Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

प्लैटिनम की खुराक- और Ruthenium-आधारित यौगिक जेब्राफ़िश में व्यापक अनुप्रयोगों के साथ आगमनात्मक युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एक्सपोजर आधारित अपटेक

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63587
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,2, 1
1Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Department of Biochemistry and Microbiology, Rutgers University, 3Centro de Química Estrutural and Departamento de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa

Summary

जेब्राफ़िश में धातुओं और धातु-आधारित यौगिकों के फार्माको- और टॉक्सिकोकाइनेटिक विश्लेषण की बढ़ी हुई दर पर्यावरण और नैदानिक अनुवाद अध्ययनों के लिए फायदेमंद हो सकती है। अज्ञात जलजनित एक्सपोजर अपटेक की सीमा को आगमनात्मक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके पचाए गए ज़ेब्राफ़िश ऊतक पर ट्रेस धातु विश्लेषण का संचालन करके दूर किया गया था।

Abstract

धातुओं और धातु आधारित यौगिकों में बहुआयामी फार्माको-सक्रिय और विष विज्ञानीय ज़ेनोबायोटिक्स शामिल हैं। भारी धातु विषाक्तता से कीमोथेरेपी तक, इन यौगिकों के विषकोकाइनेटिक्स में ऐतिहासिक और आधुनिक दोनों प्रासंगिकता है। ज़ेब्राफ़िश पर्यावरणीय जोखिम और नैदानिक अनुवाद अध्ययनों में फार्माको- और टॉक्सिकोकाइनेटिक्स को स्पष्ट करने में एक आकर्षक मॉडल जीव बन गया है। हालांकि ज़ेबराफ़िश अध्ययनों में कृंतक मॉडल की तुलना में उच्च-थ्रूपुट होने का लाभ है, मॉडल के लिए कई महत्वपूर्ण बाधाएं हैं।

ऐसी ही एक सीमा जलजनित खुराक आहार में निहित है। इन अध्ययनों से पानी की सांद्रता को विश्वसनीय आंतरिक खुराक प्रदान करने के लिए एक्सट्रपलेटेड नहीं किया जा सकता है। धातु-आधारित यौगिकों के प्रत्यक्ष माप यौगिक-संबंधित आणविक और जैविक प्रतिक्रियाओं के साथ बेहतर सहसंबंध की अनुमति देते हैं। धातुओं और धातु-आधारित यौगिकों के लिए इस सीमा को दूर करने के लिए, एक्सपोजर के बाद ज़ेब्राफ़िश लार्वा ऊतक को पचाने और आगमनात्मक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ICPMS) द्वारा ऊतक के नमूनों के भीतर धातु सांद्रता को मापने के लिए एक तकनीक विकसित की गई थी।

ICPMS विधियों का उपयोग ज़ेब्राफ़िश ऊतक में कई उपन्यास रू-आधारित कीमोथेरेपी से सिस्प्लैटिन और रूथेनियम (आरयू) से प्लैटिनम (पीटी) की धातु सांद्रता को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल ने पीटी की सांद्रता को प्रतिष्ठित किया जो जेब्राफ़िश ऊतक की तुलना में लार्वा के चोरियन में अनुक्रमित थे। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस विधि को लार्वा ऊतकों में मौजूद धातु की खुराक को क्वांटिटेट करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि को एक्सपोजर और खुराक अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला में विशिष्ट धातुओं या धातु-आधारित यौगिकों की पहचान करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

Introduction

धातुओं और धातु-आधारित यौगिकों में औषधीय और विष विज्ञान प्रासंगिकता जारी है। भारी धातु के जोखिम की व्यापकता और स्वास्थ्य पर इसके प्रभाव ने 1960 के दशक के बाद से वैज्ञानिक जांच में तेजी से वृद्धि की है और 2021 में एक सर्वकालिक उच्च स्तर पर पहुंच गया है। पीने के पानी, वायु प्रदूषण और व्यावसायिक जोखिम में भारी धातुओं की सांद्रता दुनिया भर में नियामक सीमासे अधिक है और आर्सेनिक, कैडमियम, पारा, क्रोमियम, सीसा और अन्य धातुओं के लिए एक मुद्दा बनी हुई है। पर्यावरणीय जोखिम को मापने और पैथोलॉजिकल विकास का विश्लेषण करने के लिए उपन्यास तरीके उच्च मांग 1,2,3 में बने हुए हैं।

इसके विपरीत, चिकित्सा क्षेत्र ने नैदानिक उपचार के लिए विभिन्न धातुओं के भौतिक रासायनिक गुणों का दोहन किया है। धातु-आधारित दवाओं या धातुऔषधियों में औषधीय उद्देश्यों का एक समृद्ध इतिहास है और बीमारियों की एक श्रृंखला के खिलाफ गतिविधि दिखाई गई है, जिसमें कीमोथेरेपी4 के रूप में उच्चतम सफलता है। Metallodrugs, cisplatin का सबसे प्रसिद्ध, एक पीटी-आधारित एंटीकैंसर दवा है जिसे विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा दुनिया की आवश्यक दवाओं में से एक के रूप में माना जाताहै। 2010 में, सिस्प्लैटिन और इसके पीटी डेरिवेटिव में कई कैंसर में 90% सफलता दर थी और लगभग 50% कीमोथेरेपी regimens 6,7,8 में उपयोग किया गया था। यद्यपि पीटी-आधारित कीमोथेरेपी को अकाट्य सफलता मिली है, खुराक-सीमित विषाक्तता ने परिष्कृत जैविक वितरण और गतिविधि के साथ वैकल्पिक धातु-आधारित दवाओं की गति की जांच में सेट किया है। इन विकल्पों में से, रू-आधारित यौगिक सबसे लोकप्रिय 9,10,11,12 बन गए हैं।

उपन्यास मॉडल और पद्धति धातु फार्माको- और toxicokinetic अध्ययन के लिए की जरूरत की दर के साथ तालमेल रखने के लिए आवश्यक हैं। ज़ेब्राफ़िश मॉडल जटिलता और थ्रूपुट के चौराहे पर स्थित है, जो 70% संरक्षित जीन होमोलॉजी13 के साथ एक उच्च-प्रजनन कशेरुक है। यह मॉडल फार्माकोलॉजी और विष विज्ञान में एक संपत्ति रहा है, जिसमें लीड डिस्कवरी, लक्ष्य पहचान और यांत्रिक गतिविधि 14,15,16,17 के लिए विभिन्न यौगिकों के लिए व्यापक स्क्रीनिंग है। हालांकि, रसायनों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग आमतौर पर जलजनित एक्सपोज़र पर निर्भर करती है। यह देखते हुए कि अपटेक समाधान में यौगिक के भौतिक-रासायनिक गुणों के आधार पर चर हो सकता है (यानी, फोटोडिग्रेडेशन, घुलनशीलता), यह खुराक वितरण और प्रतिक्रिया को सहसंबंधित करने की एक प्रमुख सीमा हो सकती है।

उच्च कशेरुकियों के लिए खुराक की तुलना के लिए इस सीमा को दूर करने के लिए, ज़ेबराफ़िश लार्वा ऊतक में ट्रेस धातु सांद्रता का विश्लेषण करने के लिए एक पद्धति तैयार की गई थी। यहां, घातक और सबलेथल एंडपॉइंट्स की खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों का मूल्यांकन सिस्प्लैटिन और उपन्यास आरयू-आधारित एंटीकैंसर यौगिकों के लिए किया गया था। घातकता और विलंबित हैचिंग का मूल्यांकन 0, 3.75, 7.5, 15, 30 और 60 मिलीग्राम / एल सिस्प्लैटिन की नाममात्र सांद्रता के लिए किया गया था। जीव ऊतक में पीटी संचय को ICPMS विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, और संबंधित खुराक के जीव अपटेक 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2, और 461.9 एनजी (पीटी) प्रति जीव थे। इसके अतिरिक्त, जेब्राफ़िश लार्वा को पीएमसी 79 के 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 मिलीग्राम / एल के संपर्क में लाया गया था। इन सांद्रताओं को विश्लेषणात्मक रूप से 0, 0.17, 0.44, 0.66, और 0.76 मिलीग्राम / एल आरयू को शामिल करने के लिए निर्धारित किया गया था। इस प्रोटोकॉल ने जेब्राफ़िश ऊतक की तुलना में लार्वा के चोरियन में अनुक्रमित पीटी की सांद्रता के अंतर के लिए भी अनुमति दी। यह पद्धति एक अच्छी तरह से स्थापित कीमोथेरेपी और एक उपन्यास यौगिक के बीच फार्माको- और टॉक्सिकोकाइनेटिक गतिविधि की तुलना के लिए विश्वसनीय, मजबूत डेटा प्रदान करने में सक्षम थी। इस विधि को धातुओं और धातु-आधारित यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

एबी स्ट्रेन ज़ेबराफ़िश (डैनियो रेरियो) का उपयोग सभी प्रयोगों के लिए किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें), और पशुपालन प्रोटोकॉल (# 08-025) को रटगर्स विश्वविद्यालय पशु देखभाल और सुविधा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. ज़ेबराफ़िश पशुपालन

  1. नस्ल और एक 14 घंटे प्रकाश पर एक recirculating जलीय निवास प्रणाली में zebrafish बनाए रखने: 10 ज अंधेरे चक्र.
    1. मछली प्रणाली के पानी को प्राप्त करने के लिए रेत और कार्बन निस्पंदन के माध्यम से नगरपालिका के नल के पानी को शुद्ध करें। जलीय प्रणाली के पानी को 28 डिग्री सेल्सियस, <0.05 पीपीएम नाइट्राइट, <0.2 पीपीएम अमोनिया, और 7.2 और 7.7 के बीच पीएच पर बनाए रखें।
    2. Zebrafish hatched Artemia अल्सर, नमकीन चिंराट, और मछली आहार गुच्छे भोजन का एक आहार फ़ीड.

2. Zebrafish खुराक प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल (चित्रा 1)

  1. Zebrafish अंडे के पानी के समाधान तैयार करें, या तो E3 मध्यम या अंडे का पानी स्टॉक समुद्री नमक से बना 60 μg / mL की एकाग्रता पर विआयनीकृत पानी18 में भंग कर दिया। मेथिलीन ब्लू के उपयोग से बचें।
    नोट: ICPMS के माध्यम से, ज़ेब्राफ़िश अंडे के पानी के आइसोबेरिक हस्तक्षेप को स्ट्रोंटियम ऑक्साइड के लिए पहचाना गया था, जो रूथेनियम के आइसोटोप के साथ ओवरलैप हो गया था। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से पहले लार्वा के सावधानीपूर्वक कुल्ला ने इस मुद्दे को सुधारा। ई 3 माध्यम वाणिज्यिक समुद्री लवण के मालिकाना मेकअप के कारण कुछ के लिए एक आसान विकल्प हो सकता है।
  2. E3 या अंडे के पानी में धातु या धातु आधारित यौगिकों को भंग करें। भंवर किसी भी समग्र सामग्री को तोड़ने और समाधान homogenize करने के लिए।
    नोट: नीचे उल्लिखित प्रयोग में, PMC79 और सिस्प्लैटिन को 12.4 मिलीग्राम / एल और 60 मिलीग्राम / एल की अधिकतम सांद्रता में 0.5% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की अधिकतम सांद्रता के साथ भंग कर दिया गया था ताकि वर्षा का विरोध किया जा सके।
    1. भारी धातु या धातु-आधारित यौगिकों को पतला करें, जैसे कि PMC79 और सिस्प्लैटिन, E3 या अंडे के पानी के साथ, कम से कम 5 एकाग्रता खुराक तैयार करते हैं।
      1. शुद्ध वाहन (यानी, डीएमएसओ) में स्टॉक समाधान की कम सांद्रता के साथ शुरू करें, फिर ई 3 या अंडे के पानी के साथ पतला करें। अंतिम वाहन सांद्रता पर ध्यान से विचार करें।
        नोट: कुछ धातु-आधारित यौगिक, जैसे कि सिस्प्लैटिन, तेजी से नीचा दिखाते हैं, और उनके समाधानों को दैनिक रूप से ताजा बनाया जाना चाहिए। सावधानी: देखभाल के साथ भारी धातुओं और chemotherapeutics संभाल. ब्याज की धातु के लिए विशिष्ट सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) की समीक्षा करें। सिस्प्लैटिन आंखों और त्वचा की जलन पैदा कर सकता है, निगलने पर घातक हो सकता है, और गुर्दे, रक्त, रक्त बनाने वाले अंगों और भ्रूण के ऊतकों में विषाक्तता पैदा कर सकता है। धुएं को सांस लेने और आंखों, त्वचा और कपड़ों के संपर्क में आने से बचें। अभेद्य दस्ताने और कपड़े पहनें, और सुरक्षा चश्मा या चश्मे19।
  3. लिंगों के बीच जगह में एक विभाजक के साथ 2 मादाओं से 1 पुरुष के आदर्श अनुपात में प्रयोग से पहले दोपहर को प्रजनन टैंकस्थापित करें।
    1. सुबह के चक्र के लिए रोशनी आने पर डिवाइडर खींचें।
    2. ज़ेबराफ़िश को प्रजनन करने की अनुमति दें।
      नोट: प्रजनन के लिए समय की लंबाई आवश्यक प्रारंभिक जोखिम चरण पर निर्भर करती है। 3 ज पोस्टफर्टिलाइजेशन के लिए, लगभग 2 घंटे के लिए प्रजनन की अनुमति दें। अंडे की सफाई और अलग करने के बाद अंडे 3 एचपीएफ तक पहुंच जाएंगे।
    3. प्रजनन मछली को एक साफ टैंक में ले जाएं।
    4. एक छलनी के माध्यम से टैंक का पानी डालकर अंडे इकट्ठा करें।
    5. एक पेट्री डिश पर छलनी को उलटें और डिश में अंडे को कुल्ला करने के लिए ई 3 या अंडे के पानी से भरी एक धारा निकलना बोतल का उपयोग करें।
    6. प्रयोगात्मक उपयोग से पहले भोजन और अपशिष्ट के पकवान को साफ करें।
  4. एक स्थानांतरण पिपेट और पानी की एक छोटी मात्रा का उपयोग करके व्यक्तिगत कांच की शीशियों में प्रति खुराक लगभग बीस 3 एचपीएफ भ्रूण को यादृच्छिक करें।
  5. सभी भ्रूण शीशियों में होने के बाद, सभी अंडे के पानी को हटा दें और पर्याप्त खुराक समाधान के साथ बदलें ताकि अंडे की ऊंचाई से ऊपर लगभग 1 इंच का समाधान हो।
    नोट: dechorionation की आवश्यकता पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
  6. घावों या घातकता के लिए दैनिक भ्रूण का निरीक्षण करें। भ्रूण zebrafish के तेजी से विकास के कारण, दिनों के बीच मामूली घावों की पहचान करने के लिए किसी भी ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप / कैमरा सेटअप का उपयोग करके दैनिक छवियों को प्राप्त करें।
  7. खुराक प्रतिक्रिया की समाप्ति पर (निषेचन के बाद 4-5 दिन [डीपीएफ], संगठन आर्थिक सहयोग और विकास [ओईसीडी] दिशानिर्देश21 के अनुसार), समग्र नमूने के लिए euthanization से पहले 3-5 लार्वा गठबंधन। तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीजिंग द्वारा तेजी से ठंडा करके Euthanize.
    नोट: MS-222 या tricaine मीथेनसल्फोनेट की अधिक मात्रा के माध्यम से इच्छामृत्यु संभावित रूप से ICPMS विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। हस्तक्षेप की संभावना को कम करने के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए तेजी से ठंडा इच्छामृत्यु विधियों को प्रोत्साहित किया जाता है।
  8. ऊतक के बाहरी हिस्से से अतिरिक्त यौगिक को हटाने के लिए उच्च शुद्धता वाले पानी (जैसे रिवर्स ऑस्मोसिस) के साथ ऊतक के 3 धोने का संचालन करें।
  9. नमूनों को एसिड और माइक्रोवेव-सुरक्षित 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ले जाएं। सभी अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए सावधान रहें क्योंकि कोई भी शेष तरल नाइट्रिक एसिड को पतला कर सकता है, और इसलिए, ऊतक गिरावट के दौरान एसिड की ऑक्सीकरण क्षमता।
    नोट: इस बिंदु पर, ऊतक को आगे के विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। स्वाभाविक रूप से प्रचुर मात्रा में धातुओं के लिए, उपयोग से पहले 5% नाइट्रिक एसिड स्नान में ट्यूबों की सफाई परिवेश पृष्ठभूमि के स्तर में सुधार करेगी।

3. ऊतक पाचन और ICPMS मूल्यांकन (चित्रा 2)

  1. उच्च-शुद्धता नाइट्रिक एसिड (69%) के 10 लार्वा (~ 100 μg) तक के लिए 15 mL पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में लगभग 0.25 mL जोड़ें। Ultrasonicate 1 ज के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग कर नमूनों predigest करने के लिए: अल्ट्रासोनिक स्नान उत्पादन: 85 डब्ल्यू; 42 kHz ± 6%; तापमान सीमा: 19-27 डिग्री सेल्सियस.
    चेतावनी: sonication के दौरान कान की सुरक्षा पहनें। नाइट्रिक एसिड गंभीर श्वसन पथ, आंखों और त्वचा के जलने का कारण बनता है। पूर्ण सुरक्षा उपकरण पहनें और धुएं के हुड में या पर्याप्त वेंटिलेशन वाले स्थानों में काम करें। यह अन्य सामग्रियों के साथ ज्वलनशील हो सकता है। नाइट्रिक एसिड को पाचन के दौरान उत्पादित वाष्पों के संपर्क को रोकने के लिए विशेष रूप से धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए। साँस न लें और न ही निगलें।
    1. एक एसिड-सुरक्षित माइक्रोवेव डाइजेस्टर में ऊतक पाचन (5 मिनट के अंतराल) के छोटे चक्रों को तब तक करें जब तक कि सभी ऊतक स्पष्ट रूप से ऑक्सीकृत न हो जाएं (यानी, एक समान, स्पष्ट-पीला समाधान)।
      नोट:: तालिका 1 में माइक्रोवेव प्रोटोकॉल तीन बार किया जा करने के लिए अनुशंसित है और प्रत्येक हीटिंग चरण के बीच एक 5 मिनट कूलडाउन अंतराल शामिल है।
    2. टूटने से बचने के लिए ट्यूबों की अखंडता की सावधानीपूर्वक निगरानी करें और ट्यूब के नीचे एसिड संक्षेपण को स्थानांतरित करने के लिए चक्रों के बीच सेंट्रीफ्यूज (313 × जी 1 मिनट के लिए जी ) में छोटे स्पिन का संचालन करें।
      नोट: यदि ऊतक को पचाना मुश्किल है (विशेष रूप से कोरियन), एसिड पाचन के बाद 30% उच्च-शुद्धता हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग किया जा सकता है। एसिड एकाग्रता को 3.5% तक पतला करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड (6.75 मिलीलीटर) का उपयोग करें, और नमूनों को धुएं के हुड में रात भर बैठने की अनुमति दें। हाइड्रोजन पेरोक्साइड एच2ओ तक विघटित हो जाएगा और ICPMS विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, वैकल्पिक धातुएं हाइड्रोक्लोरिक एसिड या हाइड्रोक्लोरिक एसिड और नाइट्रिक एसिड (यानी, एक्वा रेगिया) के मिश्रण में बेहतर घुल सकती हैं। हाइड्रोजन पेरोक्साइड हानिकारक है यदि निगल लिया जाता है और गंभीर आंखों की क्षति का कारण बनता है। त्वचा और आंखों की सुरक्षा22,23 पहनें।
  2. एक बार जब ऊतक स्पष्ट रूप से ऑक्सीकरण हो जाता है (यानी, समान, स्पष्ट-पीला समाधान), एक धुएं के हुड में नमूनों को 3.5% नाइट्रिक एसिड में पतला करें, जिसमें 6.75 मिलीलीटर उच्च शुद्धता वाले पानी और भंवर का उपयोग करके अच्छी तरह से मिश्रण किया जा सके।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूने कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। यह चरण अनावश्यक है यदि हाइड्रोजन पेरोक्साइड को चरण 3.1 में पाचन में सहायता करने के लिए जोड़ा गया था।
  3. एक मैट्रिक्स मिलान, 7-बिंदु अंशांकन वक्र (0.001-10 पीपीबी की एकाग्रता सीमा) का संचालन एक प्रमाणित मौलिक मानक (यानी, पीटी या रू, परख के आधार पर) ब्याज की धातु और इष्टतम आइसोटोप (ओं) के साथ किसी भी संभावित आइसोबेरिक हस्तक्षेप के लिए खाते के साथ का उपयोग कर।
    1. जलीय, प्रमाणित मौलिक मानक (Ru, Pt = 1000 ppb) की स्टॉक एकाग्रता का उपयोग करते हुए, एक 0.1 mL एलीकोट और एक नए 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट लें। 10 पीपीबी मानक समाधान का उत्पादन करने के लिए 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में 3.5% नाइट्रिक एसिड के साथ पतला करें।
    2. 10 पीपीबी स्टॉक का उपयोग करते हुए, निम्नलिखित सीरियल dilutions बनाएं: 3.5% नाइट्रिक एसिड में 0.1, 1.0, और 5.0 पीपीबी मानक समाधान।
    3. 0.1 स्टॉक का उपयोग करते हुए, निम्नलिखित सीरियल dilutions: 0.001, 0.005, और 0.01 पीपीबी 3.5% नाइट्रिक एसिड में मानक समाधान बनाते हैं।
  4. ICPMS उपकरण तैयार करें (देखें सामग्री की तालिका) के रूप में नमूना विश्लेषण के लिए निम्नानुसार है:
    1. उपकरण शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि आर्गन गैस वाल्व खुला है, सभी टयूबिंग सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है, और स्वच्छ 5% नाइट्रिक एसिड नमूना विश्लेषण के बीच ट्यूबिंग और ग्लासवेयर को धोने के लिए खुला है।
    2. मशाल और शंकु की स्थिति की जांच करें, और सुनिश्चित करें कि मशाल बॉक्स सुरक्षित रूप से कुंडी है और स्प्रे चैंबर जल निकासी ट्यूब पेरिपम्प से ठीक से जुड़ा हुआ है।
    3. सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. वैक्यूम रीडिंग की जांच करें और सुनिश्चित करें कि सभी टर्बो पंप 100% पर चल रहे हैं।
    5. प्रारंभ अनुक्रम प्रारंभ करने के लिए प्लाज्मा नियंत्रण प्रणाली स्थिति विंडो में प्रारंभ करें क्लिक करें, प्लाज्मा पंप को चालू करें, प्लाज्मा चिलर चालू करें, नेबुलाइज़र को शुद्ध करें, और प्लाज्मा को प्रकाश दें. जब स्थिति विंडो इंगित करेगी कि स्टार्टअप अनुक्रम पूरा हो गया है, तो प्लाज्मा को जलाया और स्थिर होने की प्रतीक्षा करें। इस बिंदु पर, सिस्टम स्थिति विंडो पर हरे रंग के डॉट्स का निरीक्षण करें जो इंगित करता है कि सभी पावर आपूर्ति चालू हैं।
    6. मेनू बार में, ड्रॉपडाउन मेनू में autosampler | नियंत्रण पर क्लिक करें। 5% नाइट्रिक एसिड युक्त ट्यूब के लिए autosampler रैक स्थिति दर्ज करें। एसिड को प्लाज्मा में प्रवेश करने की अनुमति दें।
    7. मेनू पट्टी में, स्कैन | पर क्लिक करें ड्रॉपडाउन मेनू में चुंबक. MagnetScan विंडो में, मार्कर मास स्थिति में 115 टाइप करें और दर्ज करें क्लिक करें। चुंबक को 115इंच (114.6083 से 115.3749) के लिए द्रव्यमान सीमा में स्कैन करने की अनुमति दें, जबकि उपकरण गर्म हो जाता है।
    8. 30 मिनट के बाद, एक 1 पीपीबी मल्टीएलमेंट ट्यूनिंग समाधान की स्थिति में जाने के लिए ऑटोसैम्पलर नियंत्रण का उपयोग करें। ट्यूनिंग समाधान aspirate और संकेत पढ़ने का अनुकूलन करने के लिए उपकरण धुन. मशाल की स्थिति (एक्स, वाई, जेड) को समायोजित करें जैसे कि मशाल प्लाज्मा नियंत्रण विंडो में शंकु और नेबुलाइज़र प्रवाह दर (~ 30 साई) के केंद्र के साथ संरेखित है। स्रोत, डिटेक्टर, और विश्लेषक के लिए आयन ऑप्टिक्स ट्यूनिंग विंडो में आवश्यक समायोजन करें।
    9. एक बार सिग्नल रीडिंग अनुकूलित हो जाने के बाद (~ 1.2 × 106 गिनती / एस 115इंच पर 1 पीपीबी के लिए), चुंबक स्कैन विंडो में रोकें क्लिक करें।
      1. कैलिब्रेट चुंबक क्लिक करें और पॉपअप विंडो में कम रिज़ॉल्यूशन का चयन करें.
      2. ठीक क्लिक करें और चुंबक कैलिब्रेट करने के लिए "मास कैलिब्रेशन (कम रिज़ॉल्यूशन).smc" फ़ाइल खोलें।
        नोट: चुंबक अंशांकन गिनती को मापने और निम्न द्रव्यमान श्रेणी के माध्यम से एक वक्र फिट करेगा: 7Li करने के लिए 238U.
      3. | सहेजें क्लिक करें विश्लेषण करने के लिए वर्तमान चुंबक अंशांकन को लागू करने के लिए उपयोग करें। यदि सांद्रता की एक विशाल श्रृंखला के साथ अज्ञात नमूनों को मापने, एक डिटेक्टर अंशांकन प्रदर्शन आयन नाड़ी उच्च सांद्रता पर उत्पादित क्षीण आयन संकेतों के लिए कम सांद्रता पर संकेतों की गणना की तुलना करने के लिए। ट्यूनिंग और अंशांकन पूरा होने के बाद नमूनों का विश्लेषण करें।
    10. मेनू पट्टी में, डेटा अधिग्रहण पर क्लिक करें।
      1. ड्रॉपडाउन मेनू में विधि सेटअप पर क्लिक करें। निर्माता द्वारा प्रदान की गई मौजूदा विधि का उपयोग करें, या रुचि के तत्वों के आधार पर एक विधि बनाएँ। यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण मोड को समायोजित करें, रहने का समय, स्विच देरी, स्वीप / चक्रों की संख्या, रिज़ॉल्यूशन, डिटेक्शन मोड, और डिफ्लेक्टर सेटिंग्स के लिए पार्क द्रव्यमान।
      2. विधि सेटिंग्स रिकॉर्ड करने के लिए सहेजें क्लिक करें. प्रत्येक धातु और आइसोटोप के लिए मापदंडों का अनुकूलन करें। इस अध्ययन में उपयोग किए गए विशिष्ट ऑपरेशन पैरामीटर के लिए तालिका 2 देखें।
    11. मेनू पट्टी में, डेटा अधिग्रहण पर क्लिक करें।
      1. ड्रॉपडाउन मेनू में बैच रन पर क्लिक करें। वैकल्पिक रूप से, मेनू पट्टी के नीचे बैच आइकन पर क्लिक करें। किसी स्प्रेडशीट से बैच पैरामीटर आयात करें, या बैच चलाएँ विंडो में कोई अनुक्रम बनाएँ। नमूना प्रकार, autosampler रैक स्थिति, स्थानांतरण समय, धोने का समय, प्रतिकृति, नमूना ID, और विधि फ़ाइल दर्ज करें।
    12. बैच रन को निम्न क्रम में व्यवस्थित करें: अंशांकन वक्र (0.001-10 ppb Pt या Ru) के लिए मानक समाधान, एक गुणवत्ता नियंत्रण मानक के बाद, फिर अज्ञात नमूने।
      नोट:: मानक समाधान ICPMS पर गिनती/s के रूप में मापा जाता है, और एक रैखिक प्रतिगमन एक सापेक्ष मानक विचलन (RSD) > 0.999 के साथ मानकों के माध्यम से फिट है। अज्ञात को भी गिनती /एस के रूप में मापा जाता है और अंशांकन वक्र के रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके पीपीबी में एकाग्रता के लिए हल किया जाता है, y = mx + b। डेटा प्रोसेसिंग को संदर्भित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके भी पूरा किया जा सकता है।
    13. मॉनिटर साधन बहाव और नमूना reproducibility एक 0.5 पीपीबी गुणवत्ता नियंत्रण मानक हर 5-10 नमूनों को शामिल करके.
      नोट:: उपयुक्त गुणवत्ता नियंत्रण मानक एक प्रमाणित मानक संदर्भ सामग्री अंशांकन वक्र में उपयोग किए जाने वाले मानक से अलग होना चाहिए।
वाट शक्ति मिनट
300 50% 5
300 75% 5
300 0% 5
300 75% 5

तालिका 1: लार्वा ऊतक द्रव्यमान के लिए माइक्रोवेव पाचन प्रोटोकॉल। ज़ेब्राफ़िश लार्वा के नमूनों को नाइट्रिक एसिड के 0.25 मिलीलीटर में पचाया गया था। इस तालिका को 24 से संशोधित किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ये परिणाम पहले24 प्रकाशित किए गए हैं। ऊतक अपटेक अध्ययन सिस्प्लैटिन के जलजनित एक्सपोजर और एक उपन्यास आरयू-आधारित एंटीकैंसर यौगिक, पीएमसी 79 के साथ आयोजित किए गए थे। घातकता और विलंबित हैचिंग का मूल्यांकन सिस्प्लैटिन 0, 3.75, 7.5, 15, 30 और 60 मिलीग्राम / एल सिस्प्लैटिन की नाममात्र सांद्रता के लिए किया गया था। जीव ऊतक में पीटी संचय को ICPMS विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, और जीव ऊतक में 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2, और 461.9 एनजी (पीटी) प्रति जीव (चित्रा 3) की संबंधित खुराक शामिल थी। सिस्प्लैटिन के लिए नाममात्र सांद्रता के विश्लेषणात्मक निर्धारण का मूल्यांकन नहीं किया गया था, सिस्प्लैटिन की ज्ञात स्थिरता को देखते हुए।

विलंबित हैचिंग सभी सिस्प्लैटिन सांद्रता में देखा गया था। अतिरिक्त प्रयोगों के साथ और मैनुअल dechorionation के बिना पीटी सांद्रता के लिए आयोजित किए गए थे। Dechorionation के बाद, chorions एकत्र किए गए थे और अलग से पीटी के लिए विश्लेषण किया गया था। dechorionation अध्ययन के लिए इस्तेमाल सिस्प्लैटिन की nonlethal खुराक निर्धारित किया है कि सिस्प्लैटिन की कुल वितरित खुराक का 93-96% लार्वा ऊतक के भीतर शेष खुराक के साथ चोरियन में जमा हो गया था (चित्रा 4)।

जेब्राफ़िश लार्वा पीएमसी 79 के 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 मिलीग्राम / एल के संपर्क में थे। इन खुराकों को आईसी50 के डेरिवेटिव का निर्धारण करके चुना गया था, जैसा कि पहले16 वर्णित किया गया था। इन सांद्रताओं को विश्लेषणात्मक रूप से 0, 0.17, 0.44, 0.66, और 0.76 मिलीग्राम / एल आरयू को शामिल करने के लिए निर्धारित किया गया था। सिस्प्लैटिन खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के विपरीत, PMC79-उजागर लार्वा में देरी से हैचिंग नहीं देखी गई थी। कोरियन को रुथेनियम विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया था क्योंकि वे लार्वा संग्रह से पहले स्वाभाविक रूप से अवक्रमित हो गए थे। शोधकर्ताओं को 24 डीपीएफ पर dechorionating और chorions इकट्ठा करके देरी से हैचिंग के बिना chorion विश्लेषण शामिल हो सकता है। प्रत्येक सांद्रता पर विश्लेषण किए गए लार्वा ऊतकों के भीतर धातु का द्रव्यमान 0.19, 0.41, और 0.68 एनजी (आरयू) प्रति लार्वा (चित्रा 5) था। 50% आबादी (एलसी 50 / एलडी 50), प्रभावी सांद्रता, या 50% आबादी(ईसी 50 / ईडी 50) के लिए खुराक सहित टॉक्सिकोलॉजिकल एंडपॉइंट्स का सारांश, और सबसे कम मनाया गया प्रतिकूल प्रभाव स्तर (एलओएईएल) तालिका 3 में पाया जा सकता है।

सिस्प्लैटिन PMC79
नाममात्र (mg/L) μM पीटी (एनजी) / जीव Analytical Ru (mg/L) μM Ru (ng) / जीव
LC50/LD50 31 (95% सीआई: 20.5-34.0) 158 (95% सीआई: 105-174) 193 (± 130) 0.79 (95% सीआई: 0.43-1.20) 7.8 (95% CI: 4.2-11.8) ना
EC50 4.6 12.5 ना ना ना ना
LOAEL 3.75 15.3 8.7 (± 4) 0.17 1.7 0.19 (± 0.05)

तालिका 3: विषाक्तता समापन बिंदु के साथ जुड़े समाधान और metalodrug uptake का निर्धारण। एलडी50 को क्रमशः सिस्प्लैटिन और पीएमसी 79 के लिए पीटी और आरयू के धातु समकक्ष विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। PMC79 के लिए LC50 सांद्रता विश्लेषणात्मक रूप से निर्धारित की गई थी। हालांकि, नाममात्र सिस्प्लैटिन सांद्रता का विश्लेषणात्मक निर्धारण आयोजित नहीं किया गया था; समाधान में सिस्प्लैटिन की ज्ञात स्थिरता को देखते हुए, यह माना जाता था कि समाधान में नाममात्र और मापा सांद्रता बराबर होगी। सिस्प्लैटिन एक्सपोजर के लिए विलंबित हैचिंग एंडपॉइंट का मूल्यांकन ईडी50 और एलओएईएल के संदर्भ में किया गया था। PMC79 की LOAEL सांद्रता विश्लेषणात्मक रूप से निर्धारित की गई थी। LOAEL में पुच्छल शिरा और पूंछ धमनी, रीढ़ की हड्डी की वक्रता और जर्दी थैली एडिमा के साथ रक्तस्राव जैसे घाव शामिल थे। सभी 95% विश्वास अंतराल की गणना लिचफील्ड विलकॉक्सन विधि का उपयोग करके की गई थी। इस तालिका को 24 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त रूप: CI = आत्मविश्वास अंतराल; एलसी50 = जनसंख्या के 50% के लिए घातक एकाग्रता; एलडी50 = 50% आबादी के लिए घातक खुराक; EC50 = जनसंख्या के 50% के लिए प्रभावी एकाग्रता; LOAEL = सबसे कम मनाया प्रतिकूल प्रभाव स्तर.

Figure 1
चित्रा 1: Zebrafish खुराक प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल. यह प्रोटोकॉल OECD FET से अनुकूलित एक संशोधित दृष्टिकोण का उपयोग करता है। Biorender के साथ बनाया गया. संक्षिप्त नाम: OECD = Organization Economic Cooperation and Development FET = मछली भ्रूण तीव्र विषाक्तता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ऊतक पाचन और ICPMS मूल्यांकन। पाचन प्रोटोकॉल जेब्राफ़िश लार्वा के समग्र नमूने को पचाने के लिए प्रभावी है। संक्षिप्त नाम: ICPMS = आगमनात्मक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री। Biorender के साथ बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सिस्प्लैटिन खुराक-प्रतिक्रिया( A) प्रतिशत का अर्थ है कि 5 dpf पर विलंबित हैचिंग प्रति जीव निर्धारित माध्य Pt समकक्षों से संबंधित है। (बी) 5 डीपीएफ पर प्रतिशत माध्य घातकता प्रति जीव माध्य पीटी समकक्षों से संबंधित है। प्रतिशत का अर्थ है: एन = 40 प्रति खुराक। पीटी (एनजी) प्रति जीव: >4 प्रति खुराक समग्र नमूने। दो प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों का आयोजन किया गया था, जिनमें से श्रेणियां प्रदर्शित की जाती हैं। इस आंकड़े को 24 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त नाम: dpf = निषेचन के बाद के दिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लार्वा में मौजूद पीटी (एनजी) की तुलना और 7.5 या 15 मिलीग्राम / एल के संपर्क में आने के बाद कोरियन। समग्र >3 लार्वा या प्रति नमूना chorions; बाएं से दाएं N = 13, 10, 10, और 11। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. मान-व्हिटनी रैंक-योग परीक्षण पी < दोनों खुराक के लिए लार्वा और चोरियन के बीच 0.001। इस आंकड़े को 24 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: PMC79 खुराक-प्रतिक्रिया। (A) प्रतिशत माध्य घातकता को समाधान (mg/L) में विश्लेषणात्मक रूप से निर्धारित माध्य रू समकक्षों से सहसंबद्ध किया गया था। (बी) एक ही प्रयोग से निषेचन के बाद 5 दिनों में प्रतिशत माध्य घातकता प्रति लार्वा माध्य आरयू समकक्षों से संबंधित थी। घातकता: एन = 40 प्रति खुराक। आरयू (मिलीग्राम / एल): एन = 6 प्रति खुराक समग्र नमूने। आरयू (एनजी) प्रति लार्वा >4 समग्र नमूने प्रति खुराक। दो प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों का आयोजन किया गया था, जिनमें से श्रेणियां प्रदर्शित की जाती हैं। इस आंकड़े को 24 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रति चोटी निवास समय 4 ms
स्विच देरी / पीक (x10micros) 2
स्वीप की संख्या 350
चक्रों की संख्या 1
साधन रिज़ॉल्यूशन 300
डिटेक्शन मोड क्षीण, विक्षेपक कूद
पार्क मास 98.90594
आइसोटोप (Isotopes) पीटी (192, 194, 195, 196), रू (99, 100, 101, 102) सीनियर (84)

तालिका 2: ICPMS विधि पैरामीटर। पीटी और आरयू आइसोटोप के विश्लेषण के लिए पैरामीटर क्रमशः सिस्प्लैटिन और पीएमसी 79 के ऊतक सांद्रता को निर्धारित करने के लिए। सीनियर को टैंक पानी की संरचना से जुड़े आइसोबेरिक हस्तक्षेपों की निगरानी करने के लिए शामिल किया गया था। इस तालिका को 24 से संशोधित किया गया है। ICPMS = आगमनात्मक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को या तो पीटी या आरयू युक्त धातु-आधारित एंटीकैंसर दवाओं के वितरण और उत्थान को निर्धारित करने के लिए लागू किया गया है। यद्यपि इन विधियों को पहले ही प्रकाशित किया जा चुका है, यह प्रोटोकॉल यौगिकों की एक श्रृंखला के लिए इस पद्धति को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण विचारों और विवरणों पर चर्चा करता है। ऊतक पाचन और ICPMS विश्लेषण के साथ युग्मित OECD प्रोटोकॉल ने हमें यह निर्धारित करने की अनुमति दी कि PMC79 सिस्प्लैटिन की तुलना में अधिक शक्तिशाली था और इसके परिणामस्वरूप अलग-अलग ऊतक संचय हुआ, जो अलग-अलग तंत्र का सुझाव देता है। इसके अलावा, क्योंकि सिस्प्लैटिन की वितरित खुराक को परिमाणित किया गया था, खुराक-प्रतिक्रिया परिणामों को रोगी आबादी के लिए extrapolated किया गया था। Sublethal खुराक (उदाहरण के लिए, LOAEL) रोगियों में अंतःशिरा खुराक सांद्रता के लिए तुलनीय थे24.

यद्यपि इस विधि को धातुओं और धातु-आधारित यौगिकों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम पर लागू किया जा सकता है, विश्लेषक के भौतिक-रासायनिक गुणों की सावधानीपूर्वक जांच को ध्यान में रखा जाना चाहिए। धातु-आधारित यौगिकों को भंग करना बहुत मुश्किल हो सकता है, और इससे बचने के लिए विभिन्न वाहनों का उपयोग किया जा सकता है। वाहन सांद्रता, जैसे कि डीएमएसओ, को ओईसीडी प्रोटोकॉल में अनुशंसित की तुलना में उच्च सांद्रता में होने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, नियंत्रण के विकास की बारीकी से निगरानी करके एक नॉनटॉक्सिक खुराक को बनाए रखना महत्वपूर्ण है; एक्सपोजर के दौरान भ्रूण को लगातार हिलाना वर्षा को कम करता है। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनोमेटेलिक यौगिक जलीय घोल में स्थिर नहीं हो सकते हैं। यदि गिरावट की प्रक्रिया अज्ञात है, तो जिन अध्ययनों में 24 घंटे समाधान नवीकरण शामिल है, उन पर विचार किया जा सकता है या गैर-नवीकरणीय खुराक-प्रतिक्रिया घटता की तुलना में किया जा सकता है।

ओईसीडी मछली तीव्र भ्रूण विषाक्तता परीक्षण (एफईटी) संख्या 23621 का पालन करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, विशिष्ट उद्देश्यों के अनुरूप संशोधन किए जा सकते हैं। कांच के कंटेनर प्लास्टिक और प्लास्टिसाइज़र जैसे विषाक्त चर को भ्रमित करने से बचते हैं, और धातुओं को दृढ़ता से adsorb नहीं करते हैं, जो अंडे के पानी से analytes को हटा देगा। उन यौगिकों के लिए जो फोटोडिग्रेड करते हैं, जैसे कि सिस्प्लैटिन, प्रकाश चक्र के बिना जोखिम का संचालन करना फायदेमंद हो सकता है।

ज़ेब्राफ़िश खुराक-प्रतिक्रिया अध्ययन25,26,27 में डिकोरियनेशन की आवश्यकता के बारे में साहित्य में बहुत चर्चा है। 24 hpf पर dechorionation के लिए तर्क बताते हैं कि chorion यौगिकों की पारगम्यता को सीमित करता है, इस प्रकार गलत-नकारात्मक परिणाम या संवर्धित खुराक-प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करता है। यद्यपि इन बिंदुओं में योग्यता है, लेकिन डिकोरियोनेशन के बिना अध्ययन करने से यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है। इन अध्ययनों से पता चलता है कि सिस्प्लैटिन अपनी अल्काइलेटिंग गतिविधि (चित्रा 2) के कारण भ्रूण के कोरियोन में जमा हो जाता है। परिणामी adducts संरचना को सुदृढ़ करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप देरी से हैचिंग होती है। हालांकि, पीएमसी 79 और अन्य आरयू-आधारित एंटीकैंसर दवाओं ने इस घटनाका कारण नहीं बनाया। यद्यपि कई कीमोथेरेपी अल्काइलेशन द्वारा अपनी एंटीकैंसर गतिविधि को लागू करते हैं, लेकिन पीएमसी 79 एक्सपोजर के बाद देरी से हैचिंग की कमी ने एक असमान तंत्र का संकेत दिया। dechorionation के साथ या बिना अध्ययन सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए या समानांतर में आयोजित किया जाना चाहिए।

डाउनस्ट्रीम ऊतक पाचन और ICPMS विश्लेषण पर लगातार विचार किया जाना चाहिए। यह सुझाव दिया जाता है कि किसी भी अभिकर्मक का उपयोग करने से बचें जो आइसोबेरिक हस्तक्षेप का कारण बन सकते हैं और वैकल्पिक तरीकों को लागू कर सकते हैं। खुराक-प्रतिक्रिया अध्ययन के दौरान उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक नाइट्रिक एसिड और इसकी ऑक्सीकरण क्षमता के साथ प्रभावित या प्रतिक्रिया कर सकते हैं या आइसोबेरिक हस्तक्षेप में योगदान कर सकते हैं। यह पता चला कि अंडे के पानी को बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले नमक के समाधान ने स्ट्रोंटियम (सीनियर) ऑक्साइड उत्पन्न किया, जो आरयू24 के एक विशिष्ट आइसोटोप के साथ ओवरलैप हो गया। नमक की सांद्रता को कम करना या लार्वा को सावधानीपूर्वक साफ करना इस मुद्दे को सुधार सकता है। इन कारणों से, यह रोगाणुरोधी मेथिलीन नीले या euthanizing एजेंट, tricaine से बचने के लिए सुझाव दिया जाता है। इसके बजाय, आटोक्लेव और बाद में रोगाणुओं को हटाने या तेजी से ठंडा करके लार्वा को euthanize करने के लिए अंडे के पानी को वातित करें। ब्याज के विश्लेषक के लिए न्यूनतम आइसोबेरिक हस्तक्षेप के साथ रैखिक आइसोटोपिक मानक घटता प्राप्त करने के लिए इस चरण में यह महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि ऑर्गेनोमेटेलिक यौगिकों को ऑक्सीकरण किया जाएगा जैसे कि केवल धातु बनी रहे। इस प्रकार, चयापचय अध्ययन आयोजित नहीं किया जा सकता है। यद्यपि प्रोटोकॉल को मध्यम-थ्रूपुट माना जा सकता है, खुराक-प्रतिक्रिया भाग को स्वचालित रासायनिक वितरण प्रणालियों और इमेजिंग की सहायता से तेज किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक नवजात पद्धति है जिसे फार्माको- और टॉक्सिकोकाइनेटिक अध्ययनों के लिए धातु और धातु-आधारित यौगिकों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए संशोधित और परिष्कृत किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

किसी भी लेखक द्वारा प्रकट किए जाने वाले हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

वित्त पोषण: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS प्रशिक्षण अनुदान T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. इसके अतिरिक्त, ब्रिटनी कारस को NINDS, NIH से प्रशिक्षण अनुदान T32NS115700 द्वारा समर्थित किया जाता है। लेखकों Andreia Valente और विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए पुर्तगाली फाउंडेशन को स्वीकार करते हैं (Fundação पैरा एक Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/ QUI-QIN/28662/2017) PMC79 की आपूर्ति के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB Strain Zebrafish (Danio reri) Zebrafish International Resource Center Wild-Type AB Wild-Type AB Zebrafish
ACS Grade Nitric Acid VWR BDH Chemicals BDH3130-2.5LP Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes
Aquatox Fish Diet (Flake) Zeigler Bros, Inc. Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Artemia cysts, brine shrimp PentairAES BS90 Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed
ASX-510 Autosampler for ICPMS Teledyne CETAC Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses.  
Centrifuge Thermo Scientific CL 2 Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention
Centrifuge tubes VWR 21008-105 Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom
Class A Clear Glass Threaded Vials Fisherbrand 03-339-25B Individual glass vials for exposure containment
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D8418 Solvent or vehicle for hydrophobic compounds
Fixed Speed Vortex Mixer VWR 10153-834 Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution
High Purity Hydrogen Peroxide Merk KGaA, EDM Millipore 1.07298.0250 Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion
High Purity Nitric Acid EDM Millipore NX0408-2 Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion
Instant Ocean Sea Salt Spectrum Brands, Inc. Instant Ocean® Sea Salt Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml
Mars X Microwave Digestion System CEM, Matthews, NC Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). 
Multi-element Solution 3 SPEX CertiPREP CLMS-3 Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses
Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) Nu Instruments/Amatek Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. 
Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 National Institute of Standards and Technology 3140 Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses
Platinum (Pt) standard solution, single-element High Purity Standards 100040-2 Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl
Ruthenium (Ru) standard solution, single-element High Purity Standards 100046-2 Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl
TetraMin Tropical Flakes Tetra 77101 Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Trace Metal Grade Nitric Acid VWR BDH Chemicals 87003-261 Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler
Ultrasonic water bath VWR B2500A-DTH Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
  2. Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
  3. Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
  4. Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
  5. Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
  6. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  7. Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97 (2019).
  8. Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
  9. Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
  10. Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
  11. Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
  12. Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
  13. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  14. Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
  15. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  16. Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
  17. Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
  20. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  21. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
  22. EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
  23. Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
  24. Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
  25. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
  26. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  27. Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 182
प्लैटिनम की खुराक- और Ruthenium-आधारित यौगिक जेब्राफ़िश में व्यापक अनुप्रयोगों के साथ आगमनात्मक युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एक्सपोजर आधारित अपटेक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karas, B. F., Doherty, C. L., Terez, … More

Karas, B. F., Doherty, C. L., Terez, K. R., Côrte-Real, L., Cooper, K. R., Buckley, B. T. Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications. J. Vis. Exp. (182), e63587, doi:10.3791/63587 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter