Summary
Die erhöhte Rate pharmako- und toxikokinetischer Analysen von Metallen und metallbasierten Verbindungen in Zebrafischen kann für Umwelt- und klinische Translationsstudien von Vorteil sein. Die Begrenzung der unbekannten Wasserexpositionsaufnahme wurde durch die Durchführung von Spurenmetallanalysen an verdautem Zebrafischgewebe unter Verwendung der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma überwunden.
Abstract
Metalle und metallbasierte Verbindungen umfassen vielfältige pharmakoaktive und toxikologische Xenobiotika. Von der Schwermetalltoxizität bis hin zu Chemotherapeutika hat die Toxikokinetik dieser Verbindungen sowohl historische als auch moderne Relevanz. Zebrafische sind zu einem attraktiven Modellorganismus für die Aufklärung der Pharmako- und Toxikokinetik in Umweltexpositions- und klinischen Translationsstudien geworden. Obwohl Zebrafischstudien den Vorteil haben, dass sie einen höheren Durchsatz haben als Nagetiermodelle, gibt es mehrere signifikante Einschränkungen für das Modell.
Eine solche Einschränkung ist dem wässrigen Dosierungsschema inhärent. Die Wasserkonzentrationen aus diesen Studien können nicht extrapoliert werden, um zuverlässige interne Dosierungen zu liefern. Direkte Messungen der metallbasierten Verbindungen ermöglichen eine bessere Korrelation mit verbindungsbezogenen molekularen und biologischen Antworten. Um diese Einschränkung für Metalle und metallbasierte Verbindungen zu überwinden, wurde eine Technik entwickelt, um Zebrafischlarvengewebe nach der Exposition zu verdauen und Metallkonzentrationen in Gewebeproben durch induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICPMS) zu quantifizieren.
ICPMS-Methoden wurden verwendet, um die Metallkonzentrationen von Platin (Pt) aus Cisplatin und Ruthenium (Ru) aus mehreren neuartigen Ru-basierten Chemotherapeutika im Zebrafischgewebe zu bestimmen. Darüber hinaus unterschied dieses Protokoll Konzentrationen von Pt, die im Chorion der Larve sequestriert wurden, im Vergleich zum Zebrafischgewebe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode angewendet werden kann, um die in Larvengeweben vorhandene Metalldosis zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode angepasst werden, um bestimmte Metalle oder metallbasierte Verbindungen in einem breiten Spektrum von Expositions- und Dosierungsstudien zu identifizieren.
Introduction
Metalle und metallbasierte Verbindungen haben nach wie vor pharmakologische und toxikologische Relevanz. Die Prävalenz der Schwermetallexposition und ihre Auswirkungen auf die Gesundheit haben die wissenschaftlichen Untersuchungen seit den 1960er Jahren exponentiell erhöht und 2021 ein Allzeithoch erreicht. Die Konzentrationen von Schwermetallen im Trinkwasser, die Luftverschmutzung und die berufliche Exposition überschreiten weltweit die gesetzlichen Grenzwerte und bleiben ein Problem für Arsen, Cadmium, Quecksilber, Chrom, Blei und andere Metalle. Neuartige Methoden zur Quantifizierung der Umweltexposition und zur Analyse der pathologischen Entwicklung sind nach wie vor sehr gefragt 1,2,3.
Umgekehrt hat der medizinische Bereich die physiochemischen Eigenschaften verschiedener Metalle für die klinische Behandlung genutzt. Metallbasierte Medikamente oder Metallodrugs haben eine reiche Geschichte von medizinischen Zwecken und haben Aktivität gegen eine Reihe von Krankheiten gezeigt, mit dem höchsten Erfolg als Chemotherapeutika4. Das berühmteste Metallodrug, Cisplatin, ist ein Pt-basiertes Krebsmedikament, das von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als eines der wichtigsten Medikamente der Welt eingestuftwird 5. Im Jahr 2010 hatten Cisplatin und seine Pt-Derivate bei mehreren Krebsarten eine Erfolgsrate von bis zu 90% und wurden in etwa 50% der Chemotherapien verwendet 6,7,8. Obwohl Pt-basierte Chemotherapeutika unwiderlegbaren Erfolg hatten, hat die dosislimitierende Toxizität Untersuchungen alternativer metallbasierter Medikamente mit verfeinerter biologischer Verabreichung und Aktivität in Gang gesetzt. Von diesen Alternativen sind Ru-basierte Verbindungen zu den beliebtesten 9,10,11,12 geworden.
Neuartige Modelle und Methoden sind erforderlich, um mit dem Bedarf an pharmakologischen und toxikokinetischen Metallstudien Schritt zu halten. Das Zebrafischmodell liegt an der Schnittstelle von Komplexität und Durchsatz, da es sich um ein Wirbeltier mit hoher Fruchtbarkeit mit 70% konservierter Genhomologiehandelt 13. Dieses Modell war ein Vorteil in der Pharmakologie und Toxikologie, mit umfangreichen Screenings für verschiedene Verbindungen für die Entdeckung von Blei, Zielidentifizierung und mechanistische Aktivität14,15,16,17. Das Hochdurchsatz-Screening von Chemikalien hängt jedoch typischerweise von wässrigen Expositionen ab. Da die Aufnahme aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung in Lösung (d. h. Photodegradation, Löslichkeit) variabel sein kann, kann dies eine wesentliche Einschränkung der korrelierenden Dosisabgabe und des Ansprechens sein.
Um diese Einschränkung für den Vergleich der Dosis mit höheren Wirbeltieren zu überwinden, wurde eine Methodik entwickelt, um die Spurenmetallkonzentrationen im Zebrafischlarvengewebe zu analysieren. Hier wurden Dosis-Wirkungs-Kurven tödlicher und subletaler Endpunkte für Cisplatin und neuartige Ru-basierte Krebsmedikamente ausgewertet. Letalität und verzögertes Schlüpfen wurden auf nominale Konzentrationen von 0, 3,75, 7,5, 15, 30 und 60 mg/L Cisplatin untersucht. Die Pt-Akkumulation im Gewebe des Organismus wurde durch ICPMS-Analyse bestimmt, und die Aufnahme der jeweiligen Dosen durch den Organismus betrug 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 und 461,9 ng (Pt) pro Organismus. Zusätzlich wurden Zebrafischlarven bei 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/L PMC79 exponiert. Diese Konzentrationen wurden analytisch so bestimmt, dass sie 0, 0,17, 0,44, 0,66 und 0,76 mg/L Ru enthielten. Dieses Protokoll ermöglichte auch die Unterscheidung von Konzentrationen von Pt, die im Chorion der Larven sequestriert wurden, im Vergleich zum Zebrafischgewebe. Diese Methodik war in der Lage, zuverlässige, robuste Daten für Vergleiche der pharmako- und toxikokinetischen Aktivität zwischen einem gut etablierten Chemotherapeutikum und einer neuartigen Verbindung zu liefern. Diese Methode kann auf eine breite Palette von Metallen und metallbasierten Verbindungen angewendet werden.
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Protocol
Der AB-Stammzebrafisch (Danio rerio) wurde für alle Experimente verwendet (siehe Materialtabelle), und das Haltungsprotokoll (# 08-025) wurde vom Rutgers University Animal Care and Facilities Committee genehmigt.
1. Zebrafischhaltung
- Züchten und pflegen Sie den Zebrafisch in einem rezirkulierenden aquatischen Lebensraumsystem auf einem 14 h hell:10 h dunklen Zyklus.
- Reinigen Sie kommunales Leitungswasser durch Sand- und Kohlenstofffiltration, um Fischsystemwasser zu erhalten. Halten Sie das Wasser des aquatischen Systems bei 28 ° C, < 0,05 ppm Nitrit, <0,2 ppm Ammoniak und pH-Wert zwischen 7,2 und 7,7.
- Füttern Sie den Zebrafisch mit einer Diät von geschlüpften Artemia-Zysten, Salzgarnelen und Fischfutter.
2. Zebrafisch-Dosis-Wirkungs-Protokoll (Abbildung 1)
- Bereiten Sie Zebrafisch-Eiwasserlösung, entweder E3-Medium oder Eiwasser aus Vorratsmeersalz in einer Konzentration von 60 μg/ml, gelöst in entionisiertem Wasser18, vor. Vermeiden Sie die Verwendung von Methylenblau.
HINWEIS: Durch ICPMS wurde eine isobare Interferenz von Zebrafisch-Eiwasser für Strontiumoxide identifiziert, die sich mit einem Isotop von Ruthenium überlappen. Eine sorgfältige Spülung der Larven vor der nachgelagerten Analyse linderte dieses Problem. E3-Medium kann für einige aufgrund der proprietären Zusammensetzung von kommerziellen Meersalzen eine einfachere Wahl sein. - Lösen Sie die metallischen oder metallbasierten Verbindungen in E3 oder Eiwasser auf. Vortex, um jegliches Zuschlagstoffmaterial aufzubrechen und die Lösung zu homogenisieren.
HINWEIS: In dem unten beschriebenen Experiment wurden PMC79 und Cisplatin in maximalen Konzentrationen von 12,4 mg/L und 60 mg/L mit einer maximalen Konzentration von 0,5% Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um der Ausfällung zu widerstehen.- Verdünnen Sie Schwermetalle oder metallbasierte Verbindungen wie PMC79 und Cisplatin mit E3 oder Eiwasser und bereiten Sie mindestens 5 Konzentrationsdosen vor.
- Beginnen Sie mit niedrigen Konzentrationen von Stammlösungen im reinen Vehikel (d. H. DMSO) und verdünnen Sie es dann mit E3 oder Eiwasser. Überlegen Sie sich die endgültigen Fahrzeugkonzentrationen sorgfältig.
HINWEIS: Bestimmte Verbindungen auf Metallbasis, wie Cisplatin, werden schnell abgebaut, und ihre Lösungen müssen täglich frisch hergestellt werden. ACHTUNG: Behandeln Sie Schwermetalle und Chemotherapeutika mit Vorsicht. Lesen Sie das spezifische Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für das Metall von Interesse. Cisplatin kann Augen- und Hautreizungen verursachen, beim Verschlucken tödlich sein und Toxizität in Nieren, Blut, blutbildenden Organen und fötalem Gewebe verursachen. Vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen und den Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung. Tragen Sie undurchlässige Handschuhe und Kleidung sowie eine Schutzbrille oder Schutzbrille19.
- Beginnen Sie mit niedrigen Konzentrationen von Stammlösungen im reinen Vehikel (d. H. DMSO) und verdünnen Sie es dann mit E3 oder Eiwasser. Überlegen Sie sich die endgültigen Fahrzeugkonzentrationen sorgfältig.
- Verdünnen Sie Schwermetalle oder metallbasierte Verbindungen wie PMC79 und Cisplatin mit E3 oder Eiwasser und bereiten Sie mindestens 5 Konzentrationsdosen vor.
- Stellen Sie am Nachmittag vor dem Experiment Zuchttanks im idealen Verhältnis von 2 Weibchen zu 1 Männchen mit einem Trennzeichen zwischen den Geschlechtern20 auf.
- Ziehen Sie an der Trennwand, wenn die Lichter für den Morgenzyklus angehen.
- Lassen Sie den Zebrafisch brüten.
HINWEIS: Die Dauer der Zucht hängt von der erforderlichen Anfangsexpositionsstufe ab. Für 3 h nach der Befruchtung ca. 2 h züchten. Die Eier erreichen 3 hpf nach der Reinigung und Trennung der Eier. - Bringen Sie die Zuchtfische in ein sauberes Becken.
- Sammeln Sie die Eier, indem Sie das Tankwasser durch ein Sieb gießen.
- Drehen Sie das Sieb über eine Petrischale und spülen Sie die Eier mit einer mit E3 oder Eiwasser gefüllten Spritzflasche in die Schale.
- Reinigen Sie die Schale vor dem experimentellen Gebrauch von Lebensmitteln und Abfällen.
- Randomisieren Sie etwa zwanzig 3 HPF-Embryonen pro Dosis in einzelne Glasfläschchen mit einer Transferpipette und einer kleinen Menge Wasser.
- Nachdem alle Embryonen in Fläschchen sind, entfernen Sie das gesamte Eiwasser und ersetzen Sie es durch genügend Dosierlösung, so dass etwa 1 Zoll Lösung über der Höhe des Eies liegt.
HINWEIS: Die Notwendigkeit der Dechorionation sollte sorgfältig abgewogen werden. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsabschnitt. - Beobachten Sie die Embryonen täglich auf Läsionen oder Letalität. Aufgrund der schnellen Entwicklung embryonaler Zebrafische erhalten Sie tägliche Bilder mit einem beliebigen Hellfeldmikroskop / Kamera-Setup, um kleinere Läsionen zwischen den Tagen zu identifizieren.
- Kombinieren Sie am Ende der Dosis-Wirkungs-Beziehung (4-5 Tage nach der Befruchtung [dpf], gemäß der OECD-Richtlinie21 der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung 3-5 Larven vor der Euthanasie für die Kompositprobenahme. Euthanasieren durch schnelles Abkühlen durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
HINWEIS: Euthanasie durch eine Überdosierung von MS-222 oder Tricain-Methansulfonat kann möglicherweise die ICPMS-Analyse nachgelagert stören. Für dieses Protokoll werden schnell abkühlende Euthanasiemethoden empfohlen, um die Möglichkeit von Interferenzen zu verringern. - Führen Sie 3 Gewebewäschen mit hochreinem Wasser durch (z. B. Umkehrosmose), um die überschüssige Verbindung von der Außenseite des Gewebes zu entfernen.
- Bewegen Sie die Proben in säure- und mikrowellensichere 15-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Achten Sie darauf, das gesamte überschüssige Wasser zu entfernen, da jede verbleibende Flüssigkeit die Salpetersäure und damit das oxidierende Potenzial der Säure während des Gewebeabbaus verdünnen kann.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann das Gewebe bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert werden. Bei natürlich reichlich vorhandenen Metallen verbessert die Reinigung der Röhrchen in einem 5% igen Salpetersäurebad vor dem Gebrauch die Hintergrundwerte in der Umgebung.
3. Gewebeverdauung und ICPMS-Bewertung (Abbildung 2)
- Fügen Sie den 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen ca. 0,25 ml für bis zu 10 Larven (~100 μg) hochreine Salpetersäure (69%) hinzu. Ultraschall für 1 Stunde, um die Proben mit den folgenden Einstellungen vorzuverdauen: Ultraschall-Badleistung: 85 W; 42 kHz ± 6%; Temperaturbereich: 19-27 °C.
ACHTUNG: Tragen Sie während der Beschallung einen Gehörschutz. Salpetersäure verursacht schwere Verbrennungen in den Atemwegen, Augen und Haut. Tragen Sie eine vollständige Schutzausrüstung und arbeiten Sie im Abzug oder an Orten mit ausreichender Belüftung. Es kann mit anderen Materialien brennbar sein. Salpetersäure sollte ausschließlich in einem Abzug gehandhabt werden, um die Exposition gegenüber Dämpfen zu vermeiden, die während der Verdauung entstehen. Nicht einatmen oder einnehmen.- Führen Sie kurze Zyklen der Gewebeverdauung (5-minütige Intervalle) in einem säuresicheren Mikrowellenfermenter durch, bis das gesamte Gewebe sichtbar oxidiert ist (d. H. Gleichmäßige, klar-gelbe Lösung).
HINWEIS: Das Mikrowellenprotokoll in Tabelle 1 wird empfohlen, dreimal durchgeführt zu werden und beinhaltet ein Abklingintervall von 5 Minuten zwischen den einzelnen Heizschritten. - Überwachen Sie die Integrität der Röhrchen sorgfältig, um einen Bruch zu vermeiden, und führen Sie kurze Drehungen in der Zentrifuge (313 × g für 1 min) zwischen den Zyklen durch, um die Säurekondensation zum Boden des Rohres zu transportieren.
HINWEIS: Wenn das Gewebe schwer verdaulich ist (insbesondere Chorionen), kann nach der Säureverdauung 30% hochreines Wasserstoffperoxid verwendet werden. Verwenden Sie das Wasserstoffperoxid (6,75 ml), um die Säurekonzentration auf 3,5% zu verdünnen, und lassen Sie die Proben über Nacht in einem Abzug sitzen. Wasserstoffperoxid zersetzt sich zuH2Ound eignet sich für die ICPMS-Analyse. Ferner können sich alternative Metalle besser in Salzsäure oder einer Mischung aus Salzsäure und Salpetersäure (d. h. Aquaregia) lösen. Wasserstoffperoxid ist beim Verschlucken schädlich und verursacht schwere Augenschäden. Tragen Sie Haut- und Augenschutz22,23.
- Führen Sie kurze Zyklen der Gewebeverdauung (5-minütige Intervalle) in einem säuresicheren Mikrowellenfermenter durch, bis das gesamte Gewebe sichtbar oxidiert ist (d. H. Gleichmäßige, klar-gelbe Lösung).
- Sobald das Gewebe sichtbar oxidiert ist (d. H. Gleichmäßige, klar-gelbe Lösung), verdünnen Sie die Proben in einem Abzug auf 3,5% Salpetersäure mit 6,75 ml hochreinem Wasser und Vortex, um gründlich zu mischen.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei Raumtemperatur gelagert werden. Dieser Schritt ist unnötig, wenn Wasserstoffperoxid hinzugefügt wurde, um die Verdauung in Schritt 3.1 zu unterstützen. - Führen Sie eine matrixangepasste, 7-Punkt-Kalibrierkurve (Konzentrationsbereich von 0,001-10 ppb) unter Verwendung eines zertifizierten elementaren Standards (d. h. Pt oder Ru, je nach Assay) mit dem interessierenden Metall und den optimalen Isotopen durch, um mögliche isobare Interferenzen zu berücksichtigen.
- Mit einer Stammkonzentration des wässrigen, zertifizierten elementaren Standards (Ru, Pt = 1000 ppb) nehmen Sie ein 0,1 mL Aliquot und pipettieren Sie es in ein neues 15 mL Zentrifugenröhrchen. Mit 3,5% Salpetersäure auf ein Endvolumen von 10 ml verdünnen, um eine Standardlösung von 10 ppb herzustellen.
- Unter Verwendung des 10-ppb-Materials werden die folgenden seriellen Verdünnungen vorgenommen: 0,1, 1,0 und 5,0 ppb Standardlösungen in 3,5% Salpetersäure.
- Verwenden Sie den 0,1-Stamm und führen Sie die folgenden seriellen Verdünnungen durch: 0,001, 0,005 und 0,01 ppb Standardlösungen in 3,5% Salpetersäure.
- Bereiten Sie das ICPMS-Instrument vor (siehe die Tabelle der Materialien) für die Probenanalyse wie folgt:
- Stellen Sie vor dem Starten des Instruments sicher, dass das Argon-Gasventil geöffnet ist, alle Schläuche sicher angeschlossen sind und saubere 5% Salpetersäure zum Spülen von Schläuchen und Glaswaren zwischen den Probenanalysen geöffnet sind.
- Überprüfen Sie den Zustand des Brenners und der Kegel und stellen Sie sicher, dass der Brennerkasten sicher verriegelt ist und das Sprühkammer-Entwässerungsrohr ordnungsgemäß mit der Peripumpe verbunden ist.
- Öffnen Sie die Software (siehe Materialtabelle).
- Überprüfen Sie die Vakuummesswerte und stellen Sie sicher, dass alle Turbopumpen zu 100% laufen.
- Klicken Sie im Fenster Status des Plasmakontrollsystems auf START, um die Startsequenz zu starten, die Plasmapumpe und den Plasmakühler einzuschalten, den Vernebler zu reinigen und das Plasma anzuzünden. Warten Sie, bis das Plasma leuchtet und stabil ist, wenn das Statusfenster anzeigt, dass die Startsequenz abgeschlossen ist. Beachten Sie an dieser Stelle die grünen Punkte im Fenster Systemstatus, die anzeigen, dass alle Netzteile eingeschaltet sind.
- Klicken Sie in der Menüleiste im Dropdown-Menü auf Control | Autosampler . Geben Sie die Position des Autosampler-Racks für das Röhrchen mit 5% Salpetersäure ein. Lassen Sie die Säure in das Plasma eindringen.
- Klicken Sie in der Menüleiste auf Scans | Magnet im Dropdown-Menü. Geben Sie im MagnetScan-Fenster 115 in die Position der Markermasse ein und drücken Sie die Eingabetaste. Lassen Sie den Magneten 30 Minuten lang über den Massenbereich für 115Zoll (114,6083 bis 115,3749) scannen, während sich das Instrument erwärmt.
- Verwenden Sie nach 30 Minuten die Autosampler-Steuerung, um in die Position einer Multielement-Tuninglösung mit 1 ppb zu wechseln. Saugen Sie die Stimmlösung ab und stimmen Sie das Instrument ab, um die Signalablesung zu optimieren. Stellen Sie die Brennerposition (X, Y, Z ) so ein, dass die Taschenlampe auf die Mitte der Kegel und die Durchflussrate des Verneblers (~ 30 psi) im Plasmasteuerungsfenster ausgerichtet ist. Nehmen Sie die erforderlichen Anpassungen im Abstimmungsfenster der Ionenoptik für die Quelle, den Detektor und den Analysator vor.
- Sobald die Signalablesung optimiert ist (~ 1,2 × 106 Zähler / s für 1 ppb auf 115Zoll), klicken Sie im Magnetscan-Fenster auf Stopp.
- Klicken Sie auf Magneten kalibrieren und wählen Sie im Popup-Fenster Niedrige Auflösung aus.
- Klicken Sie auf OK und öffnen Sie die Datei "Mass Calibration (Low Resolution).smc", um den Magneten zu kalibrieren.
HINWEIS: Die Magnetkalibrierung misst die Anzahl / s und passt eine Kurve durch den folgenden Massenbereich an: 7Li bis 238U. - Klicken Sie auf | speichern Verwenden Sie diese Option , um die aktuelle Magnetkalibrierung auf die Analysen anzuwenden. Wenn Sie unbekannte Proben mit einem großen Konzentrationsbereich messen, führen Sie eine Detektorkalibrierung durch, um Ionenpulszahlsignale bei niedrigen Konzentrationen mit abgeschwächten Ionensignalen zu vergleichen, die bei höheren Konzentrationen erzeugt werden. Analysieren Sie die Proben, sobald die Abstimmung und Kalibrierung abgeschlossen ist.
- Klicken Sie in der Menüleiste auf Datenerfassung.
- Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Methodeneinrichtung . Verwenden Sie eine vorhandene Methode, die vom Hersteller bereitgestellt wird, oder erstellen Sie eine Methode basierend auf den relevanten Elementen. Passen Sie bei Bedarf den Analysemodus, die Verweildauer, die Schaltverzögerung, die Anzahl der Sweeps/Zyklen, die Auflösung, den Erfassungsmodus und die Parkmasse für die Deflektoreinstellungen an.
- Klicken Sie auf Speichern , um die Methodeneinstellungen aufzuzeichnen. Optimieren Sie die Parameter für jedes Metall und Isotop. Siehe Tabelle 2 für die spezifischen Betriebsparameter, die in dieser Studie verwendet werden.
- Klicken Sie in der Menüleiste auf Datenerfassung.
- Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Batch Run. Alternativ können Sie auf das BATCH-Symbol unter der Menüleiste klicken. Importieren Sie die Stapelparameter aus einer Tabelle, oder erstellen Sie eine Sequenz im Fenster Stapellauf. Geben Sie den Beispieltyp, die Position des Autosampler-Racks, die Übertragungszeit, die Waschzeit, die Replikate, die Proben-ID und die Methodendatei ein.
- Ordnen Sie den Chargenlauf in der folgenden Reihenfolge an: Standardlösungen für die Kalibrierkurve (0,001-10 ppb Pt oder Ru), gefolgt von einem Qualitätskontrollstandard, dann unbekannte Proben.
HINWEIS: Standardlösungen werden als Zählungen/s auf dem ICPMS gemessen, und eine lineare Regression wird durch die Standards mit einer relativen Standardabweichung (RSD) > 0,999 angepasst. Unbekannte werden auch als Zählungen/s gemessen und für die Konzentration in ppb mit der linearen Regression der Kalibrierkurve y = mx + b gelöst. Die Datenverarbeitung kann auch über die referenzierte Software erfolgen. - Überwachen Sie die Gerätedrift und die Reproduzierbarkeit der Proben, indem Sie alle 5-10 Proben einen Qualitätskontrollstandard von 0,5 ppb einbeziehen.
HINWEIS: Geeignete Qualitätskontrollstandards sollten ein zertifiziertes Standardreferenzmaterial sein, das sich von dem in der Kalibrierkurve verwendeten Standard unterscheidet.
| Watt | Macht | Protokoll |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tabelle 1: Mikrowellen-Verdauungsprotokoll für Larvengewebemasse. Zebrafisch-Larvenproben wurden in 0,25 ml Salpetersäure verdaut. Diese Tabelle wurde von 24 geändert.
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Representative Results
Diese Ergebnisse wurden bereitsveröffentlicht 24. Gewebeaufnahmestudien wurden mit wässrigen Expositionen von Cisplatin und einer neuartigen Ru-basierten Antikrebsverbindung, PMC79, durchgeführt. Letalität und verzögertes Schlüpfen wurden für nominale Konzentrationen von Cisplatin 0, 3,75, 7,5, 15, 30 und 60 mg/L Cisplatin untersucht. Die Pt-Akkumulation im Gewebe des Organismus wurde durch ICPMS-Analyse bestimmt, und das Gewebe des Organismus enthielt entsprechende Dosen von 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 und 461,9 ng (Pt) pro Organismus (Abbildung 3). Die analytische Bestimmung der Nennkonzentrationen für Cisplatin wurde angesichts der bekannten Stabilität von Cisplatin nicht bewertet.
Ein verzögertes Schlüpfen wurde bei allen Cisplatinkonzentrationen beobachtet. Zusätzliche Experimente wurden für Pt-Konzentrationen mit und ohne manuelle Dechorionation durchgeführt. Nach der Dechorionation wurden Chorionen gesammelt und separat für Pt analysiert. Nichtletale Dosen von Cisplatin, die für Dechorionationsstudien verwendet wurden, bestimmten, dass sich 93-96% der gesamten abgegebenen Dosis von Cisplatin im Chorion angesammelt hatten, während die verbleibende Dosis im Larvengewebe verblieb (Abbildung 4).
Zebrafischlarven wurden bei 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/L PMC79 exponiert. Diese Dosen wurden durch Bestimmung der Derivate eines IC50 ausgewählt, wie zuvorbeschrieben 16. Diese Konzentrationen wurden analytisch so bestimmt, dass sie 0, 0,17, 0,44, 0,66 und 0,76 mg/L Ru enthielten. Im Gegensatz zur Cisplatin-Dosis-Wirkungs-Kurve wurde bei PMC79-exponierten Larven kein verzögertes Schlüpfen beobachtet. Chorionen wurden nicht in die Rutheniumanalyse einbezogen, da sie vor der Larvensammlung auf natürliche Weise abgebaut wurden. Forscher können Chorionanalysen ohne verzögertes Schlüpfen einbeziehen, indem sie Chorionen bei 24 dpf dechorionieren und sammeln. Die Masse des Metalls in Larvengeweben, die bei jeder Konzentration analysiert wurden, betrug 0,19, 0,41 und 0,68 ng (Ru) pro Larve (Abbildung 5). Eine Zusammenfassung der toxikologischen Endpunkte, einschließlich tödlicher Konzentrationen und/oder Dosen für 50 % der Bevölkerung (LC 50/LD50), wirksamer Konzentrationen oder Dosen für 50 % der Bevölkerung (EC 50/ED 50) und des niedrigsten Grades für beobachtete Nebenwirkungen (LOAEL) ist Tabelle 3 zu entnehmen.
| Cisplatin | PMC79 | |||||
| Nominal (mg/L) | μM | Pt (ng) / Organismus | Analytische Ru (mg/L) | μM | Ru (ng) / Organismus | |
| LC 50/LD50 | 31 (95% KI: 20,5-34,0) | 158 (95% KI: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (95% KI: 0,43-1,20) | 7,8 (95% KI: 4,2-11,8) | NA |
| EG50 | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| LOAEL | 3.75 | 15.3 | 8,7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0,19 (± 0,05) |
Tabelle 3: Bestimmung der Lösungs- und Metallodrug-Aufnahme in Verbindung mit toxikologischen Endpunkten. LD50 wurde durch Metalläquivalentanalyse von Pt und Ru für Cisplatin bzw. PMC79 bestimmt. Die LC50-Konzentrationen für PMC79 wurden analytisch bestimmt. Eine analytische Bestimmung der nominalen Cisplatinkonzentrationen wurde jedoch nicht durchgeführt; Angesichts der bekannten Stabilität von Cisplatin in Lösung wurde angenommen, dass die Nenn- und gemessenen Konzentrationen in Lösung gleichwertig wären. Der verzögerte Schraffurendpunkt für die Cisplatin-Exposition wurde in Bezug auf ED50 und LOAEL bewertet. Die LOAEL-Konzentrationen von PMC79 wurden analytisch bestimmt. Der LOAEL umfasste Läsionen wie Blutungen entlang der Schwanzvene und der Schwanzarterie, Wirbelsäulenkrümmung und Dottersacködeme. Alle 95%-Konfidenzintervalle wurden mit der Litchfield-Wilcoxon-Methode berechnet. Diese Tabelle wurde von 24 geändert. Abkürzungen: CI = Konfidenzintervall; LC50 = Letale Konzentration für 50% der Bevölkerung; LD50 = tödliche Dosis für 50% der Bevölkerung; EC 50 = Effektive Konzentration für50% der Bevölkerung; LOAEL = niedrigstes beobachtetes Niveau der unerwünschten Wirkung.
Abbildung 1: Zebrafisch-Dosis-Wirkungs-Protokoll. Dieses Protokoll verwendet einen modifizierten Ansatz, der an den FET der OECD angepasst wurde. Hergestellt mit Biorender. Abkürzung: OECD = Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung; FET = akute Toxizität des Fischembryos. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Gewebeverdauung und ICPMS-Bewertung. Das Verdauungsprotokoll ist wirksam für die Verdauung einer zusammengesetzten Probe von Zebrafischlarven. Abkürzung: ICPMS = Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma. Erstellt mit Biorender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Cisplatin-Dosis-Wirkungs-Verhältnis . (A) Prozentuale mittlere verzögerte Schraffur bei 5 dpf korreliert mit den mittleren Pt-Äquivalenten, die pro Organismus bestimmt wurden. (B) Prozentuale mittlere Letalität bei 5 dpf korreliert mit den mittleren Pt-Äquivalenten je Organismus. Prozentuale Mittel: N = 40 pro Dosis. Pt (ng) pro Organismus: >4 zusammengesetzte Proben pro Dosis. Es wurden zwei experimentelle Repliken durchgeführt, deren Bereiche dargestellt sind. Diese Zahl wurde von 24 geändert. Abkürzung: dpf = Tage nach der Befruchtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Vergleich von Pt (ng) in den Larven und dem Chorion nach Exposition bei 7,5 oder 15 mg/L. Zusammengesetzte >3 Larven oder Chorionen pro Probe; von links nach rechts N = 13, 10, 10 und 11. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung dar. Mann-Whitney-Rangsummentest P < 0,001 zwischen Larven und Chorion für beide Dosen. Diese Zahl wurde von 24 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: PMC79 Dosis-Wirkungs-Verhältnis. (A) Die prozentuale mittlere Letalität wurde mit den analytisch ermittelten mittleren Ru-Äquivalenten in Lösung (mg/L) korreliert. (B) Die prozentuale mittlere Letalität 5 Tage nach der Befruchtung aus demselben Experiment wurde mit den mittleren Ru-Äquivalenten pro Larve korreliert. Letalität: N = 40 pro Dosis. Ru (mg/L): N = 6 zusammengesetzte Proben pro Dosis. Ru (ng) pro Larve >4 zusammengesetzte Proben pro Dosis. Es wurden zwei experimentelle Repliken durchgeführt, deren Bereiche dargestellt sind. Diese Zahl wurde von 24 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Verweildauer pro Peak | 4 ms |
| Schaltverzögerung / Spitze (x10 Mikros) | 2 |
| Anzahl der Sweeps | 350 |
| Anzahl der Zyklen | 1 |
| Instrumentenauflösung | 300 |
| Erkennungsmodus | Abgeschwächt, Deflektorsprung |
| Parkmesse | 98.90594 |
| Element (Isotope) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Senior (84) |
Tabelle 2: ICPMS-Methodenparameter Parameter für die Analyse von Pt- und Ru-Isotopen zur Bestimmung der Gewebekonzentrationen von Cisplatin bzw. PMC79. Sr wurde aufgenommen, um isobare Interferenzen im Zusammenhang mit der Zusammensetzung des Tankwassers zu überwachen. Diese Tabelle wurde von 24 geändert. ICPMS = Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde implementiert, um die Verabreichung und Aufnahme von metallbasierten Krebsmedikamenten zu bestimmen, die entweder Pt oder Ru enthalten. Obwohl diese Methoden bereits veröffentlicht wurden, diskutiert dieses Protokoll wichtige Überlegungen und Details, um diese Methodik für eine Reihe von Verbindungen anzupassen. Das OECD-Protokoll in Verbindung mit der Gewebeverdauung und der ICPMS-Analyse ermöglichte es uns, festzustellen, dass PMC79 wirksamer als Cisplatin war und zu einer unterschiedlichen Gewebeansammlung führte, was auf separate Mechanismen hindeutet. Da die abgegebene Dosis von Cisplatin quantifiziert wurde, wurden die Dosis-Wirkungs-Ergebnisse auf die Patientenpopulationen extrapoliert. Die subletalen Dosen (z. B. LOAEL) waren mit den intravenösen Dosierungskonzentrationen bei Patientenvergleichbar 24.
Obwohl diese Methode auf ein breites Spektrum von Metallen und metallbasierten Verbindungen angewendet werden kann, muss eine sorgfältige Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Analyten berücksichtigt werden. Metallbasierte Verbindungen können sehr schwer zu lösen sein, und verschiedene Vehikel können verwendet werden, um dies zu vermeiden. Fahrzeugkonzentrationen wie DMSO müssen möglicherweise höhere Konzentrationen aufweisen als im OECD-Protokoll empfohlen. Daher ist es wichtig, eine ungiftige Dosis aufrechtzuerhalten, indem die Entwicklung der Kontrollen genau überwacht wird. Das kontinuierliche Schaukeln der Embryonen während der Exposition mildert den Niederschlag. Darüber hinaus sind metallorganische Verbindungen in wässriger Lösung möglicherweise nicht stabil. Wenn der Abbauprozess unbekannt ist, können Studien, die eine 24-stündige Lösungserneuerung beinhalten, in Betracht gezogen oder mit Dosis-Wirkungs-Kurven ohne Verlängerung verglichen werden.
Es wird empfohlen, den OECD Fish Acute Embryo Toxicity Test (FET) Nummer 23621 zu befolgen. Es können jedoch Änderungen vorgenommen werden, um bestimmten Zwecken gerecht zu werden. Glasbehälter vermeiden die Verwechslung toxikologischer Variablen wie Kunststoff und Weichmacher und adsorbieren Metalle nicht so stark, dass sie Analyten aus dem Eiwasser entfernen würden. Bei Verbindungen, die sich photogradieren, wie Cisplatin, kann es vorteilhaft sein, die Exposition ohne Lichtzyklus durchzuführen.
In der Literatur wird viel über die Notwendigkeit der Dechorionation in Zebrafisch-Dosis-Wirkungs-Studien25,26,27 diskutiert. Argumente für die Dechorionation bei 24 hpf deuten darauf hin, dass das Chorion die Permeabilität von Verbindungen begrenzt und somit falsch-negative Ergebnisse oder erhöhte Dosis-Wirkungs-Kurven erzeugt. Obwohl diese Punkte einen Wert haben, kann das Dirigieren von Studien ohne Dechorionation mechanistische Einblicke liefern. Diese Studien deuten darauf hin, dass sich Cisplatin aufgrund seiner alkylierenden Aktivität im Chorion der Embryonen ansammelt (Abbildung 2). Die resultierenden Addukte verstärken die Struktur, was zu einem verzögerten Schlüpfen führt. PMC79 und andere Ru-basierte Krebsmedikamente verursachten dieses Phänomenjedoch nicht 27. Obwohl viele Chemotherapeutika ihre Antikrebsaktivität durch Alkylierung ausüben, deutete das Fehlen eines verzögerten Schlüpfens nach der PMC79-Exposition auf einen unterschiedlichen Mechanismus hin. Studien mit oder ohne Dechorionation müssen sorgfältig abgewogen oder parallel durchgeführt werden.
Die nachgelagerte Gewebeverdauung und die ICPMS-Analyse müssen kontinuierlich berücksichtigt werden. Es wird empfohlen, die Verwendung von Reagenzien zu vermeiden, die isobare Interferenzen verursachen können, und alternative Methoden zu implementieren. Reagenzien, die während der Dosis-Wirkungs-Studien verwendet werden, können die Salpetersäure und ihr oxidierendes Potenzial beeinflussen oder mit ihr reagieren oder zu isobaren Interferenzen beitragen. Es wurde entdeckt, dass die Salzlösung, die zur Herstellung von Eiwasser verwendet wird, Strontiumoxide (Sr) erzeugte, die sich mit einem spezifischen Isotop von Ru24 überschnitten. Die Senkung der Salzkonzentrationen oder die sorgfältige Reinigung der Larven können dieses Problem lindern. Aus diesen Gründen wird empfohlen, das antimikrobielle Methylenblau oder das Euthanaisiermittel Tricain zu vermeiden. Autoklavieren und anschließend das Eiwasser belüften, um Mikroben zu entfernen, oder die Larven durch schnelles Abkühlen einschläfern. In diesem Schritt ist es wichtig, lineare Isotopenstandardkurven mit minimalen isobaren Interferenzen für den interessierenden Analyten zu erreichen.
Eine wichtige Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass metallorganische Verbindungen so oxidiert werden, dass nur das Metall übrig bleibt. Daher können keine Stoffwechselstudien durchgeführt werden. Obwohl das Protokoll als mittlerer Durchsatz betrachtet werden kann, kann der Dosis-Wirkungs-Anteil mit Hilfe von automatischen chemischen Abgabesystemen und Bildgebung beschleunigt werden. Dieses Protokoll ist eine im Entstehen begriffene Methodik, die für ein breites Spektrum von metall- und metallbasierten Verbindungen für pharmako- und toxikokinetische Studien modifiziert und verfeinert werden kann.
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Disclosures
Es gibt keine Interessenkonflikte, die von einem der Autoren offengelegt werden müssen.
Acknowledgments
Förderung: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Darüber hinaus wird Brittany Karas durch den Schulungszuschuss T32NS115700 von NINDS, NIH, unterstützt. Die Autoren würdigen Andreia Valente und die portugiesische Stiftung für Wissenschaft und Technologie (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) für die Lieferung von PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
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