Summary
该协议描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括1）闭合融合（也称为亲吻和运行），涉及融合孔隙开放和闭合，2）停留融合，涉及融合孔隙开放和维持开放孔，以及3）收缩融合，涉及融合囊泡收缩。
Abstract
动态融合孔隙打开和闭合介导胞吐和内吞作用，并确定其动力学。在这里，详细展示了共聚焦显微镜如何与膜片钳记录结合使用，以检测原代培养牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。三种融合模式包括1）紧密融合（也称为亲吻和运行），涉及融合孔隙开放和闭合，2）停留融合，涉及融合孔隙开放并保持开放孔，以及3）收缩融合，涉及融合产生的Ω形轮廓的收缩，直到它在质膜上完全合并。
为了检测这些融合模式，通过过表达mNeonGreen标记质膜，该蛋白与磷脂酶C δ（PH-mNG）的PH结构域连接，其与磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PtdIns（4，5）P2）在质膜的细胞质基质层面小叶处结合;囊泡加载荧光假神经递质FFN511以检测囊泡内容物的释放;并将Atto 655包含在浴液中以检测熔融孔隙闭合。在活嗜铬细胞中以每帧约20-90 ms的速度同时对这三种荧光探针进行成像，以检测融合孔隙开放，含量释放，融合孔闭合和融合囊泡尺寸变化。描述了分析方法以将三种融合模式与这些荧光测量区分开来。原则上，这里描述的方法可以应用于嗜铬细胞以外的许多分泌细胞。
Introduction
膜融合介导许多生物学功能，包括突触传递，血糖稳态，免疫反应和病毒进入1，2，3。胞吐作用涉及质膜处的囊泡融合，释放神经递质和激素以实现许多重要功能，例如神经元网络活动。融合打开一个孔以释放囊泡内容物，之后孔隙可能关闭以取回融合的囊泡，这被称为亲吻和运行1，4。不可逆和可逆的融合孔隙开口都可以通过细胞附着的电容记录与单个囊泡融合的融合孔隙电导记录来测量。
这通常被解释为反映全塌陷融合，涉及融合的扩张，直到融合囊泡变平，以及吻和运行，涉及融合孔隙的开放和闭合，分别为5，6，7，8，9，10，11，12，13.最近在染色质细胞中的共聚焦和受激辐射耗尽（STED）成像研究直接观察到融合孔隙开放和闭合（吻和运行，也称为紧密融合），融合孔隙开放，长时间保持具有开放孔隙的Ω形，称为停留融合，以及融合囊泡的收缩，直到它与质膜完全合并，这取代了完全塌陷融合，用于将融合囊泡与质膜合并4，8，14，15，16，17.
在神经元中，已经通过成像检测到融合孔的开放和闭合，显示预装在大于融合孔的囊泡中的量子点的释放，并且在神经末梢释放面5，18，19处具有融合孔导率测量。肾上腺嗜铬细胞被广泛用作研究外吞和内吞作用的模型20，21。虽然嗜铬细胞含有大的致密核心囊泡，而突触含有小的突触囊泡，但嗜铬细胞和突触中的胞吐作用和内吞作用蛋白非常相似10，11，12，20，21，22，23。
在这里，描述了一种使用共聚焦成像方法结合牛肾上腺嗜铬细胞电生理学来测量这三种融合模式的方法（图1）。该方法涉及将荧光假神经递质（FFN511）加载到囊泡中以检测胞吐作用;在浴液中加入Atto 655（A655）以填充融合产生的Ω形轮廓，并用磷脂酶C δ（PH）的PH结构域标记质膜，该结构域在质膜8，15，24处与PtdIns（4，5）P2结合。聚变孔隙动力学可以通过不同荧光强度的变化来检测。虽然描述了嗜铬细胞，但这里描述的这种方法的原理可以广泛应用于许多分泌细胞，远远超出嗜铬细胞。
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Protocol
注意：动物使用程序遵循NIH指南，并已获得NIH动物护理和使用委员会的批准。
1. 牛嗜铬细胞培养
- 在嗜铬细胞培养前1天准备Locke的溶液（表1）和高压灭菌工具。
- 在培养日从当地的屠宰场获取牛肾上腺，并在解剖前将它们浸没在冰冷的Locke溶液中。
注意：肾上腺来自21-27个月大，健康，黑人安格斯，男女皆宜（主要是男性），体重约为1，400磅（约635公斤）。 - 解剖前准备30mL（用于3个肾上腺）含有胶原酶P，胰蛋白酶抑制剂和牛血清白蛋白（表1）的新鲜酶溶液，并将其保存在室温下。
- 选择3个完整的腺体，表面没有割伤或出血，并用剪刀去除脂肪组织（图1A）。用洛克的溶液灌注来清洗腺体，直到没有血液流出。为了实现这一点，使用30mL注射器通过肾上腺静脉充气腺（图1B），该注射器连接有0.22μm过滤器，根据需要多次25。
注意：通常需要大约150毫升的Locke溶液来清洗3个腺体。 - 为了消化，使用30mL注射器通过肾上腺静脉注射酶溶液，该注射器与0.22μm过滤器连接，直到腺体开始膨胀。然后，将腺体在37°C下放置10分钟。再次注射并将腺体在37°C下再放置10分钟。
注意：需要大约30毫升的酶溶液来消化3个腺体。 - 消化后，用剪刀从静脉纵向切开腺体的另一端以展开腺体（图1C）。通过将白色延髓镊出到含有Locke溶液的10厘米培养皿中来分离延髓。
注意：消化前后腺体内部的比较如图 1C所示。消化和髓质分离的细节先前报告了23，25。 - 用剪刀将延髓切成小块（图1D）。用80-100μm尼龙网过滤延髓悬浮液到烧杯中。然后将滤液转移到50mL锥形管中，在室温下以48× g离心3分钟，减速3。
注意：延髓的切碎通常需要约10分钟。为了获得良好的细胞产量，切碎的碎片必须非常小，直到它们不能被镊子。 - 离心后，除去上清液，并通过移液将细胞沉淀与Locke溶液重悬。用80-100μm过滤器过滤细胞悬浮液，并在室温下以48× g离心3分钟，减速为3。
- 除去上清液并用30ml培养基重悬细胞沉淀（表1）。使用血细胞计数器计数室25确定细胞数。
2. 电穿孔转染
- 将2.8×106 个细胞转移到15 mL管中。通过以48× g 离心2分钟，以3的减速沉淀细胞。向细胞沉淀中加入100μL制造商提供的转染缓冲液（参见 材料表），然后加入2μgPH-mNG质粒。
注意：PH-mNG质粒是通过用PH-EGFP15 中的mNG替换增强的绿色荧光蛋白（EGFP）而产生的（参见 材料表）。 - 通过上下移液溶液轻轻混合悬浮液，并将混合物转移到电穿孔比色皿中，无延迟（图1E）。立即将比色皿转移到电敏器（请参阅 材料表），在屏幕列表中选择O-005程序，然后按 Enter 键进行电穿孔。
注意：准备细胞悬浮液以在细胞培养罩中转染。在混合步骤中，不要将气泡引入悬浮液中。立即继续执行下一步。 - 电穿孔后，立即向比色皿中加入1.8 mL培养基，并与配备无菌尖端的微量滴注器轻轻混合。然后在每个培养皿中盖玻片（见 材料表）的顶部加入300μL电穿孔细胞的悬浮液，总共电镀5-6个培养皿进行一次电穿孔反应。
- 小心地将培养皿转移到37°C的加湿培养箱中，用9%CO2 培养30分钟，并在30分钟后轻轻地向每个培养皿中加入2mL预热培养基。
- 在实验前将转染的细胞在37°C的加湿培养箱中用9%CO2 保存2-3天。
注意：培养的细胞将持续一周。最好在第2-3天使用培养的细胞。
3. 膜片钳记录和共聚焦成像的准备
注：该协议是使用激光扫描共聚焦显微镜和带电压钳位记录的膜片钳放大器以及用于电容记录的锁相放大器执行的。使用固定Z平面（XY / Z固定 扫描）的XY平面共聚焦成像同时对所有三个荧光信号进行成像。Z平面聚焦在细胞底部，质膜附着在盖玻片上。
- 在膜片钳和成像实验当天，在荧光显微镜下观察细胞。使用明场确保细胞培养物未被污染（图1F）和落射荧光以检查荧光标记蛋白的正确表达。
注意：例如，PH-mNG在〜20-30%的细胞的质膜上表达。 - 从硼硅酸盐玻璃毛细管准备贴片移液器。为此，请用移液器拉动移液器，用液体蜡涂覆其尖端，然后用微锻造对其进行抛光（参见 材料表）。
- 打开膜片钳录音放大器并启动膜片钳录音软件（见 材料表）。在软件中设置钙电流和电容记录的适当参数（见 材料表）。
- 设置总共60秒持续时间的记录协议，其中刺激从10秒开始。
- 将电压钳位记录的保持电位设置为-80 mV。设置从 -80 mV 到 10 mV 的 1 s 去极化，作为诱导钙流入和电容跳跃的刺激。
- 对于电容测量，将正弦激励的频率设置为1，000-1，500 Hz的范围，峰峰值电压不超过50 mV。
- 保存协议并创建一个新文件进行录制。
- 打开共聚焦显微镜系统并在软件中设置适当的参数（参见 材料表）。
- 打开激光器，包括458 nm，514 nm和633 nm，并根据每个荧光探针设置每个激光器的发射收集范围，如下所示。FFN511：激发波长（EX），458 nm;发射波长（EM），468-500 nm。mNG： EX， 514 nm;EM， 524-560 nm.A655： EX， 633 nm;EM， 650-700 nm.
- 对 FFN511 和 mNG 使用顺序成像，以避免这两个探头之间的串扰。为图像记录设置1分钟持续时间的延时摄影（图1G）。
4. 膜片钳记录和共聚焦成像
- 选择具有良好细胞状态和适当表达的培养皿，并向培养基中加入2μL荧光假神经递质FFN511（10mM储备，1：1，000工作溶液）。将培养皿放回培养箱中20分钟。或者，在步骤 3.2 后加载 FFN511，并在等待时执行步骤 3.3-3.5 以节省时间。
- FFN511上样完成后，制备记录室，并将2μL荧光染料A655加入500μL浴液中（图2A 和 表1）。用镊子将盖玻片从培养皿转移到记录室（见 材料表），并立即加入含A655的浴液（图2B）。
注意：A655保持在-20°C，浓度为10 mM，工作浓度为40 μM。
注意：戴上手套，避免皮肤直接接触FFN511或A655。 - 在100x油浸物镜上滴一滴油（折射率：1.518;参见 材料表）（数值孔径= 1.4）。将腔室安装在显微镜中，并使用调节旋钮使油刚好接触盖玻片的底部，然后将地丝尖端浸入浴槽溶液中（图2C，D）。
注：选择适合在室温下工作的浸入式油。无需在低倍率和高倍率镜头之间切换。在记录过程中，室温保持在20-22°C左右。 - 将细胞聚焦，并使用明场和共聚焦成像来找到具有mNG表达的良好细胞。放大所选单元格并将其调整到视图中心以最小化空白区域。
注：荧光标记示意图如图 3A所示。一个好的细胞通常具有光滑的膜和干净的边缘（图3B）。通过落射荧光或共聚焦成像，良好的细胞似乎具有具有明亮mNG表达的大而平坦的底部（图3C）。
像素大小为~50 nm，根据不同的像元大小和变焦系数，在~40-80 nm的范围内。 - 在 FFN511、PH-mNG 和 A655 的固定 Z 平面（XY/Z固定 扫描）上设置 XY 平面共聚焦成像的参数，并最大限度地缩短时间间隔。使用微调旋钮将焦点调整到单元格的底部。
注意：PH-mNG在共聚焦XY平面交叉切口处（细胞底部除外）处发出细胞质膜轮廓的信号。在细胞膜底部附近，可以观察到A655斑点，其反映了Ω形或Λ形膜侵入。如果Z焦平面低于细胞底部，则所有荧光的强度将变弱。 - 在软件中调整激发激光功率，找到一个设置，以获得最佳的信噪比，并避免明显的荧光漂白。为此，首先，对于在458 nm处激发的FFN511，从2.5 mW功率的初始测试值开始，对于在514 nm处激发的mNG，初始测试值为1 mW。对于用HeNe激光器在633nm处激发的A655，请使用高激光功率，〜12-15 mW（即最大值的70%-80%），在连续激发时，当其孔隙关闭时，可以漂白Ω形轮廓内的所有荧光A655。
注意：如果激光功率太高，PH-mNG和FFN511荧光将被快速漂白。如果激光功率太低，信号将太弱或噪声太大，无法进行分析。 - 将9μL内部溶液（表1）加入贴片移液器中，并将移液器连接到膜片钳放大器级中的支架上（参见 材料表）。
- 用注射器施加少量正压，并移动移液器尖端以用显微操纵器触摸浴液溶液。通过电压脉冲测试，确保放大器显示移液器电阻约为2-4 MΩ。按 LJ/自动 取消液体液络部。
- 使用显微操作器将移液器向所选细胞移动。要形成细胞附着模式，请移动移液器尖端以接触细胞（阻力将增加）;用注射器轻轻施加负压（电阻将增加到1 GΩ以上），将保持电位从0更改为-80 mV。
- 一旦电阻超过1 GΩ，请等待~30秒，以使配置稳定下来。按 C-快速/自动 以补偿快速电容。
- 要形成全电池模式，用注射器施加脉冲短而强大的负压以破坏膜（电流脉冲的形状随带电和放电膜电容器而变化）。按 C 慢/自动 以补偿慢速电容。
- 稍微调整成像焦点以聚焦在细胞底部。通过同时单击两个不同软件应用程序中的“开始”按钮，同时 启动 共聚焦延时成像和膜片钳记录。
注：共聚焦成像软件以~20-90 ms/帧的速率制作电影。膜片钳记录包括静息状态10秒，去极化刺激1秒，刺激后另外49秒。膜片钳配置允许记录钙电流、电容跳跃以及从 -80 至 +10 mV 的 1 s 去极化引起的衰减（图 3D）。 - 录制完成后，请确保保存数据。将保持电位改回0 mV。将移液器移出浴液并丢弃。
- 重复步骤4.7-4.13以记录培养皿中的另一个细胞。记录1小时后，换到另一个盘子进行记录。
注意：记录1小时后，膜片钳记录的成功率显着降低。为了提高数据收集的效率，建议每道菜仅记录1小时。
5. 膜片钳数据分析
- 打开适当的软件（见 材料表）进行数据分析。点击 PPT|加载脉冲文件|用于 加载.dat文件的文件按钮。单击 “执行” ，四条迹线将自动绘制在一个图形中，包括钙电流和电容迹线。
- 单击 窗口|新建“图形 ”按钮，选择Pulse_1_1_1，即 Y Wave 中的第一波，然后单击“ 执行 ”以绘制钙电流图。单击 窗口|新建“表 ”按钮，选择Pulse_1_1_1，然后单击“ 执行 ”以显示钙电流的原始数据，这些数据可用于绘制多个细胞的平均迹线。
- 在钙电流图中相应地绘制一个正方形， 右键单击 并 展开 电流信号以包括基线和钙电流峰值。点击 图表|“显示信息” 以显示光标 A 和 B，并分别将它们移动到基线和峰值。图形信息将显示在底部，并且可以估计参数。
- 重复步骤5.2，但选择Pulse_1_1_1_Cm，即Y波中的第二波，以绘制电容迹线。重复步骤5.3，将A和B光标放在适当的位置，以测量电容参数，如基线、振幅和衰减率。
- 将步骤5.2中的原始数据复制到电子表格中，计算一组记录的细胞的平均值和标准误差，并在适当的软件中绘制钙电流和膜电容的平均痕量（图3E）。
6. 共聚焦成像数据分析
- 使用制造商提供的任何软件打开原始映像文件（请参阅 材料表）。
注意：其他一些免费程序，如ImageJ或Fiji，可用于数据处理和量化第4节中获得的图像。 - 单击“ 进程|”ProcessTools 并使用工具为每个延时图像生成滚动平均值（例如，每4个图像的滚动平均值）文件并保存这些文件。
注意：在滚动平均值之后，可以对亮度和背景进行适当的调整，以更好地显示三个通道的荧光变化，这可能有助于识别聚变事件。在没有聚变事件的某些区域检查荧光强度可能有助于区分聚变事件的荧光信号和背景信号。 - 单击量化|按钮 工具|堆栈配置文件，检查刺激前后的时间点，以识别每个通道中的荧光变化。单击 绘制椭圆 按钮以圈出融合事件的感兴趣区域 （ROI）。 右键单击 图像，然后单击 保存 ROI 以保存 ROI。
注意：ROI的大小，涵盖所有三个荧光信号，与嗜铬细胞24中的囊泡大小相似。使用原始数据进行分析，同时提供增加信噪比的滚动平均数据，以清楚地显示三个信号。 - 单击 “打开项目 ”找到原始文件， 右键单击 图像，然后单击“ 加载 ROI ”以在原始成像文件中加载 ROI 文件以测量荧光强度。
注意：原始荧光信号将用于绘制不同通道的迹线。对于每个ROI，基线被定义为刺激前的强度，强度迹线可以归一化为基线。 - 单击 “工具”|在软件中对投资回报率进行排序 ，并绘制每个投资回报率所有三个通道的迹线。单击“ 报告 ”将 ROI 数据（包括数字数据和每个 ROI 的成像跟踪）保存到文件夹中。
- 通过PH-mNG（FPH）和A655（F 655）点荧光（在单个帧内）强度的同时增加来识别融合事件，同时FFN511点荧光（FFFN）的降低。
- 寻找FPH 和F655的外观，这表明由于融合产生的Ω轮廓而形成PH-mNG / A655斑点，允许PH-mNG从质膜扩散，A655从浴中持续扩散。
- 寻找FFN 降低，这表明其由于融合孔隙张开而从囊泡中释放出来，并排除了 FPH 和 F655 外观可能由内吞作用引起的膜内侵的可能性。
- 检查显示细胞底部发生的融合事件的延时XY / Z固定 图像。分析融合事件的三种模式：1）紧密融合，2）停留融合，3）收缩融合。
注：在去极化之前很少观察到聚变事件，而在去极化之后可以观察到数十个聚变事件。融合后，Ω轮廓可能关闭其孔隙，保持其开放孔，或收缩以合并到质膜中。- 为了识别紧密融合，请寻找调暗的F655 ，因为融合孔闭合阻止了浴A655的交换，而FPH 持续存在，反映了PtdIns（4，5）P2 持续转化为PtdIns（4）P，或者FPH 延迟衰减，反映囊泡夹断（闭合融合， 图4A，B）。
- 寻找持续的FPH 和F655 以确定停留融合（图4C）。
- 寻找FPH 和F655的平行下降，表明Ω轮廓收缩以确定收缩融合（图4D）。
注：如果不确定事件类型，请检查原始映像文件以检查映像跟踪。在没有聚变事件的某些区域检查荧光强度可能有助于将聚变事件的荧光信号与背景信号区分开来。
- 绘制以下三个通道的强度变化的代表性迹线：FFN511，PH-mNG和A655。量化每个单元中不同融合模式的百分比并绘制数字。
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Representative Results
按照图1和图2所示的实验程序，用PH-mNG转染来自牛肾上腺的嗜铬细胞以标记质膜;将A655加入到熔池溶液中以检测熔融孔隙闭合;并将荧光假神经递质FFN511加载到囊泡中以检测释放。接下来，在细胞底部（Z焦平面~细胞膜上方约100-200nm）每20-90 ms对FFN511，PH-mNG和A655进行XY平面共聚焦延时成像。进行全细胞膜片钳记录和应用从-80至+ 10 mV的1s去极化以唤起外吞和内吞作用（图3A-C）。这种去极化诱导了向内钙电流，表明胞吐的电容跳跃，以及表明内吞作用的跳跃后的电容衰减（图3D，E）。
在细胞底部进行延时XY / Z固定成像，在去极化后观察到许多单独的融合事件8，24（图4A），而在去极化之前观察到罕见的融合事件。1 s去极化方案诱导的融合事件被鉴定为FFN511点荧光（FFFN）减少，反映FFN511释放，伴有FPH和A655点荧光（F655）增加，反映PH-mNG和A655扩散从质膜和浴液进入熔融囊泡（融合产生的Ω谱）15。
融合后，囊泡与质膜融合产生的Ω谱可能1）闭合其孔隙，称为紧密融合，2）保持开放的融合孔，称为停留融合，或3）收缩以合并到质膜中，称为收缩融合。紧密融合被确定为F655 变暗，而FPH 持续或衰减延迟（图4B）。检测到停留融合为PH-mNG和A655斑点的持续存在（图4C）。收缩融合被检测为平行的FPH 和F655 衰变，伴随着PH-mNG光斑和A655光斑的平行尺寸减小（图4D）8，15，16，24。
图1：实验方案的示意图（A，B）用剪刀修剪牛肾上腺以去除脂肪组织（A），用Locke的溶液冲洗，并通过肾上腺静脉消化（B）。（C）没有消化的肾上腺内部（左）或经过适当消化（右）。（四）洗涤消化后，将延髓分离并切成小块，过滤离心后将嗜铬细胞从切碎的延髓中分离出来。（E）将嗜铬细胞电穿孔并接种在盖玻片上进行孵育。（F）在第2-3天，在显微镜下检查嗜铬细胞，然后进行实验。（G）将细胞样品嵌入腔室中以进行膜片钳记录和共聚焦成像。记录、放大钙电流和电容变化，并将其显示在监视器上。检测刺激时的荧光变化并显示在监视器上。比例尺 = 40 毫米 （A），20 毫米 （B-D），20 微米 （F）。请点击此处查看此图的大图。
图2：膜片钳和共聚焦设置。（A）在实验当天，在盖玻片上生长的嗜铬细胞与FFN511一起孵育20分钟。将染料A655加入到浴液中。（B）将盖玻片上的嗜铬细胞转移到记录室中，并将带有A655的浴液加入到室中。（C）在100x油浸物镜上加入一滴油后，将腔室安装在倒置共聚焦显微镜的载物台上。地线的尖端浸入浴液中。移液器在装入移液器溶液后进入到位，并由连接到头台的移液器支架固定。头部舞台由电动显微操纵器控制。（D）找到好细胞后，用显微操作器将移液器尖端移入浴液中，开始全细胞膜片钳记录和共聚焦成像。比例尺 = 10 毫米 （A）， 5 毫米 （B）。请点击此处查看此图的大图。
图3：去极化引起的钙电流和电容变化的全电池电压钳位记录。 （A）全电池电压钳位记录期间嗜铬细胞的设置图。将嗜铬细胞浸入含A655的浴液（红色）中，细胞膜和囊泡分别用PH-mNG（绿色）和FFN511（青色）标记。此图像已在 24的许可下进行了修改。（B）明场观察到的膜片钳染色质细胞的代表性图像。（C）PH-mNG（绿色），A655（红色）和FFN511（青色）在细胞足迹处具有良好焦点的细胞中的代表性图像。（D） 从 -80 至 +10 mV 的 1 s 去极化引起的钙电流和电容变化的一个例子。（E）从20个嗜铬细胞收集的钙电流（ICa）和电容（Cm）变化的平均痕量。此图像已在 26的许可下进行了修改。比例尺 = 5 μm （B， C）。缩写：ICa =钙电流;Cm = 电容;Depol = 去极化。 请点击此处查看此图的大图。
图4：共聚焦显微镜下融合事件的可视化。（A）通过细胞底部PH-mNG（绿色），A655（红色）和FFN511（青色）的共聚焦XY平面成像可以检测到许多融合点。聚变是通过从-80到+10 mV（去极化1s）的1 s去极化引起的。FFN斑点经历释放和紧密融合（圆圈）。显示去极化之前（-1 s）和之后（+1 s和+10 s）的图像。（B） 紧密融合的一个例子。（C） 停留融合的一个例子。（D） 收缩融合的一个例子。此图像已在24的许可下进行了修改。比例尺 = 1 μm （A）， 0.5 μm （B-D）。缩写：Depol = 去极化;F = 荧光强度。请点击此处查看此图的大图。
| 介质/溶液 | 描述 | ||
| 洛克的解决方案 | 145 mM NaCl，5.4 mM KCl，2.2 mM Na2HPO4，0.9 mM NaH2PO4，5.6 mM葡萄糖和10 mM HEPES，pH 7.3，用NaOH调节 | ||
| 酶溶液 | 洛克溶液中的 1.5 mg/mL 胶原酶 P、0.325 mg/mL 胰蛋白酶抑制剂和 5 mg/mL 牛血清白蛋白 | ||
| 培养基 | 补充10%胎牛血清的DMEM培养基 | ||
| 内部解决方案 | 130 mM Cs-谷氨酸盐，0.5 mM Cs-EGTA，12 mM NaCl，30 mM HEPES，1 mM MgCl2，2 mM ATP和0.5 mM GTP，pH 7.2，用CsOH调节 | ||
| 沐浴液 | 125 mM 氯化钠，10 mM 葡萄糖，10 mM HEPES，5 mM CaCl2，1 mM MgCl2，4.5 mM KCl 和 20 mM TEA，pH 7.3，用 NaOH 调节 | ||
表 1： 有关培养基和溶液成分的详细信息。
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Discussion
描述了一种共聚焦显微成像方法，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中融合孔隙和递质释放的动力学，以及三种融合模式，即紧密融合，停留融合和收缩融合4，24。描述了一种电生理学方法，用于使细胞去极化，从而唤起外吞和内吞作用。系统共聚焦图像处理提供有关聚变和裂变事件的不同孔隙行为模式的信息。
同时监测具有全细胞结构的同一细胞的钙电流和电容变化提供了有关外吞和内吞作用的额外信息，这意味着在任何给定时间全细胞水平上的孔隙打开和闭合比例。原则上，这些方法适用于原代培养物中的其它可兴奋细胞和非电激发细胞或含有~200-1，600nm15囊泡的细胞系。除了嗜铬细胞外，这里描述的方法已经应用于大鼠胰腺β细胞系，INS-1细胞4。
原则上，该方法也可以应用于含有小于200nm的囊泡的分泌细胞。然而，随着囊泡大小的减小，信噪比可能太低，无法进行可靠的检测。可能需要超分辨率成像而不是共聚焦成像。到目前为止，这里描述的方法尚未应用于含有~40nm突触囊泡的突触。
这里描述的方法的成功实施主要取决于几个一般步骤，例如培养细胞质量，质粒转染效率和电生理学记录成功率。首先，健康细胞对于膜片钳记录和共聚焦成像都至关重要。不建议在培养过程中使用抗菌或抗真菌剂，因为这些化学物质可能会影响嗜铬细胞的兴奋性。因此，勤勉地练习无菌技术和使用新鲜制备的培养基是很重要的。虽然原代培养嗜铬细胞可以在培养皿中存活至少一周25，但对于新用户来说，在第2至3天使用细胞进行实验非常重要。随着成纤维细胞逐渐生长，建立全细胞膜片钳配置变得更加困难。其次，质粒进入嗜铬细胞的电穿孔效率约为20-30%。如果电穿孔效率太低或PH-mNG荧光太暗，则需要优化电穿孔效率。第三，用100倍的油物镜对细胞的底部进行成像，以获得由三种荧光探针的变化所指示的大量事件：FFN511，PH-mNG和A655。虽然在建立全电池配置时，DIC提供了比明场或裸眼成像更清晰的视野，但任何允许用户建立配置的可视化技术都足够了。
适当的激光功率强度对于活细胞的共聚焦成像至关重要。由于FFN511和mNG可能被高激光功率漂白，因此最好在使用共聚焦激光进行可视化之前寻找具有落射荧光的良好细胞。对于A655，需要高功率激光激发来漂白囊泡内的染料。此外，该实验不成功的最常见原因是膜片钳记录失败。适当尺寸的清洁和抛光的移液器吸头以及在嗜铬细胞上产生全细胞配置的实践是关键因素。虽然成功可能需要一些时间和精力，但一旦建立，这些实验就提供了有关聚变和裂变事件的大量数据，表明膜孔在单个事件水平上开放和闭合。
这里描述的协议可以与一些修改一起使用，以进一步不同的实验目标。然而，无论实验目标如何，建议首先使用高钾溶液（如70mM KCl）作为刺激物，以查看膜在去极化时发生的变化，从而确保FFN，PH和A655这三种染料的强度变化可以可视化。质膜可以用其他膜结合荧光团标记，例如mCLING（膜结合荧光团 - 半胱氨酸 - 赖氨酸 - 棕榈酰基团）4，27 或CAAX（通过半胱氨酸残基异戊二烯化靶向细胞质基质基的蛋白质基序）4，28。A655可以用具有不同光谱的其他染料代替，例如Atto 532（A532），这取决于某些实验中使用的荧光分子的组合15。可以使用荧光染料Y代替荧光假神经递质16。
在本实验中，FFN511在458 nm而不是405 nm处激发，即使FFN511的峰值激发光谱约为405 nm。具有电容记录的研究表明，伴或不伴PH-mNG的嗜铬细胞无显着差异，表明PH-mNG的过表达不影响胞吐和内吞作用15，24。在仅用PH-mNG和A532或FFN511标记的嗜铬细胞中验证了融合事件的相似百分比，表明将FFN511加载到嗜铬囊泡中不影响含量释放和不同的融合模式16。1 s的去极化刺激可以用高钾溶液或其他去极化模式代替。这些修改可用于适应不同的实验目的。
尽管这种强大的方法具有优点，但它有一些局限性。最大的限制与共聚焦显微镜的衍射极限分辨率（~230nm）有关，这可以通过更先进的超分辨率显微镜技术来克服29。牛嗜铬细胞中的颗粒直径约为300 nm6，使得在共聚焦显微镜的空间分辨率内观察膜孔隙的开闭成为可能。然而，突触囊泡约为30-60nm30，这超出了共聚焦分辨率。将这些活细胞成像测量扩展到小突触囊泡被证明是共聚焦成像的困难。
已经开发了具有更好时间和/或空间分辨率的活细胞成像技术，例如STED显微镜，随机光学重建显微镜（STORM），光活化定位显微镜（PALM），全内反射荧光（TIRF）显微镜和最小光子通量（MINFLUX）纳米镜检查，并且可以应用于该方法31，32，33，34.事实上，STED显微镜已被用于揭示嗜铬细胞中的融合孔隙动力学。融合事件的不同模式和预成型的Ω剖面闭合可以使用超分辨率显微镜（如STED显微镜24）进一步验证。其他限制包括荧光蛋白和染料的光漂白和细胞毒性。
电生理学和共聚焦显微镜的这种组合可以广泛应用于许多分泌细胞。超分辨率显微镜与此处描述的方法相结合，将成为未来测量神经回路中融合孔隙动力学的宝贵工具，前提是超分辨率显微镜将发展到可以解析神经末梢融合孔的程度。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢NINDS校内研究计划（ZIA NS003009-13和ZIA NS003105-08）支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
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