Summary
このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。
Abstract
動的融合細孔開閉は、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを媒介し、それらの動態を決定する。ここでは、共焦点顕微鏡をパッチクランプ記録と組み合わせて使用して、初代培養ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出する方法を詳細に実証する。3つの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う密閉核(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口と開いた細孔の維持を含むステイ融合、3)核融合によって生成されたΩ形プロファイルの収縮を伴う蠕動融着が含まれる原形膜で完全に融合する。
これらの融合モードを検出するために、原形質膜を標識し、原形質膜の細胞質ゾル対向小葉においてホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸(PtdIns(4,5)P2)に結合するホスホリパーゼC δ(PH-mNG)のPHドメインと結合するmNeonGreenを過剰発現させた。小胞に蛍光偽神経伝達物質FFN511をロードして、小胞内容物放出を検出した。Atto 655を融合孔閉鎖を検出するために浴液に含ませた。これら3つの蛍光プローブを生クロマフィン細胞で1フレームあたり約20〜90ミリ秒で同時に画像化し、融合孔開口、内容物放出、融合細孔閉鎖、および融合小胞サイズ変化を検出した。分析方法は、これらの蛍光測定から3つの融合モードを区別するために説明されています。ここで説明する方法は、原則として、クロマフィン細胞以外の多くの分泌細胞に適用することができる。
Introduction
膜融合は、シナプス伝達、血糖恒常性、免疫応答、およびウイルス侵入を含む多くの生物学的機能を媒介する1,2,3。原形質膜での小胞融合を伴うエキソサイトーシスは、神経伝達物質およびホルモンを放出し、ニューロンネットワーク活動などの多くの重要な機能を達成する。融合は、小胞内容物を放出するために細孔を開き、その後、細孔が融合小胞を取り出すために閉じ得る、これはキスアンドラン1,4と呼ばれる。不可逆的および可逆的な融合孔開口の両方は、単一小胞融合の融合細孔コンダクタンス記録と組み合わせた細胞付着容量記録で測定することができる。
これはしばしば、融合小胞の平坦化までの融合の拡張を伴う完全崩壊融合、および融合孔の開閉を伴うキスアンドランを反映していると解釈され、それぞれ5、6、7、8、9、10、11、12、13.クロマフィン細胞における最近の共焦点および誘導放出枯渇(STED)イメージング研究は、融合孔の開閉(キスアンドラン、クローズフュージョンとも呼ばれる)、ステーフュージョンと呼ばれる、長期間にわたって開いた細孔でΩ形状を維持する融合ポア開口部、および原形質膜と完全に融合するまでの融合小胞の収縮、原形質膜と融合小胞を融合させるための完全崩壊融合を置き換える4、 8,14,15,16,17。
ニューロンにおいて、融合細孔の開閉は、融合孔よりも大きい小胞に予め装填された量子ドットの放出を示す画像化および神経終末の放出面における融合細孔コンダクタンス測定5、18、19によって検出されている。副腎クロマフィン細胞は、外細胞症およびエンドサイトーシスの研究のためのモデルとして広く使用されている20,21。クロマフィン細胞は大きな緻密なコア小胞を含むが、シナプスは小さなシナプス小胞を含むが、クロマフィン細胞およびシナプスにおけるエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスタンパク質は、10、11、12、20、21、22、23と非常に類似している。
ここでは、ウシ副腎クロマフィン細胞における電気生理学と組み合わせた共焦点イメージング法を用いてこれら3つの融合モードを測定する方法について説明する(図1)。この方法は、エキソサイトーシスを検出するために小胞に蛍光偽神経伝達物質(FFN511)をロードすることを含む。Atto 655(A655)を浴液に添加して融合生成したΩ形プロファイルを充填し、原形質膜8、15、24でPtdIns(4,5)P2に結合するホスホリパーゼC δ(PH)のPHドメインで原形質膜を標識する。融合細孔ダイナミクスは、異なる蛍光強度の変化によって検出することができる。クロマフィン細胞について記載されているが、ここで説明するこの方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。
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Protocol
注:動物の使用手順はNIHのガイドラインに従い、NIH動物愛護および使用委員会によって承認されました。
1. ウシクロマフィン細胞培養
- クロマフィン細胞培養の1日前にロックの溶液(表1)とオートクレーブツールを調製する。
- 培養日に地元の食肉処理場からウシ副腎を入手し、解剖前に氷冷したロックの溶液に沈めておく。
注:副腎は、体重が約1,400ポンド(〜635 kg)の21〜27ヶ月の生後21〜27ヶ月の健康な黒いアンガス(主に男性)です。 - 解剖前にコラゲナーゼP、トリプシン阻害剤、ウシ血清アルブミン(表1)を含む新鮮な酵素液30mL(副腎3本分)を調製し、室温で保存する。
- 表面に切り傷や出血のない無傷の腺を3つ選択し、脂肪組織をはさみで除去します(図1A)。血液が出なくなるまでロックの溶液で灌流して腺を洗う。これを達成するには、0.22 μmフィルターを取り付けた30 mLシリンジを必要な回数だけ使用して、副腎静脈を通って腺を膨らませます(図1B)。
注:通常、3つの腺を洗浄するには約150mLのロックの溶液が必要です。 - 消化のために、腺が腫れ始めるまで、0.22μmフィルターを取り付けた30mLシリンジを使用して副腎静脈を通して酵素溶液を注入する。その後、腺を37°Cで10分間放置する。もう一度注射し、腺を37°Cでさらに10分間放置する。
注:3つの腺を消化するには、約30mLの酵素溶液が必要です。 - 消化後、はさみで腺を静脈からもう一方の端まで縦に切断し、腺を広げます(図1C)。白い髄質をロックの溶液を含む10cmのペトリ皿にピンセットでつまんで髄質を分離します。
注:消化前後の腺の内部の比較を 図1Cに示す。消化および髄質単離の詳細は、以前に報告されている23、25。 - 髄質をハサミで細かく切って細かく刻みます(図1D)。髄質懸濁液を80〜100μmのナイロンメッシュでビーカーにろ過する。次いで、濾液を50mL円錐管に移し、48× gで遠心分離を行い、室温、3の減速で3分間行う。
注:髄質のミンチには通常〜10分かかります。細胞の良好な収量を得るためには、ピンセットでつまむことができないまで、ミンチ片は非常に小さくなければならない。 - 遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより細胞ペレットをロック溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を80〜100μmのストレーナーで濾過し、48 x g、室温で、3の減速で3分間遠心分離する。
- 上清を除去し、細胞ペレットを30mlの培養液で再懸濁した(表1)。計数チャンバ25の血球計を用いて細胞数を決定する。
2. エレクトロポレーションによるトランスフェクション
- 106個×2.8個を15mLチューブに移す。3の減速で48×gで2分間遠心分離することによって細胞をペレット化する。製造元から提供されたトランスフェクションバッファー 100 μL (材料表を参照) を細胞ペレットに加え、2 μg の PH-mNG プラスミドを追加します。
注:PH-EGFP15 において、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)をmNGで置換することによって、PH-mNGプラスミドを作成した( 材料表を参照)。 - 溶液を上下にピペッティングして懸濁液を穏やかに混合し、混合物を遅滞なくエレクトロポレーションキュベットに移す(図1E)。すぐにキュベットをエレクトロポレーターに移し( 材料表を参照)、画面リストでO-005プログラムを選択し、 Enter キーを押してエレクトロポレーションを実行します。
注: 細胞培養フードにトランスフェクション用の細胞懸濁液を準備します。混合工程中に懸濁液に気泡を導入しないでください。遅滞なく次のステップに進みます。 - エレクトロポレーション後、直ちに1.8mLの培地をキュベットに加え、滅菌チップを備えたマイクロピペッターで穏やかに混合する。次いで、各ディッシュのカバースリップ( 材料表を参照)の上にエレクトロポレーションされた細胞の懸濁液300μLを加え、合計5〜6個のディッシュを1回のエレクトロポレーション反応のためにメッキする。
- ディッシュを9%CO2 で37°Cの加湿インキュベーターに30分間慎重に移し、30分後に2mLの予備加温培地を各ディッシュに静かに加える。
- トランスフェクトした細胞を加湿インキュベーター内で、実験前に9%CO2で37 °Cに保ち、2〜3日間保管する。
注:培養細胞は1週間続きます。2〜3日目に培養細胞を使用するのが最善です。
3. パッチクランプ記録と共焦点イメージングの準備
メモ:このプロトコルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡と電圧クランプ記録付きパッチクランプアンプ、静電容量記録用のロックインアンプで実行されました。固定Z面でのXY平面共焦点イメージング(XY/Z固定 スキャン)を用いて、3つの蛍光シグナルすべてを同時に撮像した。Z面は、原形質膜がカバースリップに接着している細胞底部に集束した。
- パッチクランプおよびイメージング実験の日に、蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。明視野を使用して細胞培養物が汚染されていないことを確認し(図1F)、蛍光標識タンパク質の適切な発現を確認します。
注:例えば、PH−mNGは、細胞の〜20〜30%の原形質膜で発現される。 - ホウケイ酸ガラス毛細血管からパッチピペットを準備する。これを行うには、ピペットプーラーでピペットを引っ張り、先端を液体ワックスでコーティングし、マイクロフォージで研磨します( 材料表を参照)。
- パッチクランプ記録アンプの電源を入れ、パッチクランプ記録ソフトウェアを起動します( 資料表を参照)。ソフトウェアでカルシウム電流と静電容量の記録に適切なパラメータを設定します( 材料表を参照)。
- 合計で60秒の時間の記録プロトコルを設定し、刺激は10秒から始まります。
- 電圧クランプ記録の保持電位を-80mVに設定します。-80 mV~10 mVの1 sの分極解除を刺激として設定し、カルシウム流入と静電容量ジャンプを誘導します。
- 静電容量測定の場合は、正弦波刺激の周波数を1,000~1,500Hzの範囲に設定し、ピークtoピーク電圧を50mV以下に設定します。
- プロトコルを保存し、記録用の新しいファイルを作成します。
- 共焦点顕微鏡システムの電源を入れ、ソフトウェアで適切なパラメータを設定します( 材料表を参照)。
- 458nm、514nm、633nmなどのレーザーをオンにし、各蛍光プローブに従ってレーザーごとの発光収集範囲を以下のように設定します。FFN511:励起波長(EX)、458nm;発光波長(EM)、468〜500nm。mNG: EX, 514 nm;EM、524-560 nm。A655: EX, 633 nm;EM、650-700 nm。
- FFN511とmNGのシーケンシャルイメージングを使用して、これら2つのプローブ間のクロストークを回避します。画像記録のタイムラプスを1分に設定します(図1G)。
4. パッチクランプ記録と共焦点イメージング
- 良好な細胞状態および適切な発現を有するディッシュを選択し、2μLの蛍光偽神経伝達物質FFN511(10mMストック、1:1,000作業溶液)を培地に加える。皿をインキュベーターに20分間戻します。または、ステップ 3.2 の後に FFN511 をロードし、時間を節約するのを待っている間にステップ 3.3 から 3.5 を実行します。
- FFN511の装填が終了したら、記録チャンバーを準備し、500μLの浴液に2μLの蛍光色素A655を添加する(図2A および 表1)。カバースリップをピンセットでディッシュから記録チャンバー( 材料表参照)に移し、直ちにA655含有浴液を加える(図2B)。
注:A655は-20 °Cに保たれ、濃度は10 mMで、動作濃度は40 μMです。
警告: FFN511 または A655 に直接皮膚が触れないように、手袋を着用してください。 - 100倍のオイル浸漬対物レンズ(開口数= 1.4)にオイル(屈折率:1.518、 材料表を参照)を1滴置きます。チャンバーを顕微鏡に取り付け、調整ノブを使用してオイルがカバースリップの底部にちょうど接触するようにしてから、アース線チップをバスソリューションに浸します(図2C、D)。
メモ:室温での作業に適した浸漬油を選択してください。低倍率レンズと高倍率レンズの切り替えが不要です。室温は、記録中に約20〜22°Cに維持される。 - 細胞に焦点を合わせ、明視野および共焦点イメージングを使用して、mNG発現を有する良好な細胞を見つける。選択したセルを拡大し、ビューの中央に調整して、空白領域を最小限に抑えます。
注:蛍光標識の模式図を 図3Aに示す。良好な細胞は、通常、滑らかな膜ときれいな縁を有する(図3B)。落射蛍光または共焦点イメージングでは、良好な細胞は、明るいmNG発現を有する大きくて平らな底を有するように見える(図3C)。
ピクセルサイズは〜50nmであり、異なるセルサイズおよびズーム係数に応じて〜40〜80nmの範囲内である。 - FFN511、PH-mNG、およびA655の固定Z平面(XY/Z固定 スキャン)で、最小の時間間隔でXY平面共焦点イメージングのパラメータを設定します。微調整ノブでセルの下部にフォーカスを調整します。
注:PH-mNGは、共焦点XY平面断面(細胞底部を除く)における細胞原形質膜の輪郭を信号伝達する。細胞膜底部付近には、Ω形またはΛ形の膜侵入を反映したA655スポットが観察できる。Z焦点面が細胞底部よりも低い場合、すべての蛍光の強度は弱くなります。 - ソフトウェアで励起レーザー出力を調整して、最適な信号対雑音比を取得し、著しい蛍光漂白を回避するための設定を見つけます。これを行うには、458nmで励起されたFFN511で2.5mWの電力、514nmで励起されたmNGの1mWの初期テスト値から始めます。HeNeレーザーで633nmで励起されたA655の場合、約12〜15mW(すなわち、最大値の70%〜80%)の高いレーザーパワーを使用し、連続励起すると、細孔が閉じられたときにΩ形状プロファイル内のすべての蛍光A655を漂白することができます。
注:レーザー出力が高すぎると、PH-mNGおよびFFN511蛍光が迅速に漂白されます。レーザー出力が低すぎると、信号が弱すぎたり、ノイズが多すぎたりして分析できなくなります。 - パッチピペットに9 μLの内部溶液(表1)を加え、パッチクランプアンプステージのホルダーにピペットを取り付けます( 材料表を参照)。
- シリンジで少量の陽圧をかけ、ピペットチップを動かしてマイクロマニピュレーターで浴液に触れます。電圧パルステストでピペット抵抗が約2~4MΩであることをアンプが示していることを確認します。 LJ/Autoを押し て液体接合部をキャンセルします。
- マイクロマニピュレーターでピペットを選択したセルに向かって動かします。細胞付着モードを形成するには、ピペットチップを動かして細胞に触れます(抵抗が増加します)。シリンジで静かに負圧をかけ(抵抗は1GΩ以上に増加します)、保持電位を0から-80mVに変更します。
- 抵抗が1 GΩを超えたら、構成が安定するまで約30秒待ちます。 C-fast/Auto を押して、高速容量を補償します。
- 全セルモードを形成するには、シリンジでパルス状短くて強力な負圧を印加してメンブレンを破裂させます(電流パルスの形状は、荷電および放電されたメンブレンコンデンサで変化します)。 C-slow/Auto を押して、遅い容量を補償します。
- イメージングの焦点を少し調整して、セルの底に焦点を合わせます。共焦点タイムラプスイメージングとパッチクランプ記録を同時に開始するには、2つの異なるソフトウェアアプリケーションの [スタート ]ボタンをクリックします。
メモ:共焦点イメージングソフトウェアは、〜20〜90 ms/フレームのレートでムービーを作成します。パッチクランプ記録には、10秒間の安静状態、1秒間の脱分極刺激、および刺激後の追加の49秒間が含まれる。パッチクランプ構成により、-80~+10mVの1秒分極解除によって誘起されるカルシウム電流、静電容量ジャンプ、および減衰の記録が可能です(図3D)。 - 記録が完了したら、データが保存されていることを確認してください。保持電位を0mVに戻します。ピペットをバス溶液から取り出して廃棄します。
- 手順4.7~4.13を繰り返して、ディッシュ内の別のセルを記録します。1時間の録音後、録音のために別の皿に変更します。
メモ: 1 時間の記録後、パッチクランプの記録の成功率は大幅に低下します。データ収集の効率を高めるために、各皿に1時間だけ記録することをお勧めします。
5. パッチクランプデータ解析
- データ分析用の適切なソフトウェア( 材料表を参照)を開きます。 PPT|をクリックしますPULSEファイル|のロード.dat ファイルをロードするためのファイルボタン。[ Do it (実行) ]をクリックすると、カルシウム電流と静電容量のトレースを含む4つのトレースが1つのグラフに自動的にプロットされます。
- ウィンドウ|をクリックします。[新しいグラフ]ボタンをクリックし、Pulse_1_1_1、Y波の最初の波を選択し、[実行]をクリックしてカルシウム電流グラフをプロットします。ウィンドウ|をクリックします。[新しいテーブル] ボタンをクリックし、[Pulse_1_1_1] をクリックしてカルシウム電流の生データを表示し、複数の細胞の平均トレースをプロットするために使用できます。
- カルシウム電流グラフにそれに応じて正方形を描き、 右クリックして 電流信号 を展開し 、ベースラインとカルシウム電流のピークを含めます。[グラフ|]をクリックします。 「情報を表示」(Show Info ) : カーソル A とカーソル B を表示し、それぞれベースラインとピークに移動します。グラフ情報が下部に表示され、パラメータを推定できます。
- ステップ5.2を繰り返しますが、Pulse_1_1_1_Cm(Y波の2番目の波)を選択して、容量トレースをプロットします。ステップ 5.3 を繰り返し、A カーソルと B カーソルを適切な位置に配置して、ベースライン、振幅、減衰率などの容量パラメーターを測定します。
- ステップ5.2の生データをスプレッドシートにコピーし、記録されたセルのグループの平均と標準誤差を計算し、カルシウム電流と膜容量の平均トレース(図3E)を適切なソフトウェアにプロットします。
6. 共焦点イメージングデータ解析
- 製造元提供のソフトウェアで未加工のイメージングファイルを開きます( 材料表を参照)。
注:ImageJやFijiなどの他の無料プログラムは、セクション4で取得した画像のデータ処理と定量化に利用できます。 - 「|の処理」をクリックします。 ProcessTools を使用し、ツールを使用して、タイムラプス画像ごとにローリング平均(たとえば、4つの画像ごとのローリング平均)ファイルを生成し、それらのファイルを保存します。
注:ローリング平均の後、明るさと背景を適切に調整して、3つのチャンネルの蛍光変化をよりよく示すことができ、融合事象を特定するのに役立ちます。融合事象のないいくつかの領域における蛍光強度をチェックすることは、融合事象の蛍光シグナルをバックグラウンドシグナルから区別するのに役立ち得る。 - [ |を定量化する]ボタンをクリックツールの|スタックプロファイルは、刺激前後のタイムポイントをチェックして、各チャネルにおける蛍光変化を同定する。[ 楕円を描画] ボタンをクリックして、融合イベントの関心領域 (ROI) を丸で囲みます。画像 を右クリックし、[ ROI の保存]をクリックしてROI を保存します。
注:3つの蛍光シグナルすべてをカバーするROIのサイズは、クロマフィン細胞24における小胞サイズと類似していた。分析には生データを使用し、信号対雑音比を増加させるローリング平均化データは3つの信号を明確に示すために提供されました。 - [ プロジェクトを開く ] をクリックして raw ファイルを見つけ、画像 を右クリックし、[ ROI の読み込み ] をクリックして ROI ファイルを raw イメージング ファイルに読み込み、蛍光強度を測定します。
注:生の蛍光シグナルは、異なるチャンネルのトレースをプロットするために使用されます。各ROIについて、ベースラインは刺激前の強度として定義され、強度トレースはベースラインに正規化され得る。 - [ツール|]をクリックします。ソフトウェアでROIをソートし、各ROIの3つのチャネルすべてのトレースをプロットします。[レポート]をクリックして、各ROIのデジタルデータとイメージングトレースの両方を含むROIデータをファイルフォルダに保存します。
- PH−mNG(F PH)およびA655(F655)スポット蛍光の強度の同時増加(単一フレーム内)によって融合事象を同定し、FFN511スポット蛍光(FFFN)の減少を伴う。
- 融合によって生成されるΩ プロファイルによるPH-mNG/A655スポット形成を示すF PHおよびF655の出現を探し、原形質膜からのPH-mNGの拡散および浴中からのA655の持続的な拡散を可能にする。
- 融合孔開口による小胞からの放出を示し、FPHおよびF655の出現がエンドサイトーシスによって引き起こされる膜浸潤からのものである可能性を排除するFFFN減少を探す。
- セルの下部でフュージョンイベントが発生していることを示すタイムラプスXY/Z固定 画像を調べます。融合イベントの 3 つのモード (1) 近接融合、2) ステイフュージョン、3) シュリンクフュージョンを分析します。
注:脱分極前に核融合事象が観測されることはめったになかったが、脱分極後には数十の核融合事象が観測できた。融合後、Ωプロファイルは、その細孔を閉じたり、開いた孔を維持したり、原形質膜に合流するために収縮したりすることがあります。- 近接融着を特定するには、融着孔閉鎖が浴A655の交換を妨げるため、F PHが持続し、PtdIns(4,5)P2からPtdIns(4)Pへの継続的な変換を反映して、またはFPHが小胞のピンチオフを反映して遅延して減衰するため、調光F 655を探してください(閉塞融合、図4A、B)。
- ステイフュージョンを同定するために、持続的なFPH およびF655 を探してください(図4C)。
- FPH とF655の平行な減少を探し、Ωプロファイル収縮を示して収縮融着を特定します(図4D)。
メモ: 元のイメージングファイルを調べて、イベントタイプが不明な場合はイメージングトレースを調べます。融合事象のない一部の領域における蛍光強度をチェックすることは、融合事象の蛍光シグナルをバックグラウンドシグナルと区別するのに役立つ可能性がある。
- FFN511、PH-mNG、およびA655の3つのチャンネルの強度変化の代表的なトレースをプロットします。各セルの異なる融合モードの割合を定量化し、図をプロットします。
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Representative Results
図1および図2に示される実験手順に従って、ウシ副腎由来のクロマフィン細胞をPH−mNGでトランスフェクトし、原形質膜を標識した。A655を浴液に添加して、融合孔閉鎖を検出した。蛍光偽神経伝達物質FFN511を放出の検出のために小胞に装填した。次に、FFN511、PH-mNG、およびA655のXY面共焦点タイムラプスイメージングを、細胞底部(細胞膜上方のZ焦点面〜100〜200nm)で20〜90msごとに行った。-80~+10mVの1秒脱分極の全細胞パッチクランプ記録および適用を、外細胞症およびエンドサイトーシスを呼び起こすために行った(図3A-C)。この脱分極は、内向きのカルシウム電流、エキソサイトーシスを示す容量ジャンプ、およびエンドサイトーシスを示すジャンプ後の容量減衰を誘導した(図3D、E)。
細胞底部でのタイムラプスXY/Z固定イメージングでは、脱分極後に多くの個々の融合事象が観察された(図4A)が、脱分極前にはまれな融合事象が観察された。1s脱分極プロトコルによって誘導される融合事象は、FFN511放出を反映したFFN511スポット蛍光(FFFN)減少、原形質膜および浴液から融合小胞へのPH−mNGおよびA655拡散を反映するFPHおよびA655スポット蛍光(F655)増加を伴う(融合生成Ωプロファイル)15として同定された。
融合後、原形質膜との小胞融合によって生成されるΩプロファイルは、1)クローズフュージョンと呼ばれるその細孔を閉じる、2)ステイフュージョンと呼ばれるオープンフュージョンポアを維持する、または3)シュリンクフュージョンと呼ばれる原形質膜にマージするために収縮する。近接融着は、F PHが遅延して持続または減衰している間にF655調光として同定された(図4B)。ステイ核融合は、PH-mNGおよびA655スポットの両方の持続的な存在として検出された(図4C)。収縮融着は、PH-mNGスポットおよびA655スポットの平行なサイズ縮小を伴う平行なF PHおよびF655崩壊として検出された(図4D)8、15、16、24。
(A, B)ウシ副腎をハサミでトリミングして脂肪組織を除去し(A)、ロック溶液で洗い流し、副腎を通して消化する(B)。(C)消化のない副腎の内部(左)または適切な消化後(右)。(d)洗浄・消化後、髄質を単離して小片に細切し、濾過・遠心分離後にクロマフィン細胞を細切髄から分離する。(E)クロマフィン細胞をエレクトロポレーションし、インキュベーションのためにカバースリップに播種する。(f)2~3日目に、実験前にクロマフィン細胞を顕微鏡で確認する。(G)細胞サンプルをチャンバーに埋め込んで、パッチクランプ記録および共焦点イメージングを行う。カルシウム電流と静電容量の変化が記録され、増幅され、モニターに表示されます。刺激による蛍光変化が検出され、モニターに表示されます。スケールバー = 40 mm (A)、20 mm (B-D)、20 μm (F)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:パッチクランプと共焦点セットアップ (A)実験当日、カバースリップ上で増殖させたクロマフィン細胞をFFN511と共に20分間インキュベートする。染料A655を浴液に添加する。(B)カバースリップ上のクロマフィン細胞を記録チャンバーに移し、A655の入った浴液をチャンバーに添加する。(C)100倍の油浸漬対物レンズに油滴を加えた後、チャンバを倒立共焦点顕微鏡のステージに取り付ける。アース線の先端を浴液に浸漬する。ピペットは、ピペット溶液で装填した後に所定の位置に持ってきて、ヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーによって保持される。ヘッドステージは電動マイクロマニピュレータによって制御されます。(D)良好な細胞が見つかったら、マイクロマニピュレーターでピペットチップを浴液に移動し、全細胞パッチクランプ記録および共焦点イメージングを開始する。スケール バー = 10 mm (A)、5 mm (B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:カルシウム電流と脱分極による静電容量変化の全セル電圧クランプ記録。(A)全セル電圧クランプ記録中のクロマフィンセルのセットアップ図。クロマフィン細胞をA655含有浴液(赤色)に浸漬し、細胞膜および小胞をそれぞれPH-mNG(緑色)およびFFN511(シアン)で標識する。この画像は24の許可を得て修正されています。(b)明視野で観察したパッチクランプクロマフィン細胞の代表的な画像。(C)セルフットプリントにピントが合ったセルにおけるPH-mNG(緑)、A655(赤)、FFN511(シアン)の代表的な画像。(D)-80~+10mVの1s脱分極により誘起されるカルシウム電流および静電容量変化の一例。(E)20個のクロマフィンセルから収集されたカルシウム電流(ICa)および静電容量(Cm)変化の平均トレース。この画像は26の許可を得て改変されています。スケールバー = 5 μm (B, C)。略語: ICa = カルシウム電流;Cm = 静電容量;デポール = 脱分極。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:共焦点顕微鏡下での核融合事象の可視化。(A)細胞下部のPH-mNG(緑)、A655(赤)、FFN511(シアン)の共焦点XY面イメージングにより、多くの融合スポットを検出できる。融合は、-80から+10mV(デポール1s)までの1秒の脱分極によって誘発された。FFNスポットは解放と近接融合(円)を受けた。偏光解消の前(-1秒)と除極後(+1秒と+10秒)の画像が表示されます。(B)近接融合の一例。(C)ステイフュージョンの一例。(d)シュリンク・フュージョンの一例。この画像は24の許可を得て修正されています。スケールバー = 1 μm (A)、0.5 μm (B-D)。略語: デポール = 脱分極;F = 蛍光強度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 培地/ソリューション | 形容 | ||
| ロックのソリューション | 145 mM NaCl、5.4 mM KCl、2.2 mMNa2HPO 4、0.9 mM NaH2PO4、5.6 mM グルコース、および 10 mM HEPES、pH 7.3、NaOH で調整 | ||
| 酵素液 | 1.5 mg/mL コラゲナーゼ P、0.325 mg/mL トリプシン阻害剤、および 5 mg/mL ウシ血清アルブミンをロックの溶液に | ||
| 培地 | 10%ウシ胎児血清を添加したDMEM培地 | ||
| 内部ソリューション | 130 mM Cs-グルタミン酸塩, 0.5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 2 mM ATP, および 0.5 mM GTP, pH7.2, CsOH で調整 | ||
| 入浴剤 | 125 mM NaCl、10 mM グルコース、10 mM HEPES、5 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、4.5 mM KCl、および 20 mM TEA、pH 7.3、NaOH で調整 | ||
表 1: 培地および溶液の組成に関する詳細。
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Discussion
共焦点顕微鏡画像化法は、ウシ副腎クロマフィン細胞4,24における融合孔および伝達物質放出のダイナミクス、ならびに3つの融合モード、近接融合、ステイ融合、および収縮融合を検出するために記載されている4,24。細胞を脱分極させ、それによってエキソ細胞症およびエンドサイトーシスを呼び起こす電気生理学的方法が記載されている。体系的な共焦点画像処理は、核融合および核分裂事象の細孔挙動の異なるモードに関する情報を提供する。
全細胞構成と同じセルにおけるカルシウム電流および静電容量変化の同時モニタリングは、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスに関する追加情報を提供し、任意の時点での全セルレベルでの細孔開閉の比率を示唆する。これらの方法は、原則として、初代培養物中または〜200〜1,600nm15の小胞を含む細胞株中の他の興奮性細胞および非電気的に興奮性細胞に適用可能である。クロマフィン細胞に加えて、ここで記載した方法は、ラット膵臓β細胞株INS−1細胞4に適用されている。
原理的には、この方法は、200nm未満の小胞を含む分泌細胞にも適用することができる。ただし、ベシクルのサイズが小さくなると、信号対雑音比が低すぎて信頼性の高い検出ができない場合があります。共焦点イメージングの代わりに超解像イメージングが必要になる場合があります。これまでのところ、ここで記載される方法は、〜40nmのシナプス小胞を含むシナプスに適用されていない。
ここで説明する方法の実装の成功は、培養細胞の品質、プラスミドトランスフェクション効率、電気生理学的記録成功率など、いくつかの一般的なステップに決定的に依存します。まず、健康な細胞は、パッチクランプ記録と共焦点イメージングの両方に不可欠です。これらの化学物質はクロマフィン細胞の興奮性に影響を与える可能性があるため、培養中に抗菌剤または抗真菌剤を使用することはお勧めしません。したがって、滅菌技術の勤勉な運動および新たに調製された培地の使用が重要である。初代培養クロマフィン細胞はディッシュ中で少なくとも1週間は生存できますが25、新規ユーザーにとっては実験のために2〜3日目に細胞を使用することが重要です。線維芽細胞が徐々に増殖するにつれて、全細胞パッチクランプ構成を確立することはより困難になる。第二に、プラスミドのクロマフィン細胞へのエレクトロポレーション効率は約20〜30%である。エレクトロポレーション効率は、低すぎる場合やPH-mNG蛍光が薄すぎる場合に最適化する必要があります。第3に、細胞を100倍の油対物レンズで底部で画像化し、FFN511、PH-mNG、およびA655の3つの蛍光プローブの変化によって示される実質的な事象を得た。DICは、全細胞構成を確立する際に明視野や肉眼画像よりも鮮明な視界を提供しますが、ユーザーが構成を確立できる視覚化技術で十分です。
適切なレーザーパワー強度は、生細胞における共焦点イメージングに不可欠です。FFN511とmNGは高いレーザー出力で漂白される可能性があるため、共焦点レーザーで可視化する前に、落射蛍光で良好な細胞を探すことをお勧めします。A655 では、小胞内の色素を漂白するために高出力レーザー励起が必要です。さらに、この実験が失敗する最も一般的な理由は、パッチクランプ記録の失敗です。適切なサイズの清潔で研磨されたピペットチップと、クロマフィン細胞上の全細胞構成を生成する練習は、重要な要素です。成功するには時間と労力がかかるかもしれないが、一度確立されると、これらの実験は核融合と核分裂の両方のイベントに関する実質的なデータを提供し、単一のイベントレベルで膜孔の開閉を示す。
ここで説明するプロトコルは、さらに異なる実験目標に対していくつかの修正を加えて使用することができる。しかし、実験目標にかかわらず、最初に高カリウム溶液(70mM KClなど)を刺激として使用して、膜が脱分極されたときに受ける変化を確認し、これら3つの色素、FFN、PH、およびA655の強度変化を視覚化できるようにすることをお勧めします。原形質膜は、mCLING(膜結合性フルオロフォア - システイン - リジン - パルミトイル基)4,27またはCAAX(システイン残基イソプレニル化を介して細胞質ゾル対向原形質膜を標的とするタンパク質モチーフ)4,28などの他の膜結合蛍光団で標識することができる。A655は、特定の実験15で用いた蛍光分子の組み合わせに応じて、Atto 532(A532)などのスペクトルの異なる他の色素と置き換えることができる。ニューロペプチドYは、蛍光偽神経伝達物質16の代わりに使用することができる。
FFN511のピーク励起スペクトルが約405nmであるにもかかわらず、この実験ではFFN511は405nmではなく458nmで励起された。静電容量記録を用いた研究は、PH-mNGの有無にかかわらずクロマフィン細胞において有意差を示さず、PH-mNGの過剰発現がエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスに影響を及ぼさないことを示している15,24。融合事象の同様のパーセンテージが、PH−mNGおよびA532のみまたはFFN511で標識されたクロマフィン細胞において検証され、クロマフィン小胞へのFFN511のロードが含量放出および異なる融合モードに影響を及ぼさないことを実証した16。1秒の脱分極刺激は、高カリウム溶液または他の脱分極のパッテンで置き換えることができる。これらの改変は、異なる実験目的に適応するために使用することができる。
この強力な方法の利点にもかかわらず、いくつかの制限があります。最大の制限は、共焦点顕微鏡の回折制限分解能(〜230nm)に関連しており、これは、より高度な超解像顕微鏡技術29によって克服することができる。ウシクロマフィン細胞における顆粒径は〜300nm6であり、共焦点顕微鏡の空間分解能内で膜孔の開閉を観察することを可能にする。しかしながら、シナプス小胞は〜30〜60nm30であり、これは共焦点分解能を超えている。これらの生細胞イメージング測定を小さなシナプス小胞に拡張することは、共焦点イメージングでは困難であることが証明されています。
STED顕微鏡、確率的光再構成顕微鏡(STORM)、光活性化局在顕微鏡(PALM)、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡、および最小光子束(MINFLUX)ナノスコピーなど、より時間的および/または空間的分解能を有する生細胞イメージング技術が開発されており、この方法に適用することができる31、32、33、34.実際、STED顕微鏡は、クロマフィン細胞における融合孔ダイナミクスを明らかにするために使用されてきた。融合事象および予め形成されたΩプロファイル閉鎖の異なるモードは、STED顕微鏡24などの超解像顕微鏡を用いてさらに検証することができる。他の制限には、蛍光タンパク質および色素の光退色および細胞毒性が含まれる。
電気生理学と共焦点顕微鏡のこの組み合わせは、多くの分泌細胞に広く適用することができる。超解像顕微鏡とここで述べた方法の組み合わせは、神経終末の融合孔を解像できる程度に超解像顕微鏡が発展すれば、将来、神経回路における融合細孔ダイナミクスを測定するための貴重なツールとなるでしょう。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
我々は、この作業を支援してくれたNINDS壁内研究プログラム(ZIA NS003009-13およびZIA NS003105-08)に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
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