Summary
O aumento da taxa de análises farmaco-e toxicoléticas de metais e compostos à base de metal em zebrafish pode ser vantajoso para estudos de tradução ambiental e clínica. A limitação da absorção de exposição transmitida pela água desconhecida foi superada pela realização de análises metálicas de traços no tecido de zebrafish digerido usando espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada.
Abstract
Metais e compostos à base de metal compreendem xenobióticos farmaco-ativos e toxicológicos multifásicos. Da toxicidade do metal pesado à quimioterapia, os toxicokinetics desses compostos têm relevância histórica e moderna. Os zebrafish tornaram-se um organismo modelo atraente na elucidação da farmaco e toxicopinatics em estudos de exposição ambiental e tradução clínica. Embora os estudos de zebrafish tenham o benefício de serem mais bem-colocados do que os modelos de roedores, existem várias restrições significativas ao modelo.
Uma dessas limitações é inerente ao regime de dosagem aquaviário. As concentrações de água desses estudos não podem ser extrapoladas para fornecer doses internas confiáveis. Medições diretas dos compostos à base de metal permitem uma melhor correlação com respostas moleculares e biológicas relacionadas a compostos. Para superar essa limitação para metais e compostos à base de metal, desenvolveu-se uma técnica para digerir tecido larval de zebrafish após exposição e quantificar concentrações metálicas dentro de amostras de tecido por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICPMS).
Métodos ICPMS foram usados para determinar as concentrações metálicas de platina (Pt) de cisplatina e rutênio (Ru) de várias quimioterapias baseadas em Ru em tecido de zebrafish. Além disso, este protocolo distinguiu concentrações de Pt que foram sequestradas no acorde da larva em comparação com o tecido zebrafish. Estes resultados indicam que este método pode ser aplicado para quantificar a dose metálica presente nos tecidos larvais. Além disso, este método pode ser ajustado para identificar metais específicos ou compostos à base de metal em uma ampla gama de estudos de exposição e dosagem.
Introduction
Metais e compostos metálicos continuam a ter relevância farmacológica e toxicológica. A prevalência de exposição ao metal pesado e seu impacto na saúde aumentou exponencialmente a investigação científica desde a década de 1960 e atingiu um recorde em 2021. As concentrações de metais pesados na água potável, poluição do ar e exposição ocupacional excedem os limites regulatórios em todo o mundo e permanecem um problema para arsênico, cádmio, mercúrio, cromo, chumbo e outros metais. Novos métodos para quantificar a exposição ambiental e analisar o desenvolvimento patológico continuam em alta demanda 1,2,3.
Por outro lado, a área médica tem aproveitado as propriedades fisioquímicas de vários metais para tratamento clínico. Drogas à base de metal ou metalúrgicos têm uma rica história de fins medicinais e têm mostrado atividade contra uma série de doenças, com o maior sucesso como quimioterapia4. O mais famoso dos metalodrogas, cisplatina, é um medicamento anticâncer baseado em Pt considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma das drogas essenciais do mundo5. Em 2010, a cisplatina e seus derivados do Pt tiveram até 90% de sucesso em diversos cânceres e foram utilizadas em aproximadamente 50% dos regimes de quimioterapia 6,7,8. Embora a quimioterapia baseada em PT tenha tido sucesso irrefutável, a toxicidade limitante de dose iniciou investigações de drogas à base de metal alternativo com entrega biológica refinada e atividade. Dessas alternativas, os compostos baseados em Ru tornaram-se os 9,10,11,12 mais populares.
Novos modelos e metodologia são necessários para acompanhar a taxa de necessidade de estudos farmaco-farmaco e toxicolíticos metálicos. O modelo de zebrafish está na intersecção de complexidade e throughput, sendo um vertebrado de alta fecundidade com 70% de homologia genética conservada13. Este modelo tem sido um ativo em farmacologia e toxicologia, com extensas triagens para vários compostos para descoberta de chumbo, identificação de alvos e atividade mecanicística 14,15,16,17. No entanto, a triagem de alto rendimento de produtos químicos normalmente depende de exposições transmitidas pela água. Dado que a absorção pode ser variável com base nas propriedades físico-químicas do composto na solução (ou seja, fotodegradação, solubilidade), isso pode ser uma grande limitação de correlacionar a entrega e a resposta das doses.
Para superar essa limitação para comparação da dose com vertebrados mais elevados, foi projetada uma metodologia para analisar as concentrações metálicas de traço no tecido larval de zebrafish. Aqui, curvas de dose-resposta de pontos finais letais e subletais foram avaliadas para cisplatina e novos compostos anticancerígenos baseados em Ru. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L cisplatina. O acúmulo de PT no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS, e a absorção de organismos das respectivas doses foi de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 ng (Pt) por organismo. Além disso, as larvas de zebrafish foram expostas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12,4 mg/L de PMC79. Estas concentrações foram analiticamente determinadas para conter 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 mg/L de Ru. Este protocolo também permitiu a distinção das concentrações de Pt sequestrado no acorde das larvas em comparação com o tecido zebrafish. Essa metodologia foi capaz de fornecer dados confiáveis e robustos para comparações da atividade farmaco-e toxicolética entre um quimioterápico bem estabelecido e um novo composto. Este método pode ser aplicado a uma ampla gama de metais e compostos à base de metal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O zebrafish de cepa AB (Danio rerio) foi utilizado para todos os experimentos (ver a Tabela de Materiais), e o protocolo de criação (#08-025) foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Instalações de Animais da Universidade Rutgers.
1. Criação de zebrafish
- Procriar e manter o zebrafish em um sistema de habitat aquático recirculante em um ciclo escuro de 14 horas:10 h.
- Purificar a água da torneira municipal através da areia e filtragem de carbono para obter água do sistema de peixes. Mantenha a água do sistema aquático a 28 °C, <0,05 ppm de nitrito, <0,2 ppm de amônia e pH entre 7,2 e 7,7.
- Alimente o zebrafish uma dieta de cistos de Artemia eclodidos, camarão de salmoura e alimentos de flocos de dieta de peixe.
2. Protocolo de dose-resposta de zebrafish (Figura 1)
- Prepare a solução de água de ovo de zebrafish, seja a água média E3 ou a água de ovo feita de sal marinho de estoque a uma concentração de 60 μg/mL dissolvida em água desionizada18. Evite o uso de azul metileno.
NOTA: Através do ICPMS, foi identificada interferência isobárica da água de ovos de zebrafish para óxidos de estrôncio, que se sobrepuseram com um isótopo de rutênio. Lavagem cuidadosa das larvas antes da análise a jusante amenizar essa questão. O meio E3 pode ser uma escolha mais fácil para alguns devido à composição proprietária dos sais marinhos comerciais. - Dissolva os compostos metálicos ou metálicos em E3 ou água de ovo. Vórtice para quebrar qualquer material agregado e homogeneizar a solução.
NOTA: No experimento descrito abaixo, PMC79 e cisplatina foram dissolvidos em concentrações máximas de 12,4 mg/L e 60 mg/L com concentração máxima de 0,5% de sulfoxida de dimetil (DMSO) para resistir à precipitação.- Diluir compostos de metal pesado ou metal, como PMC79 e cisplatina, com E3 ou água de ovo, preparando pelo menos 5 doses de concentração.
- Comece com baixas concentrações de soluções de estoque em veículo puro (ou seja, DMSO), depois diluir com E3 ou água de ovo. Considere cuidadosamente as concentrações finais do veículo.
NOTA: Certos compostos à base de metal, como cisplatina, se degradam rapidamente, e suas soluções devem ser feitas diariamente. ATENÇÃO: Manuseie metais pesados e quimioterápicos com cuidado. Revise a ficha técnica específica de segurança do material (MSDS) para o metal de interesse. A cisplatina pode causar irritação nos olhos e na pele, ser fatal se engolida, e pode causar toxicidade nos rins, sangue, órgãos formados por sangue e tecido fetal. Evite respirar vapores e contato com olhos, pele e roupas. Use luvas e roupas impermeáveis, e óculos de segurança ou óculos19.
- Comece com baixas concentrações de soluções de estoque em veículo puro (ou seja, DMSO), depois diluir com E3 ou água de ovo. Considere cuidadosamente as concentrações finais do veículo.
- Diluir compostos de metal pesado ou metal, como PMC79 e cisplatina, com E3 ou água de ovo, preparando pelo menos 5 doses de concentração.
- Configure tanques de reprodução na tarde anterior ao experimento na proporção ideal de 2 fêmeas para 1 macho com um divisor entre os sexos20.
- Puxe o divisor quando as luzes se acenderem para o ciclo da manhã.
- Permita que o zebrafish se reproduza.
NOTA: O tempo de reprodução depende do estágio inicial de exposição necessário. Para 3h de pós-fertilização, deixe a reprodução por aproximadamente 2 h. Os ovos chegarão a 3 hpf após a limpeza e segregação de ovos. - Mova o peixe de criação para um tanque limpo.
- Recolhe os ovos derramando água do tanque através de um coador.
- Inverta o coador sobre uma placa de Petri e use uma garrafa de esguicho cheia de E3 ou água de ovo para enxaguar os ovos no prato.
- Limpe o prato de alimentos e resíduos antes do uso experimental.
- Randomize aproximadamente 23 embriões por dose em frascos de vidro individuais usando uma pipeta de transferência e uma pequena quantidade de água.
- Depois de todos os embriões estarem em frascos, remova toda a água dos ovos e substitua por solução de dosagem suficiente para que haja aproximadamente 1 polegada de solução acima da altura do ovo.
NOTA: A necessidade de descorção deve ser cuidadosamente considerada. Consulte a seção de discussão para mais detalhes. - Observe os embriões diariamente para lesões ou letalidade. Devido ao rápido desenvolvimento de zebrafish embrionários, obtenha imagens diárias usando qualquer configuração de microscópio/câmera de campo brilhante para identificar lesões menores entre os dias.
- Ao término da resposta à dose (4-5 dias após a fertilização [dpf], conforme a diretriz de Cooperação e Desenvolvimento Econômico da Organização [OCDE]21), combine 3-5 larvas antes da eutanásia para amostragem composta. Eutanize por resfriamento rápido por congelamento de snap em nitrogênio líquido.
NOTA: A eutanásia por overdose de MS-222 ou metanosulfonato de tricaínfina pode potencialmente interferir na análise do ICPMS rio abaixo. Métodos de eutanásia de resfriamento rápido são encorajados para este protocolo para reduzir a possibilidade de interferência. - Conduza 3 lavagens de tecido com água de alta pureza (como osmose reversa) para remover o composto em excesso do exterior do tecido.
- Mova as amostras para tubos de centrífugo de polipropileno de 15 mL com segurança de ácido e micro-ondas. Tenha cuidado para remover todo o excesso de água , pois qualquer líquido restante pode diluir o ácido nítrico e, portanto, o potencial oxidante do ácido durante a degradação tecidual.
NOTA: Neste ponto, o tecido pode ser armazenado a -20 °C até uma análise mais aprofundada. Para metais naturalmente abundantes, limpar os tubos em um banho de ácido nítrico de 5% antes do uso amenizará os níveis de fundo ambiente.
3. Digestão tecidual e avaliação de ICPMS (Figura 2)
- Adicione aproximadamente 0,25 mL aos tubos de centrífugas de polipropileno de 15 mL para até 10 larvas (~100 μg) de ácido nítrico de alta pureza (69%). Ultrassonicato por 1h para prenizar as amostras usando as seguintes configurações: saída de banho ultrassônico: 85 W; 42 kHz ± 6%; faixa de temperatura: 19-27 °C.
ATENÇÃO: Use proteção de ouvido durante a sonicação. O ácido nítrico causa queimaduras graves no trato respiratório, olho e pele. Use equipamentos de proteção completos e trabalhe no capô da fumaça ou em locais com ventilação adequada. Pode ser inflamável com outros materiais. O ácido nítrico deve ser manuseado exclusivamente em uma capa de fumaça para evitar a exposição a vapores produzidos durante a digestão. Não inspire ou ingera.- Realize ciclos curtos de digestão tecidual (intervalos de 5 minutos) em um digestor de micro-ondas seguro para ácido até que todo o tecido esteja visivelmente oxidado (ou seja, solução uniforme e amarelo-claro).
NOTA: Recomenda-se que o protocolo de micro-ondas na Tabela 1 seja realizado três vezes e inclua um intervalo de 5 minutos de recarga entre cada etapa de aquecimento. - Monitore a integridade dos tubos cuidadosamente para evitar a ruptura e realize pequenos giros na centrífuga (313 × g por 1 min) entre os ciclos para mover condensação ácida para o fundo do tubo.
NOTA: Se o tecido for difícil de digerir (especialmente corões), peróxido de hidrogênio de 30% de alta pureza pode ser usado após a digestão do ácido. Use o peróxido de hidrogênio (6,75 mL) para diluir a concentração de ácido para 3,5%, e permitir que as amostras fiquem durante a noite em um capô de fumaça. Peróxido de hidrogênio se decomporá a H2O e é adequado para análise de ICPMS. Além disso, metais alternativos podem dissolver-se melhor em ácido clorídrico ou uma mistura de ácido clorídrico e ácido nítrico (ou seja, aqua regia). Peróxido de hidrogênio é prejudicial se engolido e causa sérios danos oculares. Use proteção de pele e olhos22,23.
- Realize ciclos curtos de digestão tecidual (intervalos de 5 minutos) em um digestor de micro-ondas seguro para ácido até que todo o tecido esteja visivelmente oxidado (ou seja, solução uniforme e amarelo-claro).
- Uma vez que o tecido esteja visivelmente oxidado (ou seja, solução uniforme, amarelo-claro), dilua as amostras em uma capa de fumaça para 3,5% de ácido nítrico usando 6,75 mL de água de alta pureza e vórtice para misturar completamente.
NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente. Esta etapa é desnecessária se o peróxido de hidrogênio foi adicionado para auxiliar a digestão na etapa 3.1. - Conduzir uma curva de calibração de 7 pontos (faixa de concentração de 0,001-10 ppb) com um padrão elementar certificado (ou seja, Pt ou Ru, dependendo do ensaio) com o metal de interesse e isótopo ideal para responder por eventuais interferências isobáricas.
- Utilizando uma concentração de estoque do padrão elementar aquoso e certificado (Ru, Pt = 1000 ppb), leve uma alíquota de 0,1 mL e pipeta em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Diluir com ácido nítrico de 3,5% a um volume final de 10 mL para produzir uma solução padrão de 10 ppb.
- Utilizando o estoque de 10 ppb, faça as seguintes diluições seriais: 0,1, 1,0 e 5,0 ppb de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%.
- Utilizando o estoque de 0,1, faça as seguintes diluições seriais: 0,001, 0,005 e 0,01 ppb de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%.
- Prepare o instrumento ICPMS (veja o Tabela de Materiais) para análise amostral da seguinte forma:
- Antes de iniciar o instrumento, certifique-se de que a válvula de gás Argon esteja aberta, todas as tubulações estejam conectadas com segurança e o ácido nítrico limpo esteja aberto para enxaguar tubos e vidros entre as análises da amostra.
- Verifique as condições da tocha e dos cones e certifique-se de que a caixa da tocha está bem travada e o tubo de drenagem da câmara de pulverização está devidamente conectado ao peripoco.
- Abra o software (veja a Tabela de Materiais).
- Verifique as leituras de vácuo e certifique-se de que todas as bombas turbo estejam funcionando a 100%.
- Clique em START na janela Status do sistema de controle de plasma para iniciar a sequência inicial, ligue a bomba de plasma, esfrie o plasma, purgue o nebulizador e acenda o plasma. Aguarde que o plasma esteja aceso e estável quando a janela de status indicar que a sequência de inicialização está completa. Neste ponto, observe os pontos verdes na janela do Estado do Sistema que indicam que todas as fontes de energia estão em jogo.
- Na barra de menu, clique em Control | autosampler no menu suspenso. Digite a posição do rack do autosampler para o tubo contendo 5% de ácido nítrico. Deixe o ácido entrar no plasma.
- Na barra de menus, clique em Scans | Ímã no menu suspenso. Na janela MagnetScan , digite 115 na Posição de Massa do Marcador e clique em enter. Deixe o ímã escanear através da faixa de massa para 115In (114,6083 a 115,3749) por 30 minutos enquanto o instrumento se aquece.
- Após 30 min, use o controle do autosampler para passar para a posição de uma solução de ajuste multielement de 1 ppb. Aspire a solução de sintonia e sintonize o instrumento para otimizar a leitura do sinal. Ajuste a posição da tocha (X, Y, Z) de modo que a tocha esteja alinhada com o centro dos cones e da taxa de fluxo de nebulizadores (~ 30 psi) na janela de controle de plasma . Faça os ajustes necessários na janela de ajuste de óptica de íons para a fonte, detector e analisador.
- Uma vez que a leitura do sinal seja otimizada (~1,2 × 106 contagens/s para 1 ppb em 115In), clique em Parar na janela Magnet Scan .
- Clique em Calibrar Magnet e selecione Baixa Resolução na janela pop-up.
- Clique em OK e abra o arquivo "Mass Calibration (Baixa Resolução).smc" para calibrar o Magneto.
NOTA: A calibração do ímã medirá as contagens/s e encaixará uma curva através da seguinte faixa de massa: 7Li a 238U. - Clique em Salvar | Use para aplicar a calibração do ímã atual às análises. Se medir amostras desconhecidas com uma enorme gama de concentrações, realize uma Calibração do Detector para comparar sinais de contagem de pulsos de íons em baixas concentrações com sinais de íons atenuados produzidos em concentrações mais altas. Analise as amostras quando a sintonia e calibração estiverem completas.
- Na barra de menu, clique em Aquisição de Dados.
- Clique na configuração do método no menu suspenso. Use um método existente fornecido pelo fabricante ou crie um método baseado nos elementos de interesse. Se necessário, ajuste o modo de análise, o tempo de moradia, o atraso do switch, o número de varreduras/ciclos, a resolução, o modo de detecção e a massa do parque para as configurações do defletor.
- Clique em Salvar para gravar as configurações do método. Otimize os parâmetros para cada metal e isótopo. Consulte a Tabela 2 para obter os parâmetros de operação específicos utilizados neste estudo.
- Na barra de menu, clique em Aquisição de Dados.
- Clique em Batch Run no menu suspenso. Como alternativa, clique no ícone BATCH abaixo da barra de menu. Importe os parâmetros do lote de uma planilha ou crie uma sequência na janela Batch Run . Digite o tipo de amostra, a posição do rack do autosampler, o tempo de transferência, o tempo de lavagem, as réplicas, o ID da amostra e o arquivo do método.
- Organize a execução do lote na seguinte ordem: soluções padrão para a curva de calibração (0,001-10 ppb Pt ou Ru), seguidas por um padrão de controle de qualidade e, em seguida, amostras desconhecidas.
NOTA: As soluções padrão são medidas como contagens/s no ICPMS, e uma regressão linear é encaixada através dos padrões com um desvio padrão relativo (RSD) > 0,999. As incógnitas também são medidas como contagens/s e resolvidas para concentração em ppb utilizando a regressão linear da curva de calibração, y = mx + b. O processamento de dados também pode ser concluído usando o software referenciado. - Monitore a deriva do instrumento e a reprodutibilidade da amostra, incluindo um padrão de controle de qualidade de 0,5 ppb a cada 5-10 amostras.
NOTA: Os padrões adequados de controle de qualidade devem ser um material de referência padrão certificado diferente do padrão utilizado na curva de calibração.
| Watts | Poder | Ata |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tabela 1: Protocolo de digestão de micro-ondas para massa de tecido larval. As amostras larval de zebrafish foram digeridas em 0,25 mL de ácido nítrico. Esta tabela foi modificada a partir de 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esses resultados foram publicados anteriormente24. Estudos de absorção de tecidos foram realizados com exposições transmitidas pela água de cisplatina e um novo composto anticâncer baseado em Ru, PMC79. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de cisplatina 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L cisplatina. O acúmulo de PT no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS, e o tecido do organismo continha as respectivas doses de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 ng (Pt) por organismo (Figura 3). Não foi avaliada a determinação analítica das concentrações nominais para cisplatina, dada a estabilidade conhecida da cisplatina.
A eclosão retardada foi observada em todas as concentrações de cisplatina. Foram realizados experimentos adicionais para concentrações de Pt com e sem descorção manual. Pós-descorção, os chorions foram coletados e analisados para Pt separadamente. Doses não letais de cisplatina utilizadas para estudos de descorção determinaram que 93-96% da dose total entregue de cisplatina haviam se acumulado no acorde com a dose restante dentro do tecido larval (Figura 4).
As larvas de zebrafish foram expostas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12,4 mg/L de PMC79. Essas doses foram selecionadas por determinação dos derivados de uma IC50, conforme descrito anteriormente16. Estas concentrações foram analiticamente determinadas para conter 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 mg/L de Ru. Ao contrário da curva de dose-resposta cisplatina, a eclosão retardada não foi observada em larvas expostas ao PMC79. Os acordes não foram incluídos na análise de rutênio, pois naturalmente degradaram-se antes da coleta de larvas. Os pesquisadores podem incluir a análise de corão sem eclosão retardada, descorrioando e coletando acordes em 24 dpf. A massa de metal dentro dos tecidos larvais analisadas em cada concentração foi de 0,19, 0,41 e 0,68 ng (Ru) por larva (Figura 5). Um resumo dos pontos finais toxicológicos, incluindo concentrações letais e/ou doses para 50% da população (LC50/LD 50), concentrações efetivas ou doses para 50% das populações (EC50/ED50), e o menor nível de efeito adverso observado (LOAEL) pode ser encontrado na Tabela 3.
| Cisplatina | PMC79 | |||||
| Nominal (mg/L) | μM | Pt (ng) / organismo | Ru Analítico (mg/L) | μM | Ru (ng) / organismo | |
| LC50/LD50 | 31 (IC95%: 20,5-34,0) | 158 (IC95%: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (IC95%: 0,43-1,20) | 7,8 (IC 95%: 4,2-11,8) | NA |
| EC50 | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| LOAEL | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0.19 (± 0,05) |
Tabela 3: Determinação da solução e captação de metalodros associados a pontos finais toxicológicos. O LD50 foi determinado por análise equivalente metálica de Pt e Ru para cisplatina e PMC79, respectivamente. As concentrações lc50 para PMC79 foram determinou-se analiticamente. No entanto, não foi realizada a determinação analítica das concentrações nominais de cisplatina; dada a estabilidade conhecida da cisplatina na solução, presumiu-se que as concentrações nominais e medidas na solução seriam equivalentes. O ponto final de eclosão atrasado para exposição à cisplatina foi avaliado em termos de ED50 e LOAEL. As concentrações de LOAEL de PMC79 foram determinou-se analiticamente. O LOAEL incluiu lesões como hemorragia ao longo da veia caudal e artéria traseira, curvatura espinhal e edema de saco de gema. Todos os intervalos de confiança de 95% foram calculados usando o método Litchfield Wilcoxon. Esta tabela foi modificada a partir de 24. Abreviaturas: CI = intervalo de confiança; LC50 = Concentração Letal para 50% da população; LD50 = Dose Letal para 50% da população; EC50 = Concentração Efetiva para 50% da população; LOAEL = menor nível de efeito adverso observado.
Figura 1: Protocolo de dose-resposta de zebrafish. Este protocolo utiliza uma abordagem modificada adaptada da FET da OCDE. Feito com Biorender. Abreviação: OCDE = Organização cooperação e desenvolvimento econômico; FET = toxicidade aguda do embrião de peixe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Digestão tecidual e avaliação de ICPMS. O protocolo de digestão é eficaz para digerir uma amostra composta de larvas de zebrafish. Abreviação: ICPMS = espectrometria de massa plasmática acoplada indutivamente. Criado com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dose-resposta cisplatina. (A) Percentual médio de eclosão retardada a 5 dpf correlacionados com os equivalentes médios de Pt determinados por organismo. (B) Percentual de letalidade média em 5 dpf correlacionada com os equivalentes médios de Pt por organismo. Média percentual: N = 40 por dose. Pt (ng) por organismo: >4 amostras compostas por dose. Foram realizadas duas réplicas experimentais, das quais são exibidas as faixas. Este número foi modificado de 24. Abreviação: dpf = dias pós fertilização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação do Pt (ng) presente nas larvas e no chorão após a exposição a 7,5 ou 15 mg/L. Composto >3 larvas ou acordes por amostra; da esquerda para a direita N = 13, 10, 10 e 11. As barras de erro representam desvio padrão. Mann-Whitney teste de soma de classificação P < 0,001 entre larvas e chorão para ambas as doses. Este número foi modificado de 24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Dose-resposta PMC79. (A) Percentual de letalidade média foi correlacionado com os equivalentes médios de Ru analíticas em solução (mg/L). (B) Percentual de letalidade média aos 5 dias após a fertilização do mesmo experimento foi correlacionada com os equivalentes médios de Ru por larva. Letalidade: N = 40 por dose. Ru (mg/L): N = 6 amostras compostas por dose. Ru (ng) por larva >4 amostras compostas por dose. Foram realizadas duas réplicas experimentais, das quais são exibidas as faixas. Este número foi modificado de 24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo de moradia por pico | 4 ms |
| Atraso do interruptor/ Pico (x10micros) | 2 |
| Número de varreduras | 350 |
| Número de ciclos | 1 |
| Resolução de Instrumentos | 300 |
| Modo de detecção | Atenuado, Defletor Jump |
| Missa do Parque | 98.90594 |
| Elemento (isótopos) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Tabela 2: parâmetros do método ICPMS. Parâmetros para análise de isótopos pt e ru para determinar concentrações teciduais de cisplatina e PMC79, respectivamente. O Sr foi incluído no monitoramento de interferências isobáricas associadas à composição da água do tanque. Esta tabela foi modificada a partir de 24. ICPMS = espectrometria de massa plasmática acoplada indutivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo aqui descrito foi implementado para determinar a entrega e a absorção de drogas anticancerígenas baseadas em metal contendo Pt ou Ru. Embora esses métodos já tenham sido publicados, este protocolo discute considerações e detalhes importantes para adaptar essa metodologia para uma variedade de compostos. O protocolo da OCDE, juntamente com a digestão tecidual e a análise do ICPMS, nos permitiu determinar que o PMC79 era mais potente que a cisplatina e resultou em acúmulo de tecidos díspares, sugerindo mecanismos separados. Além disso, como a dose entregue de cisplatina foi quantificada, os resultados de dose-resposta foram extrapolados para as populações de pacientes. As doses subletares (por exemplo, LOAEL) foram comparáveis às concentrações de dosagem intravenosa em pacientes24.
Embora este método possa ser aplicado a um amplo espectro de metais e compostos à base de metal, uma investigação cuidadosa das propriedades físico-químicas do analito deve ser levada em consideração. Compostos à base de metal podem ser muito difíceis de dissolver, e vários veículos podem ser usados para evitar isso. As concentrações de veículos, como o DMSO, podem precisar estar em concentrações mais altas do que o recomendado no protocolo da OCDE. Sendo assim, é importante manter uma dose nãotóxica monitorando de perto o desenvolvimento de controles; balançar continuamente os embriões durante a exposição atenua a precipitação. Além disso, os compostos organometálicos podem não ser estáveis em solução aquosa. Se o processo de degradação for desconhecido, estudos que envolvam renovação de solução de 24 horas podem ser considerados ou comparados a curvas de dose-resposta não totalmente.
Recomenda-se seguir o Teste de Toxicidade de Embriões Agudos de Peixe (FET) da OCDE Número 23621. No entanto, modificações podem ser feitas para atender a propósitos específicos. Os recipientes de vidro evitam confundir variáveis toxicológicas, como plásticos e plastificantes, e não adsorb metais tão fortemente, o que removeria analitos da água do ovo. Para compostos que fotodegradam, como cisplatina, pode ser benéfico realizar a exposição sem um ciclo de luz.
Há muita discussão na literatura sobre a necessidade de descorção em estudos de dose-resposta de zebrafish 25,26,27. Argumentos para descorção a 24 hpf sugerem que o acorde limita a permeabilidade dos compostos, gerando resultados falso-negativos ou curvas de dose-resposta aumentadas. Embora esses pontos tenham mérito, a realização de estudos sem descorção pode fornecer uma visão mecanicista. Estes estudos sugerem que a cisplatina se acumula no acorde dos embriões devido à sua atividade de alquilação (Figura 2). Os adutos resultantes reforçam a estrutura, resultando em eclosão atrasada. No entanto, o PMC79 e outras drogas anticancerígenas baseadas em Ru não causaram esse fenômeno27. Embora muitos quimioterápicos adorem sua atividade anticancerígena por alquilação, a falta de exposição pós PMC79 retardada indicou um mecanismo díspare. Estudos com ou sem descorção devem ser cuidadosamente considerados ou conduzidos em paralelo.
A digestão do tecido a jusante e a análise do ICPMS devem ser continuamente consideradas. Sugere-se evitar o uso de reagentes que possam causar interferências isobáricas e implementar métodos alternativos. Os reagentes utilizados durante os estudos de dose-resposta podem impactar ou reagir com o ácido nítrico e seu potencial oxidante ou contribuir para interferências isobáricas. Descobriu-se que a solução de sal usada para fazer óxidos de estrôncio (Sr) de água do ovo, que se sobrepunham a um isótopo específico de Ru24. Reduzir as concentrações de sal ou limpar cuidadosamente as larvas pode amenizar essa questão. Por essas razões, sugere-se evitar o azul de metileno antimicrobiano ou o agente eutanizador, tricaine. Em vez disso, autoclave e, posteriormente, aerar a água do ovo para remover micróbios ou eutanásia as larvas por resfriamento rápido. É importante nesta etapa alcançar curvas padrão isotópicas lineares com mínimas interferências isobáricas para o analito de interesse.
Uma limitação importante para este protocolo é que os compostos organometólicos serão oxidados de tal forma que apenas o metal permanece. Como tal, estudos de metabolismo não podem ser realizados. Embora o protocolo possa ser considerado de rendimento médio, a porção dose-resposta pode ser acelerada com o auxílio de sistemas de entrega química automática e imagens. Este protocolo é uma metodologia nascente que pode ser modificada e refinada para um amplo espectro de compostos metálicos e metálicos para estudos farmaco-e toxicinocéticos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse a serem divulgados por nenhum dos autores.
Acknowledgments
Financiamento: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Além disso, Brittany Karas é apoiada pela concessão de treinamento T32NS115700 da NINDS, NIH. Os autores reconhecem Andreia Valente e a Fundação Portuguesa de Ciência e Tecnologia (FCT); PTDC/QUI-QIN/28662/2017) para o fornecimento de PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
