Summary
Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.
Abstract
Ubikitinasyon, bir substrat proteininin sadece stabilitesini değil, aynı zamanda lokalizasyonunu ve işlevini de düzenleyen bir tür posttranslasyonel modifikasyondur. Ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve neredeyse tüm temel hücresel biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, substrat proteinlerinin işlevini kontrol etmede ubikitinasyonun rolünün araştırılmasına yardımcı olur. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir prosedür, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı protein ile tanımlanmıştır. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında saflaştırıldı. Total hücresel Bayrak etiketli p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında anti-Flag antikor konjuge agaroz ile saflaştırıldı. Alternatif olarak, toplam hücresel His etiketli ubikitinlenmiş protein, denatüre edici koşullar altında nikel yüklü reçine kullanılarak saflaştırıldı. Elatlardaki ubikitinlenmiş p53 proteinleri, spesifik antikorlarla başarılı bir şekilde tespit edildi. Bu prosedürü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır.
Introduction
Ubikitin, 76 amino asit 1,2,3'ün evrimsel olarak korunmuş bir proteinidir. Ubikitin, hedef proteinler üzerindeki lizin kalıntılarını, aktive edici (E1), konjuge edici (E2) ve ligaz (E3) enzimlerini içeren kaskadlar yoluyla kovalent olarak bağlar. Ubikitin ilk önce E1 enzimi tarafından aktive edilir ve daha sonra E2 konjuge edici enzimlere aktarılır. Daha sonra, E3 ubikitin ligazları hem ubikitin yüklü E2 enzimleri hem de substrat proteinleri ile etkileşime girer ve ubikitinin C-terminali ile substrat 1,2,3,4,5'teki bir lizin kalıntısı arasında bir izopeptit bağının oluşumuna aracılık eder. Ubikitinasyon, ubikitin moieties substrat proteinleri üzerindeki lizin kalıntılarına veya kendisine bağlanmasını içerir ve bu da protein monoubikitinasyonuna veya poliubikitinasyona yol açar. Bu ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve çok çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinasyon, substrat proteinlerinin ubikitin-proteazom sistemi 1,2,3,4,5 yoluyla parçalanmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, ubikitinasyon protein hücre altı lokalizasyonunu, protein kompleks oluşumunu ve hücrelerdeki protein kaçakçılığını modüle eder 3,5. Substrat proteinlerine bağlı ubikitin moieties deubikitinating enzimler (DUB'ler) tarafından uzaklaştırılabilir6,7. Özellikle, ubikitin zincirlerinin bir araya getirildiği farklı yollar, çeşitli biyolojik süreçleri düzenlemek için sayısız araç sağlar 1,5. Substrat protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun kesin rolü şimdiye kadar tam olarak anlaşılamamıştır. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, protein ubikitinasyonunun çeşitli hücresel süreçler üzerindeki etkilerinin aydınlatılmasına katkıda bulunur.
P53 proteini en önemli tümör baskılayıcı proteinlerden biridir ve hemen hemen tüm insan kanserlerinde genetik mutasyonlar veya inaktivasyon sergiler 8,9,10,11. p53 stabilitesi ve aktivitesi, ubikitinasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon12,13 dahil olmak üzere posttranslasyonel modifikasyonlarla in vivo olarak hassas bir şekilde düzenlenir. P53 proteini, çeşitli hücrelerde 6 dakika ila 40 dakika arasında değişen kısa bir yarı ömre sahiptir, bu da esas olarak poliubikitinasyonu ve ardından proteazomal bozunması 10,12'den kaynaklanır. Fare çift dakika 2 (Mdm2), transkripsiyonel aktivitesini inhibe etmek için p53'ün N-terminusuna bağlanan bir E3 ubikitin ligazıdır12,14,15. Mdm2, stabilitesini kontrol etmek için p53'ün poliubikitinasyonunu ve proteazomal bozunmasını teşvik eder ve nükleer ihracatını kolaylaştırmak için p53'ün monoubikitinasyonunu indükler12,14,15,16. Burada, Mdm2 aracılı p53 ubikitinasyonu, memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için ayrıntılı olarak bir yöntem tanıtmak için örnek olarak kullanılmıştır. Hedef proteinlerin ubikitinasyon durumunu etkileyen düzenleyiciler, memeli hücrelerinde aşırı eksprese edildiklerinde veya yıkıldıklarında / nakavt edildiklerinde bu in vivo ubikitinasyon testi kullanılarak tanımlanabilir. Ek olarak, ubikitinlenmiş proteinler in vitro deubikitinasyon testi için substrat olarak kullanılabilir. Her yerde bulunan substratları bireysel DUB'lerle inkübe ederek hedef proteinler için spesifik DUB'leri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama yapılabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, hücrelerde aşağı akış sinyal proteinlerini işe almak için bir iskele görevi görebilir. Her yerde bulunan bir hedef protein kompleksi, doğal saflaştırma koşulları altında sıralı immünopresipitasyon ile saflaştırılabilir ve kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir. Mevcut protokol, ubikitinasyon tarafından düzenlenen hücresel proteinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılabilir.
Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için, afinite etiketli ubikitin, ubikitin antikorları, ubikitin bağlayıcı proteinler ve izole ubikitin bağlayıcı alanların (UBD'ler) kullanımını içeren çeşitli yöntemler oluşturulmuştur17. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için bir aracı olarak afinite etiketli ubikitini kullanan bir protokol sunuyoruz. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı diğer yöntemlere göre avantajlar sunar. Ubikitinlenmiş proteinler, hücresel proteinleri doğrusallaştırarak ve protein-protein etkileşimlerini bozarak nikel yüklü reçineye spesifik olmayan bağlanmayı azaltan güçlü denatürantların varlığında saflaştırılır. Buna karşılık, ubikitin antikorlarının, ubikitin bağlayıcı proteinlerin ve izole UBD'lerin aracılar olarak kullanılması, bağlanma ortaklarını hedef proteinden etkili bir şekilde dışlayamaz, çünkü saflaştırmanın daha az katı koşullar altında yapılması gerekir. Dahası, saflaştırma, bu aracıları kullanarak ilgisiz proteinlerin bağlanmasının artmasına da yol açabilir. Ek olarak, çeşitli ubikitin bağlantı tiplerinin yanı sıra ubikitin bağlayıcı proteinler veya izole UBD'ler tarafından mono- ve poli-ubikitinasyon için bağlanma eğilimi vardır17. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı, tüm hücresel ubikitinlenmiş proteinlerin aşağı çekilmesine katkıda bulunur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen anti-Flag veya anti-HA antikor konjuge agarozun kullanılması, büyük ölçekli Bayrak veya HA etiketli hedef proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında immünopreçökeltiyi kolaylaştırır. Örneğin, poli-His-etiketli ubikitini hedefleyen nikel yüklü reçine ile ikinci bir saflaştırma adımı, aşağı akış deneyleri için yüksek saflıkta ubikitinlenmiş hedef proteinleri elde etmek için kullanılabilir. Özellikle, bir epitop etiketleme saflaştırma stratejisi, hedef proteinleri etkili bir şekilde immünopreçökite etmek için spesifik bir antikor elde edilemediğinde uyarlanabilir. Son olarak, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, in vitro saflaştırma ile karşılaştırıldığında, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha fizyolojik koşullar altında korur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: H1299 hücreleri, Çin Bilimler Akademisi Kök Hücre Bankası tarafından nazikçe sağlanmıştır ve mikoplazma kontaminasyonu için negatif olduğu kanıtlanmıştır.
1. Hücre kültürü
- İlk kültür için, insan akciğer adenokarsinom hücre hattının 1 x 106 hücresini, H1299'u% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 10 glutamin katkı maddesi,% 1 sodyum piruvat ve antibiyotikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) ile desteklenmiş 10-12 mL RPMI 1640 orta ile 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Hücreleri% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de tutun. Hücreleri% 80 -% 90 akıcılığa ne zaman ulaştıklarına bağlı olarak her 2-3 günde bir bölün.
- Transfeksiyondan bir gün önce, transfeksiyon sırasında% 70-90'lık bir birleşme elde etmek için üç Petri kabı için6-9 x 10 6 hücre ve 10-12 mL ortam içeren tek bir 10 cm Petri kabında 2-3 x 106 hücre hazırlayın.
NOT: HEK293T hücreleri, yüksek transfeksiyon verimliliği ve protein ekspresyon seviyesi nedeniyle ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için de kullanılabilir.
2. Plazmid transfeksiyonu
- Üç adet 15 mL'lik santrifüj tüpüne 1,5 mL azaltılmış serum ortamı ekleyin.
- Aşağıdaki gibi seyreltmeler yapmak için her tüpe transfeksiyona hazır plazmid DNA'sı ekleyin. Tüp 1: 1 μg Flag-p53 plazmid, 12 μg boş vektör; Tüp 2: 1 μg Flag-p53 plazmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plazmidi ve 9 μg boş vektör; Tüp 3: 1 μg Flag-p53 plazmid, 3 μg HH-Ub plazmid ve 9 μg Mdm2 plazmid. Transfeksiyon verimliliğini izlemek için her tüpe toplam 0,2 μg yeşil floresan protein (GFP) plazmidi ekleyin.
NOT: Hücrelerde etkili hedef protein ekspresyonunu elde etmek için gereken en uygun plazmid miktarlarını belirlemek için bir pilot deney yapılmalıdır. - Lipozomları seyreltmek için başka bir santrifüj tüpünde 4.5 mL azaltılmış serum ortamına 78 μL lipozom transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.
- Seyreltilmiş DNA çözeltisinin 1.5 mL'sini içeren adım 2.2'den itibaren her tüpe 1.5 mL seyreltilmiş lipozom çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve plazmidleri RT'de en az 20 dakika boyunca lipozomlarla çapraz bağlayın. Plazmid DNA'sı kullanın: her transfeksiyon için 1: 2 (μg: μL) lipozom oranı.
- Orijinal ortamı Petri kaplarından atın ve her bir kaba 9 mL azaltılmış serum ortamı ekleyin. Her bir kaba 3 mL lipozom-DNA karışımı ekleyin ve plakayı 3x ileri geri hafifçe sallayarak çözeltiyi karıştırın ve daha sonra karışımın plakada eşit dağılımı için 3x sola ve sağa doğru karıştırın.
- Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO 2 ile 37 ° C'dekültürleyin. Ortamı 4-6 saat sonra değiştirin ve hücreleri 24-36 saat boyunca kültürlemeye devam edin.
3. Hücre toplama
- 24-36 saat sonra, hücreleri MG132 ile 4-6 saat boyunca 10 μM'lik son konsantrasyonda tedavi edin.
NOT: MG132, 26S proteazom kompleksinin proteolitik aktivitesini etkili bir şekilde bloke eden bir peptid aldehittir. Lisin-48 (K48) bağlantılı poliubikitin zincirleri ile ubikitinlenen proteinlerin miktarları, hücreler MG132 veya diğer proteazom inhibitörleri ile tedavi edildikten sonra arttırılabilir. - Ortamı atın, hücreleri 2 kat yıkayın (hücreleri temizlememeye dikkat ederek) buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri serolojik pipetlerle aspire edin.
- Kaba 1 mL PBS ekleyin, temiz bir kazıyıcı ile kazıyarak hücreleri çıkarın ve hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücre peletlerini toplamak için 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın.
4. Ubikitinlenmiş proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında saflaştırılması
- Kullanmadan önce proteaz inhibitörü kokteyli ile taze olarak takviye edilmiş Bayrak lizis tamponu (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA),% 1 Triton X-100,% 0.2 sarkosil ve% 10 gliserol hazırlayın.
- Her tüpteki hücrelere 800 μL buz gibi soğuk Bayrak lizis tamponu ekleyin, hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve ardından karışımı 30 dakika boyunca 4 ° C'de bir rotatörde inkübe edin.
- Karışımı ultrasonikasyonun 5-10 kısa darbesine maruz bırakın. 20 kHZ sonikasyon frekansında ve% 80 genlikte, 1 s süren her nabız ile buz üzerinde ultrasonikasyon gerçekleştirin. Karışımı bir rotatörde 4 °C'de dakikada 40 devirde (rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Ultrasonize edilmiş örnekleri 8,000 x g'de 20-30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Aliquot 80 μL (1/10) hücre ekstraktı ve 20 μL 5x sodyum dodesil sülfat (SDS) yükleme tamponu ile karıştırılır. Numuneleri 98 ° C'de 5 dakika kaynatın, 2 dakika buz üzerinde soğutun ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın. Bu örnekleri, protein ekspresyonunu izlemek için giriş grubu olarak kullanın.
- Kalan hücre ekstraktlarına 30 μL anti-Bayrak M2 antikor konjuge (Bayrak / M2) boncuk ekleyin ve en az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de bir rotatör üzerinde inkübe edin.
- Boncukları toplamak için 1.500 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj. Boncuklara 1 mL buz gibi soğuk Bayrak lizis tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
- Boncukları toplamak için 1.500 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj. Adım 4.7'yi 4-6 kez tekrarlayın.
- Boncuklara 200 ng / μL'lik son konsantrasyonda 40 μL Bayrak peptitleri ekleyin ve bağlı proteinleri etkisiz hale getirmek için 2 saat boyunca 4 ° C'de bir rotatör üzerinde inkübe edin.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, karışımı 5 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve Batı lekelenmesi için -20 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, diğer aşağı akış deneyleri için 4.10 adımındaki elüatı doğrudan -80 ° C'de saklayın.
NOT: Saflaştırılmış ubikitinlenmiş proteinlerin miktarı, hücre sayısını ve transfekte edilen plazmid miktarlarını artırarak ölçeklendirilebilir. Bir epitop etiketleme stratejisi, doğal saflaştırma koşulları altında özellikle ubikitinlenmiş p53'e bağlanan hücresel kompleksleri saflaştırmak için uyarlanabilir. Flag-p53, mdm2 ve HA-ubiquitin'i birlikte eksprese ederek, ubikitinlenmiş p53 protein kompleksi, memeli hücrelerinden sıralı Flag ve HA antikoru konjuge agaroz tarafından immünopreçökeltilebilir. Her yerde bulunan p53 proteinlerinin bağlanma ortaklarını tutmak için, saflaştırma işlemi sırasında daha az sıkı BC100 lizis tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl,% 10 gliserol, 0.2 mM EDTA,% 0.2 Triton X-100 ve 1x proteaz inhibitörü) kullanılmalıdır. HA peptidinden elde edilen elüat, özellikle ubikitinlenmiş p53'e bağlanan tüm ortakları tanımlamak için kütle spektrometrisine tabi tutulur.
5. Her yerde bulunan proteinlerin denatüre koşullar altında saflaştırılması
- Adım 3.3'te elde edilen hücre peletlerine 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. Aliquot 100 μL (1/10 hacim) hücre süspansiyonu, giriş numunesi olarak bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir.
- Hücre peletlerini toplamak için 4 °C'de 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın. Giriş numunesine 80 μL Bayrak lizis tamponu ekleyin, hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve hücreleri 1 saat boyunca buz üzerinde lize edin.
- 4 °C'de 20-30 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj. Aliquot 80 μL süpernatantın yeni bir mikrosantrifüj tüpüne dönüştürülmesi.
- Süper natanta 20 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 5-10 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika buz üzerinde soğutun ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
- Hücre peletini toplamak için hücre süspansiyonunun kalan 900 μL'sini 700 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletlerine 1 mL ubikitin tamponu 1 (UB tamponu 1; 6 M guanidin-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ve%0.2Triton X-100, taze olarak 10 mM β-merkaptoetanol ve 5 mM imidazol ile desteklenmiş) ekleyin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek birkaç kez karıştırın.
NOT: İmidazol konsantrasyonu, nikel yüklü reçine üzerindeki spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için 5 mM ila 20 mM arasında değişebilir. Ubikitin tamponu, hem ligazları hem de DUB'leri inaktive eden guanidin hidroklorür içerir. β-merkaptoetanol, çürük yumurtalara benzer güçlü, hoş olmayan bir kokuya sahip berrak, renksiz bir sıvıdır. Yüksek konsantrasyonlu bir çözelti mukoza zarında, üst solunum yollarında, cilde ve gözlerde ciddi hasara neden olur. Eldiven ve gözlük takın ve duman başlığında çalışın. - Hücre, çözelti artık viskoz olmayana kadar ultrasonikasyonun 10-20 turuna lizatlar. 20 kHZ sonikasyon frekansında ve% 80 genlikte, 1 s süren her nabız ile buz üzerinde ultrasonikasyon gerçekleştirin. RT'de 20-30 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Süpernatanta 30 μL nikel yüklü reçine ekleyin ve 4 saat boyunca 15 rpm'de ayarlanmış bir rotatörde veya RT'de bir gecede inkübe edin.
- 1 mL UB tampon 1 ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.
- Boncuklara 1 mL ubikitin tamponu 2 (UB tamponu 2; 8 M üre, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ve% 0.2 Triton X-100) ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için 2dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın. Bunu bir kez daha tekrarlayın.
- Boncuklara 1 mL PBS ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın. Bunu bir kez daha tekrarlayın.
- Boncukları RT'de 1 saat boyunca 0.5 M'lik son konsantrasyonda 40 μL imidazol ile inkübe ederek bağlı proteinler.
- Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 5 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve Batı lekelenmesi için -20 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, işlenmemiş elüatı diğer aşağı akış deneyleri için -80 ° C'de saklayın.
6. Batı lekelenmesi ile saflaştırılmış ubikitinlenmiş proteinlerin tespiti
- 4.11 ve 5.12. basamaklardaki numuneleri sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile çözün ve daha sonra tarif edildiği gibi karşılık gelen antikorları kullanarak hedef proteinleri tespit etmek için Western blotting ile bir nitroselüloz membrana aktarın18.
- Kısacası, TBST tamponunda (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-baz, 150 mM NaCI, kullanımdan önce% 0.1 Tween-20 ile taze olarak desteklenmiş) %5 defat süt tozu içeren 20 mL bloke edici çözeltiye 1 saat daldırarak membranı inkübe edin. Daha sonra, membranı RT'de birincil antikorlarla 2 saat veya 4 ° C'de bir gecede inkübe edin. Her set için aşağıdaki antikorları kullanın. Tüm primer antikorlar 1:1000 seyreltmede kullanıldı.
- Flag/M2 agaroz boncukları ile immünopresipitasyondan sonra bir anti-p53 monoklonal antikor ile ubikitinlenmiş p53 dahil olmak üzere toplam p53 proteinini tespit edin.
- Flag/M2 agaroz boncukları ile immünopresipitasyondan sonra anti-HA antikoru veya anti-ubikitin antikoru ile ubikitinlenmiş p53 proteinlerini tespit edin.
- Nikel yüklü reçine pulldown'dan sonra bir anti-p53 monoklonal antikoru ile ubikitinlenmiş p53 proteinlerini tespit edin.
- Nikel yüklü reçine pulldown'dan sonra bir anti-HA antikoru veya anti-ubikitin antikoru ile toplam ubikitinlenmiş proteini tespit edin.
- Her biri 5 dakika boyunca TBST tamponu ile 3x yıkadıktan sonra membranı RT'de yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikorlarla 1 saat boyunca inkübe edin. Tüm sekonder antikorlar 1:3000 seyreltmede kullanıldı. Ardından, membranı TBST tamponu 3x ile her biri 5 dakika boyunca nazik bir ajitasyonla yıkayın.
- Batı lekelenmesinden gelen sinyalleri tespit etmek için kemilüminesans görüntüleme sistemini başlatın. A ve B çözeltilerini 1:1 oranında karıştırarak HRP için substrat çözeltisini hazırlayın.
- Nitroselüloz membranı kamera obscura'ya yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve bir pipetleme tabancası kullanarak substrat çözeltisini membran üzerine eşit şekilde kaplayın. Kemilüminesan sinyalleri yakalamak için otomatik pozlama prosedürünü seçin ve ideal bir sinyal elde edilene kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şematik diyagram Bayrak etiketli p53 (Bayrak-p53) ve Onun / HA çift etiketli ubikitin (HH-Ub) proteinlerini göstermektedir (Şekil 1A). Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için kullanılan prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir. Poli-His-etiketli ubikitin, memeli hücrelerindeki hedef proteinlere bağlanabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, denatüre olmayan koşullar altında Flag/M2 boncukları ile veya denatüre koşullar altında immobilize metal iyonu afinite kromatografisi (IMAC) ile saflaştırılabilir (Şekil 1B). Her yerde bulunan p53 de dahil olmak üzere toplam p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında H1299 hücrelerinden Flag / M2 boncukları ile immünoprepite edildi. Düşük molekül ağırlığından yüksek molekül ağırlığına kadar bulaşmış bir bant olarak görünen ubikitinlenmiş p53 proteininden gelen sinyal, Mdm2 bu hücrelerde ektopik olarak eksprese edildiğinde belirgin şekilde artmıştır, bu da ubikitinlenmiş p53 proteininin hücrelerden etkili bir şekilde saflaştırıldığını düşündürmektedir (Şekil 2). Daha sonra, hücreler denatüre edici koşullar altında lize edildi ve toplam hücresel ubikitinlenmiş protein, nikel yüklü reçine ile aşağı çekildi. Total hücresel protein, bir anti-HA monoklonal antikoru kullanılarak Western blotting ile tespit edildi ve bir anti-p53 monoklonal antikoru kullanılarak ubikitinlenmiş p53 proteini tespit edildi. Sonuçlar, toplam ubikitinlenmiş protein seviyesinin değişmediğini, ancak Mdm2 bu hücrelerde aşırı eksprese edildikten sonra ubikitinlenmiş p53 protein seviyesinin dramatik bir şekilde arttığını göstermiştir. Bu sonuçlar, ubikitinlenmiş p53 içeren total ubikitin proteinlerinin, denatüre edici koşullar altında hücre lizatlarından etkili bir şekilde aşağı çekildiğini göstermiştir (Şekil 3).
Şekil 1: Her yerde bulunan proteinleri saflaştırmak için kullanılan prosedürlerin bir özeti . (A) Bayrak etiketli p53 (Flag-p53) ve His/HA çift etiketli ubikitin (HH-Ub) proteinlerinin şematik diyagramı. (B) Ubikitinlenmiş proteinler, denatüre olmayan koşullar altında Flag/M2 boncukları ve denatüre edici koşullar altında IMAC ile saflaştırılabilir. Kısaltmalar: His/HA = polihistidin/hemaglutinin; Ub = ubikitin; Bayrak/M2 boncuklar = anti-Bayrak M2 antikor konjuge boncuklar; IMAC = immobilize metal iyonu afinite kromatografisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ubikitinlenmiş p53 proteinleri denatüre olmayan koşullar altında saflaştırıldı. Flag-p53 ekspresyon plazmidi tek başına, HH-Ub ile veya Mdm2 ve HH-Ub ile H1299 hücrelerine transfekte edildi. Toplam p53 proteinleri ve ubikitinlenmiş formlar, hücre ekstraktlarından elde edilen Flag / M2 boncukları tarafından immünoprestite edildi. Elüat, anti-p53 (A) ve anti-HA (B) monoklonal antikorları ile Batı lekelenmesine tabi tutuldu. (C) Ham hücre ekstraktları (Giriş), anti-p53 ve anti-Mdm2 monoklonal antikorları ile Batı lekelenmesine tabi tutuldu. GFP yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Kısaltmalar: HH-Ub = His/HA çift etiketli ubiquitin; HA = hemaglutinin; Bayrak/M2 boncuklar = anti-Bayrak M2 antikor konjuge boncuklar; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ubikitinlenmiş p53 proteinleri denatüre edici koşullar altında saflaştırıldı. Flag-p53 ekspresyon plazmidi tek başına, HH-Ub ile veya Mdm2 ve HH-Ub ile H1299 hücrelerine transfekte edildi. Toplam hücresel ubikitinlenmiş proteinler nikel yüklü reçine ile aşağı çekildi ve daha sonra anti-p53 ve anti-HA monoklonal antikorları ile Batı lekelenmesine tabi tutuldu. (A) Ubikitinlenmiş p53 proteini bir anti-p53 antikoru kullanılarak tespit edildi. (B) Toplam ubikitinlenmiş protein, bir anti-HA antikoru kullanılarak tespit edildi. (C) Ham hücre ekstraktları (Giriş), anti-p53 ve anti-Mdm2 monoklonal antikorları ile Batı lekelenmesine tabi tutuldu. GFP yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Kısaltmalar: HH-Ub = His/HA çift etiketli ubiquitin; HA = hemaglutinin; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ubikitinasyon hemen hemen tüm fizyolojik ve patolojik hücresel süreçlerde kritik bir rol oynar2. Son yıllarda, ubikitinin sinyal yolaklarındaki moleküler rolünü ve ubikitin sistemindeki değişikliklerin farklı insan hastalıklarına nasıl yol açtığını anlamada büyük ilerleme kaydedilmiştir2. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, bu süreçlerde ubikitinasyonun kesin rolleri hakkında fikir vermeye katkıda bulunur. Ubikitin konjuge proteinlerin karışımları, denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırılabilir. Nikel reçineleri kullanan IMAC, denatüre koşulları altında poli-His-etiketli proteinleri saflaştırmak için kullanılabilir. Her yerde bulunan proteinleri denatüre koşullar altında saflaştırmanın amacı, etkileşim ortaklarını hedef proteinlerden atmaktır. Hedef proteinlere bağlanan tüm hücresel bileşenler, denatüre edici koşullar altında elüsyondan silinecektir. Buna karşılık, hedef proteinlere bağlanan bazı hücresel proteinler, doğal koşullar altında elüsyonda tutulabilir ve bu da aşağı akış deneylerine müdahale edebilir. Ubikitinlenmiş proteinler, nikel reçinelerine spesifik olmayan protein bağlanmasını büyük ölçüde azaltan güçlü denatürantların varlığında bile saflaştırılabilir. Buna karşılık, ubikitinlenmiş formları da dahil olmak üzere toplam hedef proteinler, denatüre olmayan koşullar altında antikor konjuge agaroz boncukları kullanılarak epitop etiketleme stratejileri ile saflaştırılabilir. Proteinler daha az katı koşullar altında saflaştırıldı, çünkü bu işlem sırasında antikor aracılı afinite saflaştırması kullanıldı. Hedef proteinler ve ubikitinlenmiş formları, protein veya ubikitine özgü antikorlarla tespit edildi. HA- ve Myc-etiketli proteinler, antikor konjuge agaroz boncukları ile aynı prosedür kullanılarak uygun şekilde saflaştırılabilir. Özellikle, tek veya çoklu monoubikitin zincirlerine sahip proteinleri tespit etmek, proteine özgü antikorlara sahip poliubikitin zincirlerine sahip olanlardan daha kolaydır. Buna karşılık, poliubikitin zincirlerine sahip proteinler, ubikitin spesifik antikorlar tarafından daha kolay tanınabilir.
Her yerde bulunan proteinleri etkili bir şekilde saflaştırmak için, memeli hücrelerinde hedef proteinlerin ekspresyon seviyesi yüksek olmalıdır. Güçlü CMV promotörlerine sahip ekspresyon vektörleri, hücrelerde yüksek düzeyde protein ekspresyonu elde etmek için kullanılabilir. Ek olarak, E3 ubikitin ligaz ve ubikitin, hedef proteinlerle birlikte eksprese edilebilir. Proteinlere ubikitin moieties daha etkili bir şekilde ekleyecektir. 26S proteazomun aktivitesi, hücrelerde ubikitinlenmiş proteinleri biriktirmek için küçük moleküllü inhibitör tarafından bloke edilebilir. Her yerde bulunan proteinlerin reçineye etkili bir şekilde bağlanmasını sağlamak için, hücre ekstraktları, çözeltiyi viskoz olmayan hale getirmek için DNA kompleksini bozmak için kısaca sonikleştirilmelidir. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, denatüre koşulları altında lizis tamponuna düşük konsantrasyonda imidazol eklenmelidir. Çok yüksek moleküler ağırlığa sahip ubikitinlenmiş proteinlerin, denatüre etme ve yeniden katlama işleminden sonra reçine ile bağlanması daha kolaydır. Elüsyonun verimliliğini arttırmak için, daha yüksek bir imidazol konsantrasyonu kullanmaya çalışın. Elüsyonun verimliliği hala son derece düşükse, SDS Laemmli yükleme tamponunda doğrudan kaynatarak ubikitinlenmiş proteinleri etkisiz hale getirmeye çalışın. Reçineye bağlı ubikitinlenmiş proteinlerin çoğu, bu güçlü denatüre tamponunda salınabilir. Her yerde bulunan proteinlerin daha yüksek saflığını elde etmek için, iki aşamalı bir afinite saflaştırması uyarlanabilir. Denatüre olmayan koşullar altında Flag/M2 immünopresipitasyonundan sonra, nikel yüklü reçine ile ikinci bir adım saflaştırma, His etiketli ubikitinlenmiş proteini aşağı çekmek ve ubikitinlenmemiş substratlardan kurtulmak için kullanılabilir. Buna karşılık, denatüre koşulu altında nikel yüklü reçine çekilmesinden sonra, anti-Flag veya anti-HA antikoru konjuge agaroz boncukları ile epitop etiketleme stratejisi kullanılarak hedef proteinleri immünopreprepite etmek için ikinci bir afinite saflaştırma adımı uyarlanabilir.
Ubikitinlenmiş proteinleri tespit etmek için gümüş boyama veya Coomassie boyama yerine daha hassas immünoblotlama kullandık, çünkü bu çalışmada küçük bir saflaştırma ölçeği gerçekleştirdik. Aslında, bazı hücresel proteinler hücrelerde kolayca ubikitine edilmesine rağmen, proteinlerin sadece küçük bir kısmı ubikitin moieties ile bağlanabilir. Bu proteinleri gümüş boyama veya Coomassie boyama ile başarılı bir şekilde tespit etmek için, büyük ölçekte saflaştırma yapılmalıdır. Her yerde bulunan proteinlerin saflığını arttırmak için, ikinci bir afinite saflaştırma adımı da yapılmalıdır. Bu deneyleri yapmadık çünkü bu protokol aracılığıyla saflaştırılan ubikitinlenmiş proteinler, aşağı akış analizlerinin gereksinimini tamamen karşılıyor. Örneğin, ubikitinasyon ile düzenlenen bir hedef protein için spesifik DUB'leri tanımlamak için, büyük miktarda ubikitinlenmiş hedef proteini saflaştırmamız gerekir. Bu proteinler, bir deubikitinasyon tamponunda memeli hücrelerinden saflaştırılmış bireysel DUB'lerle inkübe edilebilir. Bu in vitro yüksek verimli tarama ile, memeli hücrelerinde bir hedef protein için spesifik DUB'leri tanımlayabiliriz.
Tekniğin birkaç sınırlaması vardır. Ubikitinlenmiş proteinler, hedef proteinlerin çok küçük bir bölümünü oluşturur, büyük miktarda ubikitinlenmiş hedef proteini saflaştırmak zordur. Yüksek saflaştırma verimliliği elde etmek için hücrelerdeki protein ekspresyonunu büyütmeye çalışın. Bir alternatif, daha fazla ubikitinlenmiş protein elde etmek için in vitro ubikitinasyon reaksiyonu gerçekleştirmektir. Bazı proteinlerin memeli hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilmesi zordur, bu da daha yüksek miktarlarda ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılmasına başka bir sınırlama getirir. Son olarak, mevcut protokol, plazmid DNA'sı kullanılarak aşırı eksprese edilen etiketli proteinlerin saflaştırılması ile sınırlıdır. Hedef proteinlerin ekspresyon seviyeleri endojen hedef proteinlerinkinden daha yüksektir. Bir hedef proteinin endojen ubikitinasyon durumunu değerlendirmek için, ubikitinlenmiş formlarına sahip proteinler, hücrelerden hedef proteine özgü antikorlar tarafından doğrudan immünopreprepite edilebilir. Anti-ubikitin antikorları, hedef proteinin ubikitinasyon durumunu belirlemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bazı koşullar altında, daha düşük ekspresyon seviyesi, hedef proteinin düşük ubikitinasyon seviyesi veya spesifik antikorların düşük immünopresipitasyon etkinliği, endojen hedef proteinlerin memeli hücrelerinden ubikitinasyon durumunun tespitini sınırlayabilir. Mevcut protokol bunun yerine deneysel bir sistem sağlayabilir.
P53 tümör baskılayıcı protein, normal hücrelerin malign transformasyonunu önlemede kritik bir rol oynar 8,9,10,11. P53'ün stabilitesi, hücrelerde ubikitinasyon aracılı bozulma ile sıkı bir şekilde düzenlenir. Mdm2, doza bağımlı bir şekilde p53 mono- ve poliubikitinasyonu teşvik etmek için bir E3 ubikitin ligaz görevi görür16. Burada, ubikitinlenmiş p53 proteinleri, Mdm2 aşırı ekspresyonu varlığında memeli hücrelerinde denatüre edici ve denatif olmayan koşullar altında saflaştırıldı. Monoubikitinlenmiş p53 proteinleri tercihen anti-p53 monoklonal antikorlarla tespit edilirken, poliubikitinlenmiş formlar ubikitin spesifik antikorlarla kolayca tespit edildi. Poliubikitinlenmiş formların seviyeleri, hücrelerdeki Mdm2 ekspresyonunu yükselterek etkili bir şekilde arttırılabilir. Bu makale, ubikitinasyonun protein fonksiyonunu modüle etmedeki rolünü aydınlatmak için ubikitinlenmiş proteinlerin hazırlanması için ideal bir deneysel sistem sunmaktadır. Ubikitinlenmiş proteinler, bir hedef protein için spesifik DUB'leri tanımlamak ve sinyallemede farklı ubikitin zincirlerinin, örneğin K48 ve K63 bağlantılı zincirlerin rollerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu protokol, protein-protein etkileşimi ve protein kompleksi oluşumunda ubikitinasyonun rollerini araştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81972624) D.L.'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Proteasome inhibitor |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M.
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J.
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J.
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).
