המינים (בעיקר זכר) עם משקל גוף סביב 1,400 פאונד (~ 635 ק"ג).
  3. יש להכין 30 מ"ל (עבור 3 בלוטות יותרת הכליה) של תמיסת אנזימים טרייה המכילה קולגןאז P, מעכב טריפסין ואלבומין בסרום בקר (טבלה 1) לפני הניתוח ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
  4. בחרו 3 בלוטות שלמות ללא חתכים או דימומים על פני השטח והסירו את רקמת השומן באמצעות מספריים (איור 1A). לשטוף את הבלוטות על ידי זלוף עם הפתרון של לוק עד שלא יוצא דם. כדי להשיג זאת, יש לנפח את הבלוטה דרך וריד יותרת הכליה (איור 1B) באמצעות מזרק של 30 מ"ל המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר בכמות הפעמים הדרושהל-25.
    הערה: כ 150 מ"ל של הפתרון של לוק הוא בדרך כלל נחוץ כדי לשטוף 3 בלוטות.
  5. לצורך העיכול, הזריקו את תמיסת האנזים דרך וריד יותרת הכליה באמצעות מזרק של 30 מ"ל המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר עד שהבלוטה מתחילה להתנפח. לאחר מכן, השאירו את הבלוטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להזריק שוב ולהשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.
    הערה: יש צורך בכ-30 מ"ל של תמיסת אנזים כדי לעכל 3 בלוטות.
  6. לאחר העיכול, חותכים את הבלוטה לאורך הווריד לקצה השני עם מספריים כדי לפתוח את הבלוטה (איור 1C). בודדו את המדולה על ידי פינצטה של המדולה הלבנה לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה את התמיסה של לוק.
    הערה: ההשוואה בין פנים הבלוטה לפני ואחרי העיכול מוצגת באיור 1C. הפרטים של העיכול ובידוד medullae דווחו בעבר23,25.
  7. חותכים את המדולה ומחברים אותה לחתיכות קטנות עם מספריים (איור 1D). מסננים את מתלי המדולה עם רשת ניילון של 80-100 מיקרומטר לכוס. לאחר מכן להעביר את התסיס לצינור חרוטי 50 מ"ל לצנטריפוגה ב 48 × גרם, טמפרטורת החדר, למשך 3 דקות עם האטה של 3.
    הערה: כריכה של medullae בדרך כלל לוקח ~ 10 דקות. כדי להשיג תשואה טובה של תאים, החלקים הטחונים חייבים להיות קטנים מאוד, עד שלא ניתן יהיה לתקן אותם.
  8. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והחזיר את גלולת התא עם התמיסה של לוק על ידי צנרת. סנן את מתלה התא עם מסננת של 80-100 מיקרומטר, וצנטריפוגה ב-48 x גרם, טמפרטורת החדר, למשך 3 דקות עם האטה של 3.
  9. מוציאים את הסופרנטנט ומחזירים את גלולת התא עם 30 מ"ל של מדיום תרבית (טבלה 1). קבע את מספר התא באמצעות תאי ספירת המקסיטומטר25.

2. טרנספקציה עם אלקטרופורציה

  1. להעביר 2.8 × 106 תאים לתוך צינור 15 מ"ל. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 48 × g במשך 2 דקות עם האטה של 3. הוסף 100 μL של מאגר טרנספקציה (ראה טבלת החומרים) המסופק על ידי היצרן לכדור התא, ולאחר מכן הוסף 2 מיקרוגרם של פלסמיד PH-mNG.
    הערה: פלסמיד PH-mNG נוצר על-ידי החלפת החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (EGFP) ב-mNG ב-PH-EGFP15 (ראו טבלת החומרים).
  2. ערבבו בעדינות את המתלים על-ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה, והעבירו את התערובת לקובט אלקטרופורציה ללא דיחוי (איור 1E). העבר מיד את הקובט לאלקטרופורטור (ראה את טבלת החומרים), בחר את תוכנית O-005 ברשימת המסך והקש Enter כדי לבצע אלקטרופורציה.
    הערה: הכינו את תרחיף התא לטרנספקציה במכסה אדים של תרבית תאים. אין להכניס בועות אוויר למתלים במהלך שלב הערבוב. המשך לשלב הבא ללא דיחוי.
  3. לאחר אלקטרופורציה, הוסיפו 1.8 מ"ל של מדיום מיד לקובט וערבבו בעדינות עם מיקרופיפטטור המצויד בקצה סטרילי. לאחר מכן הוסיפו 300 μL של ההשעיה של התאים האלקטרופורים על גבי הכיסוי (ראו טבלת החומרים) בכל מנה, וציפו 5-6 כלים בסך הכל לתגובת אלקטרופורציה אחת.
  4. העבירו בזהירות את הכלים לחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% CO2 למשך 30 דקות, והוסיפו בעדינות 2 מ"ל של מדיום מחומם מראש לכל מנה לאחר 30 דקות.
  5. שמור את התאים הטרנספקטים באינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% CO2 למשך 2-3 ימים לפני הניסוי.
    הערה: התאים בתרבית יחזיקו מעמד במשך שבוע. עדיף להשתמש בתאים בתרבית בימים 2-3.

3. הכנה להקלטת מהדק טלאי והדמיה קונפוקלית

הערה: פרוטוקול זה בוצע עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר ומגבר מהדק טלאי עם הקלטת מהדק מתח יחד עם מגבר נעילה להקלטת קיבוליות. הדמיה קונפוקלית של מישור XY במישור Z קבוע (סריקהקבועה XY/Z) שימשה כדי לצלם את כל שלושת האותות הפלואורסצנטיים בו זמנית. מישור ה-Z היה ממוקד בקרקעית התא, שם קרום הפלזמה נדבק לכיסויים.

  1. ביום של ניסוי הידוק טלאי והדמיה, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמשו בשדה בהיר כדי לוודא שתרבית התאים אינה מזוהמת (איור 1F) ובאפיפלואורסצנציה כדי לבדוק אם יש ביטוי נכון של החלבון המתויג כחלואורסצנטי.
    הערה: לדוגמה, PH-mNG מתבטא בקרום הפלזמה של כ-20-30% מהתאים.
  2. הכן פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט. לשם כך, משכו את הפיפטות עם מושך פיפטות, ציפו את קצותיהן בשעווה נוזלית וליטשו אותן במיקרו-פורג' (ראו טבלת החומרים).
  3. הפעילו את מגבר ההקלטה של מהדק התיקון והפעילו את תוכנת ההקלטה של מהדקי התיקון (ראו טבלת החומרים). הגדר את הפרמטרים המתאימים לרישום זרם סידן וקיבוליות בתוכנה (ראה טבלת החומרים).
    1. הגדר פרוטוקול הקלטה של 60 שניות בסך הכל, כאשר הגירוי מתחיל ב-10 שניות.
    2. הגדר את פוטנציאל ההחזקה של הקלטת מהדקי מתח ל- -80 mV. קבעו דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80 mV ל-10 mV כתמריץ לגרימת זרם סידן וקפיצת קיבוליות.
    3. עבור מדידות קיבוליות, הגדר את התדר של הגירוי הסינוסואידלי לטווח של 1,000-1,500 הרץ עם מתח שיא לשיא של לא יותר מ-50 mV.
  4. שמור את הפרוטוקול וצור קובץ חדש להקלטה.
  5. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית והגדר את הפרמטרים המתאימים בתוכנה (ראה טבלת החומרים).
    1. הפעל את הלייזרים, כולל 458 ננומטר, 514 ננומטר ו- 633 ננומטר, והגדר את טווח איסוף הפליטות עבור כל לייזר בהתאם לכל בדיקה פלואורסצנטית כמו בהמשך. FFN511: אורך גל עירור (EX), 458 ננומטר; אורך גל פליטה (EM), 468-500 ננומטר. mNG: EX, 514 ננומטר; EM, 524-560 ננומטר. A655: EX, 633 ננומטר; EM, 650-700 ננומטר.
    2. השתמש בהדמיה רציפה עבור FFN511 ו- mNG כדי למנוע הצלבה בין שתי בדיקות אלה. קבעו משך זמן של דקה אחת להקלטת תמונה (איור 1G).

4. הקלטה של מהדק טלאי והדמיה קונפוקלית

  1. בחר צלחת עם מצב תא טוב וביטוי נכון והוסף 2 μL של נוירוטרנסמיטר פלואורסצנטי כוזב FFN511 (מלאי 10 mM, תמיסת עבודה 1:1,000) למדיום. החזירו את המנה לחממה למשך 20 דקות. לחלופין, טען FFN511 לאחר שלב 3.2 ובצע שלבים 3.3-3.5 תוך המתנה כדי לחסוך זמן.
  2. לאחר סיום העמסת FFN511, הכינו את תא ההקלטה והוסיפו 2 μL של צבע פלואורסצנטי A655 לתוך 500 μL של תמיסת האמבטיה (איור 2A וטבלה 1). העבירו את הכיסוי מהתבשיל לתוך תא ההקלטה (ראו טבלת החומרים) עם פינצטה, והוסיפו מיד תמיסת אמבטיה המכילה A655 (איור 2B).
    הערה: A655 נשמר ב -20 °C עם ריכוז של 10 mM וריכוז העבודה הוא 40 μM.
    אזהרה: לבשו כפפות כדי למנוע מגע ישיר עם העור עם FFN511 או A655.
  3. מקם טיפת שמן (מקדם שבירה: 1.518; ראה טבלת החומרים) על מטרת טבילת השמן פי 100 (צמצם מספרי = 1.4). הרכיבו את התא במיקרוסקופ והשתמשו בידית הכוונון כדי לגרום לשמן פשוט ליצור קשר עם החלק התחתון של הכיסוי, ואז לטבול את קצה חוט ההארקה לתוך תמיסת האמבטיה (איור 2C, D).
    הערה: בחר שמן טבילה המתאים לעבודה בטמפרטורת החדר. המעבר בין עדשת ההגדלה הנמוכה והגבוהה הוא מיותר. טמפרטורת החדר נשמרת סביב 20-22 מעלות צלזיוס במהלך ההקלטה.
  4. הכניסו את התאים למיקוד והשתמשו בהדמיה בהירה וקונפוקלית כדי למצוא תא טוב עם ביטוי mNG. הגדל את התצוגה של התא שנבחר והתאם אותו למרכז התצוגה כדי למזער אזורים ריקים.
    הערה: השרטוט הסכמטי של תיוג פלואורסצנטי מוצג באיור 3A. לתא טוב יש בדרך כלל קרום חלק וקצה נקי (איור 3B). בהדמיה אפיפלואורסצנטית או קונפוקלית, נראה שלתא טוב יש תחתית גדולה ושטוחה עם ביטוי mNG בהיר (איור 3C).
    גודל הפיקסל הוא ~ 50 ננומטר, בטווח של ~ 40-80 ננומטר בהתאם לגודל התא וגורם הזום השונים.
  5. הגדר פרמטרים להדמיה קונפוקלית במישור XY במישור Z קבוע (סריקהקבועה XY/Z) של FFN511, PH-mNG ו-A655, עם מרווח זמן מינימלי. התאם את המיקוד לתחתית התא באמצעות ידית הכוונון העדינה.
    הערה: PH-mNG מאותת על קווי המתאר של קרום הפלזמה של התא בהצלבה של מישור XY הקונפוקלי (למעט תחתית התא). ליד תחתית קרום התא, ניתן לראות כתמים A655, המשקפים Ω בצורת Ω או בצורת Λ אינוויגינציות של קרום. אם מישור מוקד ה-Z נמוך יותר מתחתית התא, העוצמה של כל הפלואורסצנציה תהיה חלשה יותר.
  6. התאם את עוצמת הלייזר של העירור בתוכנה כדי למצוא הגדרה שתקבל את יחס האות לרעש הטוב ביותר ותמנע הלבנה פלואורסצנטית משמעותית. לשם כך, התחל עם ערך בדיקה ראשוני של הספק של 2.5 mW עבור FFN511 נרגש ב- 458 ננומטר ו- 1 mW עבור mNG נרגש ב- 514 ננומטר. עבור A655 נרגש ב-633 ננומטר עם לייזר HeNe, השתמש בהספק לייזר גבוה, ~12-15 mW (כלומר, 70%-80% מהמקסימום), אשר, לאחר עירור רציף, יכול להלבין את כל A655 פלואורסצנטי בתוך פרופיל בצורת Ω כאשר הנקבובית שלו סגורה.
    הערה: אם עוצמת הלייזר גבוהה מדי, PH-mNG ו-FFN511 פלואורסצנציה יולבנו במהירות. אם עוצמת הלייזר נמוכה מדי, האותות יהיו חלשים או רועשים מכדי לנתח אותם.
  7. הוסף 9 μL של תמיסה פנימית (טבלה 1) לתוך פיפטה טלאי והצמד את הפיפטה למחזיק בשלב מגבר הידוק התיקון (ראה טבלת החומרים).
  8. יש למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי עם מזרק ולהזיז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור. ודא שהמגבר מראה שהתנגדות הפיפטה היא ~ 2-4 MΩ עם בדיקת פולס מתח. לחץ על LJ/Auto כדי לבטל את הצומת הנוזלי.
  9. הזיזו את הפיפטה לכיוון התא שנבחר באמצעות המיקרומניפולטור. כדי ליצור מצב המחובר לתא, הזז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתא (ההתנגדות תגדל); הפעלת לחץ שלילי בעדינות עם המזרק (ההתנגדות תגדל ליותר מ 1 GΩ), לשנות את פוטנציאל ההחזקה מ 0 ל -80 mV.
  10. ברגע שההתנגדות עוברת 1 GΩ, המתן עד ~ 30 שניות עד שהתצורה תתייצב. לחץ על C-fast/Auto כדי לפצות על קיבוליות מהירה.
  11. כדי ליצור מצב של תא שלם, יש להפעיל לחץ שלילי קצר אך רב עוצמה עם המזרק כדי לקרוע את הממברנה (צורת הדופק הנוכחי משתנה עם קבל ממברנה טעון ומשוחרר). לחץ על C-slow/Auto כדי לפצות על קיבוליות איטית.
  12. התאם מעט את מוקד ההדמיה כדי להתמקד בתחתית התא. התחל הדמיית זמן קונפוקלית והקלטת מהדק תיקון בו-זמנית על-ידי לחיצה על הלחצנים התחל בשני יישומי התוכנה השונים בו-זמנית.
    הערה: תוכנת ההדמיה הקונפוקלית יוצרת סרט בקצב של ~ 20-90 אלפיות השנייה למסגרת. הקלטת מהדק התיקון כוללת את מצב המנוחה במשך 10 שניות, את גירוי הדה-פולריזציה של 1 שניות, ותוספת של 49 שניות לאחר הגירוי. תצורת מהדק הטלאים מאפשרת רישום של זרם סידן, קפיצת קיבוליות ודעיכה המושרים על-ידי דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80- ל-10 mV +(איור 3D).
  13. לאחר סיום ההקלטה, ודא שהנתונים נשמרים. שנה את פוטנציאל ההחזקה בחזרה ל-0 mV. מזיזים את הפיפטה מתמיסת האמבטיה ומשליכים אותה.
  14. חזור על שלבים 4.7-4.13 כדי להקליט תא נוסף בצלחת. לאחר שעה אחת של הקלטה, החליפו למנה אחרת להקלטה.
    הערה: לאחר שעה אחת של הקלטה, שיעור ההצלחה של הקלטת מהדק טלאי יורד באופן משמעותי. כדי להגביר את היעילות של איסוף הנתונים, מומלץ לרשום רק שעה אחת בכל מנה.

5. ניתוח נתוני מהדק תיקון

  1. פתח תוכנה מתאימה (ראה טבלת החומרים) לניתוח נתונים. לחץ על | PPT טען | קובץ PULSE לחצני קובץ לטעינת הקובץ .dat. לחץ על עשה זאת וארבעה עקבות יפורטו בגרף אחד באופן אוטומטי, כולל זרם הסידן ועקבות הקיבול.
  2. לחץ על | Windows לחצני גרף חדשים, בחר את Pulse_1_1_1, הגל הראשון ב- Y Wave(s), ולחץ על עשה זאת כדי להתוות את גרף זרם הסידן. לחץ על | Windows לחצני טבלה חדשים, בחר את Pulse_1_1_1 ולחץ על עשה זאת כדי להציג את הנתונים הגולמיים של זרם סידן, שניתן להשתמש בהם כדי להתוות את העקבות הממוצעים של תאים מרובים.
  3. צייר ריבוע בהתאם בגרף זרם הסידן, לחץ לחיצה ימנית והרחב את האות הנוכחי כך שיכלול את קו הבסיס ואת שיא זרם הסידן. לחץ על גרף | הצג מידע כדי להציג את הסמנים A ו- B ולהעביר אותם לקו הבסיס ולשיא בהתאמה. פרטי הגרף יוצגו בתחתית וניתן יהיה להעריך פרמטרים.
  4. חזור על שלב 5.2, אך בחר את Pulse_1_1_1_Cm, הגל השני ב- Y Wave(s), כדי להתוות את עקבות הקיבול. חזור על שלב 5.3 והצב את הסמנים A ו- B במיקום המתאים למדידת פרמטרי הקיבול, כגון קו בסיס, משרעת וקצב דעיכה.
  5. העתק נתונים גולמיים בשלב 5.2 לגיליון אלקטרוני, חישב את השגיאה הממוצעת והסטנדרטית של הממוצע עבור קבוצת תאים מוקלטים, והתווה את העקבות הממוצעים של זרם סידן וקיבוליות ממברנה (איור 3E) בתוכנה מתאימה.

6. ניתוח נתוני הדמיה קונפוקלית

  1. פתח את קבצי ההדמיה הגולמיים עם כל תוכנה שסופקה על-ידי היצרן (ראה טבלת החומרים).
    הערה: ניתן להשתמש בכמה תוכניות חינמיות אחרות, כגון ImageJ או Fiji, לעיבוד נתונים ולכימות התמונות המתקבלות בסעיף 4.
  2. לחץ על | תהליך ProcessTools ושימוש בכלים כדי ליצור ממוצע מתגלגל (לדוגמה, ממוצע מתגלגל עבור כל 4 תמונות) עבור כל תמונה בהילוך מהיר ולשמור קבצים אלה.
    הערה: לאחר גלגול הממוצע, ניתן לבצע התאמה מתאימה של הבהירות והרקע כדי להראות טוב יותר את השינויים הפלואורסצנטיים של שלושה ערוצים, מה שעשוי לסייע בזיהוי אירועי היתוך. בדיקת עוצמת הפלואורסצנט באזורים מסוימים ללא אירוע היתוך עשויה לסייע בהבחנה בין האות הפלואורסצנטי של אירועי היתוך לבין אותות רקע.
  3. לחץ על הכפתורים כימות | כלים | פרופיל מחסנית, בדוק נקודות זמן לפני ואחרי הגירוי כדי לזהות שינויים פלואורסצנטיים בכל ערוץ. לחץ על לחצן ציור אליפסה כדי להקיף את אזורי העניין (ROIs) לאירועי היתוך. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על שמור ROIs כדי לשמור את ה- ROIs.
    הערה: גודל ההחזר על ההשקעה, המכסה את כל שלושת האותות הפלואורסצנטיים, היה דומה לגודל השלפוחית בתאי כרומפין24. לצורך הניתוח נעשה שימוש בנתונים גולמיים, בעוד שהנתונים הממוצעים המתגלגלים המגדילים את יחס האות לרעש סופקו כדי להראות בבירור את שלושת האותות.
  4. לחץ על פתח פרויקטים כדי לאתר את הקובץ הגולמי, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על Load ROIs כדי לטעון את קובץ ההחזר על ההשקעה בקבצי ההדמיה הגולמיים כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה.
    הערה: האות הפלואורסצנטי הגולמי ישמש להתוויית עקבות של ערוצים שונים. עבור כל ROI, קו הבסיס מוגדר כעוצמה שלפני הגירוי, וניתן לנרמל את עקבות העוצמה לנקודת ההתחלה.
  5. לחץ על כלים | מיין ROIs בתוכנה והתווה את העקבות עבור כל שלושת הערוצים של כל החזר השקעה. לחץ על דווח כדי לשמור את נתוני ההחזר על ההשקעה, כולל מעקבי נתונים דיגיטליים והדמיה עבור כל החזר השקעה, בתיקיית קבצים.
    1. זהה אירוע היתוך על ידי עלייה בו-זמנית בעוצמת הפלואורסצנציה הנקודתית PH-mNG (FPH) ו-A655 (F655) (בתוך מסגרת אחת), המלווה בירידה בפלואורסצנציה של נקודת FFN511 (FFFN).
    2. חפש את המראה של FPH PH ו- F655, המציין היווצרות נקודה PH-mNG / A655 עקב פרופיל Ω שנוצר על ידי היתוך, המאפשר דיפוזיה של PH-mNG מממברנת הפלזמה והפצה מתמשכת של A655 מהאמבטיה.
    3. חפשו ירידה ב-FFFN , אשר מציינת את שחרורה משלפוחית עקב פתיחת נקבוביות היתוך ואינה כוללת את האפשרות שהופעת FPH ו-F655 עשויה להיות מאינווגינציה של ממברנה הנגרמת על ידי אנדוציטוזה.
    4. בדוק את התמונותהקבועות של XY/Z בהילוך הזמן המציגות אירועי היתוך המתרחשים בתחתית התא. נתחו שלושה מצבים של אירועי היתוך: 1) היתוך קרוב, 2) היתוך שהייה, ו-3) היתוך-כיווץ.
      הערה: אירועי היתוך נצפו רק לעתים רחוקות לפני דה-פולריזציה, בעוד שניתן היה לצפות בעשרות אירועי היתוך לאחר דה-פולריזציה. לאחר ההיתוך, פרופיל Ω עשוי לסגור את הנקבובית שלו, לשמור על הנקבובית הפתוחה שלה או להתכווץ כדי להתמזג לתוך קרום הפלזמה.
      1. כדי לזהות היתוך קרוב, חפשו עמעום F655 מכיוון שסגירת נקבוביות היתוך מונעת את החלפת ה-A655 של האמבטיה, בעוד ש-FPH מתקיים, מה שמשקף את ההמרה המתמשכת של PtdIns(4,5)P2 ל-PtdIns(4)P, או FPH דועך עם השהיה, המשקף את הצביטה המתמשכת של שלפוחית (היתוך קרוב, איור 4A,B).
      2. חפשו FPH ו-F655 מתמשכים כדי לזהות היתוך שהייה (איור 4C).
      3. חפשו הפחתות מקבילות של FPH ו-F655, מה שמצביע על התכווצות בפרופיל Ω כדי לזהות היתוך כיווץ (איור 4D).
        הערה: בדוק את קבצי ההדמיה המקוריים כדי לבדוק את עקבות ההדמיה אם אינך בטוח לגבי סוג האירוע. בדיקת עוצמת הפלואורסצנט באזורים מסוימים ללא אירוע היתוך עשויה לסייע בהבחנה בין האות הפלואורסצנטי של אירועי היתוך לבין אותות רקע.
  6. העלילה מייצגת עקבות של שינויי עוצמה עבור שלושת הערוצים האלה: FFN511, PH-mNG ו- A655. לכמת את אחוז מצבי ההיתוך השונים בכל תא ומספרי העלילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות ההליכים הניסיוניים שהוכחו באיור 1 ובאיור 2, תאי כרומפין מבלוטת יותרת הכליה של בקר הועתקו עם PH-mNG כדי לתייג את קרום הפלזמה; A655 נוסף לתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך; והנוירוטרנסמיטר הכוזב הפלואורסצנטי FFN511 הועמס בשלפוחיות לזיהוי שחרור. לאחר מכן, הדמיית זמן קונפוקלית במישור XY של FFN511, PH-mNG ו-A655 בוצעה כל 20-90 אלפיות השנייה בתחתית התא (מישור מוקד Z ~100-200 ננומטר מעל קרום התא). הקלטה של מהדק טלאי של תאים שלמים ויישום של דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80 עד +10 mV בוצעה כדי לעורר אקסו ואנדוציטוזה (איור 3A-C). דה-פולריזציה זו גרמה לזרם סידן פנימי, קפיצת קיבוליות המצביעה על אקסוציטוזה, ודעיכה קיבולית לאחר הקפיצה המצביעה על אנדוציטוזה (איור 3D, E).

עם הדמיהקבועה XY/Z בהילוך מהיר בקרקעית התא, נצפו אירועי היתוך בודדים רבים 8,24 לאחר דה-פולריזציה (איור 4A), בעוד שאירועי היתוך נדירים נצפו לפני הדפולריזציה. אירועי היתוך המושרים על ידי פרוטוקול הדה-פולריזציה של 1 s זוהו כ- FFN511 ספוט פלואורסצנציה (FFFN) ירידה המשקפת שחרור FFN511, מלווה בעלייה פלואורסצנטית נקודתית FPH ו- A655 (F655) המשקפת את הדיפוזיה PH-mNG ו- A655 מממברנת הפלזמה ואת תמיסת האמבטיה לתוך שלפוחית המיזוג (פרופיל Ω שנוצר על ידי היתוך)15.

לאחר היתוך, פרופיל Ω שנוצר על ידי היתוך שלפוחית עם קרום הפלזמה עשוי 1) לסגור את הנקבובית שלו, המכונה היתוך קרוב, 2) לשמור על נקבוביית היתוך פתוחה, המכונה היתוך שהייה, או 3) להתכווץ כדי להתמזג לתוך קרום הפלזמה, המכונה התכווצות-היתוך. היתוך קרוב זוהה כעמעום F655 בעוד ש-FPH סבל או נרקב עם השהיה (איור 4B). היתוך שהייה זוהה כנוכחות מתמשכת של נקודות PH-mNG ו-A655 (איור 4C). היתוך כיווץ זוהה כדעיכה מקבילה של FPH PH ו-F655, מלווה בהקטנת גודל מקבילה של נקודת PH-mNG ונקודת A655 (איור 4D) 8,15,16,24.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול הניסיוני. (A, B) בלוטות יותרת הכליה של בקר נחתכות במספריים כדי להסיר רקמת שומן (A), סמוקות בתמיסה של לוק ומעוכלות דרך וריד יותרת הכליה (B). (C) פנים בלוטת יותרת הכליה ללא עיכול (משמאל) או לאחר עיכול תקין (מימין). (D) לאחר שנשטפים ומתעכלים, המדולות מבודדות ונכרכות לחתיכות קטנות, ותאי הכרומפין מופרדים ממדולה טחונה לאחר סינון וצנטריפוגה. (E) תאי כרומפין הם אלקטרופורים ומצופים על כיסויים לדגירה. (F) בימים 2-3, בדקו את תאי הכרומפין תחת מיקרוסקופ לפני הניסוי. (G) דגימת התא מוטבעת בתא לצורך הקלטה של מהדק טלאי והדמיה קונפוקלית. שינויים בזרם סידן ובקיבוליות נרשמים, מוגברים ומוצגים על הצג. שינויים פלואורסצנטיים בעת הגירוי מזוהים ומוצגים על הצג. פסי קנה מידה = 40 מ"מ (A), 20 מ"מ (B-D), 20 מיקרומטר (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מהדק טלאי והגדרת קונפוקל. (A) ביום הניסויים, תאי הכרומפין הגדלים על הכיסויים מודגרים עם FFN511 למשך 20 דקות. הצבע A655 מתווסף לתמיסת האמבטיה. (B) תאי כרומפין על הכיסוי מועברים לתא הקלטה, ותמיסת האמבטיה עם A655 מתווספת לתא. (C) לאחר הוספת טיפת שמן על מטרת טבילת השמן פי 100, התא מותקן על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. קצה חוט הקרקע שקוע בתמיסת אמבטיה. הפיפטה מובאת למקומה לאחר העמסה עם תמיסת פיפטה ומוחזקת על ידי מחזיק פיפטה, המחובר לראש הבמה. הבמה נשלטת על ידי מיקרומניפולטור ממונע. (D) לאחר מציאת תא טוב, העבירו את קצה הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם המיקרומניפולטור כדי להתחיל בהקלטה של מהדק טלאי שלם ובהדמיה קונפוקלית. סרגלי קנה מידה = 10 מ"מ (A), 5 מ"מ (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הקלטות של מהדקי מתח של תאים שלמים של זרמי סידן ושינויי קיבוליות המושרים על-ידי דה-פולריזציה. תא הכרומפין שקוע בתמיסת אמבטיה המכילה A655 (אדום), וקרום התא והבועיות מסומנים ב-PH-mNG (ירוק) ו-FFN511 (ציאן), בהתאמה. תמונה זו שונתה באישור מ- 24. (B) תמונה מייצגת של תא כרומפין מהודק טלאי שנצפה על ידי שדה בהיר. (C) תמונות מייצגות של PH-mNG (ירוק), A655 (אדום) ו-FFN511 (ציאן) בתא עם מיקוד טוב בטביעת הרגל של התא. (D) דוגמה לשינויים בזרם סידן ובקיבוליות המושרים על ידי דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80- ל-10 mV+. (E) העקבות הממוצעים של זרמי סידן (ICa) וקיבוליות (Cm) משתנים שנאספו מ-20 תאי כרומפין. תמונה זו שונתה באישור מ- 26. סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר (B, C). קיצורים: ICa = זרם סידן; ס"מ = קיבוליות; דפול = דה-פולריזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה של אירועי היתוך תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי. (A) ניתן לזהות נקודות היתוך רבות באמצעות הדמיה קונפוקלית במישור XY של PH-mNG (ירוק), A655 (אדום) ו-FFN511 (ציאן) בתחתית התא. היתוך נוצר על ידי דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80 ל-10 mV של +(דפול1 שניות). כתמי FFN עברו שחרור והיתוך קרוב (מעגלים). תמונות לפני (-1 s) ואחרי (+1 s ו-+10 s) דה-פולריזציה מוצגות. (B) דוגמה להיתוך קרוב. (C) דוגמה להיתוך שהייה. (ד) דוגמה להיתוך התכווצות. תמונה זו שונתה באישור מ- 24. סרגלי קנה מידה = 1 מיקרומטר (A), 0.5 מיקרומטר (B-D). קיצורים: דפול = דה-פולריזציה; F = עוצמה פלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בינוני/פתרון תיאור
הפתרון של לוק 145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2.2 mM Na2HPO4, 0.9 mM NaH2PO4, 5.6 mM גלוקוז, ו- 10 mM HEPES, pH 7.3, מותאם עם NaOH
תמיסת אנזים 1.5 מ"ג/מ"ל קולגן P, מעכב טריפסין 0.325 מ"ג/מ"ל ו-5 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר בתמיסה של לוק
מדיום תרבותי מדיום DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי
פתרון פנימי 130 mM Cs-גלוטמט, 0.5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP, ו-0.5 mM GTP, pH 7.2, מותאם ל-CsOH
תמיסת אמבטיה 125 mM NaCl, 10 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4.5 mM KCl, ו- 20 mM TEA, pH 7.3, מותאם עם NaOH

טבלה 1: פרטים על הרכב המדיום התרבותי והפתרונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית מתוארת כדי לזהות את הדינמיקה של נקבוביות היתוך ושחרור משדרים, כמו גם שלושה מצבי היתוך, היתוך קרוב, היתוך שהייה ואיחוי התכווצות בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר 4,24. מתוארת שיטה אלקטרופיזיולוגית לדה-פולריזציה של התא ובכך לעורר אקסו-פיטום ואנדוציטוזה. עיבוד תמונה קונפוקלי שיטתי מספק מידע על מצבים שונים של התנהגויות נקבוביות לאירועי היתוך וביקוע.

ניטור סימולטני של זרמי סידן ושינויי קיבוליות באותו תא עם תצורת התא השלם מספק מידע נוסף על אקסו ואנדוציטוזה, ומרמז על היחס בין פתיחת נקבוביות וסגירתן ברמת התא השלם בכל זמן נתון. שיטות אלה, באופן עקרוני, ישימות על תאים נרגשים אחרים ותאים שאינם ניתנים להתרגשות באופן לא חשמלי בתרבית ראשונית או בקווי תאים המכילים שלפוחיות של כ-200-1,600 ננומטר15. בנוסף לתאי כרומפין, השיטה המתוארת כאן יושמה על קו תאי בטא של לבלב חולדה, תאי INS-14.

באופן עקרוני, ניתן ליישם את השיטה גם על תאים מפרישים המכילים שלפוחיות קטנות מ-200 ננומטר. עם זאת, ככל שגודל השלפוחית מצטמצם, יחס האות לרעש עשוי להיות נמוך מדי לזיהוי אמין. הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד במקום הדמיה קונפוקלית עשויה להיות נחוצה. עד כה, השיטות המתוארות כאן לא יושמו על סינפסות המכילות שלפוחית סינפטית של כ-40 ננומטר.

יישום מוצלח של השיטה המתוארת כאן תלוי באופן קריטי במספר שלבים כלליים, כגון איכות תאי התרבית, יעילות הטרנספקציה של פלסמיד ושיעור ההצלחה ברישום אלקטרופיזיולוגי. ראשית, תאים בריאים חיוניים הן לרישום מהדקי טלאי והן להדמיה קונפוקלית. לא מומלץ להשתמש בחומרים אנטי-בקטריאליים או אנטי-פטרייתיים במהלך התרבית, משום שכימיקלים אלה עשויים להשפיע על רגישותם של תאי כרומפין. לכן, תרגיל חרוץ של טכניקה סטרילית ושימוש במדיה טרייה מוכנים חשובים. למרות שתאי כרומפין בתרבית ראשונית יכולים לשרוד במנות לפחות שבועאחד 25, חשוב שמשתמשים חדשים ישתמשו בתאים בימים 2 עד 3 לניסויים. ככל שהפיברובלסטים גדלים בהדרגה, קשה יותר לבסס את תצורת מהדק הטלאים של התאים השלמים. שנית, יעילות האלקטרופורציה של פלסמידים לתאי כרומפין היא כ-20-30%. יש לייעל את יעילות האלקטרופורציה אם היא נמוכה מדי או שהפלואורסצנציה של PH-mNG עמומה מדי. שלישית, התאים צולמו בתחתיתם עם מטרת שמן של פי 100 להשיג אירועים משמעותיים שצוינו על ידי שינויים בשלוש בדיקות פלואורסצנטיות: FFN511, PH-mNG ו-A655. למרות ש- DIC מספק תצוגה ברורה יותר מאשר הדמיית שדה בהיר או בלתי בעת קביעת תצורת התא השלם, כל טכניקת הדמיה המאפשרת למשתמש לקבוע את התצורה מספיקה.

חוזק כוח לייזר מתאים חיוני להדמיה קונפוקלית בתאים חיים. מכיוון ש-FFN511 ו-mNG עשויים להיות מולבנים על ידי הספק לייזר גבוה, עדיף לחפש תא טוב עם אפיפלואורסצנציה לפני ההדמיה עם לייזרים קונפוקליים. עבור A655, יש צורך בעירור לייזר בהספק גבוה כדי להלבין את הצבע בתוך הבועיות. בנוסף, הסיבה הנפוצה ביותר שהניסוי הזה לא מצליח היא כישלון של הקלטת מהדק טלאי. קצה פיפטה נקי ומלוטש של הגודל הנכון והפרקטיקה ליצירת תצורת התא השלם על תאי כרומפין הם גורמי מפתח. למרות שזה עשוי לקחת קצת זמן ומאמץ כדי להצליח, לאחר התבססות, ניסויים אלה מספקים נתונים משמעותיים הן לגבי אירועי היתוך והן לגבי אירועי ביקוע, מה שמצביע על פתיחה וסגירה של נקבוביות ממברנה ברמת אירוע אחת.

ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן עם כמה שינויים כדי לקדם מטרות ניסיוניות שונות. עם זאת, ללא קשר למטרות הניסוי, רצוי להשתמש תחילה בתמיסת אשלגן גבוהה (כגון 70 mM KCl) כגירוי כדי לראות את השינויים שהממברנה עוברת עם דה-פולריזציה, מה שמבטיח שניתן לדמיין את שינויי העוצמה בשלושת הצבעים הללו, FFN, PH ו- A655. ניתן לסמן את קרום הפלזמה עם פלואורופורים אחרים הקושרים ממברנה, כגון mCLING (קבוצת פלואורופור-ציסטאין-ליזין-פלמיטואיל קושרת ממברנה)4,27 או CAAX (מוטיב חלבון המכוון לממברנת פלזמה בעלת פני ציטוזול באמצעות איזופרנילציה של שאריות ציסטאין)4,28. ניתן להחליף את A655 בצבעים אחרים עם ספקטרום שונה, כגון Atto 532 (A532), בהתאם לשילוב של מולקולות פלואורסצנטיות המשמשות בניסויים מסוימים15. נוירופפטיד Y יכול לשמש במקום נוירוטרנסמיטורים כוזבים פלואורסצנטיים16.

FFN511 התרגש ב-458 ננומטר במקום 405 ננומטר בניסוי זה למרות שספקטרום השיא של עירור FFN511 הוא כ-405 ננומטר. מחקר עם רישום קיבוליות לא הראה הבדל משמעותי בתאי כרומפין עם או בלי PH-mNG, מה שמצביע על כך שביטוי יתר של PH-mNG אינו משפיע על אקסוציטוזה ואנדוציטוזה15,24. אחוזים דומים לאירועי היתוך אומתו בתאי כרומפין המסומנים ב-PH-mNG וב-A532 בלבד או עם FFN511, מה שמוכיח כי טעינת FFN511 לתוך שלפוחיות כרומפין אינה משפיעה על שחרור התוכן ועל מצבי היתוך שונים16. ניתן להחליף את גירוי הדה-פולריזציה של 1 s בתמיסת אשלגן גבוהה או בפטנים אחרים של דה-פולריזציה. ניתן להשתמש בשינויים אלה כדי להסתגל למטרות ניסיוניות שונות.

למרות היתרונות של שיטה חזקה זו, יש לה כמה מגבלות. המגבלה הגדולה ביותר קשורה לרזולוציה מוגבלת עקיפה (כ-230 ננומטר) של מיקרוסקופיה קונפוקלית, שניתן להתגבר עליה על ידי טכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות יותר ברזולוציה גבוהה יותר29. קוטר הגרגירים בתאי כרומפין בקר הוא ~ 300 ננומטר6, מה שמאפשר לצפות בפתיחת נקבוביות ממברנה וסגירתן ברזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה קונפוקלית. עם זאת, שלפוחיות סינפטיות הן ~ 30-60 ננומטר30, שהן מעבר לרזולוציה קונפוקלית. הרחבת מדידות ההדמיה של תאים חיים אלה לשלפוחיות סינפטיות קטנות מתגלה כקשה עם הדמיה קונפוקלית.

פותחו טכניקות הדמיה של תאים חיים ברזולוציה טמפורלית ו/או מרחבית טובה יותר, כגון מיקרוסקופ STED, מיקרוסקופיית שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופיית לוקליזציה פוטואקטיבית (PALM), מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) וננוסקופיה של שטפי פוטונים מינימליים (MINFLUX) וניתן ליישם אותן בשיטה זו 31,32,33,34 . ואכן, מיקרוסקופיית STED שימשה לחשיפת דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין. ניתן לאמת עוד יותר את המצבים השונים של אירועי היתוך וסגירת פרופיל Ω מראש באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד כגון מיקרוסקופ STED24. מגבלות אחרות כוללות הלבנת תמונות וציטוטוקסיות של חלבונים וצבעים פלואורסצנטיים.

שילוב זה של אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופיה קונפוקלית יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים. השילוב של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם השיטות המתוארות כאן יהיה כלי רב ערך למדידת דינמיקה של נקבוביות היתוך במעגלים עצביים בעתיד, בתנאי שמיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה תתפתח במידה כזו שהיא תוכל לפתור את נקבובית האיחוי בקצות העצבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לתוכניות המחקר התוך-גופיות של NINDS (ZIA NS003009-13 ו- ZIA NS003105-08) על התמיכה בעבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 11213873001 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18 (2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 181
מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu,… More

Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. G. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter