Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di imaging confocale per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule cromaffini surrenali bovine. Queste modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione termoretraibile, che coinvolge il restringimento delle vescicole fuse.
Abstract
L'apertura e la chiusura dinamica dei pori di fusione mediano l'esocitosi e l'endocitosi e ne determinano la cinetica. Qui, è dimostrato in dettaglio come la microscopia confocale è stata utilizzata in combinazione con la registrazione patch-clamp per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule surrenali surrenali bovine di coltura primaria. Le tre modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione di restringimento, che comporta il restringimento del profilo a forma di Ω generato dalla fusione fino a quando non si fonde completamente sulla membrana plasmatica.
Per rilevare queste modalità di fusione, la membrana plasmatica è stata etichettata sovraesprimendo mNeonGreen attaccato al dominio PH della fosfolipasi C δ (PH-mNG), che si lega al fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) sul foglietto rivolto verso il citosol della membrana plasmatica; le vescicole sono state caricate con il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 per rilevare il rilascio di contenuto vescicolare; e Atto 655 è stato incluso nella soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione. Queste tre sonde fluorescenti sono state fotografate simultaneamente a ~ 20-90 ms per fotogramma in cellule cromaffini vive per rilevare l'apertura dei pori di fusione, il rilascio di contenuto, la chiusura dei pori di fusione e la fusione dei cambiamenti delle dimensioni delle vescicole. Il metodo di analisi è descritto per distinguere tre modalità di fusione da queste misurazioni di fluorescenza. Il metodo qui descritto può, in linea di principio, applicarsi a molte cellule secretorie oltre le cellule cromaffini.
Introduction
La fusione di membrana media molte funzioni biologiche, tra cui la trasmissione sinaptica, l'omeostasi della glicemia, la risposta immunitaria e l'ingresso virale 1,2,3. L'esocitosi, che coinvolge la fusione delle vescicole sulla membrana plasmatica, rilascia neurotrasmettitori e ormoni per ottenere molte funzioni importanti, come le attività della rete neuronale. La fusione apre un poro per rilasciare il contenuto vescicolare, dopo di che il poro può chiudersi per recuperare la vescicola di fusione, che è chiamata kiss-and-run 1,4. Sia l'apertura irreversibile che reversibile dei pori di fusione può essere misurata con registrazioni di capacità collegate a celle combinate con registrazioni di conduttanza dei pori di fusione di fusione di singole vescicole.
Questo è spesso interpretato come riflesso della fusione a collasso completo, che comporta la dilatazione della fusione fino all'appiattimento della vescicola di fusione, e il bacio e la corsa, che comporta l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, rispettivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recenti studi di imaging confocale e sted (STED) di emissioni confocali e stimolate in cellule cromaffini hanno osservato direttamente l'apertura e la chiusura dei pori di fusione (kiss-and-run, chiamata anche fusione ravvicinata), l'apertura dei pori di fusione che mantiene una forma Ω con un poro aperto per lungo tempo, definita fusione di soggiorno, e il restringimento della vescicola fondente fino a quando non si fonde completamente con la membrana plasmatica, che sostituisce la fusione della fusione delle vescicole con la membrana plasmatica4, 8,14,15,16,17.
Nei neuroni, l'apertura e la chiusura dei pori di fusione sono state rilevate con l'imaging che mostra il rilascio di punti quantici precaricati in vescicole più grandi del poro di fusione e con misurazioni della conduttanza dei pori di fusione sulla faccia di rilascio dei terminali nervosi 5,18,19. Le cellule cromaffini surrenali sono ampiamente utilizzate come modello per lo studio dell'eso- ed endocitosi20,21. Sebbene le cellule cromaffini contengano grandi vescicole a nucleo denso, mentre le sinapsi contengono piccole vescicole sinaptiche, le proteine di esocitosi ed endocitosi nelle cellule cromaffini e nelle sinapsi sono abbastanza analoghe 10,11,12,20,21,22,23.
Qui, viene descritto un metodo per misurare queste tre modalità di fusione utilizzando un metodo di imaging confocale combinato con l'elettrofisiologia nelle cellule cromaffini surrenali bovine (Figura 1). Questo metodo prevede il caricamento di falsi neurotrasmettitori fluorescenti (FFN511) nelle vescicole per rilevare l'esocitosi; aggiunta di Atto 655 (A655) nella soluzione bagno per riempire il profilo a forma di Ω generato dalla fusione ed etichettatura della membrana plasmatica con il dominio PH della fosfolipasi C δ (PH), che si lega a PtdIns(4,5)P2 alla membranaplasmatica 8,15,24. La dinamica dei pori di fusione può essere rilevata attraverso cambiamenti in diverse intensità fluorescenti. Sebbene descritto per le cellule cromaffini, il principio di questo metodo qui descritto può essere applicato ampiamente a molte cellule secretorie ben oltre le cellule cromaffini.
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Protocol
NOTA: La procedura di utilizzo degli animali ha seguito le linee guida NIH ed è stata approvata dal NIH Animal Care and Use Committee.
1. Coltura cellulare cromaffini bovina
- Preparare la soluzione di Locke (Tabella 1) e gli strumenti in autoclave 1 giorno prima della coltura cellulare del cromaffinino.
- Ottenere ghiandole surrenali bovine da un mattatoio locale il giorno della coltura e tenerle immerse nella soluzione ghiacciata di Locke prima della dissezione.
NOTA: Le ghiandole surrenali sono di 21-27 mesi, sano, Angus nero di entrambi i sessi (principalmente maschio) con peso corporeo di circa 1.400 libbre (~ 635 kg). - Preparare 30 mL (per 3 ghiandole surrenali) di soluzione enzimatica fresca contenente collagenasi P, inibitore della tripsina e albumina sierica bovina (Tabella 1) prima della dissezione e mantenerla a temperatura ambiente.
- Scegli 3 ghiandole intatte senza tagli o sanguinamenti sulla superficie e rimuovi il tessuto adiposo con le forbici (Figura 1A). Lavare le ghiandole per perfusione con la soluzione di Locke fino a quando non esce sangue. Per raggiungere questo obiettivo, gonfiare la ghiandola attraverso la vena surrenale (Figura 1B) utilizzando una siringa da 30 ml attaccata con un filtro da 0,22 μm tutte le volte che è necessario25.
NOTA: Circa 150 ml di soluzione di Locke sono solitamente necessari per lavare 3 ghiandole. - Per la digestione, iniettare la soluzione enzimatica attraverso la vena surrenale utilizzando una siringa da 30 mL attaccata con un filtro da 0,22 μm fino a quando la ghiandola inizia a gonfiarsi. Quindi, lasciare le ghiandole a 37 °C per 10 minuti. Iniettare ancora una volta e lasciare le ghiandole a 37 °C per altri 10 minuti.
NOTA: Sono necessari circa 30 ml di soluzione enzimatica per digerire 3 ghiandole. - Dopo la digestione, tagliare la ghiandola longitudinalmente dalla vena all'altra estremità con le forbici per aprire la ghiandola (Figura 1C). Isolare i midollo estrapolando il midollo bianco in una capsula di Petri di 10 cm contenente la soluzione di Locke.
NOTA: Il confronto dell'interno della ghiandola prima e dopo la digestione è mostrato nella Figura 1C. I dettagli della digestione e dell'isolamento dei midollo sono riportati in precedenza23,25. - Tagliare e tritare il midollo in piccoli pezzi con le forbici (Figura 1D). Filtrare la sospensione del midollo con una rete di nylon da 80-100 μm in un becher. Quindi trasferire il filtrato in un tubo conico da 50 ml per la centrifugazione a 48 × g, temperatura ambiente, per 3 minuti con decelerazione di 3.
NOTA: La tritatura delle nippe di solito richiede ~ 10 minuti. Per ottenere una buona resa di cellule, i pezzi tritati devono essere molto piccoli, fino a quando non possono essere intrecciati. - Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare con la soluzione di Locke mediante pipettaggio. Filtrare la sospensione cellulare con un filtro da 80-100 μm e centrifugare a 48 x g, temperatura ambiente, per 3 minuti con decelerazione di 3.
- Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 30 ml di terreno di coltura (Tabella 1). Determinare il numero di cellule utilizzando le camere di conteggio dell'emacitometro25.
2. Trasfezione con elettroporazione
- Trasferire 2,8 × 106 celle in un tubo da 15 ml. Pellet le celle per centrifugazione a 48 × g per 2 min con decelerazione di 3. Aggiungere 100 μL di tampone di trasfezione (vedere la tabella dei materiali) fornita dal produttore al pellet cellulare, quindi aggiungere 2 μg del plasmide PH-mNG.
NOTA: Il plasmide PH-mNG è stato creato sostituendo la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) con mNG in PH-EGFP15 (vedere la tabella dei materiali). - Mescolare delicatamente la sospensione pipettando la soluzione su e giù e trasferire la miscela in una cuvetta elettroporatoria senza indugio (Figura 1E). Trasferire immediatamente la cuvetta all'elettroporatore (vedere la tabella dei materiali), selezionare il programma O-005 nell'elenco delle schermate e premere Invio per eseguire l'elettroporazione.
NOTA: Preparare la sospensione cellulare per la trasfezione in una cappa di coltura cellulare. Non introdurre bolle d'aria nella sospensione durante la fase di miscelazione. Procedere al passaggio successivo senza indugio. - Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente 1,8 ml di mezzo alla cuvetta e mescolare delicatamente con un micropipetto dotato di una punta sterile. Quindi aggiungere 300 μL della sospensione delle celle elettroporate sopra il coverslip (vedi la tabella dei materiali) in ogni piatto, placcando 5-6 piatti in totale per una reazione di elettroporazione.
- Trasferire con cura i piatti in un incubatore umidificato a 37 °C con il 9% di CO2 per 30 minuti e aggiungere delicatamente 2 ml di terreno preriscaldato a ciascun piatto dopo 30 minuti.
- Mantenere le cellule trasfettate nell'incubatore umidificato a 37 °C con il 9% di CO2 per 2-3 giorni prima dell'esperimento.
NOTA: Le cellule coltivate dureranno per una settimana. È meglio usare cellule coltivate nei giorni 2-3.
3. Preparazione per la registrazione patch-clamp e l'imaging confocale
NOTA: Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio confocale a scansione laser e un amplificatore patch-clamp con registrazione voltage-clamp insieme a un amplificatore lock-in per la registrazione della capacità. Un'immagine confocale del piano XY su un piano Z fisso (scansionefissa XY / Z) è stata utilizzata per visualizzare tutti e tre i segnali fluorescenti contemporaneamente. Il piano Z era focalizzato sul fondo della cellula dove la membrana plasmatica stava aderendo alle coperture.
- Il giorno dell'esperimento patch-clamp e imaging, osserva le cellule al microscopio a fluorescenza. Utilizzare brightfield per assicurarsi che la coltura cellulare non sia contaminata (Figura 1F) e l'epifluorescenza per verificare la corretta espressione della proteina con tag fluorescente.
NOTA: Ad esempio, PH-mNG è espresso sulla membrana plasmatica di ~ 20-30% delle cellule. - Preparare pipette patch da capillari di vetro borosilicato. Per fare questo, tirare le pipette con un estrattore di pipette, rivestire le loro punte con cera liquida e lucidarle con una microforgia (vedere la Tabella dei materiali).
- Accendere l'amplificatore di registrazione patch-clamp e avviare il software di registrazione patch-clamp (vedere la tabella dei materiali). Impostare i parametri appropriati per la registrazione della corrente di calcio e della capacità nel software (vedere la tabella dei materiali).
- Impostare un protocollo di registrazione di 60 s di durata totale, dove la stimolazione inizia a 10 s.
- Impostare il potenziale di tenuta per la registrazione del morsetto di tensione su -80 mV. Impostare una depolarizzazione di 1 s da -80 mV a 10 mV come stimolo per indurre l'afflusso di calcio e il salto di capacità.
- Per le misurazioni della capacità, impostare la frequenza dello stimolo sinusoidale su un intervallo di 1.000-1.500 Hz con una tensione da picco a picco non superiore a 50 mV.
- Salvare il protocollo e creare un nuovo file per la registrazione.
- Accendere il sistema di microscopio confocale e impostare i parametri appropriati nel software (vedere la Tabella dei materiali).
- Accendere i laser, inclusi 458 nm, 514 nm e 633 nm, e impostare l'intervallo di raccolta delle emissioni per ciascun laser in base a ciascuna sonda di fluorescenza come di seguito. FFN511: lunghezza d'onda di eccitazione (EX), 458 nm; lunghezza d'onda di emissione (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
- Utilizzare l'imaging sequenziale per FFN511 e mNG per evitare la diafonia tra queste due sonde. Impostare un timelapse della durata di 1 min per la registrazione delle immagini (Figura 1G).
4. Registrazione patch-clamp e imaging confocale
- Scegli un piatto con un buon stato cellulare e una corretta espressione e aggiungi 2 μL di falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 (10 mM di stock, 1:1.000 soluzione di lavoro) nel mezzo. Rimettere il piatto nell'incubatrice per 20 minuti. In alternativa, caricare FFN511 dopo il passaggio 3.2 ed eseguire i passaggi 3.3-3.5 in attesa di risparmiare tempo.
- Al termine del caricamento di FFN511, preparare la camera di registrazione e aggiungere 2 μL di colorante fluorescente A655 in 500 μL della soluzione da bagno (Figura 2A e Tabella 1). Trasferire il coperchio dal piatto nella camera di registrazione (vedere la tabella dei materiali) con una pinzetta e aggiungere immediatamente la soluzione da bagno contenente A655 (Figura 2B).
NOTA: L'A655 viene mantenuto a -20 °C con concentrazione di 10 mM e la concentrazione di lavoro è di 40 μM.
ATTENZIONE: Indossare guanti per evitare il contatto diretto con la pelle con FFN511 o A655. - Posizionare una goccia di olio (indice di rifrazione: 1,518; vedere la tabella dei materiali) sull'obiettivo di immersione dell'olio 100x (apertura numerica = 1,4). Montare la camera al microscopio e utilizzare la manopola di regolazione per fare in modo che l'olio entri in contatto con il fondo del coperchio, quindi immergere la punta del filo di terra nella soluzione del bagno (Figura 2C, D).
NOTA: Scegliere un olio ad immersione adatto per lavorare a temperatura ambiente. Il passaggio tra l'obiettivo a basso e quello ad alto ingrandimento non è necessario. La temperatura ambiente viene mantenuta intorno ai 20-22 °C durante la registrazione. - Metti a fuoco le cellule e usa l'imaging a campo luminoso e confocale per trovare una buona cellula con espressione mNG. Eseguite lo zoom avanti sulla cella selezionata e regolatela al centro della vista per ridurre al minimo le aree vuote.
NOTA: il disegno schematico dell'etichettatura a fluorescenza è mostrato nella Figura 3A. Una buona cellula di solito ha una membrana liscia e un bordo pulito (Figura 3B). Con l'epifluorescenza o l'imaging confocale, una buona cellula sembra avere un fondo grande e piatto con espressione mNG brillante (Figura 3C).
La dimensione dei pixel è ~ 50 nm, all'interno di un intervallo di ~ 40-80 nm in base alle diverse dimensioni della cella e al fattore di zoom. - Impostare i parametri per l'imaging confocale del piano XY su un piano Z fisso (scansionefissa XY/Z) di FFN511, PH-mNG e A655, con un intervallo di tempo ridotto al minimo. Regolare la messa a fuoco nella parte inferiore della cella con la manopola di regolazione fine.
NOTA: PH-mNG segnala il contorno della membrana plasmatica cellulare alla sezione trasversale confocale del piano XY (ad eccezione del fondo cellulare). Vicino al fondo della membrana cellulare, si possono osservare macchie A655, che riflettono invaginazioni di membrana a forma di Ω o Λ. Se il piano focale Z è inferiore al fondo della cella, l'intensità di tutta la fluorescenza diventerà più debole. - Regolare la potenza del laser di eccitazione nel software per trovare un'impostazione per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore ed evitare significativi sbiancamenti a fluorescenza. Per fare ciò, iniziare con un valore di test iniziale di 2,5 mW di potenza per FFN511 eccitato a 458 nm e 1 mW per mNG eccitato a 514 nm. Per A655 eccitato a 633 nm con un laser HeNe, utilizzare un'elevata potenza laser, ~ 12-15 mW (cioè il 70% -80% del massimo), che, dopo l'eccitazione continua, può sbiancare tutti gli A655 fluorescenti all'interno di un profilo a forma di Ω quando il suo poro è chiuso.
NOTA: se la potenza del laser è troppo elevata, la fluorescenza PH-mNG e FFN511 verrà sbiancata rapidamente. Se la potenza del laser è troppo bassa, i segnali saranno troppo deboli o rumorosi per essere analizzati. - Aggiungere 9 μL di soluzione interna (Tabella 1) in una pipetta patch e collegare la pipetta al supporto nello stadio amplificatore patch-clamp (vedere la Tabella dei materiali).
- Applicare una piccola quantità di pressione positiva con una siringa e spostare la punta della pipetta per toccare la soluzione da bagno con un micromanipolatore. Assicurarsi che l'amplificatore mostri che la resistenza della pipetta è ~ 2-4 MΩ con un test di impulso di tensione. Premere LJ/Auto per annullare la giunzione del liquido.
- Spostare la pipetta verso la cella selezionata con il micromanipolatore. Per formare una modalità collegata alla cella, spostare la punta della pipetta per toccare la cella (la resistenza aumenterà); applicando delicatamente la pressione negativa con la siringa (la resistenza aumenterà a più di 1 GΩ), modificare il potenziale di tenuta da 0 a -80 mV.
- Una volta che la resistenza supera 1 GΩ, attendere ~ 30 s affinché la configurazione si stabilizzi. Premere C-fast/Auto per compensare la capacità veloce.
- Per formare una modalità a cellula intera, applicare una pressione negativa pulsata breve ma potente con la siringa per rompere la membrana (la forma dell'impulso corrente cambia con un condensatore a membrana carico e scaricato). Premere C-slow/Auto per compensare la capacità lenta.
- Regolare leggermente la messa a fuoco dell'immagine per mettere a fuoco il fondo della cella. Avviare contemporaneamente l'imaging timelapse confocale e la registrazione patch-clamp facendo clic contemporaneamente sui pulsanti Start nelle due diverse applicazioni software.
NOTA: il software di imaging confocale crea un filmato ad una velocità di ~20-90 ms/fotogramma. La registrazione patch-clamp include lo stato di riposo per 10 s, la stimolazione di depolarizzazione 1 s e altri 49 s dopo la stimolazione. La configurazione patch-clamp consente la registrazione della corrente di calcio, del salto di capacità e del decadimento indotto dalla depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV (Figura 3D). - Una volta terminata la registrazione, assicurati che i dati vengano salvati. Modificare il potenziale di mantenimento a 0 mV. Spostare la pipetta fuori dalla soluzione del bagno e scartarla.
- Ripetere i passaggi 4.7-4.13 per registrare un'altra cella nel piatto. Dopo 1 ora di registrazione, passare a un altro piatto per la registrazione.
NOTA: dopo 1 ora di registrazione, il tasso di successo della registrazione patch-clamp diminuisce in modo significativo. Per aumentare l'efficienza della raccolta dei dati, si consiglia la registrazione per solo 1 ora in ogni piatto.
5. Analisi dei dati patch-clamp
- Aprire un software appropriato (vedere la Tabella dei materiali) per l'analisi dei dati. Fare clic sul | PPT Carica | file PULSE Pulsanti File per caricare il file .dat. Fai clic su Fallo e quattro tracce verranno tracciate automaticamente in un grafico, incluse le tracce di corrente di calcio e capacità.
- Fare clic sul | Windows Nuovi pulsanti Grafico , scegliere il Pulse_1_1_1, la prima onda in Onda Y e fare clic su Esegui per tracciare il grafico corrente di calcio. Fare clic sul | Windows Pulsanti Nuova tabella , scegliere il Pulse_1_1_1 e fare clic su Esegui per visualizzare i dati grezzi della corrente di calcio, che potrebbero essere utilizzati per tracciare la traccia media di più celle.
- Disegna un quadrato di conseguenza nel grafico della corrente di calcio, fai clic con il pulsante destro del mouse ed espandi il segnale corrente per includere la linea di base e il picco della corrente di calcio. Fai clic su Grafico | Mostra info per mostrare i cursori A e B e spostarli rispettivamente sulla linea di base e sul picco. Le informazioni del grafico saranno mostrate in basso e i parametri possono essere stimati.
- Ripetete il passaggio 5.2, ma scegliete il Pulse_1_1_1_Cm, la seconda ondata in Onda Y, per tracciare la traccia di capacità. Ripetere il passaggio 5.3 e posizionare i cursori A e B nella posizione appropriata per misurare i parametri di capacità, ad esempio la linea di base, l'ampiezza e la velocità di decadimento.
- Copiare i dati grezzi nel passaggio 5.2 in un foglio di calcolo, calcolare l'errore medio e standard della media per un gruppo di celle registrate e tracciare le tracce medie di corrente di calcio e capacità della membrana (Figura 3E) in un software appropriato.
6. Analisi dei dati di imaging confocale
- Aprire i file di imaging grezzi con qualsiasi software fornito dal produttore (vedere la Tabella dei materiali).
NOTA: Alcuni altri programmi gratuiti, come ImageJ o Fiji, potrebbero essere utilizzati per l'elaborazione dei dati e la quantificazione delle immagini ottenute nella sezione 4. - Fai clic su | processo ProcessTools e utilizzare gli strumenti per generare file di media mobile (ad esempio, rolling average per ogni 4 immagini) per ogni immagine timelapse e salvare tali file.
NOTA: Dopo la media mobile, è possibile eseguire un'appropriata regolazione della luminosità e dello sfondo per mostrare meglio i cambiamenti di fluorescenza di tre canali, il che può aiutare a identificare gli eventi di fusione. Controllare l'intensità fluorescente in alcune regioni senza evento di fusione può aiutare a distinguere il segnale fluorescente degli eventi di fusione dai segnali di fondo. - Fai clic sui pulsanti Quantifica | Strumenti | Stack Profile, controlla i timepoint prima e dopo la stimolazione per identificare i cambiamenti di fluorescenza in ciascun canale. Fare clic sul pulsante Disegna ellisse per cerchiare le regioni di interesse (ROI) per gli eventi di fusione. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Salva ROI per salvare i ROI.
NOTA: La dimensione del ROI, che copre tutti e tre i segnali fluorescenti, era simile alla dimensione delle vescicole nelle celle cromaffini24. Per l'analisi sono stati utilizzati dati grezzi, mentre i dati di rolling averageaging che aumentano il rapporto segnale-rumore sono stati forniti per mostrare chiaramente i tre segnali. - Fare clic su Apri progetti per individuare il file raw, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Carica ROI per caricare il file ROI nei file di imaging raw per misurare le intensità di fluorescenza.
NOTA: il segnale fluorescente grezzo verrà utilizzato per tracciare tracce di canali diversi. Per ogni ROI, la linea di base è definita come l'intensità prima della stimolazione e le tracce di intensità possono essere normalizzate alla linea di base. - Fare clic su Strumenti | Ordina i ROI nel software e traccia le tracce per tutti e tre i canali di ciascun ROI. Fare clic su Report per salvare i dati ROI, inclusi i dati digitali e le tracce di imaging per ogni ROI, in una cartella di file.
- Identificare un evento di fusione mediante l'aumento simultaneo dell'intensità della fluorescenza spot PH-mNG (FPH) eA655 (F 655) (all'interno di un singolo fotogramma), accompagnata da una diminuzione della fluorescenza spot FFN511 (FFFN).
- Cerca l'aspetto di FPH e F655, che indica la formazione di spot PH-mNG/A655 a causa di un profilo Ω generato dalla fusione, consentendo la diffusione di PH-mNG dalla membrana plasmatica e la diffusione persistente di A655 dal bagno.
- Cerca la diminuzione di FFFN , che indica il suo rilascio da una vescicola a causa dell'apertura dei pori di fusione ed esclude la possibilità che l'aspetto di FPH e F655 possa derivare dall'invaginazione della membrana causata dall'endocitosi.
- Ispezionare le immaginifisse XY/Z timelapse che mostrano eventi di fusione che si verificano sul fondo della cella. Analizza tre modalità di eventi di fusione: 1) fusione ravvicinata, 2) fusione di permanenza e 3) fusione di restringimento.
NOTA: gli eventi di fusione sono stati osservati raramente prima della depolarizzazione, mentre decine di eventi di fusione potrebbero essere osservati dopo la depolarizzazione. Dopo la fusione, il profilo Ω può chiudere i pori, mantenere i pori aperti o restringersi per fondersi nella membrana plasmatica.- Per identificare la fusione ravvicinata, cercare l'oscuramento F655 perché la chiusura dei pori di fusione impedisce lo scambio del bagno A655, mentre FPH sostiene, riflettendo la continua conversione di PtdIns(4,5)P2 in PtdIns(4)P, o FPH decade con un ritardo, riflettendo il pizzicamento delle vescicole (close-fusion, Figura 4A,B).
- Cerca FPH e F655 sostenuti per identificare la fusione di soggiorno (Figura 4C).
- Cercare diminuzioni parallele di FPH e F655, indicando Ω restringimento del profilo per identificare la fusione di termoretrazione (Figura 4D).
NOTA: controllare i file di imaging originali per ispezionare le tracce di imaging se non sono certi del tipo di evento. Il controllo dell'intensità fluorescente in alcune regioni senza evento di fusione può aiutare a distinguere il segnale fluorescente degli eventi di fusione dai segnali di fondo.
- Traccia tracce rappresentative delle variazioni di intensità per questi tre canali: FFN511, PH-mNG e A655. Quantificare la percentuale di diversi modi di fusione in ogni cella e tracciare le figure.
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Representative Results
Seguendo le procedure sperimentali mostrate in Figura 1 e Figura 2, le cellule cromaffini delle ghiandole surrenali bovine sono state trasfettate con PH-mNG per etichettare la membrana plasmatica; A655 è stato aggiunto alla soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione; e il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 è stato caricato in vescicole per il rilevamento del rilascio. Successivamente, l'imaging timelapse confocale del piano XY di FFN511, PH-mNG e A655 è stato eseguito ogni 20-90 ms sul fondo della cellula (piano focale Z ~ 100-200 nm sopra la membrana cellulare). La registrazione patch-clamp a cellula intera e l'applicazione di una depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV è stata eseguita per evocare eso- ed endocitosi (Figura 3A-C). Questa depolarizzazione ha indotto una corrente di calcio verso l'interno, un salto di capacità che indica l'esocitosi e un decadimento della capacità dopo il salto che indica l'endocitosi (Figura 3D, E).
Con l'imagingfisso timelapse XY/Z sul fondo cellulare, molti eventi di fusione individuali sono stati osservati 8,24 dopo la depolarizzazione (Figura 4A), mentre rari eventi di fusione sono stati osservati prima della depolarizzazione. Gli eventi di fusione indotti dal protocollo di depolarizzazione 1 s sono stati identificati come diminuzione della fluorescenza spot FFN511 (FFFN) che riflette il rilascio di FFN511, accompagnata da FPH e aumento della fluorescenza spotA655 (F 655) che riflette la diffusione di PH-mNG e A655 dalla membrana plasmatica e dalla soluzione del bagno nella vescicola di fusione (il profilo Ω generato dalla fusione)15.
Dopo la fusione, il Ω-profilo generato dalla fusione delle vescicole con la membrana plasmatica può 1) chiudere il suo poro, chiamato fusione ravvicinata, 2) mantenere un poro di fusione aperto, chiamato fusione di soggiorno, o 3) restringersi per fondersi nella membrana plasmatica, chiamata fusione termoretraibile. La fusione ravvicinata è stata identificata come F655 dimming mentre FPH ha sostenuto o decaduto con un ritardo (Figura 4B). La fusione stay-fusion è stata rilevata come presenza sostenuta di spot PH-mNG e A655 (Figura 4C). La fusione termoretraibile è stata rilevata come decadimento parallelo FPH e F655 accompagnato da una riduzione parallela delle dimensioni dello spot PH-mNG e dello spot A655 (Figura 4D)8,15,16,24.
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale. (A, B) Le ghiandole surrenali bovine sono tagliate con forbici per rimuovere il tessuto adiposo (A), lavate con la soluzione di Locke e digerite attraverso la vena surrenale (B). (C) L'interno di una ghiandola surrenale senza digestione (a sinistra) o dopo una corretta digestione (a destra). (D) Dopo essere stati lavati e digeriti, i midollo vengono isolati e tritati in piccoli pezzi e le cellule cromaffini vengono separate dai midollo tritati dopo il filtraggio e la centrifugazione. (E) Le celle cromaffini sono elettroporate e placcate su coverslip per l'incubazione. (F) Nei giorni 2-3, controllare le cellule cromaffini al microscopio prima della sperimentazione. (G) Il campione cellulare è incorporato nella camera per la registrazione patch-clamp e l'imaging confocale. Le variazioni di corrente e capacità del calcio vengono registrate, amplificate e visualizzate sul monitor. I cambiamenti di fluorescenza al momento della stimolazione vengono rilevati e visualizzati sul monitor. Barre di scala = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Patch-clamp e configurazione confocale. (A) Il giorno della sperimentazione, le cellule cromaffini cresciute su coverslip vengono incubate con FFN511 per 20 min. Il colorante A655 viene aggiunto alla soluzione del bagno. (B) Le cellule cromaffini sul coperchio vengono trasferite in una camera di registrazione e la soluzione da bagno con A655 viene aggiunta alla camera. (C) Dopo aver aggiunto una goccia di olio sull'obiettivo di immersione in olio 100x, la camera viene montata sullo stadio di un microscopio confocale invertito. La punta del filo di terra è immersa nella soluzione del bagno. La pipetta viene portata in posizione dopo il caricamento con soluzione di pipetta e tenuta da un supporto per pipetta, che è fissato a un palco di testa. L'headstage è controllato da un micromanipolatore motorizzato. (D) Dopo aver trovato una buona cella, spostare la punta della pipetta nella soluzione da bagno con il micromanipolatore per avviare la registrazione del patch-clamp a cellula intera e l'imaging confocale. Barre di scala = 10 mm (A), 5 mm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Registrazioni a morsetto di tensione a cella intera di correnti di calcio e variazioni di capacità indotte dalla depolarizzazione. (A) Disegno di configurazione delle celle cromaffini durante la registrazione del morsetto di tensione dell'intera cella. La cellula cromaffini è immersa in una soluzione bagnosa contenente A655 (rosso) e la membrana cellulare e le vescicole sono etichettate rispettivamente con PH-mNG (verde) e FFN511 (ciano). Questa immagine è stata modificata con il permesso di 24. (B) Un'immagine rappresentativa di una cellula cromaffini a patch-clamped osservata da brightfield. (C) Immagini rappresentative di PH-mNG (verde), A655 (rosso) e FFN511 (ciano) in una cella con una buona messa a fuoco all'impronta della cella. (D) Un esempio di variazioni di corrente e capacità del calcio indotte dalla depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV. (E) Le tracce medie di correnti di calcio (ICa) e variazioni di capacità (Cm) raccolte da 20 cellule cromaffini. Questa immagine è stata modificata con il permesso di 26. Barre di scala = 5 μm (B, C). Abbreviazioni: ICa = corrente di calcio; Cm = capacità; Depol = depolarizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Visualizzazione degli eventi di fusione al microscopio confocale. (A) Molti punti di fusione possono essere rilevati con l'imaging confocale del piano XY di PH-mNG (verde), A655 (rosso) e FFN511 (ciano) sul fondo della cellula. La fusione è stata evocata da una depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV (depol1s). Le macchie FFN sono state sottoposte a rilascio e fusione ravvicinata (cerchi). Vengono mostrate le immagini prima (-1 s) e dopo (+1 s e +10 s) la depolarizzazione. (B) Un esempio di fusione ravvicinata. (C) Un esempio di stay-fusion. (D) Un esempio di fusione termoretraibile. Questa immagine è stata modificata con il permesso di 24. Barre di scala = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Abbreviazioni: Depol = depolarizzazione; F = intensità fluorescente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Medio/Soluzione | Descrizione | ||
| La soluzione di Locke | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM di glucosio e 10 mM HEPES, pH 7,3, regolato con NaOH | ||
| Soluzione enzimatica | 1,5 mg/mL di collagenasi P, 0,325 mg/mL di inibitore della tripsina e 5 mg/mL di albumina sierica bovina nella soluzione di Locke | ||
| Terreno di coltura | DMEM medio integrato con siero bovino fetale al 10% | ||
| Soluzione interna | 130 mM Cs-glutammato, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP e 0,5 mM GTP, pH 7,2, regolato con CsOH | ||
| Soluzione bagno | 125 mM NaCl, 10 mM glucosio, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl e 20 mM TEA, pH 7,3, regolato con NaOH | ||
Tabella 1: Dettagli riguardanti la composizione del mezzo culturale e le soluzioni.
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Discussion
Viene descritto un metodo di imaging microscopico confocale per rilevare la dinamica del rilascio dei pori di fusione e del trasmettitore, nonché tre modalità di fusione, fusione ravvicinata, fusione di permanenza e fusione di restringimento nelle cellule cromaffini surrenali bovine 4,24. Viene descritto un metodo elettrofisiologico per depolarizzare la cellula e quindi evocare l'eso- e l'endocitosi. L'elaborazione sistematica delle immagini confocali fornisce informazioni sulle diverse modalità di comportamento dei pori per gli eventi di fusione e fissione.
Il monitoraggio simultaneo della corrente di calcio e delle variazioni di capacità nella stessa cella con la configurazione dell'intera cellula fornisce ulteriori informazioni sull'eso- e l'endocitosi, implicando il rapporto tra apertura e chiusura dei pori a livello di cellula intera in un dato momento. Questi metodi sono, in linea di principio, applicabili ad altre cellule eccitabili e cellule eccitabili non elettricamente in coltura primaria o in linee cellulari contenenti vescicole di ~ 200-1.600 nm15. Oltre alle cellule cromaffini, il metodo qui descritto è stato applicato a una linea di beta-cellule pancreatiche di ratto, le cellule INS-14.
In linea di principio, il metodo può essere applicato anche a cellule secretorie contenenti vescicole inferiori a 200 nm. Tuttavia, poiché la dimensione delle vescicole è diminuita, il rapporto segnale-rumore potrebbe essere troppo basso per un rilevamento affidabile. Potrebbe essere necessario l'imaging a super-risoluzione anziché l'imaging confocale. Finora, i metodi qui descritti non sono stati applicati alle sinapsi contenenti vescicole sinaptiche a ~ 40 nm.
Il successo dell'implementazione del metodo qui descritto dipende in modo critico da diversi passaggi generali, come la qualità delle cellule di coltura, l'efficienza di trasfezione del plasmide e il tasso di successo della registrazione elettrofisiologica. In primo luogo, le cellule sane sono vitali sia per la registrazione patch-clamp che per l'imaging confocale. Non è consigliabile utilizzare agenti antibatterici o antifungini durante la coltura perché queste sostanze chimiche possono influenzare l'eccitabilità delle cellule cromaffini. Pertanto, l'esercizio diligente della tecnica sterile e l'uso di mezzi appena preparati sono importanti. Sebbene le cellule cromaffini di coltura primaria possano sopravvivere nei piatti per almeno una settimana25, è importante che i nuovi utenti utilizzino le cellule nei giorni da 2 a 3 per gli esperimenti. Man mano che i fibroblasti crescono gradualmente, diventa più difficile stabilire la configurazione patch-clamp dell'intera cellula. In secondo luogo, l'efficienza di elettroporazione dei plasmidi in cellule cromaffini è di circa il 20-30%. L'efficienza di elettroporazione deve essere ottimizzata se è troppo bassa o la fluorescenza PH-mNG è troppo debole. In terzo luogo, le cellule sono state fotografate sul fondo con un obiettivo di olio 100x per ottenere eventi sostanziali indicati da cambiamenti in tre sonde fluorescenti: FFN511, PH-mNG e A655. Sebbene DIC fornisca una visione più chiara rispetto al campo luminoso o all'imaging ad occhio nudo quando si stabilisce la configurazione dell'intera cella, qualsiasi tecnica di visualizzazione che consenta all'utente di stabilire la configurazione è sufficiente.
Un'adeguata potenza del laser è vitale per l'imaging confocale nelle cellule vive. Poiché FFN511 e mNG possono essere sbiancati da un'elevata potenza laser, è meglio cercare una buona cellula con epifluorescenza prima della visualizzazione con laser confocali. Per A655, è necessaria l'eccitazione laser ad alta potenza per sbiancare il colorante all'interno delle vescicole. Inoltre, il motivo più comune per cui questo esperimento non ha successo è un fallimento della registrazione patch-clamp. Una punta di pipetta pulita e lucida delle dimensioni corrette e la pratica di generare la configurazione dell'intera cella sulle celle cromaffini sono fattori chiave. Sebbene possano essere necessari tempo e sforzi per avere successo, una volta stabiliti, questi esperimenti forniscono dati sostanziali riguardanti sia gli eventi di fusione che di fissione, indicando l'apertura e la chiusura dei pori della membrana a livello di singolo evento.
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato con alcune modifiche per ulteriori obiettivi sperimentali diversi. Tuttavia, indipendentemente dagli obiettivi sperimentali, è consigliabile utilizzare prima una soluzione ad alto contenuto di potassio (come 70 mM KCl) come stimolo per vedere i cambiamenti che la membrana subisce dopo essere stata depolarizzata, assicurando che i cambiamenti di intensità in questi tre coloranti, FFN, PH e A655, possano essere visualizzati. La membrana plasmatica può essere etichettata con altri fluorofori leganti la membrana, come mCLING (gruppo fluoroforo-cisteina-lisina-palmitoil legante la membrana)4,27 o CAAX (un motivo proteico che prende di mira la membrana plasmatica rivestita di citosol tramite isoprenilazione del residuo di cisteina)4,28. A655 può essere sostituito con altri coloranti con spettri diversi, come Atto 532 (A532), a seconda della combinazione di molecole fluorescenti utilizzate in alcuni esperimenti15. Il neuropeptide Y può essere utilizzato al posto dei falsi neurotrasmettitori fluorescenti16.
FFN511 è stato eccitato a 458 nm invece di 405 nm in questo esperimento anche se lo spettro di eccitazione di picco di FFN511 è di circa 405 nm. Lo studio con registrazione della capacità non ha mostrato differenze significative nelle cellule cromaffini con o senza PH-mNG, indicando che la sovraespressione di PH-mNG non influisce sull'esocitosi e sull'endocitosi15,24. Percentuali simili per eventi di fusione sono state verificate in cellule cromaffini marcate solo con PH-mNG e A532 o con FFN511, dimostrando che il caricamento di FFN511 in vescicole di cromaffina non influisce sul rilascio del contenuto e sulle diverse modalità di fusione16. La stimolazione della depolarizzazione 1 s può essere sostituita da una soluzione ad alto contenuto di potassio o da altri patten di depolarizzazione. Queste modifiche possono essere utilizzate per adattarsi a diversi obiettivi sperimentali.
Nonostante i vantaggi di questo potente metodo, ha alcune limitazioni. La più grande limitazione è legata alla risoluzione limitata dalla diffrazione (~ 230 nm) della microscopia confocale, che può essere superata con tecniche di microscopia a super-risoluzione più avanzate29. Il diametro del granulo nelle cellule cromaffini bovine è ~ 300 nm6, rendendo possibile osservare l'apertura e la chiusura dei pori della membrana all'interno della risoluzione spaziale della microscopia confocale. Tuttavia, le vescicole sinaptiche sono ~ 30-60 nm30, che è oltre la risoluzione confocale. L'estensione di queste misurazioni di imaging di cellule vive a piccole vescicole sinaptiche si rivela difficile con l'imaging confocale.
Tecniche di imaging di cellule vive con migliore risoluzione temporale e/o spaziale, come la microscopia STED, la microscopia stocastica a ricostruzione ottica (STORM), la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e la nanoscopia a flussi di fotoni minimi (MINFLUX) sono state sviluppate e possono essere applicate a questo metodo 31,32,33,34 . In effetti, la microscopia STED è stata utilizzata per rivelare la dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini. Le diverse modalità di eventi di fusione e la chiusura preformata a profilo Ω possono essere ulteriormente verificate utilizzando la microscopia a super-risoluzione come la microscopia STED24. Altre limitazioni includono il fotosbiancamento e la citotossicità delle proteine fluorescenti e dei coloranti.
Questa combinazione di elettrofisiologia e microscopia confocale può essere applicata ampiamente a molte cellule secretorie. La combinazione della microscopia a super-risoluzione con i metodi qui descritti sarebbe uno strumento prezioso per misurare la dinamica dei pori di fusione nei circuiti neurali in futuro, a condizione che la microscopia a super-risoluzione si sviluppi a tal punto da poter risolvere il poro di fusione ai terminali nervosi.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo i programmi di ricerca intramurale NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) per aver sostenuto questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C.
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al.
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O'Connor, D. T., et al.
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al.
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
