Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica di imaging confocale per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule cromaffini surrenali bovine. Queste modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione termoretraibile, che coinvolge il restringimento delle vescicole fuse.

Abstract

L'apertura e la chiusura dinamica dei pori di fusione mediano l'esocitosi e l'endocitosi e ne determinano la cinetica. Qui, è dimostrato in dettaglio come la microscopia confocale è stata utilizzata in combinazione con la registrazione patch-clamp per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule surrenali surrenali bovine di coltura primaria. Le tre modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione di restringimento, che comporta il restringimento del profilo a forma di Ω generato dalla fusione fino a quando non si fonde completamente sulla membrana plasmatica.

Per rilevare queste modalità di fusione, la membrana plasmatica è stata etichettata sovraesprimendo mNeonGreen attaccato al dominio PH della fosfolipasi C δ (PH-mNG), che si lega al fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P₂) sul foglietto rivolto verso il citosol della membrana plasmatica; le vescicole sono state caricate con il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 per rilevare il rilascio di contenuto vescicolare; e Atto 655 è stato incluso nella soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione. Queste tre sonde fluorescenti sono state fotografate simultaneamente a ~ 20-90 ms per fotogramma in cellule cromaffini vive per rilevare l'apertura dei pori di fusione, il rilascio di contenuto, la chiusura dei pori di fusione e la fusione dei cambiamenti delle dimensioni delle vescicole. Il metodo di analisi è descritto per distinguere tre modalità di fusione da queste misurazioni di fluorescenza. Il metodo qui descritto può, in linea di principio, applicarsi a molte cellule secretorie oltre le cellule cromaffini.

Introduction

La fusione di membrana media molte funzioni biologiche, tra cui la trasmissione sinaptica, l'omeostasi della glicemia, la risposta immunitaria e l'ingresso virale ^1,2,3. L'esocitosi, che coinvolge la fusione delle vescicole sulla membrana plasmatica, rilascia neurotrasmettitori e ormoni per ottenere molte funzioni importanti, come le attività della rete neuronale. La fusione apre un poro per rilasciare il contenuto vescicolare, dopo di che il poro può chiudersi per recuperare la vescicola di fusione, che è chiamata kiss-and-run ^1,4

Protocol

NOTA: La procedura di utilizzo degli animali ha seguito le linee guida NIH ed è stata approvata dal NIH Animal Care and Use Committee.

1. Coltura cellulare cromaffini bovina

1. Preparare la soluzione di Locke (Tabella 1) e gli strumenti in autoclave 1 giorno prima della coltura cellulare del cromaffinino.
2. Ottenere ghiandole surrenali bovine da un mattatoio locale il giorno della coltura e tenerle immerse nella soluzione ghiacciata di Locke prima della dissezione.
   NOTA: Le ghiandole surrenali sono di 21-27 mesi, sano, Angus nero di entrambi i sessi (principalmente maschio) con peso corpor....

Results

Seguendo le procedure sperimentali mostrate in Figura 1 e Figura 2, le cellule cromaffini delle ghiandole surrenali bovine sono state trasfettate con PH-mNG per etichettare la membrana plasmatica; A655 è stato aggiunto alla soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione; e il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 è stato caricato in vescicole per il rilevamento del rilascio. Successivamente, l'imaging timelapse confocale del piano XY di .......

Discussion

Viene descritto un metodo di imaging microscopico confocale per rilevare la dinamica del rilascio dei pori di fusione e del trasmettitore, nonché tre modalità di fusione, fusione ravvicinata, fusione di permanenza e fusione di restringimento nelle cellule cromaffini surrenali bovine ^4,24. Viene descritto un metodo elettrofisiologico per depolarizzare la cellula e quindi evocare l'eso- e l'endocitosi. L'elaborazione sistematica delle immagini confocali fornisce in.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesio	Sigma	A9187-500MG	ATP per la preparazione della soluzione interna
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Colorante Atto per etichettare la soluzione da bagno
Nucleofector di base per neuroni primari	Lonza	VSPI-1003	Tampone di trasfezione per elettroporazione insieme al kit
Pipetta capillare in vetro Boroscilicate	Warner Strumenti	64-0795	Parete standard con filamento OD=2,0 mm ID=1,16 mm Lunghezza=7,5 cm
Albumina sierica bovina	Sigma	A2153-50G	Reagente per la digestione delle ghiandole
Cloruro di calcio 2 M	Qualità Biologica	351-130-721	Reagente per la preparazione della soluzione del bagno
Filtri cellulari, 100 &; m	Falcon	352360	Materiale per filtrare la sospensione cellulare cromaffini
Soluzione di idrossido di cesio	Sigma	232041	Reagente per la preparazione della soluzione interna e del tampone madre Cs-glutammato/Cs-EGTA
Collagenasi P	Sigma	11213873001	Enzima per la digestione delle ghiandole
Vetrino coprioggetti	Neuvitro	GG-14-Laminina	GG-14-Laminina, diametro 14 mm #1 spessore 60 pezzi Laminina vetrini coprioggetti tedeschi rivestiti
D-(+)-Glucosio	Sigma	G8270-1KG	Reagente per la preparazione di Locke' s soluzione e soluzione per il bagno
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagente per la preparazione del terreno di coltura
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagente per la preparazione del tampone madre Cs-EGTA per la soluzione del bagno
Elettroporazione e Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Trasfetta i plasmidi in cellule
Siero fetale bovino	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagente per la preparazione del terreno di coltura
FFN511	Abcam	ab120331	Falso neurotrasmettitore fluorescente per marcare le vescicole
Guanosina 5'-trifosfato sale sodico idrato	Sigma	G8877-250MG	GTP per la preparazione della soluzione interna
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagente per la preparazione di Locke'
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software per l'analisi patch-clamp e la presentazione dei dati di imaging
Software Leica Application Suite X Software	Leica	LAS X Software	confocale per la raccolta e l'analisi dei dati di imaging
Microscopio a scansione laser confocale Leica TCS SP5 Microscopio	Leica	TCS SP5	per la raccolta
dei dati di imagingAcido L-glutammico	Sigma	49449-100G	Reagente per la preparazione del tampone stock Cs-glutammato per la soluzione del bagno
Amplificatore lock-in	Heka	Software Lock-in	per la registrazione della capacità
Cloruro di magnesio 1 M	Qualità biologica	351-033-721EA	Reagente per la preparazione della soluzione interna e della soluzione per il bagno
Ematocitometro metallizzato Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Camera di conteggio
Microforge	Narishige	MF-830	Pipette polaccate per migliorare la formazione e la stabilità delle guarnizioni giga-ohm Unità
filtro siringa Millex-GP, 0,22 e micro; m	Millipore	SLGPR33RB	Materiale per il lavaggio e la digestione delle ghiandole
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Dima per la costruzione PH-mNeonGreen
Schermo filtrante in rete di nylon 100 micron	EIKO filtrante co	03-100/32	Materiale per la sospensione del midollo filtrante
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplificatore per dati patch-clamp collezione
PH-EGFP	Addgene	Plasmide #51407	Spina dorsale per PH-mNeonGreen
costruzione Estrattore di pipette	Sutter Strumento	P-97	Realizzare pipette per la registrazione patch-clamp
Cloruro di potassio	Sigma	P5404-500G	Reagente per la preparazione di Locke' s e la soluzione per il bagno
Software a impulsi	Heka	Pulse	per la raccolta dei dati patch-clamp
Camera di registrazione	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	camera di vetrino coprioggetti, applicare pipetta patch-clamp su cellule vive
Cloruro di sodio	Sigma	S7653-1KG	Reagente per la preparazione di Locke' soluzione di s, soluzione di bagno e soluzione interna
Idrossido di sodio	Sigma	S5881-500G	Reagente per la preparazione di Locke' s soluzione
Sodio fosfato bibasico	Sigma	S0876-500G	Reagente per la preparazione di Locke' s soluzione
Sodio fosfato monobasico	Sigma	S8282-500G	Reagente per la preparazione di Locke' Piastra
riscaldante di agitazione	Barnsted/Thermolyne	tipo 10100	Riscaldatore per il rivestimento di pipette con cera
Siringa, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Materiale per il lavaggio e la digestione delle ghiandole
Cloruro di tetraetilammonio	Sigma	T2265-100G	TEA per la preparazione della soluzione per il bagno
Inibitore della tripsina	Sigma	T9253-5G	Reagente per la digestione delle ghiandole
Tipo F Liquido da immersione	Leica	195371-10-9	Olio per montaggio confocale Leica