Summary
Повышенная скорость фармако- и токсикокинетического анализа металлов и соединений на основе металлов у рыбок данио может быть полезна для экологических и клинических трансляционных исследований. Ограничение неизвестного поглощения воздействия воды было преодолено путем проведения анализа следов металлов на переваренной ткани рыбок данио с использованием масс-спектрометрии индуктивно связанной плазмы.
Abstract
Металлы и соединения на их основе содержат разнообразные фармакоактивные и токсикологические ксенобиотики. От токсичности тяжелых металлов до химиотерапии, токсикокинетика этих соединений имеет как историческое, так и современное значение. Рыбки данио стали привлекательным модельным организмом в выяснении фармако- и токсикокинетики в исследованиях воздействия окружающей среды и клинических трансляций. Хотя исследования рыбок данио имеют преимущество в том, что они имеют более высокую пропускную способность, чем модели грызунов, существует несколько существенных ограничений для модели.
Одно из таких ограничений присуще режиму дозирования на водной основе. Концентрации воды из этих исследований не могут быть экстраполированы для обеспечения надежных внутренних доз. Прямые измерения соединений на основе металлов позволяют лучше коррелировать с молекулярными и биологическими реакциями, связанными с соединениями. Чтобы преодолеть это ограничение для металлов и соединений на основе металлов, был разработан метод переваривания ткани личинок рыбок данио после воздействия и количественной оценки концентраций металлов в образцах тканей с помощью масс-спектрометрии индуктивно связанной плазмы (ICPMS).
Методы ICPMS были использованы для определения металлических концентраций платины (Pt) из цисплатина и рутения (Ru) из нескольких новых химиотерапевтических препаратов на основе Ru в ткани рыбок данио. Кроме того, этот протокол различал концентрации Pt, которые были изолированы в хорионе личинки по сравнению с тканью рыбки данио. Эти результаты показывают, что этот метод может быть применен для количественного определения дозы металла, присутствующего в тканях личинок. Кроме того, этот способ может быть скорректирован для идентификации конкретных металлов или соединений на основе металлов в широком диапазоне исследований воздействия и дозирования.
Introduction
Металлы и соединения на их основе по-прежнему имеют фармакологическое и токсикологическое значение. Распространенность воздействия тяжелых металлов и его влияние на здоровье экспоненциально увеличили научные исследования с 1960-х годов и достигли рекордно высокого уровня в 2021 году. Концентрации тяжелых металлов в питьевой воде, загрязнение воздуха и профессиональное воздействие превышают нормативные пределы во всем мире и остаются проблемой для мышьяка, кадмия, ртути, хрома, свинца и других металлов. Новые методы количественной оценки воздействия окружающей среды и анализа патологического развития по-прежнему пользуются большим спросом 1,2,3.
И наоборот, медицинская область использовала физико-химические свойства различных металлов для клинического лечения. Препараты на основе металлов или металлопрепараты имеют богатую историю лечебных целей и показали активность против целого ряда заболеваний, с наибольшим успехом в качестве химиотерапевтическихсредств 4. Самый известный из металлопрепаратов, цисплатин, является противоопухолевым препаратом на основе Pt, признанным Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) одним из основных лекарств в мире5. В 2010 году цисплатин и его производные Pt имели до 90% успеха при нескольких видах рака и использовались примерно в 50% схем химиотерапии 6,7,8. Хотя химиотерапевтические средства на основе Pt имели неопровержимый успех, токсичность, ограничивающая дозу, привела в движение исследования альтернативных препаратов на основе металлов с рафинированной биологической доставкой и активностью. Из этих альтернатив соединения на основе Ru стали самыми популярными 9,10,11,12.
Новые модели и методология необходимы, чтобы идти в ногу со скоростью потребности в фармако- и токсикокинетических исследованиях металлов. Модель рыбок данио находится на пересечении сложности и пропускной способности, являясь высокоплотным позвоночным с 70% сохраненной гомологией гена13. Эта модель была активом в фармакологии и токсикологии, с обширными скринингами для различных соединений для обнаружения свинца, идентификации мишеней и механистической активности 14,15,16,17. Тем не менее, высокопроизводительный скрининг химических веществ обычно зависит от воздействия воды. Учитывая, что поглощение может быть переменным в зависимости от физико-химических свойств соединения в растворе (т.е. фотодеградации, растворимости), это может быть основным ограничением корреляции дозы доставки и ответа.
Чтобы преодолеть это ограничение для сравнения дозы с более высокими позвоночными, была разработана методология анализа концентраций следов металлов в ткани личинок рыбок данио. Здесь кривые «доза-реакция» летальных и сублетальных конечных точек были оценены для цисплатина и новых противоопухолевых соединений на основе Ru. Летальность и задержка вылупления оценивались для номинальных концентраций 0, 3,75, 7,5, 15, 30 и 60 мг/л цисплатина. Накопление Pt в тканях организма было определено анализом ICPMS, и поглощение организмом соответствующих доз составило 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 и 461,9 нг (Pt) на организм. Кроме того, личинки рыбок данио подвергались воздействию 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 мг/л PMC79. Эти концентрации были аналитически определены как содержащие 0, 0,17, 0,44, 0,66 и 0,76 мг/л Ru. Этот протокол также позволил различать концентрации Pt, секвестрированного в хорионе личинок, по сравнению с тканью рыбок данио. Эта методология смогла предоставить надежные, надежные данные для сравнения фармако- и токсикокинетической активности между хорошо зарекомендовавшим себя химиотерапевтическим и новым соединением. Этот метод может быть применен к широкому спектру металлов и соединений на их основе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Штамм данио AB (Danio rerio) использовался для всех экспериментов (см. Таблицу материалов), а протокол животноводства (No 08-025) был одобрен Комитетом по уходу за животными и учреждениям Университета Рутгерса.
1. Разведение рыбок данио
- Разводите и поддерживайте рыбок данио в рециркуляционной системе водной среды обитания в 14-часовом светлом: 10-часовом темном цикле.
- Очистите муниципальную водопроводную воду с помощью песка и угольной фильтрации для получения воды в рыбной системе. Поддерживайте воду водной системы при температуре 28 °C, <0,05 ppm нитрита, <0,2 ppm аммиака и pH между 7,2 и 7,7.
- Кормите рыбок данио диетой из вылупившихся цист артемии, рассолом креветок и рыбьей диетической чешуйчатой пищей.
2. Протокол доза-реакция рыбок данио (рисунок 1)
- Приготовьте яичный водный раствор рыбок данио, либо среду E3, либо яичную воду, изготовленную из запасной морской соли в концентрации 60 мкг/мл, растворенную в деионизированной воде18. Избегайте использования метиленового синего.
ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью ICPMS изобарическая интерференция яичной воды рыбок данио была идентифицирована для оксидов стронция, которые перекрывались изотопом рутения. Тщательное промывание личинок перед последующим анализом улучшило эту проблему. Среда E3 может быть более легким выбором для некоторых из-за запатентованного состава коммерческих морских солей. - Растворите металл или соединения на их основе в Е3 или яичной воде. Вихрь для разрушения любого заполнителя материала и гомогенизации раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте, описанном ниже, PMC79 и цисплатин растворяли в максимальных концентрациях 12,4 мг/л и 60 мг/л с максимальной концентрацией 0,5% диметилсульфоксида (ДМСО), чтобы противостоять осаждению.- Разбавляют тяжелые металлы или соединения на основе металлов, такие как PMC79 и цисплатин, Е3 или яичной водой, получая по меньшей мере 5 доз концентрации.
- Начинают с низких концентраций стоковых растворов в чистом носителе (т.е. ДМСО), затем разбавляют Е3 или яичной водой. Тщательно рассмотрите конечные концентрации транспортного средства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые соединения на основе металлов, такие как цисплатин, быстро разлагаются, и их растворы должны ежедневно обновляться. ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с тяжелыми металлами и химиотерапевтическими препаратами с осторожностью. Просмотрите конкретный паспорт безопасности материала (MSDS) для интересующего металла. Цисплатин может вызвать раздражение глаз и кожи, быть смертельным при проглатывании и может вызвать токсичность в почках, крови, кроветворных органах и тканях плода. Избегайте дыхания испарений и контакта с глазами, кожей и одеждой. Носите непроницаемые перчатки и одежду, а также защитные очки или очки19.
- Начинают с низких концентраций стоковых растворов в чистом носителе (т.е. ДМСО), затем разбавляют Е3 или яичной водой. Тщательно рассмотрите конечные концентрации транспортного средства.
- Разбавляют тяжелые металлы или соединения на основе металлов, такие как PMC79 и цисплатин, Е3 или яичной водой, получая по меньшей мере 5 доз концентрации.
- Установите резервуары для размножения во второй половине дня перед экспериментом в идеальном соотношении 2 самок на 1 самца с разделителем на месте между полами20.
- Потяните за разделитель, когда загорится свет для утреннего цикла.
- Позвольте рыбкам данио размножаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени для разведения зависит от требуемой начальной стадии воздействия. В течение 3 ч после оплодотворения допускайте размножение в течение примерно 2 ч. Яйца достигнут 3 л.с. после очистки и сегрегации яиц. - Переместите размножающуюся рыбу в чистый аквариум.
- Соберите яйца, вылив воду из резервуара через ситечко.
- Переверните ситечко над чашкой Петри и используйте бутылку с брызгами, наполненную E3 или яичной водой, чтобы промыть яйца в чашку.
- Очистите тарелку от пищи и отходов перед экспериментальным использованием.
- Рандомизируйте примерно двадцать 3 эмбрионов hpf на дозу в отдельные стеклянные флаконы, используя переносную пипетку и небольшое количество воды.
- После того, как все эмбрионы окажутся во флаконах, удалите всю яичную воду и замените достаточным количеством дозирующего раствора, чтобы над высотой яйца было примерно на 1 дюйм раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует тщательно рассмотреть необходимость дехорионации. Более подробную информацию см. в разделе обсуждения. - Ежедневно наблюдайте за эмбрионами на предмет поражений или летальности. Из-за быстрого развития эмбриональных рыбок данио, получайте ежедневные изображения с помощью любого яркого микроскопа / камеры для выявления незначительных поражений между днями.
- По окончании дозового ответа (через 4-5 дней после оплодотворения [dpf], согласно руководящим принципам21 Организации экономического сотрудничества и развития [ОЭСР]), объедините 3-5 личинок перед эвтаназией для композитного отбора проб. Усыпление путем быстрого охлаждения путем мгновенного замораживания в жидком азоте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия через передозировку MS-222 или трикаина метансульфоната может потенциально помешать анализу ICPMS в дальнейшем. Методы быстроохлаждающей эвтаназии рекомендуются для этого протокола, чтобы уменьшить возможность вмешательства. - Проведите 3 промывания тканей водой высокой чистоты (например, обратным осмосом) для удаления лишнего соединения с внешней стороны ткани.
- Переместите образцы в кислото- и микроволновые безопасные 15 мл полипропиленовые центрифужные трубки. Будьте осторожны, чтобы удалить всю лишнюю воду , так как любая оставшаяся жидкость может разбавить азотную кислоту и, следовательно, окислительный потенциал кислоты во время деградации тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ткань может храниться при -20 °C до дальнейшего анализа. Для металлов с естественным изобилием очистка трубок в 5% азотной кислотной ванне перед использованием улучшит фоновые уровни окружающей среды.
3. Сбраживание тканей и оценка ICPMS (рисунок 2)
- Добавьте приблизительно 0,25 мл в 15 мл полипропиленовых центрифужных пробирок для 10 личинок (~100 мкг) азотной кислоты высокой чистоты (69%). Ультразвук в течение 1 ч для предварительного переваривания образцов с использованием следующих настроек: мощность ультразвуковой ванны: 85 Вт; 42 кГц ± 6%; температурный диапазон: 19-27 °C.
ВНИМАНИЕ: Носите защиту ушей во время обработки ультразвуком. Азотная кислота вызывает серьезные ожоги дыхательных путей, глаз и кожи. Носите полное защитное снаряжение и работайте в вытяжном шкафу или в местах с достаточной вентиляцией. Он может быть легковоспламеняющимся с другими материалами. Азотная кислота должна обрабатываться исключительно в вытяжке, чтобы предотвратить воздействие паров, образующихся во время пищеварения. Не вдыхайте и не глотайте.- Выполняйте короткие циклы переваривания тканей (интервалы 5 минут) в кислотно-безопасном микроволновом реакторе до тех пор, пока вся ткань не будет заметно окислена (т. Е. Однородный, прозрачно-желтый раствор).
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроволновый протокол в таблице 1 рекомендуется выполнять три раза и включает 5-минутный интервал охлаждения между каждым этапом нагрева. - Тщательно контролируйте целостность труб, чтобы избежать разрыва, и проводите короткие вращения в центрифуге (313 × г в течение 1 мин) между циклами, чтобы переместить кислотную конденсацию на дно трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань трудно усваивается (особенно хорионы), 30% перекись водорода высокой чистоты может быть использована после кислотного переваривания. Используйте перекись водорода (6,75 мл), чтобы разбавить концентрацию кислоты до 3,5%, и дайте образцам посидеть на ночь в вытяжке. Перекись водорода разлагается доH2Oи подходит для анализа ICPMS. Кроме того, альтернативные металлы могут лучше растворяться в соляной кислоте или смеси соляной кислоты и азотной кислоты (т.е. aqua regia). Перекись водорода вредна при проглатывании и вызывает серьезные повреждения глаз. Носите средства защиты кожи и глаз 22,23.
- Выполняйте короткие циклы переваривания тканей (интервалы 5 минут) в кислотно-безопасном микроволновом реакторе до тех пор, пока вся ткань не будет заметно окислена (т. Е. Однородный, прозрачно-желтый раствор).
- Как только ткань будет заметно окислена (т.е. однородный, прозрачно-желтый раствор), разбавьте образцы в вытяжке до 3,5% азотной кислоты, используя 6,75 мл воды высокой чистоты и вихря для тщательного перемешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при комнатной температуре. Этот шаг не нужен, если перекись водорода была добавлена для облегчения пищеварения на этапе 3.1. - Проведите матричную 7-точечную калибровочную кривую (диапазон концентраций 0,001-10 ppb) с использованием сертифицированного элементарного стандарта (т.е. Pt или Ru, в зависимости от анализа) с интересующим металлом и оптимальным изотопом (изотопами) для учета любых потенциальных изобарических интерференций.
- Используя запасную концентрацию водного, сертифицированного элементарного стандарта (Ru, Pt = 1000 ppb), возьмите аликвоту 0,1 мл и пипетируйте в новую 15-литровую центрифужную трубку. Разбавляют 3,5% азотной кислотой до конечного объема 10 мл для получения стандартного раствора 10 ppb.
- Используя запас 10 ppb, делают следующие последовательные разведения: 0,1, 1,0 и 5,0 ppb стандартных растворов в 3,5% азотной кислоте.
- Используя запас 0,1, делают следующие последовательные разведения: 0,001, 0,005 и 0,01 ppb стандартных растворов в 3,5% азотной кислоте.
- Подготовка инструмента ICPMS (см. Таблица материалов) для анализа проб следующим образом:
- Перед запуском прибора убедитесь, что клапан аргонового газа открыт, вся трубка надежно подключена, а чистая 5% азотная кислота открыта для промывки трубок и стеклянной посуды между анализами образцов.
- Проверьте состояние горелки и конусов и убедитесь, что коробка горелки надежно заперта, а дренажная трубка распылительной камеры правильно подключена к перипу.
- Откройте программное обеспечение (см. Таблицу материалов).
- Проверьте показания вакуума и убедитесь, что все турбонасосы работают на 100%.
- Нажмите кнопку ПУСК в окне Состояние системы управления плазмой , чтобы инициировать последовательность запуска, включить плазменный насос, плазменный чиллер, продуть небулайзер и зажечь плазму. Подождите, пока плазма загорится и стабилизируется, когда окно состояния покажет, что последовательность запуска завершена. На этом этапе обратите внимание на зеленые точки в окне Состояние системы , которые указывают на то, что все блоки питания включены.
- В строке меню выберите Управление | автосэмплера в раскрывающемся меню. Введите положение стойки автопробоотборника для трубки, содержащей 5% азотной кислоты. Позвольте кислоте проникнуть в плазму.
- В строке меню нажмите на Сканы | Магнит в выпадающем меню. В окне MagnetScan введите 115 в поле Положение массы маркера и нажмите кнопку ВВОД. Позвольте магниту сканировать в диапазоне масс в течение 115В (от 114,6083 до 115,3749) в течение 30 минут, пока инструмент нагревается.
- Через 30 минут используйте элемент управления автоподборником, чтобы перейти в положение многоэлементного решения для настройки 1 ppb. Аспирируйте решение настройки и настройте прибор для оптимизации считывания сигнала. Отрегулируйте положение горелки (X, Y, Z) таким образом, чтобы горелка была выровнена с центром конусов и расходом небулайзера (~ 30 фунтов на кв. дюйм) в окне управления плазмой . Внесите необходимые изменения в окне Настройка ионной оптики для источника, детектора и анализатора.
- После оптимизации показаний сигнала (~1,2 × 106 отсчетов/с для 1 ppb на 115вкл)) нажмите кнопку «Стоп» в окне «Сканирование магнита ».
- Нажмите «Калибровать магнит» и выберите «Низкое разрешение » во всплывающем окне.
- Нажмите OK и откройте файл "Mass Calibration (Low Resolution).smc" для калибровки магнита.
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка магнита измеряет количество/с и устанавливает кривую в следующем диапазоне масс: от 7Li до 238U. - Нажмите Сохранить | Используется для применения калибровки токового магнита к анализам. При измерении неизвестных образцов с огромным диапазоном концентраций выполните калибровку детектора для сравнения сигналов подсчета ионных импульсов при низких концентрациях с ослабленными ионными сигналами, полученными при более высоких концентрациях. Проанализируйте образцы после завершения настройки и калибровки.
- В строке меню выберите Сбор данных.
- Нажмите настройка метода в раскрывающемся меню. Используйте существующий метод, предоставленный производителем, или создайте метод на основе интересующих элементов. При необходимости отрегулируйте режим анализа, время ожидания, задержку переключения, количество разверток/циклов, разрешение, режим обнаружения и парковую массу для настроек дефлектора.
- Нажмите кнопку Сохранить , чтобы записать параметры метода. Оптимизируйте параметры для каждого металла и изотопа. Конкретные параметры работы, используемые в данном исследовании, см. в таблице 2 .
- В строке меню выберите Сбор данных.
- Нажмите на Пакетный запуск в раскрывающемся меню. Кроме того, нажмите на значок BATCH под строкой меню. Импортируйте параметры пакета из электронной таблицы или создайте последовательность в окне Пакетный запуск . Введите тип образца, положение стойки автоподборщика, время передачи, время стирки, реплики, идентификатор образца и файл метода.
- Организуйте серийный запуск в следующем порядке: стандартные растворы для калибровочной кривой (0,001-10 ppb Pt или Ru), затем стандарт контроля качества, затем неизвестные образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные решения измеряются как количество/ы на ICPMS, и линейная регрессия соответствует стандартам с относительным стандартным отклонением (RSD) > 0,999. Неизвестные также измеряются как количество/с и решаются для концентрации в ppb с использованием линейной регрессии калибровочной кривой, y = mx + b. Обработка данных также может быть завершена с использованием указанного программного обеспечения. - Мониторинг дрейфа прибора и воспроизводимости образцов путем включения стандарта контроля качества 0,5 ppb каждые 5-10 образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящими стандартами контроля качества должен быть сертифицированный стандартный эталонный материал, отличный от стандарта, используемого в калибровочной кривой.
| Мощность в ваттах | Сила | Протокол |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Таблица 1: Протокол микроволнового сбраживания для массы ткани личинки. Образцы личинок рыбок данио переваривали в 0,25 мл азотной кислоты. Эта таблица была изменена с 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Таких результатов ранее было опубликовано24. Исследования поглощения тканей проводились с воздействием цисплатина на водной основе и нового противоопухолевого соединения на основе Ru, PMC79. Летальность и задержка вылупления оценивались для номинальных концентраций цисплатина 0, 3,75, 7,5, 15, 30 и 60 мг/л цисплатина. Накопление Pt в тканях организма определяли с помощью анализа ICPMS, и ткани организма содержали соответствующие дозы 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 и 461,9 нг (Pt) на организм (рисунок 3). Аналитическое определение номинальных концентраций цисплатина не оценивалось, учитывая известную стабильность цисплатина.
Задержка вылупления наблюдалась при всех концентрациях цисплатина. Дополнительные эксперименты проводились для концентраций Pt с ручным дехорионацией и без нее. После дехорионации хорионы были собраны и проанализированы для Pt отдельно. Нелетальные дозы цисплатина, используемые для исследований дехорионации, определили, что 93-96% от общей дозы цисплатина накапливалось в хорионе, а оставшаяся доза находилась в личиночной ткани (рисунок 4).
Личинки рыбок данио подвергались воздействию 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 мг/л PMC79. Эти дозы были выбраны путем определения производных IC50, как описано ранее16. Эти концентрации были аналитически определены как содержащие 0, 0,17, 0,44, 0,66 и 0,76 мг/л Ru. В отличие от кривой доза-реакция цисплатина, задержка вылупления не наблюдалась у личинок, подвергшихся воздействию PMC79. Хорионы не были включены в анализ рутения, поскольку они естественным образом деградировали до сбора личинок. Исследователи могут включить анализ хорионов без задержки вылупления путем дехорионирования и сбора хорионов при 24 dpf. Масса металла в личиночных тканях, проанализированных при каждой концентрации, составляла 0,19, 0,41 и 0,68 нг (Ru) на личинку (рисунок 5). Краткое изложение токсикологических конечных точек, включая летальные концентрации и/или дозы для 50% населения (LC50/LD50), эффективные концентрации или дозы для 50% населения (EC50/ED50) и самый низкий наблюдаемый уровень неблагоприятного воздействия (LOAEL) можно найти в таблице 3.
| Цисплатин | ПМК79 | |||||
| Номинальная (мг/л) | мкМ | Pt (нг) / организм | Аналитический Ru (мг/л) | мкМ | Ru (нг) / организм | |
| ЛК50/ЛД50 | 31 (95% ДИ: 20,5-34,0) | 158 (95% ДИ: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (95% ДИ: 0,43-1,20) | 7,8 (95% ДИ: 4,2-11,8) | Н.А. |
| ЭК50 | 4.6 | 12.5 | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. |
| ЛОЭЛЬ | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0,19 (± 0,05) |
Таблица 3: Определение поглощения раствора и металлопрепаратов, связанных с токсикологическими конечными точками. LD50 был определен анализом металлического эквивалента Pt и Ru для цисплатина и PMC79 соответственно. Аналитически определены концентрации LC50 для PMC79. Однако аналитическое определение номинальных концентраций цисплатина не проводилось; учитывая известную стабильность цисплатина в растворе, предполагалось, что номинальные и измеренные концентрации в растворе будут эквивалентны. Конечная точка замедленного вылупления для воздействия цисплатина оценивалась с точки зрения ED50 и LOAEL. Аналитически определены концентрации ПМК79 в LOAEL. LOAEL включал такие поражения, как кровоизлияние вдоль каудальной вены и хвостовой артерии, искривление позвоночника и отек желточного мешка. Все 95% доверительные интервалы были рассчитаны с использованием метода Личфилда Уилкоксона. Эта таблица была изменена с 24. Сокращения: CI = доверительный интервал; LC50 = смертельная концентрация для 50% населения; LD50 = смертельная доза для 50% населения; ЕС50 = эффективная концентрация для 50% населения; LOAEL = самый низкий наблюдаемый уровень неблагоприятного воздействия.
Рисунок 1: Протокол доза-реакция рыбок данио. В этом протоколе используется модифицированный подход, адаптированный из FET ОЭСР. Сделано с биорендером. Аббревиатура: ОЭСР = Организация экономического сотрудничества и развития; FET = острая токсичность эмбриона рыбы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сбраживание тканей и оценка ICPMS. Протокол пищеварения эффективен для переваривания составного образца личинок рыбок данио. Аббревиатура: ICPMS = масс-спектрометрия плазменной с индуктивно связанной связью. Создано с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Доза-реакция цисплатина. (А) Процентное среднее отсроченное вылупление при 5 dpf коррелирует со средними эквивалентами Pt, определенными на организм. (B) Процентная средняя летальность при 5 dpf коррелирует со средним эквивалентом Pt на организм. Процентное значение: N = 40 на дозу. Pt (нг) на организм: >4 композитных образца на дозу. Были проведены две экспериментальные реплики, диапазоны которых показаны. Эта цифра была изменена с 24. Аббревиатура: dpf = дни после оплодотворения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнение Pt (ng), присутствующего в личинках и хорионе после воздействия 7,5 или 15 мг/л. Составные >3 личинки или хорионы на образец; слева направо N = 13, 10, 10 и 11. Полосы погрешностей представляют стандартное отклонение. Тест Манна-Уитни P < 0,001 между личинками и хорионом для обеих доз. Эта цифра была изменена с 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Доза-реакция PMC79. (A) Процентное среднее летальность коррелировало с аналитически определенным средними эквивалентами Ru в растворе (мг/л). (B) Процент средней летальности через 5 дней после оплодотворения из того же эксперимента коррелировал со средними эквивалентами Ru на личинку. Летальность: N = 40 на дозу. Ru (мг/л): N = 6 составных образцов на дозу. Ru (нг) на личинку >4 композитных образца на дозу. Были проведены две экспериментальные реплики, диапазоны которых показаны. Эта цифра была изменена с 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Время ожидания на пик | 4 мс |
| Задержка переключения / пик (x10micros) | 2 |
| Количество разверток | 350 |
| Количество циклов | 1 |
| Разрешение прибора | 300 |
| Режим обнаружения | Ослабленный, Дефлекторный прыжок |
| Парк Месса | 98.90594 |
| Элемент (изотопы) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Таблица 2: Параметры метода ICPMS. Параметры анализа изотопов Pt и Ru для определения тканевых концентраций цисплатина и PMC79 соответственно. Sr был включен для мониторинга изобарических помех, связанных с составом воды в резервуаре. Эта таблица была изменена с 24. ICPMS = масс-спектрометрия плазменной с индуктивной связью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, был реализован для определения доставки и поглощения противоопухолевых препаратов на основе металлов, содержащих либо Pt, либо Ru. Хотя эти методы уже были опубликованы, в этом протоколе обсуждаются важные соображения и детали для адаптации этой методологии для ряда соединений. Протокол ОЭСР в сочетании с перевариванием тканей и анализом ICPMS позволил нам определить, что PMC79 был более мощным, чем цисплатин, и привел к разрозненному накоплению тканей, предполагая отдельные механизмы. Кроме того, поскольку доставленная доза цисплатина была количественно определена, результаты дозы-ответа были экстраполированы на популяции пациентов. Сублетальные дозы (например, LOAEL) были сопоставимы с внутривенными дозирующими концентрациями у пациентов24.
Хотя этот метод может быть применен к широкому спектру металлов и соединений на их основе, необходимо учитывать тщательное исследование физико-химических свойств анализируемого вещества. Соединения на основе металлов могут быть очень трудными для растворения, и для этого могут использоваться различные транспортные средства. Концентрации в транспортных средствах, такие как ДМСО, возможно, должны быть более высокими концентрациями, чем это рекомендовано в протоколе ОЭСР. Таким образом, важно поддерживать нетоксичную дозу, внимательно следя за развитием контроля; непрерывное раскачивание эмбрионов во время воздействия смягчает осадки. Кроме того, металлоорганические соединения могут быть нестабильными в водном растворе. Если процесс деградации неизвестен, исследования, которые включают 24-часовое обновление раствора, могут быть рассмотрены или сопоставлены с кривыми невозобновления доза-реакция.
Рекомендуется следовать тесту ОЭСР на острую токсичность эмбрионов (FET) No 23621. Тем не менее, изменения могут быть сделаны в соответствии с конкретными целями. Стеклянные контейнеры избегают путаницы токсикологических переменных, таких как пластик и пластификаторы, и не адсорбируют металлы так сильно, что удаляют аналиты из яичной воды. Для соединений, которые разлагаются, таких как цисплатин, может быть полезно проводить экспозицию без светового цикла.
В литературе много обсуждается необходимость дехорионации в исследованиях «доза-реакция рыбок данио» 25,26,27. Аргументы в пользу дехорионации при 24 л.с. предполагают, что хорион ограничивает проницаемость соединений, тем самым генерируя ложноотрицательные результаты или увеличенные кривые доза-реакция. Хотя эти моменты имеют свои достоинства, проведение исследований без дехорионации может обеспечить механистическое понимание. Эти исследования показывают, что цисплатин накапливается в хорионе эмбрионов из-за его алкилирующей активности (рисунок 2). Полученные аддукты укрепляют структуру, что приводит к задержке вылупления. Однако PMC79 и другие противоопухолевые препараты на основе Ru не вызвали этого явления27. Хотя многие химиотерапевтические средства проявляют свою противоопухолевую активность путем алкилирования, отсутствие замедленного инкубационного воздействия после PMC79 указывает на разрозненный механизм. Исследования с дехорионацией или без нее должны тщательно рассматриваться или проводиться параллельно.
Необходимо постоянно учитывать последующее переваривание тканей и анализ ICPMS. Рекомендуется избегать использования любых реагентов, которые могут вызывать изобарические помехи, и применять альтернативные методы. Реагенты, используемые во время исследований «доза-реакция», могут воздействовать или реагировать с азотной кислотой и ее окислительным потенциалом или способствовать изобарическим интерференциям. Было обнаружено, что солевой раствор, используемый для производства яичной воды, генерирует оксиды стронция (Sr), которые перекрываются со специфическим изотопом Ru24. Снижение концентрации соли или тщательная очистка личинок может улучшить эту проблему. По этим причинам рекомендуется избегать антимикробного метиленового синего или усыпляющего агента трикаина. Вместо этого автоклав и последующая аэрация яичной воды для удаления микробов или усыпления личинок путем быстрого охлаждения. На этом этапе важно достичь линейных изотопных стандартных кривых с минимальными изобарическими интерференциями для интересующего анализа.
Важным ограничением этого протокола является то, что металлоорганические соединения будут окисляться таким образом, что останется только металл. Таким образом, исследования метаболизма не могут быть проведены. Хотя протокол можно считать среднепроизводительным, доза-реакция может быть ускорена с помощью автоматических систем доставки химических веществ и визуализации. Этот протокол представляет собой зарождающуюся методологию, которая может быть модифицирована и уточнена для широкого спектра металлов и соединений на основе металлов для фармако- и токсикокинетических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет никаких конфликтов интересов, которые могут быть раскрыты кем-либо из авторов.
Acknowledgments
Финансирование: NJAES-Rutgers NJ01201, грант NIEHS на обучение T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Кроме того, Бриттани Карас поддерживается грантом на обучение T32NS115700 от NINDS, NIH. Авторы выражают признательность Андрее Валенте и Португальскому фонду науки и техники (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) на поставку PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
