Summary
Este protocolo describe una técnica de imagen confocal para detectar tres modos de fusión en células cromafines suprarrenales bovinas. Estos modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y el cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción de la vesícula fusionada.
Abstract
La apertura y el cierre dinámicos de los poros de fusión median la exocitosis y la endocitosis y determinan su cinética. Aquí, se demuestra en detalle cómo se utilizó la microscopía confocal en combinación con el registro de pinza de parche para detectar tres modos de fusión en células de cromafina suprarrenal bovina de cultivo primario. Los tres modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción del perfil en forma de Ω generado por la fusión hasta que se fusiona completamente en la membrana plasmática.
Para detectar estos modos de fusión, la membrana plasmática se marcó sobreexpresando mNeonGreen unido con el dominio PH de la fosfolipasa C δ (PH-mNG), que se une al fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) en la valva orientada al citosol de la membrana plasmática; las vesículas se cargaron con el falso neurotransmisor fluorescente FFN511 para detectar la liberación de contenido vesicular; y Atto 655 se incluyó en la solución de baño para detectar el cierre de poros de fusión. Estas tres sondas fluorescentes se tomaron imágenes simultáneamente a ~ 20-90 ms por cuadro en células cromafines vivas para detectar la apertura del poro de fusión, la liberación de contenido, el cierre del poro de fusión y la fusión de cambios en el tamaño de la vesícula. El método de análisis se describe para distinguir tres modos de fusión de estas mediciones de fluorescencia. El método descrito aquí puede, en principio, aplicarse a muchas células secretoras más allá de las células cromafines.
Introduction
La fusión de membrana media muchas funciones biológicas, incluida la transmisión sináptica, la homeostasis de la glucosa en sangre, la respuesta inmune y la entrada viral 1,2,3. La exocitosis, que implica la fusión de vesículas en la membrana plasmática, libera neurotransmisores y hormonas para lograr muchas funciones importantes, como las actividades de la red neuronal. La fusión abre un poro para liberar contenido vesicular, después de lo cual el poro puede cerrarse para recuperar la vesícula fusionante, que se denomina kiss-and-run 1,4. Tanto la apertura irreversible como reversible del poro de fusión se puede medir con grabaciones de capacitancia conectadas a células combinadas con grabaciones de conductancia de poro de fusión de fusión de una sola vesícula.
Esto a menudo se interpreta como un reflejo de la fusión de colapso completo, que implica la dilatación de la fusión hasta el aplanamiento de la vesícula fusionada, y el beso y la carrera, que implica la apertura y el cierre del poro de fusión, respectivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estudios recientes de imágenes de agotamiento por emisión confocal y estimulada (STED) en células cromafines observaron directamente la apertura y el cierre del poro de fusión (kiss-and-run, también llamado close-fusion), la apertura del poro de fusión que mantiene una forma de Ω con un poro abierto durante mucho tiempo, denominada fusión de permanencia y la reducción de la vesícula fusionante hasta que se fusiona completamente con la membrana plasmática, que reemplaza la fusión de colapso completo para fusionar las vesículas fusionadas con la membrana plasmática4, 8,14,15,16,17.
En las neuronas, se han detectado apertura y cierre de poros de fusión con imágenes que muestran la liberación de puntos cuánticos precargados en vesículas que son más grandes que el poro de fusión y con mediciones de conductancia de poro de fusión en la cara de liberación de terminales nerviosos 5,18,19. Las células cromafines suprarrenales son ampliamente utilizadas como modelo para el estudio de la exocitosis y la endocitosis20,21. Aunque las células cromafines contienen grandes vesículas de núcleo denso, mientras que las sinapsis contienen pequeñas vesículas sinápticas, las proteínas de exocitosis y endocitosis en las células cromafines y sinapsis son bastante análogas 10,11,12,20,21,22,23.
Aquí, se describe un método para medir estos tres modos de fusión utilizando un método de imagen confocal combinado con electrofisiología en células de cromafin suprarrenal bovina (Figura 1). Este método consiste en la carga de falsos neurotransmisores fluorescentes (FFN511) en vesículas para detectar la exocitosis; adición de Atto 655 (A655) en la solución de baño para llenar el perfil en forma de Ω generado por fusión, y etiquetado de la membrana plasmática con el dominio PH de fosfolipasa C δ (PH), que se une a PtdIns(4,5)P2 en la membrana plasmática 8,15,24. La dinámica de los poros de fusión se puede detectar a través de cambios en diferentes intensidades fluorescentes. Aunque se describe para las células cromafines, el principio de este método descrito aquí se puede aplicar ampliamente a muchas células secretoras mucho más allá de las células cromafines.
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Protocol
NOTA: El procedimiento de uso de animales siguió las pautas de los NIH y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de los NIH.
1. Cultivo de células de cromafina bovina
- Preparar la solución de Locke (Tabla 1) y las herramientas de autoclave 1 día antes del cultivo celular de cromafines.
- Obtenga glándulas suprarrenales bovinas de un matadero local el día del cultivo y manténgalas sumergidas en la solución helada de Locke antes de la disección.
NOTA: Las glándulas suprarrenales son de 21-27 meses de edad, sanos, Angus negro de ambos sexos (principalmente hombres) con un peso corporal de alrededor de 1,400 libras (~ 635 kg). - Preparar 30 ml (para 3 glándulas suprarrenales) de solución enzimática fresca que contenga colagenasa P, inhibidor de tripsina y albúmina sérica bovina (Tabla 1) antes de la disección y mantenerla a temperatura ambiente.
- Elija 3 glándulas intactas sin cortes ni sangrados en la superficie y retire el tejido graso con tijeras (Figura 1A). Lave las glándulas por perfusión con la solución de Locke hasta que no salga sangre. Para lograr esto, infle la glándula a través de la vena suprarrenal (Figura 1B) usando una jeringa de 30 ml conectada con un filtro de 0.22 μm tantas veces como sea necesario25.
NOTA: Por lo general, se necesitan aproximadamente 150 ml de solución de Locke para lavar 3 glándulas. - Para la digestión, inyecte la solución enzimática a través de la vena suprarrenal con una jeringa de 30 ml conectada con un filtro de 0,22 μm hasta que la glándula comience a hincharse. Luego, deje las glándulas a 37 ° C durante 10 min. Inyecte una vez más y deje las glándulas a 37 °C durante otros 10 min.
NOTA: Se necesitan aproximadamente 30 ml de solución enzimática para digerir 3 glándulas. - Después de la digestión, corte la glándula longitudinalmente desde la vena hasta el otro extremo con tijeras para desplegar la glándula (Figura 1C). Aísle las médulas exprimiendo la médula blanca en una placa de Petri de 10 cm que contenga la solución de Locke.
NOTA: La comparación del interior de la glándula antes y después de la digestión se muestra en la Figura 1C. Los detalles de la digestión y el aislamiento de las médulas se reportaron previamente23,25. - Cortar y picar la médula en trozos pequeños con tijeras (Figura 1D). Filtre la suspensión de la médula con una malla de nylon de 80-100 μm en un vaso de precipitados. Luego transfiera el filtrado a un tubo cónico de 50 ml para centrifugación a 48 × g, temperatura ambiente, durante 3 min con desaceleración de 3.
NOTA: El picado de las médulas generalmente toma ~ 10 min. Para obtener un buen rendimiento de las células, las piezas picadas deben ser muy pequeñas, hasta que no se puedan pinzar. - Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la celda con la solución de Locke mediante pipeteo. Filtre la suspensión celular con un colador de 80-100 μm, y centrífuga a 48 x g, temperatura ambiente, durante 3 min con desaceleración de 3.
- Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular con 30 ml de medio de cultivo (Tabla 1). Determine el número de celda utilizando cámaras de conteo hemacitómetro25.
2. Transfección con electroporación
- Transfiera 2,8 × 106 células a un tubo de 15 ml. Pellet las células por centrifugación a 48 × g durante 2 min con desaceleración de 3. Agregue 100 μL de tampón de transfección (consulte la Tabla de materiales) proporcionado por el fabricante al pellet celular y luego agregue 2 μg del plásmido PH-mNG.
NOTA: El plásmido PH-mNG se creó reemplazando la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) con mNG en PH-EGFP15 (consulte la Tabla de materiales). - Mezcle suavemente la suspensión canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo, y transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación sin demora (Figura 1E). Transfiera inmediatamente la cubeta al electroporador (consulte la Tabla de materiales), seleccione el programa O-005 en la lista de pantalla y presione Entrar para realizar la electroporación.
NOTA: Prepare la suspensión celular para la transfección en una campana de cultivo celular. No introduzca burbujas de aire en la suspensión durante el paso de mezcla. Continúe con el siguiente paso sin demora. - Después de la electroporación, agregue 1,8 ml de medio inmediatamente a la cubeta y mezcle suavemente con un micropipetador equipado con una punta estéril. Luego agregue 300 μL de la suspensión de las celdas electroporadas en la parte superior de la cubierta (consulte la Tabla de materiales) en cada plato, chapando 5-6 platos en total para una reacción de electroporación.
- Transfiera cuidadosamente los platos a una incubadora humidificada a 37 ° C con 9% de CO2 durante 30 min, y agregue suavemente 2 ml de medio precalentado a cada plato después de 30 min.
- Mantenga las células transfectadas en la incubadora humidificada a 37 °C con un 9% de CO2 durante 2-3 días antes del experimento.
NOTA: Las células cultivadas durarán una semana. Es mejor usar células cultivadas en los días 2-3.
3. Preparación para el registro de la pinza de parche y la imagen confocal
NOTA: Este protocolo se realizó con un microscopio confocal de barrido láser y un amplificador de abrazadera de parche con grabación de abrazadera de voltaje junto con un amplificador de bloqueo para la grabación de capacitancia. Se utilizó una imagen confocal del plano XY en un plano Z fijo (escaneofijo XY /Z) para obtener imágenes de las tres señales fluorescentes simultáneamente. El plano Z se centró en la parte inferior de la célula, donde la membrana plasmática se adhería a las cubiertas.
- El día del experimento de pinza de parche e imágenes, observe las células bajo un microscopio de fluorescencia. Use brightfield para asegurarse de que el cultivo celular no esté contaminado (Figura 1F) y epifluorescencia para verificar la expresión adecuada de la proteína marcada con fluorescentes.
NOTA: Por ejemplo, PH-mNG se expresa en la membrana plasmática de ~ 20-30% de las células. - Prepare pipetas de parche a partir de capilares de vidrio de borosilicato. Para hacer esto, tire de las pipetas con un extractor de pipetas, cubra sus puntas con cera líquida y límpielas con una microtorcha (consulte la Tabla de materiales).
- Encienda el amplificador de grabación patch-clamp e inicie el software de grabación patch-clamp (consulte la Tabla de materiales). Establezca los parámetros apropiados para el registro de corriente de calcio y capacitancia en el software (consulte la Tabla de materiales).
- Establecer un protocolo de grabación de 60 s de duración en total, donde la estimulación comienza a los 10 s.
- Ajuste el potencial de retención para la grabación de la abrazadera de voltaje a -80 mV. Establezca una despolarización de 1 s de -80 mV a 10 mV como estímulo para inducir la afluencia de calcio y el salto de capacitancia.
- Para las mediciones de capacitancia, establezca la frecuencia del estímulo sinusoidal en un rango de 1,000-1,500 Hz con un voltaje de pico a pico de no más de 50 mV.
- Guarde el protocolo y cree un nuevo archivo para grabar.
- Encienda el sistema de microscopio confocal y establezca los parámetros apropiados en el software (consulte la Tabla de materiales).
- Encienda los láseres, incluidos 458 nm, 514 nm y 633 nm, y establezca el rango de recolección de emisiones para cada láser de acuerdo con cada sonda de fluorescencia como se indica a continuación. FFN511: longitud de onda de excitación (EX), 458 nm; longitud de onda de emisión (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
- Utilice imágenes secuenciales para FFN511 y mNG para evitar la diafonía entre estas dos sondas. Establezca un lapso de tiempo de 1 minuto de duración para la grabación de imágenes (Figura 1G).
4. Grabación con abrazadera de parche e imágenes confocales
- Elija un plato con buen estado celular y expresión adecuada y agregue 2 μL de falso neurotransmisor fluorescente FFN511 (stock de 10 mM, solución de trabajo 1: 1,000) en el medio. Vuelva a poner el plato en la incubadora durante 20 minutos. Alternativamente, cargue FFN511 después del paso 3.2 y realice los pasos 3.3-3.5 mientras espera para ahorrar tiempo.
- Una vez finalizada la carga FFN511, prepare la cámara de grabación y agregue 2 μL de colorante fluorescente A655 en 500 μL de la solución de baño (Figura 2A y Tabla 1). Transfiera el cubrehojas del plato a la cámara de grabación (consulte la Tabla de materiales) con pinzas e inmediatamente agregue la solución de baño que contiene A655 (Figura 2B).
NOTA: El A655 se mantiene en -20 °C con una concentración de 10 mM y la concentración de trabajo es de 40 μM.
PRECAUCIÓN: Use guantes para evitar el contacto directo de la piel con FFN511 o A655. - Coloque una gota de aceite (índice de refracción: 1.518; consulte la Tabla de materiales) en el objetivo de inmersión de aceite 100x (apertura numérica = 1.4). Monte la cámara en el microscopio y use la perilla de ajuste para hacer que el aceite entre en contacto con la parte inferior de la cubierta, luego sumerja la punta del cable de tierra en la solución del baño (Figura 2C, D).
NOTA: Elija un aceite de inmersión apropiado para trabajar a temperatura ambiente. Cambiar entre la lente de bajo y alto aumento es innecesario. La temperatura ambiente se mantiene alrededor de 20-22 ° C durante el registro. - Enfoca las células y usa imágenes de campo brillante y confocales para encontrar una buena célula con expresión de mNG. Amplíe la celda seleccionada y ajústela al centro de la vista para minimizar las regiones en blanco.
NOTA: El dibujo esquemático del etiquetado de fluorescencia se muestra en la Figura 3A. Una buena célula generalmente tiene una membrana lisa y un borde limpio (Figura 3B). Con epifluorescencia o imágenes confocales, una buena célula parece tener un fondo grande y plano con expresión de mNG brillante (Figura 3C).
El tamaño del píxel es de ~ 50 nm, dentro de un rango de ~ 40-80 nm de acuerdo con diferentes tamaños de celda y factor de zoom. - Configure los parámetros para la obtención de imágenes confocales del plano XY en un plano Z fijo (escaneofijo XY/Z) de FFN511, PH-mNG y A655, con un intervalo de tiempo minimizado. Ajuste el enfoque a la parte inferior de la celda con la perilla de ajuste fino.
NOTA: PH-mNG señala el contorno de la membrana plasmática celular en la sección transversal confocal del plano XY (excepto la parte inferior de la célula). Cerca del fondo de la membrana celular, se pueden observar manchas A655, que reflejan invaginaciones de membrana en forma de Ω o forma de Λ. Si el plano focal Z es más bajo que el fondo de la célula, la intensidad de toda la fluorescencia se debilitará. - Ajuste la potencia del láser de excitación en el software para encontrar una configuración para obtener la mejor relación señal-ruido y evitar un blanqueamiento significativo de la fluorescencia. Para hacerlo, comience con un valor de prueba inicial de 2.5 mW de potencia para FFN511 excitado a 458 nm y 1 mW para mNG excitado a 514 nm. Para A655 excitado a 633 nm con un láser HeNe, use alta potencia láser, ~ 12-15 mW (es decir, 70% -80% del máximo), que, tras la excitación continua, puede blanquear todo el A655 fluorescente dentro de un perfil en forma de Ω cuando su poro está cerrado.
NOTA: Si la potencia del láser es demasiado alta, la fluorescencia PH-mNG y FFN511 se blanqueará rápidamente. Si la potencia del láser es demasiado baja, las señales serán demasiado débiles o ruidosas para ser analizadas. - Añadir 9 μL de solución interna (Tabla 1) en una pipeta de parche y conectar la pipeta al soporte en la etapa del amplificador de abrazadera de parche (consulte la Tabla de materiales).
- Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con una jeringa y mueva la punta de la pipeta para tocar la solución de baño con un micromanipulador. Asegúrese de que el amplificador muestre que la resistencia de la pipeta es de ~ 2-4 MΩ con una prueba de pulso de voltaje. Pulse LJ/Auto para cancelar la unión líquida.
- Mueva la pipeta hacia la celda seleccionada con el micromanipulador. Para formar un modo conectado a la celda, mueva la punta de la pipeta para tocar la celda (la resistencia aumentará); aplicando presión negativa suavemente con la jeringa (la resistencia aumentará a más de 1 GΩ), cambie el potencial de sujeción de 0 a -80 mV.
- Una vez que la resistencia pase 1 GΩ, espere ~ 30 s para que la configuración se estabilice. Presione C-fast/Auto para compensar la capacitancia rápida.
- Para formar un modo de celda completa, aplique presión negativa pulsada corta pero potente con la jeringa para romper la membrana (la forma del pulso actual cambia con un condensador de membrana cargado y descargado). Presione C-slow/Auto para compensar la capacitancia lenta.
- Ajuste ligeramente el enfoque de la imagen para enfocar la parte inferior de la célula. Inicie simultáneamente la grabación simultánea de imágenes de lapso de tiempo confocal y de abrazadera de parches haciendo clic en los botones Inicio en las dos aplicaciones de software diferentes.
NOTA: El software de imágenes confocales hace una película a una velocidad de ~ 20-90 ms / fotograma. El registro de la pinza de parche incluye el estado de reposo durante 10 s, la estimulación de despolarización de 1 s y 49 s adicionales después de la estimulación. La configuración de la abrazadera de parche permite registrar la corriente de calcio, el salto de capacitancia y la desintegración inducida por la despolarización de 1 s de -80 a +10 mV (Figura 3D). - Una vez finalizada la grabación, asegúrese de que los datos estén guardados. Cambie el potencial de retención a 0 mV. Retire la pipeta de la solución de baño y deséchela.
- Repita los pasos 4.7-4.13 para grabar otra celda en el plato. Después de 1 h de grabación, cambie a otro plato para grabar.
NOTA: Después de 1 h de grabación, la tasa de éxito de la grabación con abrazadera de parche disminuye significativamente. Para aumentar la eficiencia de la recopilación de datos, se recomienda registrar solo 1 h en cada plato.
5. Análisis de datos patch-clamp
- Abra el software apropiado (consulte la Tabla de materiales) para el análisis de datos. Haga clic en el | PPT Cargar | de archivos PULSE Botones de archivo para cargar el archivo .dat. Haga clic en Hacerlo y se trazarán cuatro trazas en un gráfico automáticamente, incluidas las trazas de corriente de calcio y capacitancia.
- Haga clic en el | Windows Botones Nuevo gráfico , elija el Pulse_1_1_1, la primera onda en la(s) onda(s) Y y haga clic en Hacerlo para trazar el gráfico de corriente de calcio. Haga clic en el | Windows Nuevos botones tabla, elija el Pulse_1_1_1 y haga clic en Hacerlo para mostrar los datos sin procesar de la corriente de calcio, que podría usarse para trazar el rastro promediado de varias celdas.
- Dibuje un cuadrado en consecuencia en el gráfico de corriente de calcio, haga clic con el botón derecho y expanda la señal de corriente para incluir la línea de base y el pico de corriente de calcio. Haga clic en gráfico | Mostrar información para mostrar los cursores A y B y moverlos a la línea base y al pico respectivamente. La información del gráfico se mostrará en la parte inferior y se pueden estimar los parámetros.
- Repita el paso 5.2, pero elija el Pulse_1_1_1_Cm, la segunda onda en Y Wave(s), para trazar el trazado de capacitancia. Repita el paso 5.3 y coloque los cursores A y B en la posición adecuada para medir los parámetros de capacitancia, como la línea de base, la amplitud y la velocidad de decaimiento.
- Copie los datos sin procesar en el paso 5.2 en una hoja de cálculo, calcule la media y el error estándar de la media para un grupo de células registradas y trace los rastros promediados de la corriente de calcio y la capacitancia de la membrana (Figura 3E) en un software apropiado.
6. Análisis de datos de imágenes confocales
- Abra los archivos de imágenes sin procesar con cualquier software suministrado por el fabricante (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Algunos otros programas gratuitos, como ImageJ o Fiji, podrían utilizarse para procesar datos y cuantificar las imágenes obtenidas en la sección 4. - Haga clic en Procesar | ProcessTools y use las herramientas para generar archivos de promedio móvil (por ejemplo, promedio móvil por cada 4 imágenes) para cada imagen de lapso de tiempo y guardar esos archivos.
NOTA: Después del promedio móvil, se podría hacer un ajuste apropiado del brillo y el fondo para mostrar mejor los cambios de fluorescencia de tres canales, lo que puede ayudar a identificar los eventos de fusión. Verificar la intensidad fluorescente en algunas regiones sin evento de fusión puede ayudar a distinguir la señal fluorescente de los eventos de fusión de las señales de fondo. - Haga clic en los botones Cuantificar | Herramientas | Stack Profile, compruebe los puntos de tiempo antes y después de la estimulación para identificar los cambios de fluorescencia en cada canal. Haga clic en el botón Dibujar elipse para rodear las regiones de interés (ROI) de los eventos de fusión. Haga clic con el botón derecho en la imagen y haga clic en Guardar ROI para guardar los ROI.
NOTA: El tamaño del ROI, que cubre las tres señales fluorescentes, fue similar con el tamaño de la vesícula en las células cromafines24. Para el análisis se utilizaron datos brutos, mientras que los datos de promedio rodante que aumentan la relación señal-ruido se proporcionaron para mostrar claramente las tres señales. - Haga clic en Abrir proyectos para localizar el archivo raw, haga clic con el botón derecho en la imagen y haga clic en Cargar ROI para cargar el archivo ROI en los archivos de imágenes raw para medir las intensidades de fluorescencia.
NOTA: La señal fluorescente en bruto se utilizará para trazar trazas de diferentes canales. Para cada ROI, la línea de base se define como la intensidad antes de la estimulación, y los rastros de intensidad se pueden normalizar a la línea de base. - Haga clic en herramientas | Ordene los ROI en el software y trace los rastros para los tres canales de cada ROI. Haga clic en Informe para guardar los datos de ROI, incluidos los datos digitales y los rastros de imágenes para cada ROI, en una carpeta de archivos.
- Identificar un evento de fusión por el aumento simultáneo en la intensidad de la fluorescencia puntual de PH-mNG (FPH) yA655 (F 655) (dentro de un solo marco), acompañado de una disminución en la fluorescencia puntual de FFN511 (FFFN).
- Busque la aparición de FPH y F655, lo que indica la formación de puntos PH-mNG / A655 debido a un perfil de Ω generado por fusión, lo que permite la difusión de PH-mNG desde la membrana plasmática y la difusión persistente de A655 desde el baño.
- Busque la disminución de FFFN , que indica su liberación de una vesícula debido a la apertura del poro de fusión y excluye la posibilidad de que la aparición de FPH y F655 pueda deberse a la invaginación de la membrana causada por endocitosis.
- Inspeccione las imágenesfijas XY/Z de lapso de tiempo que muestran los eventos de fusión que ocurren en la parte inferior de la celda. Analice tres modos de eventos de fusión: 1) fusión cercana, 2) fusión de permanencia y 3) fusión de contracción.
NOTA: Los eventos de fusión rara vez se observaron antes de la despolarización, mientras que decenas de eventos de fusión se pudieron observar después de la despolarización. Después de la fusión, el perfil Ω puede cerrar su poro, mantener su poro abierto o encogerse para fusionarse con la membrana plasmática.- Para identificar la fusión cercana, busque la atenuación F655 porque el cierre del poro de fusión impide el intercambio del baño A655, mientras que FPH se mantiene, lo que refleja la conversión continua de PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(4)P, o FPH se desintegra con un retraso, reflejando el pellizco de vesícula (fusión cercana, Figura 4A, B).
- Busque FPH sostenido y F655 para identificar la fusión de permanencia (Figura 4C).
- Busque disminuciones paralelas de FPH y F655, lo que indica la contracción de perfil Ω para identificar la fusión retráctil (Figura 4D).
Nota : compruebe los archivos de imágenes originales para inspeccionar los rastros de imágenes si no está seguro del tipo de evento. La comprobación de la intensidad fluorescente en algunas regiones sin evento de fusión puede ayudar a distinguir la señal fluorescente de los eventos de fusión de las señales de fondo.
- Traza trazas representativas de los cambios de intensidad para estos tres canales: FFN511, PH-mNG y A655. Cuantificar el porcentaje de diferentes modos de fusión en cada celda y trazar figuras.
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Representative Results
Siguiendo los procedimientos experimentales mostrados en la Figura 1 y la Figura 2, las células cromafines de las glándulas suprarrenales bovinas fueron transfectadas con PH-mNG para etiquetar la membrana plasmática; Se agregó A655 a la solución de baño para detectar el cierre de poros de fusión; y el falso neurotransmisor fluorescente FFN511 se cargó en vesículas para la detección de liberación. A continuación, se realizaron imágenes de lapso de tiempo confocal de plano XY de FFN511, PH-mNG y A655 cada 20-90 ms en la parte inferior de la célula (plano focal Z ~ 100-200 nm por encima de la membrana celular). Se realizó el registro de la pinza de parche de células enteras y la aplicación de una despolarización de -1 s de -80 a +10 mV para evocar exocitosis y endocitosis (Figura 3A-C). Esta despolarización indujo una corriente de calcio hacia adentro, un salto de capacitancia que indica exocitosis y una desintegración de capacitancia después del salto que indica endocitosis (Figura 3D, E).
Con imágenesfijas de lapso de tiempo XY/Z en la parte inferior de la célula, se observaron muchos eventos de fusión individuales 8,24 después de la despolarización (Figura 4A), mientras que se observaron eventos de fusión raros antes de la despolarización. Los eventos de fusión inducidos por el protocolo de despolarización 1 s se identificaron como disminución de la fluorescencia puntual FFN511 (FFFN) que refleja la liberación de FFN511, acompañada de FPH y aumento de la fluorescencia puntualA655 (F 655) que refleja la difusión de PH-mNG y A655 desde la membrana plasmática y la solución de baño hacia la vesícula fusionada (el perfil Ω generado por la fusión)15.
Después de la fusión, el perfil Ω generado por la fusión de vesículas con la membrana plasmática puede 1) cerrar su poro, denominado fusión cercana, 2) mantener un poro de fusión abierto, denominado fusión de permanencia, o 3) encogerse para fusionarse en la membrana plasmática, denominado fusión retráctil. La fusión cercana se identificó como atenuación F655 mientras que FPH se mantuvo o decayó con un retraso (Figura 4B). La permanencia-fusión se detectó como la presencia sostenida de manchas PH-mNG y A655 (Figura 4C). La fusión retráctil se detectó como desintegración paralela de FPH y F655 acompañada de una reducción de tamaño paralela del punto PH-mNG y el punto A655 (Figura 4D)8,15,16,24.
Figura 1: Representación esquemática del protocolo experimental. (A, B) Las glándulas suprarrenales bovinas se recortan con tijeras para eliminar el tejido graso (A), se enjuagan con la solución de Locke y se digieren a través de la vena suprarrenal (B). (C) El interior de una glándula suprarrenal sin digestión (izquierda) o después de una digestión adecuada (derecha). (D) Después de ser lavadas y digeridas, las médulas se aíslan y se pican en trozos pequeños, y las células cromafines se separan de las médulas picadas después de filtrar y centrifugar. (E) Las células cromafines se electroporan y se chapan en hojas de cubierta para su incubación. (F) En los días 2-3, verifique las células cromafines bajo un microscopio antes de la experimentación. (G) La muestra celular está incrustada en la cámara para el registro de la pinza de parche y la imagen confocal. Los cambios de corriente de calcio y capacitancia se registran, amplifican y muestran en el monitor. Los cambios de fluorescencia tras la estimulación se detectan y se muestran en el monitor. Barras de escala = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Patch-clamp y configuración confocal. (A) El día de la experimentación, las células cromafines cultivadas en coverslips se incuban con FFN511 durante 20 min. El tinte A655 se añade a la solución de baño. (B) Las células de cromafina en el recubierto se transfieren a una cámara de grabación y la solución de baño con A655 se agrega a la cámara. (C) Después de agregar una gota de aceite en el objetivo de inmersión de aceite 100x, la cámara se monta en la etapa de un microscopio confocal invertido. La punta del cable de tierra se sumerge en una solución de baño. La pipeta se coloca en su posición después de la carga con la solución de pipeta y se sujeta mediante un soporte de pipeta, que está unido a un cabezal. El estadio está controlado por un micromanipulador motorizado. (D) Después de encontrar una buena célula, mueva la punta de la pipeta a la solución de baño con el micromanipulador para iniciar el registro de la pinza de parche de célula entera y la obtención de imágenes confocales. Barras de escala = 10 mm (A), 5 mm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Registros de pinzas de voltaje de celda entera de corrientes de calcio y cambios de capacitancia inducidos por la despolarización. (A) Dibujo de configuración de celdas de cromafina durante el registro de pinzas de voltaje de celda entera. La célula cromafin se sumerge en una solución de baño que contiene A655 (rojo), y la membrana celular y las vesículas están marcadas con PH-mNG (verde) y FFN511 (cian), respectivamente. Esta imagen ha sido modificada con permiso de 24. (B) Una imagen representativa de una célula de cromafin sujeta con parche observada por campo brillante. (C) Imágenes representativas de PH-mNG (verde), A655 (rojo) y FFN511 (cian) en una célula con buen enfoque en la huella celular. (D) Un ejemplo de cambios de corriente de calcio y capacitancia inducidos por la despolarización de 1 s de -80 a +10 mV. (E) Los rastros promediados de las corrientes de calcio (ICa) y los cambios de capacitancia (Cm) recogidos de 20 células cromafines. Esta imagen ha sido modificada con permiso de 26. Barras de escala = 5 μm (B, C). Abreviaturas: ICa = corriente de calcio; Cm = capacitancia; Depol = despolarización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visualización de eventos de fusión bajo el microscopio confocal. (A) Se pueden detectar muchos puntos de fusión con imágenes confocales del plano XY de PH-mNG (verde), A655 (rojo) y FFN511 (cian) en la parte inferior de la célula. La fusión fue evocada por una despolarización de 1 s de -80 a +10 mV (depol1s). Las manchas FFN sufrieron liberación y fusión cercana (círculos). Se muestran imágenes antes (-1 s) y después (+1 s y +10 s) de despolarización. B) Un ejemplo de fusión estrecha. (C) Un ejemplo de fusión de estancia. (D) Un ejemplo de fusión retráctil. Esta imagen ha sido modificada con permiso de 24. Barras de escala = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Abreviaturas: Depol = despolarización; F = intensidad fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio/Solución | Descripción | ||
| La solución de Locke | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM de glucosa y 10 mM HEPES, pH 7,3, ajustado con NaOH | ||
| Solución enzimática | 1,5 mg/ml de colagenasa P, 0,325 mg/ml de inhibidor de tripsina y 5 mg/ml de albúmina sérica bovina en solución de Locke | ||
| Medio de cultivo | Medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% | ||
| Solución interna | 130 mM Cs-glutamato, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP y 0,5 mM GTP, pH 7,2, ajustado con CsOH | ||
| Solución de baño | 125 mM NaCl, 10 mM de glucosa, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl, y 20 mM TEA, pH 7.3, ajustado con NaOH | ||
Tabla 1: Detalles sobre la composición del medio de cultivo y las soluciones.
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Discussion
Se describe un método de imagen microscópica confocal para detectar la dinámica de la liberación de poros y transmisores de fusión, así como tres modos de fusión, fusión cercana, fusión de permanencia y fusión retráctil en células cromafines suprarrenales bovinas 4,24. Se describe un método electrofisiológico para despolarizar la célula y, por lo tanto, evocar exocitosis y endocitosis. El procesamiento sistemático de imágenes confocales proporciona información sobre diferentes modos de comportamiento de poros para eventos de fusión y fisión.
El monitoreo simultáneo de la corriente de calcio y los cambios de capacitancia en la misma célula con la configuración de toda la célula proporciona información adicional sobre la exocitosis y la endocitosis, lo que implica la proporción de apertura y cierre de poros a nivel de células enteras en un momento dado. Estos métodos son, en principio, aplicables a otras células excitables y células no excitables eléctricamente en cultivo primario o en líneas celulares que contienen vesículas de ~200-1.600 nm15. Además de las células cromafines, el método descrito aquí se ha aplicado a una línea de células beta pancreáticas de rata, las células INS-14.
En principio, el método también se puede aplicar a células secretoras que contienen vesículas menores de 200 nm. Sin embargo, a medida que disminuye el tamaño de la vesícula, la relación señal-ruido puede ser demasiado baja para una detección confiable. Las imágenes de superresolución en lugar de las imágenes confocales pueden ser necesarias. Hasta ahora, los métodos descritos aquí no se han aplicado a las sinapsis que contienen ~ 40 nm de vesículas sinápticas.
La implementación exitosa del método descrito aquí depende críticamente de varios pasos generales, como la calidad de la célula de cultivo, la eficiencia de transfección de plásmidos y la tasa de éxito del registro electrofisiológico. En primer lugar, las células sanas son vitales tanto para el registro de la pinza de parche como para las imágenes confocales. No se recomienda el uso de agentes antibacterianos o antifúngicos durante el cultivo, ya que estos productos químicos pueden afectar la excitabilidad de las células cromafines. Por lo tanto, el ejercicio diligente de la técnica estéril y el uso de medios recién preparados son importantes. Aunque las células cromafines de cultivo primario pueden sobrevivir en platos durante al menos una semana25, es importante que los nuevos usuarios usen células en los días 2 a 3 para los experimentos. A medida que los fibroblastos crecen gradualmente, se vuelve más difícil establecer la configuración de abrazadera de parche de células enteras. En segundo lugar, la eficiencia de electroporación de los plásmidos en las células cromafines es de aproximadamente el 20-30%. La eficiencia de la electroporación debe optimizarse si es demasiado baja o si la fluorescencia de PH-mNG es demasiado tenue. En tercer lugar, las células fueron fotografiadas en sus fondos con un objetivo de aceite 100x para obtener eventos sustanciales indicados por cambios en tres sondas fluorescentes: FFN511, PH-mNG y A655. Aunque DIC proporciona una visión más clara que el campo brillante o las imágenes a simple vista al establecer la configuración de celda completa, cualquier técnica de visualización que permita al usuario establecer la configuración es suficiente.
La fuerza de potencia láser adecuada es vital para la obtención de imágenes confocales en células vivas. Como FFN511 y mNG pueden ser blanqueados por alta potencia láser, es mejor buscar una buena célula con epifluorescencia antes de la visualización con láseres confocales. Para A655, se necesita excitación láser de alta potencia para blanquear el tinte dentro de las vesículas. Además, la razón más común por la que este experimento no tiene éxito es una falla en la grabación de la pinza de parche. Una punta de pipeta limpia y pulida del tamaño adecuado y la práctica de generar la configuración de celda completa en células cromafines son factores clave. Aunque puede llevar algún tiempo y esfuerzo tener éxito, una vez establecidos, estos experimentos proporcionan datos sustanciales con respecto a los eventos de fusión y fisión, lo que indica la apertura y el cierre de los poros de la membrana a un solo nivel de evento.
El protocolo descrito aquí se puede utilizar con algunas modificaciones para promover diferentes objetivos experimentales. Sin embargo, independientemente de los objetivos experimentales, es aconsejable utilizar primero una solución alta en potasio (como 70 mM KCl) como estímulo para ver los cambios que sufre la membrana al despolarizarse, asegurando que se puedan visualizar los cambios de intensidad en estos tres colorantes, FFN, PH y A655. La membrana plasmática puede etiquetarse con otros fluoróforos de unión a la membrana, como mCLING (grupo fluoróforo-cisteína-lisina-palmitoilo) de unión a la membrana)4,27 o CAAX (un motivo proteico que se dirige a la membrana plasmática cara al citosol a través de la isoprenilación de residuos de cisteína)4,28. A655 puede ser reemplazado por otros colorantes con diferentes espectros, como Atto 532 (A532), dependiendo de la combinación de moléculas fluorescentes utilizadas en ciertos experimentos15. El neuropéptido Y se puede utilizar en lugar de los falsos neurotransmisores fluorescentes16.
FFN511 se excitó a 458 nm en lugar de 405 nm en este experimento, a pesar de que el espectro de excitación máximo de FFN511 es de aproximadamente 405 nm. El estudio con registro de capacitancia no mostró diferencias significativas en las células cromafines con o sin PH-mNG, lo que indica que la sobreexpresión de PH-mNG no afecta la exocitosis y la endocitosis15,24. Se verificaron porcentajes similares para eventos de fusión en células cromafines marcadas con PH-mNG y A532 solamente o con FFN511, demostrando que la carga de FFN511 en vesículas de cromafina no afecta la liberación de contenido y los diferentes modos de fusión16. La estimulación de despolarización 1 s puede ser reemplazada por una solución alta en potasio u otros pattens de despolarización. Estas modificaciones se pueden utilizar para adaptarse a diferentes objetivos experimentales.
A pesar de las ventajas de este poderoso método, tiene algunas limitaciones. La mayor limitación está relacionada con la resolución limitada por difracción (~230 nm) de la microscopía confocal, que puede ser superada por técnicas de microscopía de superresolución más avanzadas29. El diámetro del gránulo en las células cromafines bovinas es de ~300 nm6, lo que permite observar la apertura y el cierre de los poros de la membrana dentro de la resolución espacial de la microscopía confocal. Sin embargo, las vesículas sinápticas son ~ 30-60 nm30, lo que está más allá de la resolución confocal. Extender estas mediciones de imágenes de células vivas a pequeñas vesículas sinápticas resulta ser difícil con las imágenes confocales.
Se han desarrollado técnicas de imagen de células vivas con mejor resolución temporal y/o espacial, como la microscopía STED, la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), la microscopía de localización fotoactivada (PALM), la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y la nanoscopía de flujos mínimos de fotones (MINFLUX) que pueden aplicarse a este método 31,32,33,34 . De hecho, la microscopía STED se ha utilizado para revelar la dinámica de los poros de fusión en las células cromafines. Los diferentes modos de eventos de fusión y cierre preformado de perfil Ω se pueden verificar aún más utilizando microscopía de superresolución como la microscopía STED24. Otras limitaciones incluyen el fotoblanqueo y la citotoxicidad de proteínas fluorescentes y colorantes.
Esta combinación de electrofisiología y microscopía confocal se puede aplicar ampliamente a muchas células secretoras. La combinación de la microscopía de superresolución con los métodos descritos aquí sería una herramienta valiosa para medir la dinámica de los poros de fusión en los circuitos neuronales en el futuro, siempre que la microscopía de superresolución se desarrolle hasta tal punto que pueda resolver el poro de fusión en las terminales nerviosas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los Programas de Investigación Intramuros del NINDS (ZIA NS003009-13 y ZIA NS003105-08) por apoyar este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
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