Summary
제브라피쉬에서 금속 및 금속 기반 화합물의 약리학 및 독성 분석의 증가된 속도는 환경 및 임상 번역 연구에 유리할 수 있다. 알려지지 않은 수인성 노출 흡수의 한계는 유도 결합 플라즈마 질량 분광법을 사용하여 소화 된 제브라 피쉬 조직에 대한 미량 금속 분석을 수행함으로써 극복되었습니다.
Abstract
금속 및 금속-기반 화합물은 다방면의 약리-활성 및 독성학적 이종생물제를 포함한다. 중금속 독성에서 화학 요법에 이르기까지,이 화합물의 독성 학은 역사적, 현대적 관련성을 모두 가지고 있습니다. Zebrafish는 환경 노출 및 임상 번역 연구에서 약물 및 독성 학을 밝히는 데 매력적인 모델 유기체가되었습니다. 제브라 피쉬 연구는 설치류 모델보다 처리량이 높다는 이점이 있지만 모델에 몇 가지 중요한 제약 조건이 있습니다.
그러한 제한 중 하나는 수인성 투약 요법에 내재되어 있습니다. 이러한 연구의 물 농도는 신뢰할 수있는 내부 복용량을 제공하기 위해 외삽 될 수 없습니다. 금속계 화합물의 직접 측정은 화합물 관련 분자 및 생물학적 반응과의 더 나은 상관관계를 허용한다. 금속 및 금속 기반 화합물에 대한 이러한 한계를 극복하기 위해 노출 후 제브라피쉬 유충 조직을 소화하고 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICPMS)을 통해 조직 샘플 내의 금속 농도를 정량화하는 기술이 개발되었습니다.
ICPMS 방법은 제브라피쉬 조직에서 몇몇 신규한 Ru-기반 화학요법제로부터 시스플라틴 및 루테늄(Ru)으로부터의 백금(Pt)의 금속 농도를 결정하기 위해 사용되었다. 또한,이 프로토콜은 제브라 피쉬 조직과 비교하여 애벌레의 chorion에서 격리 된 Pt의 농도를 구별했습니다. 이들 결과는 이 방법이 애벌레 조직에 존재하는 금속 용량을 정량화하기 위해 적용될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이 방법은 광범위한 노광 및 투약 연구에서 특정 금속 또는 금속계 화합물을 동정하도록 조정될 수 있다.
Introduction
금속 및 금속계 화합물은 약리학적 및 독성학적 관련성을 계속 갖는다. 중금속 노출의 유병률과 건강에 미치는 영향은 1960 년대 이후 과학적 조사를 기하 급수적으로 증가 시켰으며 2021 년에는 사상 최고치에 도달했습니다. 식수, 대기 오염 및 직업적 노출에서 중금속의 농도는 전 세계적으로 규제 한계를 초과하며 비소, 카드뮴, 수은, 크롬, 납 및 기타 금속의 문제로 남아 있습니다. 환경 노출을 정량화하고 병리학 적 발달을 분석하는 새로운 방법은 계속해서 높은 수요에 있습니다 1,2,3.
반대로, 의료 분야는 임상 치료를 위해 다양한 금속의 물리 화학적 특성을 활용했습니다. 금속 기반 약물 또는 메탈로 약물은 의약 목적의 풍부한 역사를 가지고 있으며 화학 요법으로 가장 높은 성공을 거둔 다양한 질병에 대한 활성을 보여주었습니다4. 메탈로제들 중 가장 유명한 시스플라틴은 세계보건기구(WHO)가 세계 필수의약품 중 하나로 간주하는 Pt 기반 항암제이다5. 2010년, 시스플라틴 및 이의 Pt 유도체는 여러 암에서 최대 90%의 성공률을 보였으며 화학요법요법 6,7,8의 약 50%에 사용되었다. Pt 기반 화학 요법은 반박 할 수없는 성공을 거두었지만 용량 제한 독성은 세련된 생물학적 전달 및 활성을 가진 대체 금속 기반 약물에 대한 조사를 시작했습니다. 이러한 대안 중 Ru계 화합물이 가장 많이 사용되는9,10,11,12가되었습니다.
새로운 모델과 방법론은 금속 약리학 및 독성 학적 연구에 대한 필요성의 비율에 보조를 맞추기 위해 필요합니다. 제브라피쉬 모델은 복잡성과 처리량의 교차점에 있으며, 70% 보존된 유전자 상동성을 갖는 높은 출산율 척추동물이다(13). 이 모델은 약리학 및 독성학의 자산이었으며 납 발견, 표적 식별 및 기계론적 활동을위한 다양한 화합물에 대한 광범위한 스크리닝14,15,16,17. 그러나 화학 물질의 고처리량 스크리닝은 일반적으로 수인성 노출에 의존합니다. 흡수가 용액 중의 화합물의 물리화학적 특성(즉, 광분해, 용해도)에 기초하여 가변적일 수 있다는 것을 감안할 때, 이것은 용량 전달 및 반응과 상관관계가 있는 주요 한계가 될 수 있다.
더 높은 척추 동물에 대한 복용량의 비교를위한 이러한 한계를 극복하기 위해, 방법론은 제브라 피쉬 애벌레 조직에서 미량 금속 농도를 분석하도록 설계되었습니다. 여기서, 치사 및 치사하 종말점의 용량-반응 곡선을 시스플라틴 및 신규한 Ru계 항암 화합물에 대해 평가하였다. 치사율 및 지연된 부화는 0, 3.75, 7.5, 15, 30 및 60 mg/L 시스플라틴의 공칭 농도에 대해 평가되었다. 유기체 조직에서의 Pt 축적은 ICPMS 분석에 의해 결정되었고, 각각의 투여량의 유기체 흡수는 유기체 당 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2, 및 461.9 ng (Pt)이었다. 또한, 제브라 피쉬 유충은 PMC79의 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L에 노출되었습니다. 이 농도는 분석적으로 0, 0.17, 0.44, 0.66 및 0.76 mg / L의 Ru를 포함하는 것으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 또한 제브라 피쉬 조직과 비교하여 유충의 chorion에서 격리 된 Pt의 농도를 구별 할 수있었습니다. 이 방법론은 잘 확립 된 화학 요법과 새로운 화합물 사이의 약물 및 독성 학적 활성의 비교를위한 신뢰할 수 있고 강력한 데이터를 제공 할 수있었습니다. 이 방법은 광범위한 금속 및 금속계 화합물에 적용될 수 있다.
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Protocol
AB 균주 제브라피쉬(Danio rerio)를 모든 실험에 사용하였고( 자료표 참조), 축산 프로토콜(#08-025)은 럿거스 대학 동물 관리 및 시설 위원회에 의해 승인되었다.
1. 제브라피쉬 축산
- 제브라 피쉬를 번식시키고 14 시간 빛 : 10 시간 어둠주기로 재순환하는 수생 서식지 시스템에서 유지하십시오.
- 모래와 탄소 여과를 통해 시립 수돗물을 정화하여 어류 시스템 물을 얻습니다. 수생 시스템 물을 28°C, <0.05ppm 아질산염, <0.2ppm 암모니아 및 pH를 7.2~7.7로 유지하십시오.
- 제브라 피쉬에게 부화 한 Artemia 낭종, 소금물 새우 및 생선 다이어트 플레이크 음식의 식단을 먹이십시오.
2. 제브라피쉬 용량 반응 프로토콜(그림 1)
- 제브라피쉬 달걀 물 용액, E3 배지 또는 비스톡 바다 소금으로 만든 달걀 물을 탈이온수18에 녹인 60 μg / mL의 농도로 준비하십시오. 메틸렌 블루의 사용을 피하십시오.
참고 : ICPMS를 통해 제브라 피쉬 달걀 물의 등압 간섭이 루테늄의 동위원소와 겹치는 스트론튬 산화물에 대해 확인되었습니다. 하류 분석 전에 유충을주의 깊게 헹구면이 문제가 개선되었습니다. E3 배지는 상업용 바다 소금의 독점적 인 구성으로 인해 일부 사람들에게는 더 쉬운 선택 일 수 있습니다. - 금속 또는 금속계 화합물을 E3 또는 계란 물에 녹인다. 소용돌이는 모든 골재 물질을 분해하고 용액을 균질화합니다.
참고: 아래에 요약된 실험에서, PMC79와 시스플라틴은 침전에 저항하기 위해 최대 농도 12.4mg/L 및 최대 농도 0.5% 디메틸설폭사이드(DMSO)로 60mg/L로 용해되었다.- PMC79 및 시스플라틴과 같은 중금속 또는 금속 기반 화합물을 E3 또는 달걀 물로 희석하여 최소 5 농도 용량을 준비합니다.
- 순수한 비히클 (즉, DMSO)에서 낮은 농도의 스톡 용액으로 시작한 다음 E3 또는 계란 물로 희석하십시오. 최종 차량 농도를 신중하게 고려하십시오.
참고 : 시스 플라틴과 같은 특정 금속 기반 화합물은 빠르게 분해되며 용액은 매일 신선하게 만들어야합니다. 주의: 중금속과 화학요법제를 조심스럽게 다루십시오. 관심있는 금속에 대한 특정 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)를 검토하십시오. 시스플라틴 은 눈과 피부에 자극을 줄 수 있고, 삼키면 치명적일 수 있으며, 신장, 혈액, 혈액 형성 기관 및 태아 조직에 독성을 유발할 수 있습니다. 연기를 호흡하고 눈, 피부 및 의복과의 접촉을 피하십시오. 불침투성 장갑과 의복, 안전 안경 또는 고글을 착용하십시오19.
- 순수한 비히클 (즉, DMSO)에서 낮은 농도의 스톡 용액으로 시작한 다음 E3 또는 계란 물로 희석하십시오. 최종 차량 농도를 신중하게 고려하십시오.
- PMC79 및 시스플라틴과 같은 중금속 또는 금속 기반 화합물을 E3 또는 달걀 물로 희석하여 최소 5 농도 용량을 준비합니다.
- 실험 전날 오후에 남녀20 명 사이에 칸막이가있는 암컷 2 마리와 남성 1 마리의 이상적인 비율로 번식 탱크를 설치하십시오.
- 아침 사이클을 위해 조명이 켜지면 분배기를 당깁니다.
- 제브라 피쉬가 번식하도록 허용하십시오.
참고 : 번식 시간은 필요한 초기 노출 단계에 따라 다릅니다. 수정 후 3 시간 동안 약 2 시간 동안 번식을 허용하십시오. 계란은 계란을 청소하고 분리 한 후 3 마력에 이릅니다. - 번식 물고기를 깨끗한 탱크로 옮깁니다.
- 스트레이너를 통해 탱크 물을 부어 계란을 수집하십시오.
- 스트레이너를 페트리 접시 위로 뒤집고 E3 또는 달걀 물로 채워진 분출 병을 사용하여 계란을 접시에 헹구십시오.
- 실험적으로 사용하기 전에 음식과 쓰레기 접시를 청소하십시오.
- 복용량 당 약 20 3 hpf 배아를 전달 피펫과 소량의 물을 사용하여 개별 유리 병에 무작위 화하십시오.
- 모든 배아가 바이알에 들어간 후, 모든 난자를 제거하고 충분한 투약 용액으로 교체하여 계란 높이 위에 약 1 인치의 용액이 있도록하십시오.
참고 : dechorionation의 필요성은주의 깊게 고려되어야합니다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. - 병변이나 치사율에 대해 매일 배아를 관찰하십시오. 배아 제브라 피쉬의 급속한 발달로 인해 밝은 필드 현미경 / 카메라 설정을 사용하여 매일 이미지를 확보하여 며칠 간의 사소한 병변을 식별하십시오.
- 용량 반응이 종료되면 (수정 후 4-5 일 [dpf], 조직 경제 협력 개발 [OECD] 지침21에 따라), 복합 샘플링을 위해 안락사하기 전에 3-5 마리의 유충을 결합하십시오. 액체 질소에서 스냅 냉동하여 급속 냉각으로 안락사하십시오.
참고: MS-222 또는 트리카인 메탄설포네이트의 과다 복용을 통한 안락사는 ICPMS 분석 하류를 잠재적으로 방해할 수 있습니다. 간섭의 가능성을 줄이기 위해이 프로토콜을 위해 급속 냉각 안락사 방법이 권장됩니다. - 조직의 외부에서 과도한 화합물을 제거하기 위해 고순도의 물 (예 : 역삼투압)으로 조직을 3 번 세척하십시오.
- 샘플을 산 및 마이크로파 안전 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮깁니다. 임의의 잔여 액체가 질산을 희석시킬 수 있고, 따라서, 조직 분해 동안 산의 산화 전위를 제거할 수 있으므로 모든 과량의 물을 제거하도록 주의해야 한다.
참고: 이 시점에서, 조직은 추가 분석될 때까지 -20°C에서 저장될 수 있다. 자연적으로 풍부한 금속의 경우, 사용하기 전에 5 % 질산 욕조에서 튜브를 청소하면 주변 배경 수준이 개선됩니다.
3. 조직 소화 및 ICPMS 평가(그림 2)
- 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 약 0.25 mL를 첨가하여 최대 10마리의 유충(~100 μg)의 고순도 질산(69%)을 섭취한다. 다음 설정을 사용하여 샘플을 사전 소화하기 위해 1 시간 동안 초음파 처리 : 초음파 욕조 출력 : 85W; 42 kHz ± 6%; 온도 범위 : 19-27 °C.
주의: 초음파 처리 중에 귀 보호 장치를 착용하십시오. 질산은 심각한 호흡기, 눈 및 피부 화상을 일으 킵니다. 완전한 보호 장비를 착용하고 흄 후드 또는 적절한 환기가있는 장소에서 작업하십시오. 그것은 다른 재료와 함께 가연성 일 수 있습니다. 질산은 소화 중에 생성 된 증기에 노출되지 않도록 흄 후드에서만 독점적으로 처리해야합니다. 흡입하거나 섭취하지 마십시오.- 모든 조직이 눈에 띄게 산화 될 때까지 산 안전 마이크로파 소화조에서 짧은 사이클 (5 분 간격)을 수행하십시오 (즉, 균일하고 맑은 노란색 용액).
참고: 표 1 의 마이크로파 프로토콜은 세 번 수행하는 것이 좋으며 각 가열 단계 사이에 5분의 쿨다운 간격을 포함합니다. - 파열을 피하기 위해 튜브의 무결성을 주의 깊게 모니터링하고 사이클 사이에 원심분리기(313 × g 에서 1분 동안 g)에서 짧은 회전을 수행하여 산 응축을 튜브 바닥으로 이동시킵니다.
참고 : 조직이 소화하기 어려운 경우 (특히 융자), 산 소화 후 30 % 고순도 과산화수소를 사용할 수 있습니다. 과산화수소(6.75 mL)를 사용하여 산 농도를 3.5%로 희석하고, 샘플이 흄 후드에서 하룻밤 동안 앉을 수 있도록 한다. 과산화수소는H2O로 분해되며 ICPMS 분석에 적합합니다. 또한, 대체 금속은 염산 또는 염산과 질산의 혼합물 (즉, 아쿠아 레지아)에 더 잘 용해 될 수 있습니다. 과산화수소는 삼키면 해롭고 심각한 눈 손상을 일으 킵니다. 착용 피부 및 눈 보호22,23.
- 모든 조직이 눈에 띄게 산화 될 때까지 산 안전 마이크로파 소화조에서 짧은 사이클 (5 분 간격)을 수행하십시오 (즉, 균일하고 맑은 노란색 용액).
- 조직이 눈에 띄게 산화되면 (즉, 균일하고 맑은 황색 용액), 흄 후드에서 샘플을 6.75 mL의 고순도 물과 와류를 사용하여 3.5 % 질산으로 희석하여 완전히 혼합하십시오.
참고: 이 시점에서 샘플은 실온에서 저장할 수 있습니다. 이 단계는 단계 3.1에서 소화를 돕기 위해 과산화수소를 첨가하는 경우 불필요하다. - 관심있는 금속 및 잠재적 등압 간섭을 설명하기 위해 인증 된 원소 표준 (즉, 분석법에 따라 Pt 또는 Ru)을 사용하여 매트릭스 매칭, 7 점 보정 곡선 (0.001-10 ppb의 농도 범위)을 수행하십시오.
- 수성, 인증된 원소 표준(Ru, Pt = 1000 ppb)의 스톡 농도를 사용하여, 0.1 mL 분취량과 피펫을 새로운 15 mL 원심분리 튜브에 넣는다. 10 mL의 최종 부피에 3.5% 질산으로 희석하여 10 ppb 표준 용액을 생성하였다.
- 10ppb 스톡을 사용하여 3.5% 질산에 0.1, 1.0 및 5.0ppb 표준 용액을 연속 희석합니다.
- 0.1 스톡을 사용하여 3.5% 질산에 0.001, 0.005 및 0.01ppb 표준 용액을 연속 희석합니다.
- ICPMS 계측기 준비( 물자의 표)를 시료 분석을 위해 다음과 같이 한다.
- 장비를 시작하기 전에 아르곤 가스 밸브가 열려 있고 모든 튜브가 단단히 연결되어 있는지 확인하고 샘플 분석 사이에 튜브와 유리 제품을 헹구기 위해 깨끗한 5 % 질산이 열려 있는지 확인하십시오.
- 토치와 콘의 상태를 확인하고 토치 박스가 단단히 걸쇠되어 있고 스프레이 챔버 배수 튜브가 주변 펌프에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오.
- 소프트웨어를 엽니다( 자료표 참조).
- 진공 판독값을 확인하고 모든 터보 펌프가 100%에서 작동하는지 확인합니다.
- 플라즈마 제어 시스템 상태 창에서 START(시작)를 클릭하여 시작 시퀀스를 시작하고, 플라즈마 펌프, 플라즈마 냉각기를 켜고, 분무기를 제거하고, 플라즈마를 밝힙니다. 상태 창에 시작 시퀀스가 완료되었음을 나타낼 때 플라즈마가 켜지고 안정될 때까지 기다립니다. 이 시점에서 시스템 상태 창에서 모든 전원 공급 장치가 켜져 있음을 나타내는 녹색 점을 관찰하십시오.
- 메뉴 막대에서 드롭 다운 메뉴에서 자동 샘플러| 제어를 클릭하십시오. 5% 질산을 포함하는 튜브의 자동 시료 주입기 랙 위치를 입력합니다. 산이 플라즈마에 들어가도록 허용하십시오.
- 메뉴 막대에서 스캔을 클릭| 드롭 다운 메뉴의 자석. MagnetScan 창에서 마커 질량 위치에 115를 입력하고 Enter 키를 클릭합니다. 계측기가 예열되는 동안 자석이 질량 범위에서 30분 동안 115In(114.6083 ~ 115.3749)을 스캔하도록 합니다.
- 30분 후, 자동 시료 주입기 제어를 사용하여 1ppb 다중 요소 튜닝 용액의 위치로 이동합니다. 튜닝 솔루션을 흡인하고 계측기를 조정하여 신호 판독을 최적화하십시오. 토치 위치(X, Y, Z)를 조정하여 토치가 플라즈마 제어 창에서 원뿔 및 분무기 유량(~30psi)의 중심과 정렬되도록 합니다. 소스, 검출기 및 분석기에 대한 이온 광학 튜닝 창에서 필요한 조정을 수행합니다.
- 신호 판독값이 최적화되면(115인치× 1ppb에 대해 ~1.2 106카운트/s), 자석 스캔 창에서 중지를 클릭합니다.
- 자석 보정을 클릭하고 팝업 창에서 저해상도를 선택합니다.
- 확인을 클릭하고 "질량 보정(저해상도).smc" 파일을 열어 자석을 보정합니다.
참고: 자석 보정은 카운트/s를 측정하고 다음 질량 범위를 통해 곡선에 맞춥니다: 7Li~ 238U. - | 저장을 클릭합니다. 현재 자석 교정을 분석에 적용하는 데 사용합니다. 엄청난 범위의 농도로 알려지지 않은 샘플을 측정하는 경우 검출기 보정을 수행하여 낮은 농도의 이온 펄스 카운트 신호를 더 높은 농도에서 생성된 감쇠된 이온 신호와 비교합니다. 튜닝 및 교정이 완료되면 샘플을 분석합니다.
- 메뉴 모음에서 데이터 수집을 클릭하십시오.
- 드롭 다운 메뉴에서 메소드 설정을 클릭하십시오. 제조업체에서 제공하는 기존 방법을 사용하거나 관심 있는 요소를 기반으로 메서드를 만듭니다. 필요한 경우 디플렉터 설정을 위해 분석 모드, 체류 시간, 스위치 지연, 스윕/사이클 수, 해상도, 감지 모드 및 공원 질량을 조정합니다.
- 저장을 클릭하여 메서드 설정을 기록합니다. 각 금속 및 동위원소에 대한 파라미터를 최적화합니다. 본 연구에 사용된 특정 조작 파라미터에 대해서는 표 2를 참조한다.
- 메뉴 모음에서 데이터 수집을 클릭하십시오.
- 드롭 다운 메뉴에서 배치 실행을 클릭하십시오. 또는 메뉴 막대 아래의 배치 아이콘을 클릭하십시오. 스프레드시트에서 배치 매개 변수를 가져오거나 배치 실행 창에서 시퀀스를 만듭니다. 샘플 유형, 자동 시료 주입기 랙 위치, 전송 시간, 세척 시간, 반복실험, 샘플 ID 및 메소드 파일을 입력합니다.
- 배치 실행을 다음 순서로 정렬하십시오 : 교정 곡선 (0.001-10 ppb Pt 또는 Ru)에 대한 표준 솔루션, 품질 관리 표준 및 알 수없는 샘플.
참고: 표준 솔루션은 ICPMS에서 카운트/s로 측정되며 선형 회귀는 상대 표준 편차(RSD)가 0.999인 표준> 통과합니다. 미지수는 또한 카운트/s로 측정되고 보정 곡선의 선형 회귀(y = mx + b)를 사용하여 ppb의 농도에 대해 풀립니다. 데이터 처리는 참조된 소프트웨어를 사용하여 완료할 수도 있습니다. - 5-10개 샘플마다 0.5ppb 품질 관리 표준을 포함하여 기기 드리프트 및 샘플 재현성을 모니터링합니다.
참고: 적합한 품질 관리 표준은 교정 곡선에 사용되는 표준과 다른 인증된 표준 기준 재료여야 합니다.
| 와트 | 힘 | 분 |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
표 1: 애벌레 조직 질량에 대한 마이크로파 소화 프로토콜. 제브라피쉬 유충 샘플을 0.25 mL의 질산에서 소화시켰다. 이 테이블은 24에서 수정되었습니다.
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Representative Results
이러한 결과는 이전에 발표되었습니다24. 조직 흡수 연구는 시스플라틴과 새로운 Ru 기반 항암 화합물 인 PMC79의 수인성 노출로 수행되었습니다. 치사율 및 지연된 부화는 시스플라틴 0, 3.75, 7.5, 15, 30 및 60 mg/L 시스플라틴의 공칭 농도에 대해 평가되었다. 유기체 조직에서의 Pt 축적은 ICPMS 분석에 의해 결정되었고, 유기체 조직은 유기체 당 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2, 및 461.9 ng (Pt)의 각각의 투여량을 함유하였다 (도 3). 시스플라틴에 대한 공칭 농도의 분석적 결정은 시스플라틴의 공지된 안정성을 고려할 때 평가되지 않았다.
지연된 부화는 모든 시스플라틴 농도에서 관찰되었다. 추가적인 실험은 수동 데코리오네이션의 유무에 관계없이 Pt 농도에 대해 수행되었다. 데코리오네이션 후, 호리온을 수집하여 Pt에 대해 개별적으로 분석하였다. dechorionation 연구에 사용 된 시스 플라틴의 비 치명적인 복용량은 시스 플라틴의 총 전달 용량의 93-96 %가 애벌레 조직 내에서 남은 용량과 함께 chorion에 축적 된 것으로 나타났습니다 (그림 4).
제브라피쉬 유충은 PMC79의 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg/L에 노출되었다. 이들 투여량은 앞서16에 기술된 바와 같이IC50의 유도체를 결정함으로써 선택되었다. 이 농도는 분석적으로 0, 0.17, 0.44, 0.66 및 0.76 mg / L의 Ru를 포함하는 것으로 결정되었습니다. 시스플라틴 용량-반응 곡선과는 달리, PMC79-노출된 유충에서는 지연된 부화는 관찰되지 않았다. Chorions는 애벌레 수집 전에 자연적으로 분해되기 때문에 루테늄 분석에 포함되지 않았습니다. 연구원은 24 dpf에서 chorionating 및 수집에 의해 부화를 지연시키지 않고 chorion 분석을 포함 할 수 있습니다. 각 농도에서 분석한 유충 조직 내 금속의 질량은 유충 당 0.19, 0.41 및 0.68 ng (Ru)이었다 (도 5). 집단의 50%에 대한 치사농도 및/또는 투여량(LC 50/LD50), 유효 농도 또는 집단의 50%에 대한 투여량(EC 50/ED50) 및 가장 낮은 관찰된 부작용 수준(LOAEL)을 포함하는 독성학적 종점의 요약이 표 3에서 발견될 수 있다.
| 시스플라틴 | PMC79 | |||||
| 명목상 (mg/L) | μM | Pt (ng) / 유기체 | 분석 Ru (mg / L) | μM | 루 (ng) / 유기체 | |
| LC 50/LD50 | 31 (95% CI: 20.5-34.0) | 158 (95% CI: 105-174) | 193 (± 130) | 0.79 (95% CI: 0.43-1.20) | 7.8 (95% CI: 4.2-11.8) | 북미 |
| EC50 | 4.6 | 12.5 | 북미 | 북미 | 북미 | 북미 |
| 로엘 | 3.75 | 15.3 | 8.7(± 4) | 0.17 | 1.7 | 0.19(± 0.05) |
표 3: 독성학적 종점과 관련된 용액 및 메탈로약물 흡수의 결정. LD50은 시스플라틴 및 PMC79에 대한 Pt 및 Ru의 금속 등가 분석에 의해 각각 결정되었다. PMC79에 대한 LC50 농도를 분석적으로 결정하였다. 그러나, 공칭 시스플라틴 농도의 분석적 결정은 수행되지 않았다; 용액 중의 시스플라틴의 공지된 안정성을 고려할 때, 용액 중의 공칭 및 측정된 농도는 동등할 것이라고 가정하였다. 시스플라틴 노출에 대한 지연된 부화 종점을 ED50 및 LOAEL의 관점에서 평가하였다. PMC79의 LOAEL 농도를 분석적으로 결정하였다. LOAEL에는 꼬리 정맥과 꼬리 동맥을 따른 출혈, 척추 만곡 및 노른자 낭 부종과 같은 병변이 포함되었습니다. 모든 95% 신뢰 구간은 리치필드 윌콕슨 방법을 사용하여 계산하였다. 이 테이블은 24에서 수정되었습니다. 약어: CI = 신뢰 구간; LC50 = 인구의 50%에 대한 치사농도; LD50 = 인구의 50%에 대한 치사량; EC50 = 인구의 50%에 대한 효과적인 농도; LOAEL = 관찰된 가장 낮은 부작용 수준.
그림 1: 제브라피쉬 용량-반응 프로토콜. 이 프로토콜은 OECD FET에서 적응된 수정된 접근법을 사용한다. 바이오렌더로 제작되었습니다. 약어: OECD = 조직 경제 협력 및 개발; FET = 물고기 배아 급성 독성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조직 소화 및 ICPMS 평가. 소화 프로토콜은 제브라 피쉬 유충의 복합 샘플을 소화하는 데 효과적입니다. 약어: ICPMS = 유도 결합 플라즈마 질량 분석법. 바이오렌더로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 시스플라틴 용량-반응 . (A) 5 dpf에서의 평균 지연된 부화 백분율은 유기체당 결정된 평균 Pt 등가물과 상관관계가 있다. (B) 5 dpf에서의 평균 치사율은 유기체 당 평균 Pt 등가물과 상관관계가 있다. 백분율 평균: 복용량 당 N = 40. 유기체 당 Pt(ng) : 복용량 당 >4 개의 복합 샘플. 두 번의 실험 반복실험이 수행되었으며, 그 범위가 표시됩니다. 이 수치는 24에서 수정되었습니다. 약어 : dpf = 수정 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 7.5 또는 15 mg / L에 노출 된 후 유충과 chorion에 존재하는 Pt (ng)의 비교. 샘플 당 복합 >3 마리의 유충 또는 융모; 왼쪽에서 오른쪽으로 N = 13, 10, 10 및 11. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 만-휘트니 랭크-합계 시험 P< 두 투여량 모두에 대해 유충과 쵸리온 사이에 0.001이다. 이 수치는 24에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PMC79 용량-반응 . (A) 백분율 평균 치사율은 용액 중의 분석적으로 결정된 평균 Ru 등가물(mg/L)과 상관관계가 있었다. (b) 동일한 실험으로부터 수정 후 5일째에서의 평균 치사율 백분율은 유충 당 평균 Ru 등가물과 상관관계가 있었다. 치사율: N = 복용량 당 40. Ru (mg/L): 용량당 N = 6개의 복합 샘플. 유충 당 Ru (ng) >4 회 복합 샘플. 두 번의 실험 반복실험이 수행되었으며, 그 범위가 표시됩니다. 이 수치는 24에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 피크당 체류 시간 | 4 밀리세컨드 |
| 스위치 지연/피크(x10마이크로) | 2 |
| 스윕 수 | 350 |
| 사이클 수 | 1 |
| 계측기 해상도 | 300 |
| 감지 모드 | 감쇠, 디플렉터 점프 |
| 파크 매스 | 98.90594 |
| 원소(동위원소) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
표 2: ICPMS 방법 매개변수. Pt 및 Ru 동위원소의 분석을 위한 파라미터는 각각 시스플라틴 및 PMC79의 조직 농도를 결정한다. Sr은 탱크 물 조성물과 관련된 등압 간섭을 모니터링하기 위해 포함되었다. 이 테이블은 24에서 수정되었습니다. ICPMS = 유도 결합 플라즈마 질량 분석법.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 Pt 또는 Ru를 함유하는 금속계 항암제의 전달 및 흡수를 결정하기 위해 구현되었다. 이러한 방법은 이미 발표되었지만이 프로토콜은 다양한 화합물에 대해이 방법론을 적용하기위한 중요한 고려 사항 및 세부 사항을 논의합니다. 조직 소화 및 ICPMS 분석과 결합 된 OECD 프로토콜은 PMC79가 시스 플라틴보다 더 강력하다는 것을 결정할 수있게 해주었고 이질적인 조직 축적을 초래하여 별도의 메커니즘을 제시했습니다. 또한, 시스플라틴의 전달 투여량이 정량화되었기 때문에, 용량-반응 결과는 환자 집단에 외삽되었다. 치사하 투여량(예를 들어, LOAEL)은 환자24의 정맥내 투약 농도와 비교하였다.
이 방법은 광범위한 금속 및 금속 기반 화합물에 적용될 수 있지만 분석 물질의 물리 화학적 특성에 대한 신중한 조사가 고려되어야합니다. 금속계 화합물은 용해하기가 매우 어려울 수 있으며, 이를 피하기 위해 다양한 비히클을 사용할 수 있다. DMSO와 같은 차량 농도는 OECD 프로토콜에서 권장하는 것보다 더 높은 농도여야 할 수도 있습니다. 따라서 대조군의 개발을 면밀히 모니터링하여 무독성 용량을 유지하는 것이 중요합니다. 노출 중에 배아를 지속적으로 흔들면 강수량이 완화됩니다. 추가적으로, 유기금속 화합물은 수용액에서 안정하지 않을 수 있다. 분해 과정이 알려지지 않은 경우, 24 시간 용액 갱신을 포함하는 연구가 고려되거나 비 갱신 용량 반응 곡선과 비교 될 수 있습니다.
OECD 어류 급성 배아 독성 시험 (FET) 번호 23621을 따르는 것이 좋습니다. 그러나 특정 목적에 맞게 수정할 수 있습니다. 유리 용기는 플라스틱 및 가소제와 같은 혼란스러운 독성 학적 변수를 피하고 금속을 강하게 흡착하지 않아 계란 물에서 분석 물을 제거합니다. 시스플라틴과 같이 광분해되는 화합물의 경우, 광 사이클 없이 노광을 실시하는 것이 유익할 수 있다.
제브라피쉬 용량-반응 연구25,26,27에서 데코리온화의 필요성에 관한 문헌에는 많은 논의가 있다. 24 hpf에서의 데코리온화에 대한 논증은 chorion이 화합물의 투과성을 제한하여 위음성 결과 또는 증강 된 용량 - 반응 곡선을 생성한다는 것을 암시합니다. 이러한 점들이 장점이 있지만, 속임수없이 연구를 수행하는 것은 기계론적 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 연구들은 시스플라틴이 알킬화 활성으로 인해 배아의 합창성에 축적된다는 것을 시사한다(그림 2). 결과 부가물은 구조를 보강하여 해칭이 지연됩니다. 그러나, PMC79 및 다른 Ru계 항암제는 이러한 현상을 일으키지 않았다(27). 많은 화학요법제가 알킬화에 의한 항암 활성을 제정하지만, PMC79 노출 후 지연된 부화의 부족은 이질적인 메카니즘을 나타냈다. dechorionation의 유무에 관계없이 연구는 신중하게 고려되거나 병렬로 수행되어야합니다.
하류 조직 소화 및 ICPMS 분석은 지속적으로 고려되어야합니다. 등압 간섭을 일으킬 수있는 시약 사용을 피하고 대체 방법을 구현하는 것이 좋습니다. 용량-반응 연구 동안 사용되는 시약은 질산 및 그의 산화 잠재력에 영향을 주거나 반응하거나 등압 간섭에 기여할 수 있다. 달걀 물을 만드는 데 사용 된 소금 용액이 Ru24의 특정 동위원소와 겹치는 스트론튬 (Sr) 산화물을 생성한다는 것이 발견되었습니다. 소금 농도를 낮추거나 유충을주의 깊게 청소하면이 문제를 개선 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 항균성 메틸렌 블루 또는 안락사제인 트리카인을 피하는 것이 제안된다. 대신, 오토클레이브 및 이어서 달걀 물을 통기시켜 미생물을 제거하거나 급속 냉각에 의해 유충을 안락사시킨다. 이 단계에서는 관심 있는 분석물에 대한 등압 간섭을 최소화하면서 선형 동위원소 표준 곡선을 달성하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜의 중요한 한계는 유기 금속 화합물이 금속만 남도록 산화된다는 것입니다. 따라서 신진 대사 연구는 수행 될 수 없습니다. 프로토콜이 중간-처리량으로 간주될 수 있지만, 용량-반응 부분은 자동 화학적 전달 시스템 및 영상화의 도움으로 신속해질 수 있다. 이 프로토콜은 약리학 및 독성 학적 연구를 위해 광범위한 금속 및 금속 기반 화합물을 위해 변형되고 정제 될 수있는 초기 방법론입니다.
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Disclosures
저자 중 누구에게도 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
펀딩: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS 트레이닝 그랜트 T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. 또한 브리트니 카라스는 NINDS, NIH의 교육 보조금 T32NS115700에 의해 지원됩니다. 저자는 Andreia Valente와 포르투갈 과학 기술 재단 (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) PMC79 공급용.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
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