Summary
De verhoogde snelheid van farmaco- en toxicokinetische analyses van metalen en op metaal gebaseerde verbindingen in zebravissen kan voordelig zijn voor milieu- en klinische vertaalstudies. De beperking van onbekende blootstelling aan water werd overwonnen door sporenmetaalanalyse uit te voeren op verteerd zebravisweefsel met behulp van inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie.
Abstract
Metalen en op metaal gebaseerde verbindingen omvatten veelzijdige farmaco-actieve en toxicologische xenobiotica. Van toxiciteit voor zware metalen tot chemotherapeutica, de toxicokinetiek van deze verbindingen heeft zowel historische als hedendaagse relevantie. Zebravissen zijn een aantrekkelijk modelorganisme geworden in het ophelderen van farmaco- en toxicokinetiek in milieublootstelling en klinische vertaalstudies. Hoewel zebravisstudies het voordeel hebben dat ze een hogere doorvoer hebben dan knaagdiermodellen, zijn er verschillende belangrijke beperkingen aan het model.
Een dergelijke beperking is inherent aan het watergedragen doseringsregime. Waterconcentraties uit deze studies kunnen niet worden geëxtrapoleerd om betrouwbare interne doseringen te bieden. Directe metingen van de op metaal gebaseerde verbindingen zorgen voor een betere correlatie met compound-gerelateerde moleculaire en biologische responsen. Om deze beperking voor metalen en op metaal gebaseerde verbindingen te overwinnen, werd een techniek ontwikkeld om larvenweefsel van zebravissen na blootstelling te verteren en metaalconcentraties in weefselmonsters te kwantificeren door inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICPMS).
ICPMS-methoden werden gebruikt om de metaalconcentraties van platina (Pt) uit cisplatine en ruthenium (Ru) te bepalen uit verschillende nieuwe op Ru gebaseerde chemotherapeutica in zebravisweefsel. Bovendien onderscheidde dit protocol concentraties van Pt die werden gesekwestreerd in het chorion van de larve in vergelijking met het zebravisweefsel. Deze resultaten geven aan dat deze methode kan worden toegepast om de metaaldosis in larvale weefsels te kwantificeren. Verder kan deze methode worden aangepast om specifieke metalen of op metaal gebaseerde verbindingen te identificeren in een breed scala aan blootstellings- en doseringsstudies.
Introduction
Metalen en op metalen gebaseerde verbindingen blijven farmacologische en toxicologische relevantie hebben. De prevalentie van blootstelling aan zware metalen en de impact ervan op de gezondheid heeft het wetenschappelijk onderzoek sinds de jaren 1960 exponentieel verhoogd en bereikte een recordhoogte in 2021. De concentraties van zware metalen in drinkwater, luchtvervuiling en beroepsmatige blootstelling overschrijden wereldwijd de wettelijke limieten en blijven een probleem voor arseen, cadmium, kwik, chroom, lood en andere metalen. Nieuwe methoden om de blootstelling aan het milieu te kwantificeren en pathologische ontwikkeling te analyseren, blijven veel gevraagd 1,2,3.
Omgekeerd heeft het medische veld de fysiochemische eigenschappen van verschillende metalen benut voor klinische behandeling. Geneesmiddelen op basis van metaal of metallodrugs hebben een rijke geschiedenis van medicinale doeleinden en hebben activiteit getoond tegen een reeks ziekten, met het hoogste succes als chemotherapeutica4. De beroemdste van metallodrugs, cisplatine, is een op Pt gebaseerd antikankermedicijn dat door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) wordt beschouwd als een van 's werelds essentiële geneesmiddelen5. In 2010 hadden cisplatine en zijn Pt-derivaten tot een slagingspercentage van 90% bij verschillende kankers en werden ze gebruikt in ongeveer 50% van de chemotherapieregimes 6,7,8. Hoewel pt-gebaseerde chemotherapeutica onweerlegbaar succes hebben gehad, heeft de dosisbeperkende toxiciteit onderzoek in gang gezet naar alternatieve op metaal gebaseerde geneesmiddelen met verfijnde biologische afgifte en activiteit. Van deze alternatieven zijn op Ru gebaseerde verbindingen de meest populairegeworden 9,10,11,12.
Nieuwe modellen en methodologie zijn nodig om gelijke tred te houden met de snelheid van de behoefte aan farmaco- en toxicokinetische studies naar metaal. Het zebravismodel ligt op het snijvlak van complexiteit en doorvoer, omdat het een gewerveld dier met een hoge vruchtbaarheid is met 70% geconserveerde gen homologie13. Dit model is een aanwinst geweest in de farmacologie en toxicologie, met uitgebreide screenings voor verschillende verbindingen voor loodontdekking, doelidentificatie en mechanistische activiteit 14,15,16,17. Screening van chemicaliën met een hoge doorvoer is echter meestal afhankelijk van blootstellingen aan water. Aangezien de opname variabel kan zijn op basis van de fysisch-chemische eigenschappen van de verbinding in oplossing (d.w.z. fotodegradatie, oplosbaarheid), kan dit een belangrijke beperking zijn van het correleren van dosisafgifte en respons.
Om deze beperking voor vergelijking van de dosis met hogere gewervelde dieren te overwinnen, werd een methodologie ontworpen om sporenmetaalconcentraties in larvenweefsel van zebravissen te analyseren. Hier werden dosis-responscurven van dodelijke en subletale eindpunten geëvalueerd voor cisplatine en nieuwe op Ru gebaseerde antikankerverbindingen. Letaliteit en vertraagd uitkomen werden geëvalueerd voor nominale concentraties van 0, 3,75, 7,5, 15, 30 en 60 mg/l cisplatine. Pt-accumulatie in organismeweefsel werd bepaald door ICPMS-analyse en de opname van respectieve doses door organismen was 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 en 461,9 ng (Pt) per organisme. Bovendien werden zebravislarven blootgesteld aan 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg / l PMC79. Deze concentraties werden analytisch bepaald om 0, 0,17, 0,44, 0,66 en 0,76 mg/l Ru te bevatten. Dit protocol maakte het ook mogelijk om concentraties pt te onderscheiden die in het chorion van de larven waren gesekwestreerd in vergelijking met het zebravisweefsel. Deze methodologie was in staat om betrouwbare, robuuste gegevens te leveren voor vergelijkingen van farmaco- en toxicokinetische activiteit tussen een gevestigde chemotherapeutische en een nieuwe verbinding. Deze methode kan worden toegepast op een breed scala aan metalen en op metaal gebaseerde verbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De AB-stam zebravis (Danio rerio) werd gebruikt voor alle experimenten (zie de Tabel met Materialen) en het houderijprotocol (# 08-025) werd goedgekeurd door de Rutgers University Animal Care and Facilities Committee.
1. Zebravishouderij
- Fok en onderhoud de zebravis in een recirculerend aquatisch habitatsysteem op een 14 uur licht: 10 uur donkere cyclus.
- Zuiver gemeentelijk leidingwater door zand- en koolstoffiltratie om vissysteemwater te verkrijgen. Houd het water in het aquatische systeem op 28 °C, <0,05 ppm nitriet, <0,2 ppm ammoniak en pH tussen 7,2 en 7,7.
- Voer de zebravis een dieet van uitgekomen Artemia-cysten, pekelkreeftjes en vlokkenvoer van het visdieet.
2. Dosis-responsprotocol zebravissen (figuur 1)
- Bereid zebravis ei water oplossing, ofwel E3 medium of ei water gemaakt van bouillon zeezout in een concentratie van 60 μg / ml opgelost in gedeïoniseerd water18. Vermijd het gebruik van methyleenblauw.
OPMERKING: Via ICPMS werd isobare interferentie van zebravis eiwater geïdentificeerd voor strontiumoxiden, die overlapten met een isotoop van ruthenium. Zorgvuldig spoelen van de larven voordat stroomafwaartse analyse dit probleem verbeterde. E3-medium kan voor sommigen een gemakkelijkere keuze zijn vanwege de gepatenteerde samenstelling van commerciële zeezouten. - Los het metaal of de op metaal gebaseerde verbindingen op in E3 of eiwater. Vortex om elk aggregaatmateriaal te breken en de oplossing te homogeniseren.
OPMERKING: In het hieronder beschreven experiment werden PMC79 en cisplatine opgelost in maximale concentraties van 12,4 mg/l en 60 mg/l met een maximale concentratie van 0,5% dimethylsulfoxide (DMSO) om neerslag te weerstaan.- Verdun zware metalen of op metaal gebaseerde verbindingen, zoals PMC79 en cisplatine, met E3 of eiwater en bereid ten minste 5 concentratiedoses voor.
- Begin met lage concentraties stamoplossingen in zuiver vehikel (d.w.z. DMSO) en verdun vervolgens met E3 of eiwater. Overweeg de uiteindelijke voertuigconcentraties zorgvuldig.
OPMERKING: Bepaalde op metaal gebaseerde verbindingen, zoals cisplatine, worden snel afgebroken en hun oplossingen moeten dagelijks vers worden gemaakt. LET OP: Ga voorzichtig om met zware metalen en chemotherapeutica. Bekijk het specifieke veiligheidsinformatieblad (MSDS) voor het metaal van belang. Cisplatine kan oog- en huidirritatie veroorzaken, fataal zijn als het wordt ingeslikt en kan toxiciteit veroorzaken in nieren, bloed, bloedvormende organen en foetaal weefsel. Vermijd het inademen van dampen en contact met ogen, huid en kleding. Draag ondoordringbare handschoenen en kleding, en een veiligheidsbril of -bril19.
- Begin met lage concentraties stamoplossingen in zuiver vehikel (d.w.z. DMSO) en verdun vervolgens met E3 of eiwater. Overweeg de uiteindelijke voertuigconcentraties zorgvuldig.
- Verdun zware metalen of op metaal gebaseerde verbindingen, zoals PMC79 en cisplatine, met E3 of eiwater en bereid ten minste 5 concentratiedoses voor.
- Zet de middag voorafgaand aan het experiment kweektanks op in de ideale verhouding van 2 vrouwtjes tot 1 mannetje met een scheidingswand tussen de geslachten20.
- Trek aan de scheidingswand wanneer de lichten aangaan voor de ochtendcyclus.
- Laat de zebravis broeden.
OPMERKING: De duur van het fokken is afhankelijk van de initiële blootstellingsfase die vereist is. Voor 3 uur na de verzwaartting, laat fokken ongeveer 2 uur. De eieren bereiken 3 hpf na het reinigen en scheiden van eieren. - Verplaats de broedvis naar een schone tank.
- Verzamel de eieren door het tankwater door een zeef te gieten.
- Keer de zeef om boven een petrischaaltje en gebruik een spuitfles gevuld met E3 of eiwater om de eieren in het gerecht te spoelen.
- Reinig de schaal van voedsel en afval voorafgaand aan experimenteel gebruik.
- Randomiseer ongeveer twintig embryo's van 3 hpf per dosis in individuele glazen injectieflacons met behulp van een transferpipet en een kleine hoeveelheid water.
- Nadat alle embryo's in injectieflacons zijn, verwijdert u al het eiwater en vervangt u het door voldoende doseeroplossing zodat er ongeveer 1 inch oplossing boven de hoogte van het ei is.
OPMERKING: De noodzaak van dechorionatie moet zorgvuldig worden overwogen. Zie het discussiegedeelte voor meer informatie. - Observeer de embryo's dagelijks op laesies of letaliteit. Vanwege de snelle ontwikkeling van embryonale zebravissen, kunt u dagelijks beelden verkrijgen met behulp van een brightfield-microscoop / camera-opstelling om kleine laesies tussen dagen te identificeren.
- Combineer bij het einde van de dosisrespons (4-5 dagen na de bevruchting [dpf], volgens richtlijn21 van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) 3-5 larven voorafgaand aan euthanasie voor samengestelde bemonstering. Euthanasie door snelle afkoeling door invriezen in vloeibare stikstof.
OPMERKING: Euthanasie door een overdosis MS-222 of tricaine methaansulfonaat kan mogelijk interfereren met ICPMS-analyse stroomafwaarts. Voor dit protocol worden snel afkoelende euthanasiemethoden aangemoedigd om de kans op interferentie te verkleinen. - Voer 3 wasbeurten van weefsel uit met zeer zuiver water (zoals omgekeerde osmose) om de overtollige verbinding van de buitenkant van het weefsel te verwijderen.
- Verplaats de monsters naar zuur- en magnetronveilige polypropyleen centrifugebuizen van 15 ml. Wees voorzichtig om al het overtollige water te verwijderen, omdat elke resterende vloeistof het salpeterzuur kan verdunnen, en dus het oxiderende potentieel van het zuur tijdens weefselafbraak.
OPMERKING: Op dit punt kan weefsel worden opgeslagen bij -20 °C tot verdere analyse. Voor van nature overvloedige metalen zal het reinigen van de buizen in een 5% salpeterzuurbad voorafgaand aan gebruik de omgevingsachtergrondniveaus verbeteren.
3. Weefselvertering en ICPMS-evaluatie (figuur 2)
- Voeg ongeveer 0,25 ml toe aan de polypropyleencentrifugebuizen van 15 ml voor maximaal 10 larven (~ 100 μg) zeer zuiver salpeterzuur (69%). Ultrasoon gedurende 1 uur om de monsters voor te verteren met behulp van de volgende instellingen: ultrasone baduitgang: 85 W; 42 kHz ± 6%; temperatuurbereik: 19-27 °C.
LET OP: Draag oorbescherming tijdens ultrasoonapparaat. Salpeterzuur veroorzaakt ernstige brandwonden in de luchtwegen, ogen en huid. Draag volledige beschermingsmiddelen en werk in de zuurkast of op plaatsen met voldoende ventilatie. Het kan brandbaar zijn met andere materialen. Salpeterzuur mag uitsluitend in een zuurkast worden gehanteerd om blootstelling aan dampen die tijdens de spijsvertering worden geproduceerd, te voorkomen. Niet inademen of innemen.- Voer korte cycli van weefselvertering uit (intervallen van 5 minuten) in een zuurveilige microgolfvergister totdat al het weefsel zichtbaar is geoxideerd (d.w.z. uniforme, heldergele oplossing).
OPMERKING: Het microgolfprotocol in tabel 1 wordt aanbevolen om drie keer te worden uitgevoerd en bevat een afkoelinterval van 5 minuten tussen elke verwarmingsstap. - Controleer de integriteit van de buizen zorgvuldig om breuk te voorkomen en voer korte spins uit in de centrifuge (313 × g gedurende 1 minuut) tussen cycli om zure condensatie naar de bodem van de buis te verplaatsen.
OPMERKING: Als het weefsel moeilijk te verteren is (vooral chorionen), kan 30% hoogzuiver waterstofperoxide worden gebruikt na zure vertering. Gebruik het waterstofperoxide (6,75 ml) om de zuurconcentratie te verdunnen tot 3,5% en laat de monsters een nacht in een zuurkast zitten. Waterstofperoxide zal ontbinden tot H2O en is geschikt voor ICPMS-analyse. Verder kunnen alternatieve metalen beter oplossen in zoutzuur of een mengsel van zoutzuur en salpeterzuur (d.w.z. aqua regia). Waterstofperoxide is schadelijk bij inslikken en veroorzaakt ernstig oogletsel. Draag huid- en oogbescherming22,23.
- Voer korte cycli van weefselvertering uit (intervallen van 5 minuten) in een zuurveilige microgolfvergister totdat al het weefsel zichtbaar is geoxideerd (d.w.z. uniforme, heldergele oplossing).
- Zodra het weefsel zichtbaar is geoxideerd (d.w.z. uniforme, heldergele oplossing), verdunt u de monsters in een zuurkast tot 3,5% salpeterzuur met behulp van 6,75 ml hoogzuiver water en vortex om grondig te mengen.
OPMERKING: Op dit punt kunnen de monsters bij kamertemperatuur worden bewaard. Deze stap is niet nodig als in stap 3.1 waterstofperoxide is toegevoegd om de spijsvertering te bevorderen. - Voer een matrix-gematchte, 7-punts kalibratiecurve (concentratiebereik van 0,001-10 ppb) uit met behulp van een gecertificeerde elementaire standaard (d.w.z. Pt of Ru, afhankelijk van de test) met het metaal van belang en optimale isotoop (en) om rekening te houden met mogelijke isobare interferenties.
- Gebruik een voorraadconcentratie van de waterige, gecertificeerde elementaire standaard (Ru, Pt = 1000 ppb) en neem een aliquot van 0,1 ml en pipetteer in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Verdun met 3,5% salpeterzuur tot een eindvolume van 10 ml om een standaardoplossing van 10 ppb te verkrijgen.
- Maak met behulp van de 10 ppb-voorraad de volgende seriële verdunningen: 0,1, 1,0 en 5,0 ppb standaardoplossingen in 3,5% salpeterzuur.
- Maak met behulp van de 0,1-voorraad de volgende seriële verdunningen: standaardoplossingen van 0,001, 0,005 en 0,01 ppb in 3,5% salpeterzuur.
- Bereid het ICPMS-instrument voor (zie de Tabel met materialen) voor de monsteranalyse als volgt:
- Voordat u het instrument start, moet u ervoor zorgen dat de Argon-gasklep open is, dat alle slangen goed zijn aangesloten en dat schoon 5% salpeterzuur open is voor het spoelen van slangen en glaswerk tussen monsteranalyses.
- Controleer de staat van de zaklamp en kegels en zorg ervoor dat de fakkeldoos goed is vergrendeld en dat de afvoerbuis van de sproeikamer goed is aangesloten op de peripomp.
- Open de software (zie de tabel met materialen).
- Controleer de vacuümmetingen en zorg ervoor dat alle turbopompen op 100% draaien.
- Klik op START in het venster Status plasmacontrolesysteem om de startvolgorde te starten, de plasmapomp en plasmakoeler in te schakelen, de vernevelaar te verwijderen en het plasma aan te steken. Wacht tot het plasma brandt en stabiel is wanneer het statusvenster aangeeft dat de opstartvolgorde is voltooid. Let op dit punt op de groene stippen in het venster Systeemstatus die aangeven dat alle voedingen zijn ingeschakeld.
- Klik in de menubalk op Control | autosampler in het vervolgkeuzemenu. Voer de positie van het autosampler-rek in voor de buis met 5% salpeterzuur. Laat het zuur in het plasma komen.
- Klik in de menubalk op Scans | Magneet in het vervolgkeuzemenu. Typ in het MagnetScan-venster 115 in de markermassapositie en klik op enter. Laat de magneet gedurende 30 minuten over het massabereik scannen voor 115in (114.6083 tot 115.3749) terwijl het instrument opwarmt.
- Gebruik na 30 minuten de autosampler-besturing om naar de positie van een 1 ppb multielement tuning-oplossing te gaan. Adem de stemoplossing op en stem het instrument af om de signaalaflezing te optimaliseren. Pas de fakkelpositie (X, Y, Z) zodanig aan dat de zaklamp is uitgelijnd met het midden van de kegels en het debiet van de vernevelaar (~ 30 psi) in het plasmacontrolevenster . Breng de nodige aanpassingen aan in het venster Ion Optics Tuning voor de bron, detector en analyzer.
- Zodra de signaalaflezing is geoptimaliseerd (~ 1,2 × 106 tellen / s voor 1 ppb op 115In), klikt u op Stoppen in het venster Magneetscan .
- Klik op Magneet kalibreren en selecteer Lage resolutie in het pop-upvenster.
- Klik op OK en open het bestand "Mass Calibration (Low Resolution).smc" om de magneet te kalibreren.
OPMERKING: De magneetkalibratie meet de tellingen/en past in een curve door het volgende massabereik: 7Li tot 238U. - Klik op Opslaan | Gebruik om de huidige magneetkalibratie toe te passen op de analyses. Als u onbekende monsters met een enorm bereik van concentraties meet, voert u een detectorkalibratie uit om ionpulstellingensignalen bij lage concentraties te vergelijken met verzwakte ionsignalen die bij hogere concentraties worden geproduceerd. Analyseer de monsters zodra de afstemming en kalibratie zijn voltooid.
- Klik in de menubalk op Data Acquisition.
- Klik op Method Setup in het vervolgkeuzemenu. Gebruik een bestaande methode van de fabrikant of maak een methode op basis van de elementen van belang. Pas indien nodig de analysemodus, verblijftijd, schakelvertraging, aantal sweeps / cycli, resolutie, detectiemodus en de parkmassa aan voor deflectorinstellingen.
- Klik op Opslaan om de methode-instellingen vast te leggen. Optimaliseer de parameters voor elk metaal en elke isotoop. Zie tabel 2 voor de specifieke bedrijfsparameters die in dit onderzoek zijn gebruikt.
- Klik in de menubalk op Data Acquisition.
- Klik op Batchrun in het vervolgkeuzemenu. U kunt ook op het BATCH-pictogram onder de menubalk klikken. Importeer de batchparameters uit een spreadsheet of maak een reeks in het venster Batchrun . Voer het voorbeeldtype, de positie van het autosampler-rek, de overdrachtstijd, de wastijd, de replicaties, de voorbeeld-id en het methodebestand in.
- Rangschik de batchrun in de volgende volgorde: standaardoplossingen voor de kalibratiecurve (0,001-10 ppb Pt of Ru), gevolgd door een kwaliteitscontrolestandaard en vervolgens onbekende monsters.
OPMERKING: Standaardoplossingen worden gemeten als tellingen/s op de ICPMS en een lineaire regressie past door de normen met een relatieve standaarddeviatie (RSD) > 0,999. Onbekenden worden ook gemeten als tellingen/s en opgelost voor concentratie in ppb met behulp van de lineaire regressie van de kalibratiecurve, y = mx + b. Gegevensverwerking kan ook worden voltooid met behulp van de software waarnaar wordt verwezen. - Bewaak instrumentdrift en sample reproduceerbaarheid door elke 5-10 samples een kwaliteitscontrolestandaard van 0,5 ppb op te nemen.
OPMERKING: Geschikte kwaliteitscontrolenormen moeten een gecertificeerd standaardreferentiemateriaal zijn dat verschilt van de standaard die in de kalibratiecurve wordt gebruikt.
| Watt | Macht | Notulen |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tabel 1: Microgolfverteringsprotocol voor larvale weefselmassa. Zebravislarvemonsters werden verteerd in 0,25 ml salpeterzuur. Deze tabel is gewijzigd van 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze resultaten zijn eerder gepubliceerd24. Weefselopnamestudies werden uitgevoerd met watergedragen blootstellingen van cisplatine en een nieuwe op Ru gebaseerde antikankerverbinding, PMC79. Letaliteit en vertraagd uitkomen werden geëvalueerd op nominale concentraties van cisplatine 0, 3,75, 7,5, 15, 30 en 60 mg/l cisplatine. Pt-accumulatie in organismeweefsel werd bepaald door ICPMS-analyse en organismeweefsel bevatte respectievelijke doses van 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 en 461,9 ng (Pt) per organisme (figuur 3). Analytische bepaling van de nominale concentraties voor cisplatine werd niet beoordeeld, gezien de bekende stabiliteit van cisplatine.
Vertraagd uitkomen werd waargenomen bij alle cisplatineconcentraties. Aanvullende experimenten werden uitgevoerd voor Pt-concentraties met en zonder handmatige dechorionatie. Na dechorionatie werden koraalen afzonderlijk verzameld en geanalyseerd voor Pt. Niet-dodelijke doses cisplatine die werden gebruikt voor dechorionatiestudies bepaalden dat 93-96% van de totale afgeleverde dosis cisplatine zich had opgehoopt in het chorion met de resterende dosis in het larvale weefsel (figuur 4).
Zebravislarven werden blootgesteld aan 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg / L PMC79. Deze doses werden geselecteerd door de derivaten van een IC50 te bepalen, zoals eerder beschreven16. Deze concentraties werden analytisch bepaald om 0, 0,17, 0,44, 0,66 en 0,76 mg/l Ru te bevatten. In tegenstelling tot de dosis-responscurve van cisplatine werd vertraagd uitkomen niet waargenomen bij aan PMC79 blootgestelde larven. Chorionen werden niet opgenomen in rutheniumanalyse omdat ze van nature werden afgebroken voorafgaand aan larvale verzameling. Onderzoekers kunnen chorionanalyse opnemen zonder vertraagd uitkomen door chorioneren en verzamelen van chorionen bij 24 dpf. De massa metaal in larvale weefsels geanalyseerd bij elke concentratie was 0,19, 0,41 en 0,68 ng (Ru) per larve (figuur 5). Een samenvatting van de toxicologische eindpunten, waaronder letale concentraties en/of doses voor 50% van de bevolking (LC50/LD50), effectieve concentraties of doses voor 50% van de populaties (EC50/ED50) en het laagste waargenomen effectniveau (LOAEL) is te vinden in tabel 3.
| Cisplatine | Pmc79 | |||||
| Nominaal (mg/L) | μM | Pt (ng) / organisme | Analytische Ru (mg/L) | μM | Ru (ng) / organisme | |
| LC50/LD50 | 31 (95% BI: 20,5-34,0) | 158 (95% BI: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (95% BI: 0,43-1,20) | 7,8 (95% BI: 4,2-11,8) | NA |
| EG50 | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| Loael | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0,19 (± 0,05) |
Tabel 3: Bepaling van de opname van oplossing en metallodrug geassocieerd met toxicologische eindpunten. LD50 werd bepaald door metaalequivalente analyse van Pt en Ru voor respectievelijk cisplatine en PMC79. De LC50-concentraties voor PMC79 werden analytisch bepaald. Er werd echter geen analytische bepaling van de nominale cisplatineconcentraties uitgevoerd; gezien de bekende stabiliteit van cisplatine in oplossing, werd aangenomen dat nominale en gemeten concentraties in oplossing gelijkwaardig zouden zijn. Het vertraagde broedeindpunt voor cisplatineblootstelling werd geëvalueerd in termen van ED50 en LOAEL. De LOAEL-concentraties van PMC79 werden analytisch bepaald. De LOAEL omvatte laesies zoals bloedingen langs de staartader en staartslagader, spinale kromming en dooierzakoedeem. Alle 95% betrouwbaarheidsintervallen werden berekend met behulp van de Litchfield Wilcoxon-methode. Deze tabel is gewijzigd van 24. Afkortingen: CI = betrouwbaarheidsinterval; LC50 = Letale concentratie voor 50% van de bevolking; LD50 = dodelijke dosis voor 50% van de bevolking; EC50 = Effectieve concentratie voor 50% van de bevolking; LOAEL = laagste waargenomen effectniveau.
Figuur 1: Zebravis dosis-respons protocol. Dit protocol maakt gebruik van een aangepaste aanpak die is aangepast aan de OESO-FET. Gemaakt met Biorender. Afkorting: OECD = Organisatie Voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling; FET = acute toxiciteit voor visembryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Weefselvertering en ICPMS-evaluatie. Het verteringsprotocol is effectief voor het verteren van een samengesteld monster van zebravislarven. Afkorting: ICPMS = inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie. Gemaakt met Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dosis-respons van cisplatine. (A) Percentage gemiddelde vertraagd uitkomen bij 5 dpf gecorreleerd met de gemiddelde Pt-equivalenten bepaald per organisme. (B) Percentage gemiddelde letaliteit bij 5 dpf gecorreleerd met de gemiddelde Pt-equivalenten per organisme. Percentage betekent: N = 40 per dosis. Pt (ng) per organisme: >4 samengestelde monsters per dosis. Er werden twee experimentele replicaties uitgevoerd, waarvan de bereiken worden weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van 24. Afkorting: dpf = dagen na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van Pt (ng) aanwezig in de larven en het chorion na blootstelling aan 7,5 of 15 mg/l. Samengestelde >3 larven of chorionen per monster; van links naar rechts N = 13, 10, 10 en 11. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Mann-Whitney rank-sum test P < 0,001 tussen larven en chorion voor beide doses. Dit cijfer is gewijzigd van 24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Dosis-respons PMC79. (A) Percentagegemiddelde letaliteit was gecorreleerd met de analytisch bepaalde gemiddelde Ru-equivalenten in oplossing (mg/L). (B) Percentage gemiddelde letaliteit op 5 dagen na de bevruchting van hetzelfde experiment was gecorreleerd met de gemiddelde Ru-equivalenten per larve. Letaliteit: N = 40 per dosis. Ru (mg/L): N = 6 samengestelde monsters per dosis. Ru (ng) per larve >4 samengestelde monsters per dosis. Er werden twee experimentele replicaties uitgevoerd, waarvan de bereiken worden weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van 24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Verblijftijd per piek | 4 ms |
| Schakelvertraging/ Piek (x10micros) | 2 |
| Aantal sweeps | 350 |
| Aantal cycli | 1 |
| Instrument resolutie | 300 |
| Detectiemodus | Verzwakt, Deflector Jump |
| Parkmis | 98.90594 |
| Element (isotopen) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Tabel 2: ICPMS-methodeparameters. Parameters voor analyse van Pt- en Ru-isotopen om weefselconcentraties van respectievelijk cisplatine en PMC79 te bepalen. Sr werd opgenomen om isobare interferenties in verband met de samenstelling van het tankwater te controleren. Deze tabel is gewijzigd van 24. ICPMS = inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol is geïmplementeerd om de levering en opname van op metaal gebaseerde antikankergeneesmiddelen met Pt of Ru te bepalen. Hoewel deze methoden al zijn gepubliceerd, bespreekt dit protocol belangrijke overwegingen en details om deze methodologie aan te passen voor een reeks verbindingen. Het OESO-protocol in combinatie met weefselvertering en ICPMS-analyse stelde ons in staat om te bepalen dat PMC79 krachtiger was dan cisplatine en resulteerde in ongelijksoortige weefselaccumulatie, wat afzonderlijke mechanismen suggereert. Bovendien, omdat de afgeleverde dosis cisplatine werd gekwantificeerd, werden dosis-responsresultaten geëxtrapoleerd naar patiëntenpopulaties. Subletale doses (bijv. LOAEL) waren vergelijkbaar met intraveneuze doseringsconcentraties bij patiënten24.
Hoewel deze methode kan worden toegepast op een breed spectrum van metalen en op metaal gebaseerde verbindingen, moet zorgvuldig onderzoek naar de fysisch-chemische eigenschappen van de analyt in overweging worden genomen. Op metaal gebaseerde verbindingen kunnen zeer moeilijk op te lossen zijn en verschillende voertuigen kunnen worden gebruikt om dit te voorkomen. Voertuigconcentraties, zoals DMSO, moeten mogelijk hogere concentraties hebben dan aanbevolen in het OESO-protocol. Als zodanig is het belangrijk om een niet-toxische dosis te handhaven door de ontwikkeling van controles nauwlettend te volgen; het continu schommelen van de embryo's tijdens blootstelling vermindert de neerslag. Bovendien zijn organometaalverbindingen mogelijk niet stabiel in waterige oplossing. Als het afbraakproces onbekend is, kunnen studies met 24-uurs oplossingsvernieuwing worden overwogen of vergeleken met niet-renewal dosis-responscurven.
Het wordt aanbevolen om de OESO Fish Acute Embryo Toxicity Test (FET) nummer 23621 te volgen. Er kunnen echter wijzigingen worden aangebracht voor specifieke doeleinden. Glazen containers vermijden verstorende toxicologische variabelen, zoals plastic en weekmakers, en adsorberen metalen niet zo sterk, waardoor analyten uit het eiwater zouden worden verwijderd. Voor verbindingen die fotodegraderen, zoals cisplatine, kan het nuttig zijn om de belichting zonder lichtcyclus uit te voeren.
Er is veel discussie in de literatuur over de noodzaak van dechorionatie in dosis-responsstudies van zebravissen 25,26,27. Argumenten voor dechorionatie bij 24 hpf suggereren dat het chorion de permeabiliteit van verbindingen beperkt, waardoor vals-negatieve resultaten of verhoogde dosis-responscurven worden gegenereerd. Hoewel deze punten verdienstelijk zijn, kan het uitvoeren van studies zonder dechorionatie mechanistisch inzicht bieden. Deze studies suggereren dat cisplatine zich ophoopt in het chorion van de embryo's als gevolg van de alkylerende activiteit (figuur 2). De resulterende adducten versterken de structuur, wat resulteert in vertraagd uitkomen. PMC79 en andere op Ru gebaseerde geneesmiddelen tegen kanker veroorzaakten dit fenomeen echter niet27. Hoewel veel chemotherapeutica hun antikankeractiviteit uitvoeren door alkylering, duidde het ontbreken van vertraagd uitkomen na blootstelling aan PMC79 op een ongelijksoortig mechanisme. Studies met of zonder dechorionatie moeten zorgvuldig worden overwogen of parallel worden uitgevoerd.
Downstream weefselvertering en ICPMS-analyse moeten voortdurend worden overwogen. Er wordt voorgesteld om het gebruik van reagentia die isobare interferenties kunnen veroorzaken te vermijden en alternatieve methoden te implementeren. Reagentia die tijdens de dosis-responsstudies worden gebruikt, kunnen invloed hebben op of reageren met het salpeterzuur en zijn oxiderend potentieel of bijdragen aan isobare interferenties. Er werd ontdekt dat de zoutoplossing die werd gebruikt om eiwater te maken strontium (Sr) oxiden genereerde, die overlapten met een specifieke isotoop van Ru24. Het verlagen van zoutconcentraties of het zorgvuldig reinigen van de larven kan dit probleem verbeteren. Om deze redenen wordt voorgesteld om het antimicrobiële methyleenblauw of het euthanasiemiddel tricaïne te vermijden. In plaats daarvan autoclaaf en vervolgens het eiwater beluchten om microben te verwijderen of de larven te euthanaseren door snelle afkoeling. Het is belangrijk om bij deze stap lineaire isotopische standaardcurven te bereiken met minimale isobare interferenties voor de analyt van belang.
Een belangrijke beperking van dit protocol is dat organometaalverbindingen zodanig worden geoxideerd dat alleen het metaal overblijft. Als zodanig kunnen metabolismestudies niet worden uitgevoerd. Hoewel het protocol kan worden beschouwd als medium-throughput, kan het dosis-responsgedeelte worden versneld met behulp van automatische chemische toedieningssystemen en beeldvorming. Dit protocol is een ontluikende methodologie die kan worden gewijzigd en verfijnd voor een breed spectrum van metaal- en metaalgebaseerde verbindingen voor farmaco- en toxicokinetische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen belangenconflicten die door een van de auteurs moeten worden bekendgemaakt.
Acknowledgments
Financiering: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Daarnaast wordt Brittany Karas ondersteund door opleidingssubsidie T32NS115700 van NINDS, NIH. De auteurs erkennen Andreia Valente en de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) voor de levering van PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
