Summary
הקצב המוגבר של ניתוחים פרמקו וטוקסיקוקינטיים של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת בדגי זברה יכול להוות יתרון למחקרי תרגום סביבתיים וקליניים. ההגבלה של ספיגת חשיפה לא ידועה הנישאת במים התגברה על ידי ביצוע ניתוח עקבות של מתכות על רקמת דגי זברה מעוכלים באמצעות ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.
Abstract
מתכות ותרכובות מבוססות מתכת מרכיבות קסנוביוטיקה פרמקו-אקטיבית וטוקסיקולוגית רב-תכליתית. מרעילות מתכות כבדות ועד כימותרפיה, לטוקסיקוקינטיקה של תרכובות אלה יש רלוונטיות היסטורית ומודרנית כאחד. דגי זברה הפכו לאורגניזם מודל אטרקטיבי בהבהרת פרמקו וטוקסיקוקינטיקה במחקרי חשיפה סביבתית ותרגום קליני. למרות שלמחקרים של דגי זברה יש יתרון בכך שהם בעלי תפוקה גבוהה יותר ממודלים של מכרסמים, ישנם מספר אילוצים משמעותיים למודל.
מגבלה אחת כזו טבועה במשטר המינון הנישא במים. לא ניתן לבצע אקסטרפולציה של ריכוזי מים ממחקרים אלה כדי לספק מינונים פנימיים אמינים. מדידות ישירות של התרכובות מבוססות המתכת מאפשרות מתאם טוב יותר עם תגובות מולקולריות וביולוגיות הקשורות לתרכובות. כדי להתגבר על מגבלה זו עבור מתכות ותרכובות מבוססות מתכת, פותחה טכניקה לעיכול רקמת זחל דגי זברה לאחר חשיפה ולכמת ריכוזי מתכות בתוך דגימות רקמה על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICPMS).
שיטות ICPMS שימשו לקביעת ריכוזי המתכת של פלטינה (Pt) מציספלטין ורותניום (Ru) ממספר כימותרפיות חדשניות המבוססות על Ru ברקמת דגי זברה. בנוסף, פרוטוקול זה הבחין בריכוזים של Pt שהיו מצומדים במקהלת הזחל בהשוואה לרקמת דגי הזברה. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן ליישם שיטה זו כדי לנפח את מינון המתכת הקיים ברקמות הזחל. יתר על כן, שיטה זו עשויה להיות מותאמת לזיהוי מתכות ספציפיות או תרכובות מבוססות מתכת במגוון רחב של מחקרי חשיפה ומינון.
Introduction
מתכות ותרכובות מבוססות מתכת ממשיכות להיות בעלות רלוונטיות פרמקולוגית וטוקסיקולוגית. השכיחות של חשיפה למתכות כבדות והשפעתה על הבריאות הגדילו באופן אקספוננציאלי את המחקר המדעי מאז שנות ה-60 והגיעו לשיא של כל הזמנים ב-2021. הריכוזים של מתכות כבדות במי שתייה, זיהום אוויר וחשיפה תעסוקתית חורגים מגבולות הרגולציה ברחבי העולם ונותרים בעיה עבור ארסן, קדמיום, כספית, כרום, עופרת ומתכות אחרות. שיטות חדשניות לכימות חשיפה סביבתית ולניתוח התפתחות פתולוגית ממשיכות להיות מבוקשות 1,2,3.
לעומת זאת, התחום הרפואי רתם את התכונות הפיזיוכימיות של מתכות שונות לטיפול קליני. לתרופות מבוססות מתכת או מטאלודרוגים יש היסטוריה עשירה של מטרות רפואיות והן הראו פעילות נגד מגוון מחלות, עם ההצלחה הגבוהה ביותר ככימותרפיה4. המפורסמת ביותר של metallodrugs, cisplatin, היא תרופה נגד סרטן מבוססת Pt הנחשבת על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כאחת התרופות החיוניות בעולם5. בשנת 2010, ציספלטין ונגזרותיו Pt היו בעלי שיעור הצלחה של עד 90% במספר סוגי סרטן והיו בשימוש בכ-50% ממשטרי הכימותרפיה 6,7,8. אף על פי שכימותרפיה מבוססת Pt זכתה להצלחה בלתי ניתנת לערעור, הרעילות המגבילה את המינון הניעה חקירות של תרופות חלופיות מבוססות מתכת עם אספקה ופעילות ביולוגית מזוקקת. מבין החלופות הללו, תרכובות מבוססות Ru הפכו ל-9,10,11,12 הפופולריות ביותר.
מודלים ומתודולוגיות חדשניים נדרשים כדי לעמוד בקצב הצורך במחקרים פרמקו-פרמקו-מתכתיים וטוקסיקוקינטיים. מודל דג הזברה נמצא בצומת של מורכבות ותפוקה, בהיותו בעל חוליות בעל נקבה גבוהה עם הומולוגיה גנטית שמורה של 70%13. מודל זה היה נכס בפרמקולוגיה ובטוקסיקולוגיה, עם בדיקות מקיפות לתרכובות שונות לגילוי עופרת, זיהוי מטרות ופעילות מכניסטית 14,15,16,17. עם זאת, סינון בתפוקה גבוהה של כימיקלים מסתמך בדרך כלל על חשיפות הנישאות במים. בהתחשב בכך שספיגה יכולה להיות משתנה בהתבסס על התכונות הפיזיקוכימיות של התרכובת בתמיסה (כלומר, פוטו-פירוק, מסיסות), זו יכולה להיות מגבלה עיקרית של קורלציה בין מתן מינון לתגובה.
כדי להתגבר על מגבלה זו לצורך השוואת המינון לבעלי חוליות גבוהים יותר, תוכננה מתודולוגיה לניתוח ריכוזי מתכות קורט ברקמת הזחל של דגי הזברה. כאן הוערכו עקומות מינון-תגובה של נקודות קצה קטלניות וסובלתליות עבור ציספלטין ותרכובות אנטי-סרטניות חדשניות המבוססות על Ru. קטלניות ועיכוב בבקיעה הוערכו בריכוזים נומינליים של 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ו-60 מ"ג/ל' ציספלטין. הצטברות Pt ברקמת האורגניזם נקבעה על ידי ניתוח ICPMS, וספיגת אורגניזמים של מינונים בהתאמה הייתה 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ו-461.9 ננוגרם (Pt) לאורגניזם. בנוסף, זחלי דגי זברה נחשפו ל-0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 מ"ג/ל' של PMC79. ריכוזים אלה נקבעו באופן אנליטי כמכילים 0, 0.17, 0.44, 0.66 ו-0.76 מ"ג/ל' של Ru. פרוטוקול זה גם איפשר הבחנה בין ריכוזים של Pt sequestered בכוריון של הזחלים לעומת רקמת דגי הזברה. מתודולוגיה זו הצליחה לספק נתונים אמינים וחזקים להשוואות של פעילות פרמקו וטוקסיקוקינטית בין כימותרפיה מבוססת היטב לבין תרכובת חדשנית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגי הזברה מזן AB (Danio rerio) שימשו לכל הניסויים (ראו טבלת החומרים), ופרוטוקול הגידול (#08-025) אושר על ידי ועדת הטיפול והמתקנים לבעלי חיים באוניברסיטת ראטגרס.
1. גידול דגי זברה
- לגדל ולתחזק את דגי הזברה במערכת בתי גידול מימיים המשחזרת במחזור חושך של 14 שעות אור:10 שעות.
- טהרו את מי הברז העירוניים באמצעות סינון חול ופחמן כדי להשיג מי מערכת דגים. שמור על מי המערכת הימית בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, <0.05 ppm ניטריט, <0.2 ppm אמוניה ו- pH בין 7.2 ל-7.7.
- האכילו את דגי הזברה בתזונה של ציסטות ארטמיה בקעו, שרימפס תמלחת ומזון פתיתי דיאטת דגים.
2. פרוטוקול תגובת מינון של דגי זברה (איור 1)
- הכינו תמיסת מי ביצים של דגי זברה, או מים בינוניים E3 או מי ביצים העשויים ממלח ים מלא בריכוז של 60 מיקרוגרם/מ"ל המומסים במים שעברו דה-יוניזציה18. הימנעו משימוש במתילן כחול.
הערה: באמצעות ICPMS זוהתה הפרעה איזוברית של מי ביצת דגי זברה עבור תחמוצות סטרונציום, אשר חפפו לאיזוטופ של רותניום. שטיפה מדוקדקת של הזחלים לפני ניתוח במורד הזרם העלתה את הבעיה. מדיום E3 עשוי להיות בחירה קלה יותר עבור חלקם בשל ההרכב הקנייני של מלחי ים מסחריים. - ממיסים את התרכובות מבוססות המתכת או המתכת במי E3 או במי הביצה. מערבולת לפירוק כל חומר צבירה והומוגניזציה של הפתרון.
הערה: בניסוי המתואר להלן, PMC79 וציספלטין הומסו בריכוזים מרביים של 12.4 מ"ג/ל' ו-60 מ"ג/ל' עם ריכוז מרבי של 0.5% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לעמוד בפני משקעים.- דילול מתכות כבדות או תרכובות על בסיס מתכת, כגון PMC79 וציספלטין, עם E3 או מי ביצים, תוך הכנת לפחות 5 מינוני ריכוז.
- התחילו עם ריכוזים נמוכים של תמיסות מלאי ברכב טהור (כלומר, DMSO), ואז דיללו עם E3 או מי ביצים. שקול היטב את ריכוזי הרכב הסופיים.
הערה: תרכובות מסוימות המבוססות על מתכת, כגון ציספלטין, מתפרקות במהירות, והפתרונות שלהן חייבים להיות טריים מדי יום. אזהרה: טפלו במתכות כבדות ובכימותרפיה בזהירות. סקור את גיליון נתוני בטיחות החומר הספציפי (MSDS) עבור המתכת המעניינת. ציספלטין עלול לגרום לגירוי בעיניים ובעור, להיות קטלני אם הוא נבלע, ועלול לגרום לרעילות בכליות, בדם, באיברים יוצרי דם וברקמות העובר. יש להימנע מאדי נשימה וממגע עם העיניים, העור והבגדים. הרכיבו כפפות ובגדים אטומים, ומשקפי בטיחות או משקפי מגן19.
- התחילו עם ריכוזים נמוכים של תמיסות מלאי ברכב טהור (כלומר, DMSO), ואז דיללו עם E3 או מי ביצים. שקול היטב את ריכוזי הרכב הסופיים.
- דילול מתכות כבדות או תרכובות על בסיס מתכת, כגון PMC79 וציספלטין, עם E3 או מי ביצים, תוך הכנת לפחות 5 מינוני ריכוז.
- הקימו מיכלי רבייה אחר הצהריים לפני הניסוי ביחס האידיאלי בין 2 נקבות לזכר אחד עם מחיצה בין המינים20.
- משכו את המחיצה כאשר האורות נדלקים למחזור הבוקר.
- אפשרו לדג הזברה להתרבות.
הערה: משך הזמן לרבייה תלוי בשלב החשיפה הראשוני הנדרש. עבור 3 שעות לאחר פריטיליזציה, אפשר רבייה במשך כ 2 שעות. הביצים יגיעו ל-3 כ"ס לאחר ניקוי והפרדת ביצים. - העבירו את דג הרבייה למיכל נקי.
- אספו את הביצים על ידי שפיכת מי המיכל דרך מסננת.
- הפכו את המסננת על צלחת פטרי והשתמשו בבקבוק השפריץ במילוי E3 או במי ביצים כדי לשטוף את הביצים לתוך התבשיל.
- נקו את המנה של מזון ופסולת לפני השימוש הניסיוני.
- יש לחלק באקראי כעשרים 3 עוברי HPF למנה לבקבוקוני זכוכית בודדים באמצעות פיפטת העברה וכמות קטנה של מים.
- לאחר שכל העוברים נמצאים בבקבוקונים, הסירו את כל מי הביציות והחליפו בתמיסת מינון מספקת כך שיהיה כ-1 ס"מ של תמיסה מעל גובה הביצית.
הערה: יש לשקול היטב את הצורך בהתרת ההדחה. עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים. - התבונן בעוברים מדי יום עבור נגעים או קטלניות. בשל ההתפתחות המהירה של דגי זברה עובריים, קבל תמונות יומיות באמצעות כל מיקרוסקופ שדה בהיר / מערך מצלמה כדי לזהות נגעים קלים בין ימים.
- בסיום תגובת המינון (4-5 ימים לאחר ההפריה [dpf], לפי הנחיית הארגון לשיתוף פעולה כלכלי ופיתוח (OECD)21), שלבו 3-5 זחלים לפני המתת חסד לדגימה מרוכבת. המתת חסד על ידי קירור מהיר על ידי הקפאת הצמדה בחנקן נוזלי.
הערה: המתת חסד באמצעות מנת יתר של MS-222 או טריקאין מתנסולפונט עלולה להפריע לניתוח ICPMS במורד הזרם. שיטות המתת חסד לקירור מהיר מעודדות עבור פרוטוקול זה כדי להפחית את האפשרות של הפרעה. - לבצע 3 שטיפות של רקמות עם מים בטוהר גבוה (כגון אוסמוזה הפוכה) כדי להסיר את התרכובת העודפת מהחלק החיצוני של הרקמה.
- העבר את הדגימות לצינורות צנטריפוגת פוליפרופילן 15 מ"ל בטוחים למיקרוגל ובטוחים במיקרוגל. הקפידו להסיר את כל עודפי המים , שכן כל נוזל שנותר עלול לדלל את החומצה החנקתית, ולכן, את הפוטנציאל המחמצן של החומצה במהלך פירוק הרקמה.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן רקמה בטמפרטורה של -20 °C (75 °F) עד לניתוח נוסף. עבור מתכות שופעות באופן טבעי, ניקוי הצינורות באמבט חומצה חנקתית של 5% לפני השימוש ישפר את רמות הרקע הסביבתיות.
3. עיכול רקמות והערכת ICPMS (איור 2)
- הוסיפו כ-0.25 מ"ל לצינורות הצנטריפוגה של פוליפרופילן 15 מ"ל עבור עד 10 זחלים (כ-100 מיקרוגרם) של חומצה חנקתית בטוהר גבוה (69%). Ultrasonicate במשך 1 שעה כדי predigest את הדגימות באמצעות ההגדרות הבאות: פלט אמבטיה קולי: 85 W; 42 קילוהרץ ± 6%; טווח טמפרטורות: 19-27 מעלות צלזיוס.
אזהרה: ללבוש הגנה על האוזן במהלך sonication. חומצה חנקתית גורמת לכוויות חמורות בדרכי הנשימה, בעין ובעור. לבשו ציוד מגן מלא ועבדו במכסה המנוע של האדים או במקומות עם אוורור הולם. זה יכול להיות דליק עם חומרים אחרים. יש לטפל בחומצה חנקתית אך ורק במכסה אדים כדי למנוע חשיפה לאדים המיוצרים במהלך העיכול. אין לשאוף או לבלוע.- בצע מחזורים קצרים של עיכול רקמות (מרווחים של 5 דקות) במעכל מיקרוגל בטוח לחומצה עד שכל הרקמה מתחמצנת בעליל (כלומר, תמיסה אחידה וצהובה בהירה).
הערה: מומלץ לבצע את פרוטוקול המיקרוגל בטבלה 1 שלוש פעמים והוא כולל מרווח קירור של 5 דקות בין כל שלב חימום. - עקוב אחר שלמות הצינורות בזהירות כדי למנוע קרע ולבצע סיבובים קצרים בצנטריפוגה (313 × גרם במשך דקה אחת) בין מחזורים כדי להזיז את עיבוי החומצה לתחתית הצינור.
הערה: אם הרקמה קשה לעיכול (במיוחד כוריונים), ניתן להשתמש במי חמצן בטוהר גבוה של 30% לאחר עיכול חומצי. השתמשו במי חמצן (6.75 מ"ל) כדי לדלל את ריכוז החומצה ל-3.5%, ולאפשר לדגימות לשבת למשך הלילה במכסה אדים. מי חמצן יתפרק ל-H2O ויתאים לניתוח ICPMS. יתר על כן, מתכות חלופיות עשויות להתמוסס טוב יותר בחומצה הידרוכלורית או בתערובת של חומצה הידרוכלורית וחומצה חנקתית (כלומר, אקווה רג'יה). מי חמצן מזיקים אם נבלעים וגורמים לנזק חמור לעיניים. ללבוש עור והגנה על העיניים22,23.
- בצע מחזורים קצרים של עיכול רקמות (מרווחים של 5 דקות) במעכל מיקרוגל בטוח לחומצה עד שכל הרקמה מתחמצנת בעליל (כלומר, תמיסה אחידה וצהובה בהירה).
- ברגע שהרקמה מחומצנת באופן נראה לעין (כלומר, תמיסה אחידה וצהובה שקופה), מדללים את הדגימות במכסה אדים ל-3.5% חומצה חנקתית באמצעות 6.75 מ"ל של מים ומערבולת בטוהר גבוה כדי לערבב היטב.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר. שלב זה אינו נחוץ אם מי חמצן נוספו כדי לסייע לעיכול בשלב 3.1. - נהלו עקומת כיול תואמת מטריצה של 7 נקודות (טווח ריכוז של 0.001-10 ppb) באמצעות תקן יסודי מאושר (כלומר, Pt או Ru, בהתאם לבדיקה) עם המתכת המעניינת והאיזוטופים האופטימליים כדי להסביר הפרעות איזובריות פוטנציאליות.
- באמצעות ריכוז מלאי של תקן היסודי המיימי והמאושר (Ru, Pt = 1000 ppb), קח אליקוט 0.1 מ"ל ופיפט לתוך צינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. דיללו עם 3.5% חומצה חנקתית לנפח סופי של 10 מ"ל כדי לייצר פתרון סטנדרטי של 10 ppb.
- באמצעות מלאי 10 ppb, בצע את הדילולים הטוריים הבאים: 0.1, 1.0, ו- 5.0 ppb פתרונות סטנדרטיים של 3.5% חומצה חנקתית.
- באמצעות מלאי 0.1, בצע את הדילולים הטוריים הבאים: 0.001, 0.005 ו- 0.01 ppb פתרונות סטנדרטיים ב- 3.5% חומצה חנקתית.
- הכן את מכשיר ה- ICPMS (ראה את טבלת חומרים) לניתוח מדגם כדלקמן:
- לפני הפעלת המכשיר, יש לוודא כי שסתום הגז ארגון פתוח, כל הצינורות מחוברים היטב, וחומצה חנקתית נקייה של 5% פתוחה לשטיפת צינורות וכלי זכוכית בין ניתוחים לדוגמה.
- בדקו את מצב הלפיד והאצטרובלים, וודאו שתיבת הלפיד נעולה היטב ושצינור הניקוז של תא הריסוס מחובר כראוי לפריפאמפ.
- פתח את התוכנה (ראה טבלת החומרים).
- בדקו את קריאות הוואקום וודאו שכל משאבות הטורבו פועלות ב-100%.
- לחץ על התחל בחלון מצב מערכת בקרת הפלזמה כדי להתחיל את רצף ההתחלה, הפעל את משאבת הפלזמה, צ'ילר הפלזמה, נקה את הנבולייזר והדלק את הפלזמה. המתן עד שהפלזמה תהיה מוארת ויציבה כאשר חלון המצב יציין שרצף האתחול הושלם. בשלב זה, שים לב לנקודות הירוקות בחלון מצב המערכת המציינות שכל ספקי הכוח פועלים.
- בשורת התפריטים, לחץ על שליטה | דגימה אוטומטית בתפריט הנפתח. הזן את מיקום המדף האוטומטי עבור הצינור המכיל 5% חומצה חנקתית. אפשר לחומצה להיכנס לפלזמה.
- בשורת התפריטים, לחץ על סריקות | מגנט בתפריט הנפתח. בחלון MagnetScan, הקלד 115 במיקום מסת הסמן ולחץ על Enter. אפשרו למגנט לסרוק את טווח המסה של 115אינץ' (114.6083 עד 115.3749) במשך 30 דקות בזמן שהמכשיר מתחמם.
- לאחר 30 דקות, השתמש בבקרת ה-autosampler כדי לעבור למיקום של פתרון כוונון רב-שכבתי של 1 ppb. שאפו לפתרון הכוונון וכיוונו את המכשיר כדי למטב את קריאת האות. התאם את מיקום הלפיד (X, Y, Z) כך שהלפיד יהיה מיושר עם מרכז המדוכים וקצב זרימת הנבולייזר (~ 30 psi) בחלון הבקרה של Plasma . בצע את ההתאמות הדרושות בחלון כוונון יון אופטיקה עבור המקור, הגלאי והמנתח.
- לאחר אופטימיזציה של קריאת האותות (~1.2 × 106 ספירות לשנייה עבור 1 ppb ב - 115In), לחץ על עצור בחלון סריקת מגנט .
- לחץ על כיול מגנט ובחר רזולוציה נמוכה בחלון הקופץ.
- לחץ על אישור ופתח את הקובץ "כיול מסה (רזולוציה נמוכה).smc" כדי לכייל את המגנט.
הערה: כיול המגנטים ימדוד את הספירות/שניות ויתאים לעקומה דרך טווח המסה הבא: 7Li עד 238U. - לחץ על שמור | השתמש כדי להחיל את כיול המגנט הנוכחי על הניתוחים. אם מודדים דגימות לא ידועות עם טווח עצום של ריכוזים, בצע כיול גלאי כדי להשוות בין אותות ספירת יונים בריכוזים נמוכים לאותות יונים מוחלשים המיוצרים בריכוזים גבוהים יותר. נתח את הדגימות לאחר השלמת הכוונון והכיול.
- בשורת התפריטים, לחץ על רכישת נתונים.
- לחץ על הגדרת השיטה בתפריט הנפתח. השתמש בשיטה קיימת המסופקת על ידי היצרן, או צור שיטה המבוססת על האלמנטים המעניינים. במידת הצורך, התאם את מצב הניתוח, זמן השהייה, השהיית המתג, מספר הטאטואים/מחזורים, הרזולוציה, מצב הזיהוי ומסת הפארק להגדרות הסטייה.
- לחץ על שמור כדי להקליט את הגדרות השיטה. מטב את הפרמטרים עבור כל מתכת ואיזוטופ. ראה טבלה 2 עבור פרמטרי הפעולה הספציפיים המשמשים במחקר זה.
- בשורת התפריטים, לחץ על רכישת נתונים.
- לחץ על Batch Run בתפריט הנפתח. לחלופין, לחץ על סמל BATCH מתחת לשורת התפריטים. ייבא את פרמטרי האצווה מגיליון אלקטרוני, או צור רצף בחלון Batch Run . הזן את סוג הדגימה, את מיקום ארון התקשורת של הדגימה האוטומטית, זמן ההעברה, זמן הכביסה, המשכפלים, מזהה הדגימה וקובץ השיטה.
- ארגן את הרצת האצווה בסדר הבא: פתרונות סטנדרטיים לעקומת הכיול (0.001-10 ppb Pt או Ru), ולאחר מכן תקן בקרת איכות, ולאחר מכן דגימות לא ידועות.
הערה: פתרונות סטנדרטיים נמדדים כספירה/שנייה ב-ICPMS, ורגרסיה ליניארית מותאמת דרך התקנים עם סטיית תקן יחסית (RSD) > 0.999. לא ידועים נמדדים גם כספרות/s ונפתרים לריכוז ב-ppb באמצעות הרגרסיה הליניארית של עקומת הכיול, y = mx + b. ניתן גם להשלים את עיבוד הנתונים באמצעות התוכנה המופנית. - עקוב אחר סחיפת מכשירים ושכפול דגימות על ידי הכללת תקן בקרת איכות של 0.5 ppb כל 5-10 דגימות.
הערה: תקני בקרת איכות מתאימים צריכים להיות חומר ייחוס סטנדרטי מוסמך השונה מהתקן המשמש בעקומת הכיול.
| וואט | כח | דקות |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
טבלה 1: פרוטוקול עיכול מיקרוגל למסת רקמת הזחל. דגימות הזחל של דגי הזברה עוכלו ב-0.25 מ"ל של חומצה חנקתית. טבלה זו שונתה מ- 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות אלה פורסמו בעבר24. מחקרי ספיגת רקמות נערכו עם חשיפות המועברות במים של ציספלטין ותרכובת אנטי סרטנית חדשנית מבוססת Ru, PMC79. קטלניות ועיכוב בקיעה הוערכו עבור ריכוזים נומינליים של ציספלטין 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ו-60 מ"ג/ל' ציספלטין. הצטברות Pt ברקמת האורגניזם נקבעה על ידי ניתוח ICPMS, ורקמת האורגניזם הכילה מינונים מתאימים של 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ו-461.9 ננוגרם (Pt) לאורגניזם (איור 3). קביעה אנליטית של הריכוזים הנומינליים עבור ציספלטין לא הוערכה, בהתחשב ביציבות הידועה של ציספלטין.
בקיעה מאוחרת נצפתה בכל ריכוזי הציספלטין. ניסויים נוספים נערכו עבור ריכוזי Pt עם וללא דה-הוריון ידני. לאחר ההדחה, כוריונות נאספו ונותחו עבור Pt בנפרד. מינונים לא-קטלניים של ציספלטין ששימשו למחקרי דה-קוריונציה קבעו כי 93-96% מכלל המינון שנמסר של ציספלטין הצטבר בכוריון עם המינון הנותר בתוך רקמת הזחל (איור 4).
זחלי דגי זברה נחשפו ל-0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 מ"ג/ל' של PMC79. מינונים אלה נבחרו על ידי קביעת הנגזרות של IC50, כפי שתואר קודם לכן16. ריכוזים אלה נקבעו באופן אנליטי כמכילים 0, 0.17, 0.44, 0.66 ו-0.76 מ"ג/ל' של Ru. שלא כמו עקומת תגובת המינון של ציספלטין, בקיעה מושהית לא נצפתה בזחלים שנחשפו ל-PMC79. כוריונים לא נכללו באנליזת רותניום מכיוון שהם התדרדרו באופן טבעי לפני איסוף הזחלים. חוקרים עשויים לכלול ניתוח כוריון ללא בקיעה מאוחרת על ידי דה-הוריון ואיסוף כוריונים ב-24 dpf. מסת המתכת בתוך רקמות הזחל שנותחה בכל ריכוז הייתה 0.19, 0.41 ו-0.68 ננוגרם (Ru) לכל זחל (איור 5). סיכום של נקודות הקצה הטוקסיקולוגיות, כולל ריכוזים ו/או מינונים קטלניים עבור 50% מהאוכלוסייה (LC50/LD50), ריכוזים או מינונים יעילים עבור 50% מהאוכלוסיות (EC50/ED50), ורמת ההשפעה השלילית הנמוכה ביותר שנצפתה (LOAEL) ניתן למצוא בטבלה 3.
| ציספלטין | PMC79 | |||||
| נומינלי (מ"ג/ל') | μM | Pt (ng) / אורגניזם | רו אנליטי (מ"ג/ל') | μM | Ru (ng) / אורגניזם | |
| LC50/LD50 | 31 (95% CI: 20.5-34.0) | 158 (95% CI: 105-174) | 193 (± 130) | 0.79 (95% CI: 0.43-1.20) | 7.8 (95% CI: 4.2-11.8) | נה |
| EC50 | 4.6 | 12.5 | נה | נה | נה | נה |
| לואל | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0.19 (± 0.05) |
טבלה 3: קביעת תמיסה וספיגת מטאלודרוג הקשורה לנקודות קצה טוקסיקולוגיות. LD50 נקבע על ידי ניתוח שווה ערך למתכת של Pt ו- Ru עבור ציספלטין ו- PMC79, בהתאמה. ריכוזי LC50 עבור PMC79 נקבעו באופן אנליטי. עם זאת, קביעה אנליטית של ריכוזי ציספלטין נומינליים לא נערכה; בהתחשב ביציבות הידועה של ציספלטין בתמיסה, ההנחה הייתה שריכוזים נומינליים ומדודים בתמיסה יהיו שקולים. נקודת הקצה של הבקיעה המאוחרת לחשיפה לציספלטין הוערכה במונחים של ED50 ו- LOAEL. ריכוזי LOAEL של PMC79 נקבעו באופן אנליטי. ה- LOAEL כלל נגעים כגון דימום לאורך וריד הזנב ועורק הזנב, עקמומיות עמוד השדרה ובצקת שק חלמון. כל 95% מרווחי הבר-סמך חושבו בשיטת ליצ'פילד וילקוקסון. טבלה זו שונתה מ- 24. קיצורים: CI = רווח בר-סמך; LC50 = ריכוז קטלני עבור 50% מהאוכלוסייה; LD50 = מינון קטלני עבור 50% מהאוכלוסייה; EC50 = ריכוז יעיל עבור 50% מהאוכלוסייה; LOAEL = רמת ההשפעה השלילית הנמוכה ביותר שנצפתה.
איור 1: פרוטוקול תגובת מינון של דגי זברה. פרוטוקול זה משתמש בגישה שונה שהותאמה מה-OECD FET. מיוצר עם Biorender. קיצור: OECD = ארגון שיתוף פעולה ופיתוח כלכלי; FET = עובר דגים רעילות חריפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: עיכול רקמות והערכת ICPMS. פרוטוקול העיכול יעיל לעיכול דגימה מורכבת של זחלי דגי זברה. קיצור: ICPMS = ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית. נוצר עם Biorender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תגובת מינון ציספלטין. (A) אחוז ממוצע הבקיעה המאוחרת ב-5 dpf בקורלציה למקבילות ה-Pt הממוצעות שנקבעו לכל אורגניזם. (B) אחוזי הקטלניות הממוצעים ב-5 dpf מתואמים עם המקבילות הממוצעות של Pt לכל אורגניזם. אחוז פירושו: N = 40 למנה. Pt (ng) לכל אורגניזם: >4 דגימות מרוכבות לכל מנה. נערכו שני שכפולים ניסיוניים, שטווחיהם מוצגים. נתון זה שונה מ-24. קיצור: dpf = ימים לאחר ההפריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: השוואה בין Pt (ng) שנמצא בזחלים לבין הכוריון לאחר חשיפה ל-7.5 או 15 מ"ג/ל'. מרוכבים >3 זחלים או מקהלות לכל דגימה; משמאל לימין N = 13, 10, 10 ו- 11. פסי שגיאה מייצגים סטיית תקן. מבחן סכום הדירוג של מאן-וויטני P < 0.001 בין זחלים לכוריון עבור שני המינונים. נתון זה שונה מ-24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תגובת מינון PMC79. (A) הקטלניות הממוצעת באחוזים נמצאה בקורלציה לממוצע האנליטי שנקבע כשווה ערך ל-Ru בתמיסה (mg/L). (B) אחוזי הקטלניות הממוצעים ב-5 ימים לאחר ההפריה מאותו ניסוי היו מתואמים עם המקבילות הממוצעות של Ru לכל זחל. קטלניות: N = 40 למנה. Ru (mg/L): N = 6 דגימות מרוכבות לכל מנה. Ru (ng) לכל זחל >4 דגימות מרוכבות לכל מנה. נערכו שני שכפולים ניסיוניים, שטווחיהם מוצגים. נתון זה שונה מ-24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| זמן השהייה לכל שיא | 4 אלפיות השנייה |
| השהיית מתג/ שיא (x10micros) | 2 |
| מספר מטאטאים | 350 |
| מספר מחזורים | 1 |
| רזולוציית מכשיר | 300 |
| מצב זיהוי | מוחלש, קפיצת דפלקטור |
| מיסת פארק | 98.90594 |
| יסוד (איזוטופים) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
טבלה 2: פרמטרים של שיטת ICPMS. פרמטרים לניתוח איזוטופים של Pt ו- Ru כדי לקבוע ריכוזי רקמות של ציספלטין ו- PMC79, בהתאמה. Sr נכלל כדי לנטר הפרעות איזובריות הקשורות להרכב המים במיכל. טבלה זו שונתה מ- 24. ICPMS = ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן יושם כדי לקבוע את האספקה והקליטה של תרופות אנטי סרטניות מבוססות מתכת המכילות Pt או Ru. למרות ששיטות אלה כבר פורסמו, פרוטוקול זה דן בשיקולים ופרטים חשובים כדי להתאים מתודולוגיה זו למגוון תרכובות. פרוטוקול ה-OECD בשילוב עם עיכול רקמות וניתוח ICPMS אפשרו לנו לקבוע ש-PMC79 היה חזק יותר מציספלטין והביא להצטברות רקמות שונה, מה שמרמז על מנגנונים נפרדים. יתר על כן, מכיוון שהמינון שנמסר של ציספלטין כומת, תוצאות תגובת המינון היו אקסטרפולציה לאוכלוסיות המטופלים. מינונים תת-קרקעיים (למשל, LOAEL) היו דומים לריכוזי מינון תוך ורידיים בחולים24.
למרות ששיטה זו עשויה להיות מיושמת על ספקטרום רחב של מתכות ותרכובות מבוססות מתכת, יש לקחת בחשבון חקירה מדוקדקת של התכונות הפיזיקוכימיות של האנליט. תרכובות מבוססות מתכת עשויות להיות קשות מאוד להמסה, וניתן להשתמש בכלי רכב שונים כדי להימנע מכך. ייתכן שריכוזי כלי רכב, כגון DMSO, יצטרכו להיות בריכוזים גבוהים יותר מהמקובל בפרוטוקול ה-OECD. ככזה, חשוב לשמור על מינון לא רעיל על ידי מעקב צמוד אחר התפתחות הבקרות; נדנדה מתמשכת של העוברים במהלך החשיפה מפחיתה משקעים. בנוסף, תרכובות אורגנומטליות עשויות שלא להיות יציבות בתמיסה מימית. אם תהליך ההשפלה אינו ידוע, ניתן לשקול או להשוות מחקרים הכוללים חידוש תמיסה של 24 שעות או להשוות אותם לעקומות שאינן חוזרות של תגובת מינון.
מומלץ לעקוב אחר בדיקת רעילות העוברים החריפה של ה-OECD לדגים (FET) מספר 23621. עם זאת, ניתן לבצע שינויים שיתאימו למטרות ספציפיות. מיכלי זכוכית נמנעים ממשתנים טוקסיקולוגיים מבלבלים, כגון פלסטיק ופלסטיקאים, ואינם סופחים מתכות באותה עוצמה, מה שיסיר את האנליטים ממי הביצים. עבור תרכובות שצולמו-גרדיות, כגון ציספלטין, ייתכן שיהיה זה מועיל לבצע את החשיפה ללא מחזור אור.
יש דיון רב בספרות על הצורך בדה-לגיטימציה במחקרי מינון-תגובה של דגי זברה 25,26,27. טיעונים בעד דה-הוריונציה ב-24 כ"ס מצביעים על כך שהכוריון מגביל את החדירות של תרכובות, ובכך יוצר תוצאות שליליות כוזבות או עקומות מינון-תגובה מוגברות. אף על פי שלנקודות אלה יש יתרון, עריכת מחקרים ללא דה-קוריונציה עשויה לספק תובנה מכניסטית. מחקרים אלה מצביעים על כך שציספלטין מצטבר בכוריון של העוברים בשל פעילותו האלקילטית (איור 2). התוספות המתקבלות מחזקות את המבנה, וכתוצאה מכך הבקיעה המאוחרת. עם זאת, PMC79 ותרופות אחרות נגד סרטן המבוססות על Ru לא גרמו לתופעה זו27. אף על פי שכימותרפיה רבים מחוקקת את פעילותם נגד סרטן על ידי אלקילציה, היעדר הבקיעה המאוחרת לאחר חשיפה ל-PMC79 הצביע על מנגנון שונה. מחקרים עם או בלי דה-הוריונציה חייבים להישקל בקפידה או להתבצע במקביל.
יש לשקול באופן רציף באופן רציף עיכול רקמות במורד הזרם וניתוח ICPMS. מומלץ להימנע משימוש בריאגנטים שעלולים לגרום להפרעות איזובריות וליישם שיטות חלופיות. ריאגנטים המשמשים במהלך מחקרי המינון-תגובה עשויים להשפיע או להגיב עם החומצה החנקתית ופוטנציאל החמצון שלה או לתרום להפרעות איזובריות. התגלה כי תמיסת המלח ששימשה לייצור מי ביצים יצרה תחמוצות סטרונציום (Sr), אשר חפפו לאיזוטופ מסוים של Ru24. הורדת ריכוזי המלח או ניקוי קפדני של הזחלים יכולים לפתור בעיה זו. מסיבות אלה, מומלץ להימנע ממתילן כחול מתילן אנטי-מיקרוביאלי או מהסוכן המתת חסד, טריקאין. במקום זאת, יש לאוורר את מי הביצים ולאחר מכן לאוורר את מי הביצים כדי לסלק חיידקים או להרדים את הזחלים על ידי התקררות מהירה. חשוב בשלב זה להשיג עקומות סטנדרטיות איזוטופיות ליניאריות עם הפרעות איזובריות מינימליות לאנליט של העניין.
מגבלה חשובה לפרוטוקול זה היא שתרכובות אורגנומטליות יתחמצנו כך שרק המתכת תישאר. ככזה, לא ניתן לערוך מחקרי חילוף חומרים. למרות שהפרוטוקול יכול להיחשב לתפוקה בינונית, ניתן לזרז את החלק של תגובת המינון בעזרת מערכות אספקה כימיות אוטומטיות והדמיה. פרוטוקול זה הוא מתודולוגיה מתפתחת שניתן לשנות ולזקק עבור ספקטרום רחב של תרכובות מבוססות מתכת ומתכת למחקרים פרמקו וטוקסיקוקינטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי עניינים שיש לחשוף על ידי אף אחד מהמחברים.
Acknowledgments
מימון: NJAES-Rutgers NJ01201, מענק הכשרה של NIEHS T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. בנוסף, בריטני קאראס נתמכת על ידי מענק הכשרה T32NS115700 מ- NINDS, NIH. המחברים מכירים את אנדריאה ולנטה ואת הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) לאספקת PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
