Summary
Denne protokollen beskriver en konfokal bildeteknikk for å oppdage tre fusjonsmoduser i bovin binyre binyrene. Disse fusjonsmodusene inkluderer 1) tett fusjon (også kalt kyss-og-løp), som involverer fusjonsporeråpning og -lukking, 2) stay-fusion, som involverer fusjonsporering og vedlikehold av den åpne poren, og 3) krympefusjon, som involverer smeltet vesiclekrymping.
Abstract
Dynamisk fusjon pore åpning og lukking mediat exocytosis og endokytose og bestemme deres kinetikk. Her er det demonstrert i detalj hvordan konfokal mikroskopi ble brukt i kombinasjon med patch-clamp opptak for å oppdage tre fusjonsmoduser i primærkultur bovin binyre binyrene celler. De tre fusjonsmodusene inkluderer 1) nærfusjon (også kalt kyss-og-løp), som involverer fusjonsporåpning og -lukking, 2) stay-fusion, som involverer fusjonsporåpning og vedlikehold av den åpne poren, og 3) krympefusjon, som involverer krymping av den fusjonsgenererte Ω-formprofilen til den smelter helt sammen ved plasmamembranen.
For å oppdage disse fusjonsmodusene ble plasmamembranen merket med overekspresserende mNeonGreen festet med PH-domenet til fosfolipase C δ (PH-mNG), som binder seg til fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PtdIns(4,5)P2) ved det cytosolvendte pakningsvedlegget i plasmamembranen; vesicles ble lastet med fluorescerende falsk nevrotransmitter FFN511 for å oppdage vesikulær innholdsutgivelse; og Atto 655 ble inkludert i badeløsningen for å oppdage fusjonsporedlegging. Disse tre fluorescerende sondene ble avbildet samtidig ved ~ 20-90 ms per ramme i levende kromatinceller for å oppdage fusjonsporåpning, innholdsutgivelse, fusjonsporerende og fusjonerende vesiclestørrelsesendringer. Analysemetoden er beskrevet for å skille tre fusjonsmoduser fra disse fluorescensmålingene. Metoden beskrevet her kan i prinsippet gjelde for mange sekretoriske celler utover kromoffinceller.
Introduction
Membranfusjon formidler mange biologiske funksjoner, inkludert synaptisk overføring, blodsukker homeostase, immunrespons og viral oppføring 1,2,3. Exocytose, som involverer vesiclefusjon ved plasmamembranen, frigjør nevrotransmittere og hormoner for å oppnå mange viktige funksjoner, for eksempel nevronale nettverksaktiviteter. Fusion åpner en pore for å frigjøre vesikulært innhold, hvorpå poren kan lukke seg for å hente den fusing vesicle, som kalles kyss-og-kjør 1,4. Både irreversibel og reversibel fusjonsporåpning kan måles med celletilknyttede kapasitansopptak kombinert med fusjons poreledningsopptak av enkelt vesiclefusjon.
Dette tolkes ofte som reflekterende full-kollaps fusjon, som involverer utvidelse av fusjonen til sammenslåing av fusjon vesicle, og kyss-og-løp, involverer fusjon pore åpning og lukking, henholdsvis 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Nylige konfokale og stimulerte utslippsuttømmingsstudier (STED) i kromboffinceller observerte direkte fusjonsporåpning og -lukking (kyss-og-løp, også kalt nærfusjon), fusjonsporåpning som opprettholder en Ω-form med en åpen pore i lang tid, betegnet stay-fusion og krymping av fusing vesicle til den komplette fusjonerer med plasmamembranen, som erstatter full-kollaps fusjon for sammenslåing av fusing vesiles med plasmamembranen4, 8,14,15,16,17.
I nevroner har fusjonsporåpning og -lukking blitt oppdaget med avbildning som viser frigjøring av kvanteprikker forhåndslastet i vesikler som er større enn fusjonsporene og med fusjonsporiske ledningsmålinger ved frigjøringsflaten til nerveterminaler 5,18,19. Binyrenes kromoffinceller er mye brukt som modell for studiet av ekso- og endokytose 20,21. Selv om kromoffinceller inneholder store tette vesicles, mens synapser inneholder små synaptiske vesicles, er eksocytose- og endokytoseproteinene i kromboffinceller og synapser ganske analoge 10,11,12,20,21,22,23.
Her beskrives en metode for å måle disse tre fusjonsmodusene ved hjelp av en konfokal avbildningsmetode kombinert med elektrofysiologi i bovin binyrenes kromoffinceller (figur 1). Denne metoden innebærer lasting av fluorescerende falske nevrotransmittere (FFN511) i vesikler for å oppdage eksocytose; tilsetning av Atto 655 (A655) i badeløsningen for å fylle den fusjonsgenererte Ω-formprofilen, og merking av plasmamembranen med PH-domenet til fosfolipase C δ (PH), som binder seg til PtdIns (4,5)P2 ved plasmamembranen 8,15,24. Fusion poredynamikk kan oppdages gjennom endringer i forskjellige fluorescerende intensiteter. Selv om det er beskrevet for kromboffinceller, kan prinsippet om denne metoden beskrevet her brukes mye på mange sekretoriske celler langt utover kromoffinceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dyrebruksprosedyren fulgte NIH-retningslinjene og ble godkjent av NIH Animal Care and Use Committee.
1. Bovine chromaffin cellekultur
- Forbered Lockes løsning (tabell 1) og autoklavverktøy 1 dag før chromaffincellekultur.
- Få bovin binyrene fra en lokal abattoir på kulturdagen, og hold dem nedsenket i iskald Lockes løsning før disseksjon.
MERK: Binyrene er fra 21-27 måneder gamle, sunne, svarte Angus av begge kjønn (hovedsakelig mannlige) med kroppsvekt rundt 1,400 pounds (~ 635 kg). - Forbered 30 ml (for 3 binyrene) fersk enzymoppløsning som inneholder kollagenase P, trypsinhemmer og bovint serumalbumin (tabell 1) før disseksjon og hold den ved romtemperatur.
- Velg 3 intakte kjertler uten kutt eller blødninger på overflaten og fjern fettvevet med saks (figur 1A). Vask kjertlene ved perfusjon med Lockes løsning til det ikke kommer blod ut. For å oppnå dette, blås opp kjertelen gjennom binyreåren (figur 1B) ved hjelp av en 30 ml sprøyte festet med et 0,22 μm filter så mange ganger som nødvendig25.
MERK: Omtrent 150 ml Lockes oppløsning er vanligvis nødvendig for å vaske 3 kjertler. - For fordøyelsen, injiser enzymoppløsningen gjennom binyreåren ved hjelp av en 30 ml sprøyte festet med et 0,22 μm filter til kjertelen begynner å svulme. La deretter kjertlene stå på 37 °C i 10 minutter. Injiser igjen og la kjertlene stå på 37 °C i ytterligere 10 minutter.
MERK: Omtrent 30 ml enzymoppløsning er nødvendig for å fordøye 3 kjertler. - Etter fordøyelsen, kutt kjertelen langsgående fra venen til den andre enden med saks for å utfolde kjertelen (figur 1C). Isoler medullaen ved å pinse ut den hvite medullaen i en 10 cm Petri-tallerken som inneholder Lockes løsning.
MERK: Sammenligningen av det indre av kjertelen før og etter fordøyelsen er vist i figur 1C. Detaljene i fordøyelsen og medullaeisolasjonen er rapportert tidligere23,25. - Klipp og hakk medulla i små biter med saks (figur 1D). Filtrer medullafjæringen med et 80-100 μm nylonnett til et beger. Overfør deretter filtratet til et 50 ml nålerør for sentrifugering ved 48 × g, romtemperatur, i 3 min med retardasjon på 3.
MERK: Mincing av medullae tar vanligvis ~ 10 min. For å oppnå et godt utbytte av celler må hakkede stykker være svært små, til de ikke kan pinsett opp. - Etter sentrifugering, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten med Lockes løsning ved pipettering. Filtrer cellefjæringen med en 80-100 μm sil, og sentrifuge ved 48 x g, romtemperatur, i 3 min med retardasjon på 3.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten med 30 ml kulturmedium (tabell 1). Bestem cellenummeret ved hjelp av hemacytometertellingskamre25.
2. Transfeksjon med elektroporasjon
- Overfør 2,8 × 106 celler til et 15 ml rør. Pellet cellene ved sentrifugering ved 48 × g i 2 min med retardasjon på 3. Tilsett 100 μL transfeksjonsbuffer (se materialtabellen) levert av produsenten til cellepelleten, og tilsett deretter 2 μg PH-mNG plasmid.
MERK: PH-mNG-plasmidet ble opprettet ved å erstatte det forbedrede grønne fluorescerende proteinet (EGFP) med mNG i PH-EGFP15 (se materialtabellen). - Bland suspensjonen forsiktig ved å pipettere oppløsningen opp og ned, og overfør blandingen til en elektroporasjonsklynett uten forsinkelse (figur 1E). Overfør umiddelbart cuvette til elektroporatoren (se materialtabellen), velg O-005-programmet i skjermlisten og trykk Enter for å utføre elektroporasjon.
MERK: Forbered cellefjæringen for transfeksjon i en cellekulturhette. Ikke innfør luftbobler i fjæringen under blandetrinnet. Fortsett til neste trinn uten forsinkelse. - Etter elektroporasjon, tilsett 1,8 ml medium umiddelbart til cuvette og bland forsiktig med en mikropipettor utstyrt med en steril spiss. Tilsett deretter 300 μL av suspensjonen av de elektroporerte cellene på toppen av dekslene (se materialtabellen) i hver tallerken, plating 5-6 retter totalt for en elektroporasjonsreaksjon.
- Overfør forsiktig rettene til en fuktet inkubator ved 37 °C med 9 % CO2 i 30 minutter, og tilsett forsiktig 2 ml forvarselt medium til hver tallerken etter 30 minutter.
- Oppbevar de transfekterte cellene i den fuktede inkubatoren ved 37 °C med 9 % CO2 i 2–3 dager før eksperimentering.
MERK: De kultiverte cellene varer i en uke. Det er best å bruke dyrkede celler på dag 2-3.
3. Forberedelse for patch-klemme opptak og konfikal avbildning
MERK: Denne protokollen ble utført med et laserskanningskonfokalt mikroskop og patch-clamp forsterker med spenningsklemmeopptak sammen med en innlåsingsforsterker for kapasitansopptak. Et XY-plan konfokalt bildebehandling på et fast Z-plan (XY/Zfast skanning) ble brukt til å avbilde alle tre fluorescerende signaler samtidig. Z-flyet var fokusert på cellebunnen der plasmamembranen holdt seg til dekslene.
- På dagen for patch-klemmen og bildebehandlingseksperimentet, observere cellene under et fluorescensmikroskop. Bruk brightfield for å sikre at cellekulturen ikke er forurenset (figur 1F) og epifluorescens for å se etter riktig uttrykk for det fluorescerende taggede proteinet.
MERK: Ph-mNG uttrykkes for eksempel ved plasmamembranen på ~ 20-30% av cellene. - Forbered patchpipetter fra borosilikatglass kapillærer. For å gjøre dette, trekk pipettene med en pipettetrekker, belegge spissene med flytende voks og polere dem med en mikroforge (se materialtabellen).
- Slå på patch-clamp opptaksforsterkeren og start patch-clamp opptaksprogramvaren (se materialtabellen). Angi de riktige parametrene for kalsiumstrøm og kapasitansopptak i programvaren (se materialtabellen).
- Angi en registreringsprotokoll på totalt 60 s varighet, der stimuleringen starter på 10 s.
- Sett holdepotensialet for spenningsklemmeopptak til -80 mV. Sett en 1 s depolarisering fra -80 mV til 10 mV som stimulans for å indusere kalsiumtilstrømning og kapasitanshopp.
- For kapasitansmålinger setter du frekvensen av den sinusformede stimulansen til et område på 1000-1500 Hz med en topp-til-topp spenning på ikke mer enn 50 mV.
- Lagre protokollen, og opprett en ny fil for innspilling.
- Slå på det konfokale mikroskopsystemet og angi de riktige parametrene i programvaren (se materialtabellen).
- Slå på laserne, inkludert 458 nm, 514 nm og 633 nm, og still inn utslippsinnsamlingsområdet for hver laser i henhold til hver fluorescenssonde som i det følgende. FFN511: eksitasjonsbølgelengde (EX), 458 nm; bølgelengde (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
- Bruk sekvensiell avbildning for FFN511 og mNG for å unngå krysstale mellom disse to sondene. Angi et tidsforløp på 1 min. varighet for bildeopptak (figur 1G).
4. Patch-clamp opptak og konfikal avbildning
- Velg en tallerken med god celletilstand og riktig uttrykk og tilsett 2 μL fluorescerende falsk nevrotransmitter FFN511 (10 mM lager, 1:1,000 arbeidsløsning) i mediet. Sett parabolen tilbake i inkubatoren i 20 min. Alternativt kan du laste inn FFN511 etter trinn 3.2 og utføre trinn 3.3-3.5 mens du venter på å spare tid.
- Etter at FFN511-lasten er ferdig, klargjør du opptakskammeret og tilsetter 2 μL fluorescerende fargestoff A655 i 500 μL av badeløsningen (figur 2A og tabell 1). Overfør dekslene fra retten til opptakskammeret (se materialbordet) med pinsett, og tilsett umiddelbart A655-inneholdende badeløsning (figur 2B).
MERK: A655 holdes i -20 °C med en konsentrasjon på 10 mM og arbeidskonsentrasjonen er 40 μM.
FORSIKTIG: Bruk hansker for å unngå direkte hudkontakt med FFN511 eller A655. - Plasser en dråpe olje (brytningsindeks: 1,518; se materialtabellen) på 100x oljeinnlevelsesmål (numerisk blenderåpning = 1,4). Monter kammeret i mikroskopet og bruk justeringsknappen til å få oljen til å bare komme i kontakt med bunnen av dekslene, og senk deretter jordledningsspissen ned i badeløsningen (figur 2C, D).
MERK: Velg en nedsenkningsolje som passer til å arbeide ved romtemperatur. Det er unødvendig å bytte mellom objektivet for lav og høy forstørrelse. Romtemperaturen opprettholdes rundt 20-22 °C under registrering. - Få cellene i fokus og bruk brightfield og confocal imaging for å finne en god celle med mNG-uttrykk. Zoom inn på den merkede cellen, og juster den til midten av visningen for å minimere tomme områder.
MERK: Den skjematiske tegningen av fluorescensmerking er vist i figur 3A. En god celle har vanligvis en jevn membran og ren kant (figur 3B). Med epifluorescens eller konfokal avbildning ser det ut til at en god celle har en stor og flat bunn med lyst mNG-uttrykk (figur 3C).
Pikselstørrelsen er ~ 50 nm, innenfor et område på ~ 40-80 nm i henhold til forskjellig cellestørrelse og zoomfaktor. - Definer parametere for XY-planets konfokale bildebehandling ved et fast Z-plan (XY/Zfast skanning) av FFN511, PH-mNG og A655, med et minimert tidsintervall. Juster fokuset til bunnen av cellen med finjusteringsknappen.
MERK: PH-mNG signaliserer konturen til celleplasmamembranen ved konfekt XY-plankrysset (unntatt cellebunnen). I nærheten av cellemembranbunnen kan det observeres A655 flekker, som reflekterer Ω- eller Λ-formmembraninvaginasjoner. Hvis Z-fokalplanet er lavere enn cellebunnen, blir intensiteten av all fluorescens svakere. - Juster eksitasjonslaserkraften i programvaren for å finne en innstilling for å få det beste signal-til-støy-forholdet og unngå betydelig fluorescensbleking. For å gjøre dette, start med en start testverdi på 2,5 mW strøm for FFN511 spent på 458 nm og 1 mW for mNG spent på 514 nm. For A655 spent på 633 nm med en HeNe laser, bruk høy lasereffekt, ~ 12-15 mW (dvs. 70% -80% av maksimumet), som ved kontinuerlig eksitasjon kan bleke alle fluorescerende A655 inne i en Ω-form profil når poren er lukket.
MERK: Hvis lasereffekten er for høy, blir PH-mNG og FFN511 fluorescens raskt bleket. Hvis lasereffekten er for lav, vil signalene være for svake eller støyende til å analyseres. - Tilsett 9 μL innvendig oppløsning (tabell 1) i en patchpipette og fest pipetten til holderen i patchklemmeforsterkerstadiet (se materialtabellen).
- Påfør en liten mengde positivt trykk med en sprøyte og flytt pipettespissen for å berøre badeløsningen med en mikromanipulator. Forsikre deg om at forsterkeren viser at pipettemotstanden er ~ 2-4 MΩ med en spenningspulstest. Trykk på LJ/Auto for å avbryte det flytende krysset.
- Flytt pipetten mot den valgte cellen med mikromanipulatoren. Hvis du vil danne en celle tilkoblet modus, flytter du pipettespissen for å berøre cellen (motstanden øker); påføring av negativt trykk forsiktig med sprøyten (motstanden vil øke til mer enn 1 GΩ), endre holdepotensialet fra 0 til -80 mV.
- Når motstanden passerer 1 GΩ, vent til ~ 30 s for at konfigurasjonen skal stabilisere seg. Trykk på C-fast/Auto for å kompensere for rask kapasitans.
- For å danne en helcellemodus, bruk pulserende kort, men kraftig negativt trykk med sprøyten for å sprekke membranen (formen på den nåværende pulsen endres med en ladet og utladet membrankondensator). Trykk på C-slow/Auto for å kompensere for langsom kapasitans.
- Juster bildefokuset litt for å fokusere på cellebunnen. Start confocal timelapse-avbildning og patch-clamp-opptak samtidig ved å klikke på Start-knappene i de to forskjellige programmene samtidig.
MERK: Den konfokale bildebehandlingsprogramvaren lager en film med en hastighet på ~ 20-90 ms / ramme. Patch-klemmeopptaket inkluderer hviletilstanden i 10 s, 1 s depolariseringstimulering og ytterligere 49 s etter stimulering. Patch-clamp-konfigurasjonen tillater registrering av kalsiumstrøm, kapasitanshopp og forfall forårsaket av 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV (figur 3D). - Når innspillingen er fullført, må du sørge for at dataene er lagret. Endre holdepotensialet tilbake til 0 mV. Flytt pipetten ut av badeløsningen og kast den.
- Gjenta trinn 4.7-4.13 for å registrere en annen celle i parabolen. Etter 1 h innspilling, bytt til en annen tallerken for opptak.
MERK: Etter 1 t opptak reduseres suksessraten for patch-clamp-opptak betydelig. For å øke effektiviteten til datainnsamlingen, anbefales det å registrere for bare 1 time i hver tallerken.
5. Patch-klemme dataanalyse
- Åpne passende programvare (se materialfortegneren) for dataanalyse. Klikk PPT-| Last inn PULSE-fil | Filknapper for å laste inn den .dat filen. Klikk gjør det og fire spor vil bli plottet inn i en graf automatisk inkludert kalsiumstrøm og kapasitansspor.
- Klikk Windows | Nye Graph-knapper , velg Pulse_1_1_1, den første bølgen i Y Wave(s), og klikk Gjør det for å tegne inn kalsiumstrømgrafen. Klikk Windows | Nye tabellknapper , velg Pulse_1_1_1, og klikk Gjør det for å vise rådataene for kalsiumstrømmen, som kan brukes til å tegne inn gjennomsnittlig spor av flere celler.
- Tegn en firkant tilsvarende i kalsiumstrømgrafen, høyreklikk og utvid det nåværende signalet for å inkludere grunnlinjen og toppen av kalsiumstrømmen. Klikk Graph | Vis informasjon for å vise markørene A og B og flytte dem til henholdsvis grunnlinjen og toppen. Grafinformasjonen vises nederst, og parametere kan estimeres.
- Gjenta trinn 5.2, men velg Pulse_1_1_1_Cm, den andre bølgen i Y Wave(s), for å plotte kapasitanssporingen. Gjenta trinn 5.3 og plasser A- og B-markører i riktig posisjon for å måle kapasitansparametrene, for eksempel grunnlinje, amplitude og forfallshastighet.
- Kopier rådata i trinn 5.2 inn i et regneark, beregn gjennomsnittet og standardfeilen for gjennomsnitt for en gruppe registrerte celler, og tegn inn de gjennomsnittlige sporene av kalsiumstrøm og membrankapasitans (figur 3E) i en passende programvare.
6. Confocal bildebehandling dataanalyse
- Åpne raw-bildefilene med eventuell programvare fra produsenten (se materialfortegneren).
MERK: Noen andre gratis programmer, for eksempel ImageJ eller Fiji, kan brukes til databehandling og kvantifisering av bildene som er oppnådd i avsnitt 4. - Klikk Behandle | ProcessTools og bruke verktøyene til å generere rullende gjennomsnitt (f.eks. rullende gjennomsnitt for hver 4 bilder) filer for hvert timelapse bilde og lagre disse filene.
MERK: Etter rullende gjennomsnitt kan passende justering av lysstyrken og bakgrunnen gjøres for å vise fluorescensendringene til tre kanaler bedre, noe som kan bidra til å identifisere fusjonshendelser. Kontroller fluorescerende intensitet i noen regioner uten fusjonshendelse kan bidra til å skille fluorescerende signal om fusjonshendelser fra bakgrunnssignaler. - Klikk knappene Kvantifiser | Verktøy | Stableprofil, kontroller tidspunkter før og etter stimulering for å identifisere fluorescensendringer i hver kanal. Klikk Tegn ellipse for å sirkle inn interesseområdene (ROIene) for fusjonshendelser. Høyreklikk på bildet og klikk Lagre ROIer for å lagre ROIene.
MERK: Størrelsen på avkastningen, som dekker alle de tre fluorescerende signalene, var lik vesiclestørrelsen i kromoffincellene24. Rådata ble brukt til analysen, mens de rullende gjennomsnittsdataene som øker signal-til-støy-forholdet ble gitt for å vise klart de tre signalene. - Klikk Åpne prosjekter for å finne RAW-filen, høyreklikk på bildet og klikk Last inn ROIer for å laste inn ROI-filen i RAW-bildefilene for å måle fluorescensintensitetene.
MERK: Det rå fluorescerende signalet vil bli brukt til å plotte spor av forskjellige kanaler. For hver avkastning defineres grunnlinjen som intensiteten før stimulering, og intensitetssporene kan normaliseres til baseline. - Klikk Verktøy | Sorter ROIer i programvaren og plott sporene for alle tre kanalene i hver avkastning. Klikk Rapport for å lagre avkastningsdataene, inkludert både digitale data og bildesporinger for hver avkastning, i en filmappe.
- Identifiser en fusjonshendelse ved samtidig økning i intensiteten av PH-mNG (FPH) og A655 (F655) spotfluorescens (innenfor en enkelt ramme), ledsaget av en reduksjon i FFN511 spotfluorescens (FFFN).
- Se etter utseendet til FPH og F655, som indikerer PH-mNG / A655 spotdannelse på grunn av en Ω-profil generert av fusjon, slik at diffusjonen av PH-mNG fra plasmamembranen og vedvarende diffusjon av A655 fra badet.
- Se etter FFFN-reduksjon , noe som indikerer frigjøring fra en vesicle på grunn av fusjonsporéåpning og utelukker muligheten for at FPH og F655 utseende kan være fra membraninvaginering forårsaket av endokytose.
- Inspiser de faste bildene for tidsforløpXY /Z som viser fusjonshendelser som skjer på cellebunnen. Analyser tre moduser for fusjonshendelser: 1) nærfusjon, 2) stay-fusion og 3) krympefusjon.
MERK: Fusjonshendelser ble sjelden observert før depolarisering, mens titalls fusjonshendelser kunne observeres etter depolarisering. Etter fusjon kan Ω-profilen lukke poren, opprettholde sin åpne pore eller krympe for å fusjonere inn i plasmamembranen.- For å identifisere tett fusjon, se etter dimming F655 fordi fusjon pore lukking forhindrer utveksling av bad A655, mens FPH opprettholder, reflekterer den fortsatte konverteringen av PtdIns (4,5)P2 til PtdIns(4)P, eller FPH forfaller med en forsinkelse, reflekterer vesicle pinch-off (nær-fusion, Figur 4A, B).
- Se etter vedvarende FPH og F655 for å identifisere stay-fusion (figur 4C).
- Se etter parallelle reduksjoner av FPH og F655, noe som indikerer Ω-profil krymping for å identifisere krympefusjon (figur 4D).
MERK: Kontroller de opprinnelige bildefilene for å undersøke bildesporingene hvis de er usikre på hendelsestypen. Kontroll av fluorescerende intensitet i noen regioner uten fusjonshendelse kan bidra til å skille fluorescerende signal om fusjonshendelser fra bakgrunnssignaler.
- Plott representative spor av intensitetsendringer for disse tre kanalene: FFN511, PH-mNG og A655. Kvantifisere prosentandelen av forskjellige fusjonsmoduser i hver celle og plottfigurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter de eksperimentelle prosedyrene som er vist i figur 1 og figur 2, ble kromaffinceller fra bovin binyrene transfektert med PH-mNG for å merke plasmamembranen; A655 ble lagt til badeløsningen for å oppdage fusjon porelukking; fluorescerende falsk nevrotransmitter FFN511 ble lastet i vesicles for påvisning av frigjøring. Deretter ble XY-plane confocal timelapse imaging av FFN511, PH-mNG og A655 utført hver 20-90 ms ved cellebunnen (Z-fokalplan ~ 100-200 nm over cellemembranen). Helcellet patch-clamp-opptak og påføring av en 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV ble utført for å fremkalle ekso- og endokytose (figur 3A-C). Denne depolariseringen induserte en innadvendt kalsiumstrøm, et kapasitanshopp som indikerer eksocytose, og en kapasitansforfall etter hoppet som indikerer endokytose (figur 3D, E).
Med tidsforløp XY/Zfast bildebehandling på cellebunnen ble mange individuelle fusjonshendelser observert 8,24 etter depolarisering (figur 4A), mens sjeldne fusjonshendelser ble observert før depolarisering. Fusjonshendelser forårsaket av 1 s depolariseringsprotokoll ble identifisert som FFN511 spotfluorescens (FFFN) reduksjon som reflekterer FFN511-utgivelsen, ledsaget av FPH og A655 spotfluorescens (F655) økning reflekterende PH-mNG og A655 diffusjon fra plasmamembranen og badeløsningen inn i fusing vesicle (den fusjonsgenererte Ω-profil)15.
Etter fusjon, den Ω-profil generert av vesicle fusjon med plasmamembranen kan 1) lukke sin pore, betegnet nær-fusion, 2) opprettholde en åpen fusjon pore, betegnet stay-fusion, eller 3) krympe for å fusjonere inn i plasmamembranen, kalt krympe-fusjon. Nærfusjon ble identifisert som F655 dimming mens FPH opprettholdt eller forfalt med en forsinkelse (figur 4B). Stay-fusion ble oppdaget som vedvarende tilstedeværelse av både PH-mNG og A655 flekker (figur 4C). Krympefusjon ble påvist som parallell FPH og F655 forfall ledsaget av en parallell størrelsesreduksjon av PH-mNG-punktet og A655-stedet (figur 4D) 8,15,16,24.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle protokollen. (A, B) Binyrene trimmes med saks for å fjerne fettvev (A), skylles med Lockes løsning og fordøyes gjennom binyreåre (B). (C) Interiøret i en binyrene uten fordøyelse (venstre) eller etter riktig fordøyelse (høyre). (D) Etter å ha blitt vasket og fordøyd, isoleres medullaen og hakkes i små biter, og kromatinceller skilles fra hakket medullae etter filtrering og sentrifugering. (E) Kromboffinceller er elektroporerte og belagt på deksler for inkubasjon. (F) På dag 2-3 må du kontrollere kromoffincellene under et mikroskop før eksperimentering. (G) Celleprøven er innebygd i kammeret for patch-clamp opptak og konfektavbildning. Endringer i kalsiumstrøm og kapasitans registreres, forsterkes og vises på skjermen. Fluorescensendringer ved stimulering oppdages og vises på skjermen. Skalastenger = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Patch-clamp og confocal setup. (A) På eksperimentdagen inkuberes kromoffincellene som vokser på deksler, med FFN511 i 20 minutter. Fargestoffet A655 legges til badeløsningen. (B) Kromboffinceller på dekslene overføres til et opptakskammer, og badeløsningen med A655 legges til kammeret. (C) Etter å ha tilsatt en dråpe olje på 100x olje nedsenkningsmålet, er kammeret montert på scenen til et invertert konfokalt mikroskop. Spissen av jordledningen er nedsenket i badeløsning. Pipetten bringes på plass etter lasting med pipetteoppløsning og holdes av en pipetteholder, som er festet til et hodesett. Headstage styres av en motorisert mikromanipulator. (D) Etter å ha funnet en god celle, flytt pipettespissen inn i badeløsningen med mikromanipulatoren for å starte helcellet patch-clamp-opptak og konfokal avbildning. Skalastenger = 10 mm (A), 5 mm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Helcellespenningsklemmeopptak av kalsiumstrømmer og kapasitansendringer forårsaket av depolarisering. (A) Oppsetttegning av kromoffinceller under helcellet spenningsklemmeopptak. Kromoffincellen er nedsenket i A655-inneholdende badeløsning (rød), og cellemembranen og vesiklene er merket med ph-mNG (grønn) og FFN511 (cyan). Dette bildet er endret med tillatelse fra 24. (B) Et representativt bilde av en lappklemmet kromoffincelle observert av brightfield. (C) Representative bilder av PH-mNG (grønn), A655 (rød) og FFN511 (cyan) i en celle med godt fokus på cellefotavtrykket. (D) Et eksempel på kalsiumstrøm og kapasitansendringer indusert av 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV. (E) Gjennomsnittlige spor av kalsiumstrømmer (ICa) og kapasitans (Cm) endringer samlet inn fra 20 kromaffinceller. Dette bildet er endret med tillatelse fra 26. Skalastenger = 5 μm (B, C). Forkortelser: ICa = kalsiumstrøm; Cm = kapasitans; Depol = depolarisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Visualisering av fusjonshendelser under det konfokale mikroskopet. (A) Mange fusjonsflekker kan påvises med konfokal XY-planavbildning av PH-mNG (grønn), A655 (rød) og FFN511 (cyan) nederst i cellen. Fusion ble fremkalt av en 1 s depolarisering fra -80 til +10 mV (depol1s). FFN-flekker gjennomgikk frigjøring og tett fusjon (sirkler). Bilder før (-1 s) og etter (+1 s og +10 s) depolarisering vises. (B) Et eksempel på nærfusjon. (C) Et eksempel på stay-fusion. (D) Et eksempel på krympefusjon. Dette bildet er endret med tillatelse fra 24. Skalastenger = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Forkortelser: Depol = depolarisering; F = fluorescerende intensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Middels/løsning | Beskrivelse | ||
| Lockes løsning | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM glukose og 10 mM HEPES, pH 7,3, justert med NaOH | ||
| Enzym løsning | 1,5 mg/ml kollagenase P, 0,325 mg/ml trypsinhemmer og 5 mg/ml bovint serumalbumin i Lockes oppløsning | ||
| Kultur medium | DMEM medium supplert med 10% foster bovint serum | ||
| Intern løsning | 130 mM Cs-glutamat, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP og 0,5 mM GTP, pH 7,2, justert med CsOH | ||
| Badeløsning | 125 mM NaCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl og 20 mM TE, pH 7,3, justert med NaOH | ||
Tabell 1: Detaljer om sammensetningen av kulturmedium og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En konfokal mikroskopisk bildemetode er beskrevet for å oppdage dynamikken i fusjonspor og senderutløsning, samt tre fusjonsmoduser, tett fusjon, stay-fusion og krympefusjon i bovin binyre binyrenes kromatinceller 4,24. En elektrofysiologisk metode for å depolarisere cellen og dermed fremkalle ekso- og endokytose er beskrevet. Systematisk konfokal bildebehandling gir informasjon om ulike typer poreoppførsel for fusjons- og fisjonshendelser.
Samtidig overvåking av kalsiumstrøm og kapasitansendringer i samme celle med helcellekonfigurasjonen gir tilleggsinformasjon om ekso- og endokytose, noe som til enhver tid innebærer forholdet mellom poreåpning og lukking på et helt cellenivå. Disse metodene gjelder i prinsippet for andre spennende celler og ikke-eklektrisk spennende celler i primærkulturen eller i cellelinjer som inneholder vesikler på ~ 200-1600 nm15. I tillegg til kromoffinceller er metoden beskrevet her brukt på en betacellelinje i bukspyttkjertelen, INS-1 celle4.
I prinsippet kan metoden også brukes på sekretoriske celler som inneholder vesikler mindre enn 200 nm. Men etter hvert som vesiclestørrelsen reduseres, kan signal-til-støy-forholdet være for lavt for pålitelig deteksjon. Avbildning med superoppløsning i stedet for konfikal avbildning kan bli nødvendig. Så langt har metodene beskrevet her ikke blitt brukt på synapser som inneholder ~ 40 nm synaptiske vesicles.
Vellykket implementering av metoden beskrevet her avhenger kritisk av flere generelle trinn, for eksempel kulturcellekvaliteten, plasmid transfeksjonseffektivitet og elektrofysiologisk registreringssuksess. For det første er sunne celler avgjørende for både patch-clamp opptak og confocal avbildning. Det anbefales ikke å bruke antibakterielle eller antifungale midler under kultur fordi disse kjemikaliene kan påvirke eksitabiliteten av kromatinceller. Dermed er flittig trening av steril teknikk og bruk av nylagde medier viktig. Selv om primærkulturkromatinceller kan overleve i retter i minst en uke25, er det viktig for nye brukere å bruke celler på dag 2 til 3 for forsøkene. Etter hvert som fibroblaster vokser gradvis, blir det vanskeligere å etablere hele celle patch-clamp-konfigurasjonen. For det andre er elektroporasjonseffektiviteten til plasmider i kromoffinceller ca. 20-30%. Elektroporasjonseffektiviteten må optimaliseres hvis den er for lav eller PH-mNG-fluorescensen er for svak. For det tredje ble celler avbildet på bunnen med et 100x oljemål om å oppnå betydelige hendelser indikert ved endringer i tre fluorescerende sonder: FFN511, PH-mNG og A655. Selv om DIC gir en klarere visning enn lyse felt eller nakenøyebilder når du etablerer helcellekonfigurasjonen, er enhver visualiseringsteknikk som lar brukeren etablere konfigurasjonen tilstrekkelig.
Passende laserkraftstyrke er avgjørende for konfektavbildning i levende celler. Siden FFN511 og mNG kan bli bleket av høy laserkraft, er det bedre å se etter en god celle med epifluorescens før visualisering med konfokale lasere. For A655 er høyeffekts lasereksitasjon nødvendig for å bleke fargestoffet inne i vesikler. I tillegg er den vanligste årsaken til at dette eksperimentet ikke lykkes, en feil i patch-clamp-opptak. En ren og polert pipettespiss av riktig størrelse og praksis som genererer helcellekonfigurasjonen på kromatinceller er nøkkelfaktorer. Selv om det kan ta litt tid og krefter å lykkes, når de er etablert, gir disse eksperimentene betydelige data om både fusjons- og fisjonshendelser, noe som indikerer åpning og lukking av membranporer på ett enkelt arrangementsnivå.
Protokollen som er beskrevet her, kan brukes med noen modifikasjoner for å fremme forskjellige eksperimentelle mål. Men uavhengig av eksperimentelle mål, er det tilrådelig å først bruke høy kaliumoppløsning (for eksempel 70 mM KCl) som en stimulus for å se endringene membranen gjennomgår når den blir depolarisert, slik at intensitetsendringene i disse tre fargestoffene, FFN, PH og A655, kan visualiseres. Plasmamembranen kan merkes med andre membranbindende fluoroforer, for eksempel mCLING (membranbindende fluorofor-cystein-lysin-palmitoylgruppe)4,27 eller CAAX (et proteinmotiv som retter seg mot cytosol-faced plasmamembran via cysteinrester isoprenylering)4,28. A655 kan erstattes med andre fargestoffer med forskjellige spektra, for eksempel Atto 532 (A532), avhengig av kombinasjonen av fluorescerende molekyler som brukes i visse eksperimenter15. Neuropeptid Y kan brukes i stedet for fluorescerende falske nevrotransmittere16.
FFN511 var spent på 458 nm i stedet for 405 nm i dette eksperimentet, selv om toppeksitasjonsspekteret til FFN511 er omtrent 405 nm. Studie med kapasitansopptak viste ingen signifikant forskjell i kromatinceller med eller uten PH-mNG, noe som indikerer at overekspressering av PH-mNG ikke påvirker eksocytose og endokytose 15,24. Lignende prosentandeler for fusjonshendelser ble verifisert i kromoffinceller merket med PH-mNG og A532 bare eller med FFN511, noe som viser at lasting av FFN511 i kromoffin vesicles ikke påvirker innholdsutgivelsen og forskjellige fusjonsmoduser16. 1 s depolariseringstimulering kan erstattes av høy kaliumoppløsning eller andre pattens av depolarisering. Disse modifikasjonene kan brukes til å tilpasse seg ulike eksperimentelle mål.
Til tross for fordelene med denne kraftige metoden, har den noen begrensninger. Den største begrensningen er relatert til diffraksjonsbegrenset oppløsning (~ 230 nm) av konfektmikroskopi, som kan overvinnes av mer avanserte mikroskopiteknikker med superoppløsning29. Granulatdiameteren i storfekromatinceller er ~ 300 nm6, noe som gjør det mulig å observere membranporåpning og lukking innenfor den romlige oppløsningen av konfektmikroskopi. Synaptiske vesicles er imidlertid ~ 30-60 nm30, som er utenfor konfikal oppløsning. Å utvide disse live-celle bildebehandlingsmålingene til små synaptiske vesicles viser seg å være vanskelig med konfikal avbildning.
Levende celleavbildningsteknikker med bedre tidsmessig og/eller romlig oppløsning, som STED-mikroskopi, stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM), total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi og minimal fotonflukser (MINFLUX) nanoskopi er utviklet og kan brukes på denne metoden 31,32,33,34 . Faktisk har STED mikroskopi blitt brukt til å avsløre fusjonsporiske dynamikk i kromboffinceller. De forskjellige modusene for fusjonshendelser og forhåndsformet Ω-profillukking kan verifiseres ytterligere ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi som STED-mikroskopi24. Andre begrensninger inkluderer fotobleking og cytotoksisitet av fluorescerende proteiner og fargestoffer.
Denne kombinasjonen av elektrofysiologi og konfølende mikroskopi kan brukes mye på mange sekretoriske celler. Kombinasjonen av superoppløselig mikroskopi med metodene beskrevet her ville være et verdifullt verktøy for måling av fusjonspordynamikk i nevrale kretser i fremtiden, forutsatt at superoppløsningsmikroskopi vil utvikle seg i en slik grad at den kan løse fusjonsporene ved nerveterminaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 og ZIA NS003105-08) for å støtte dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C.
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al.
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O'Connor, D. T., et al.
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al.
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
