Summary
يصف البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات باستخدام بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان من الخلايا في ظل ظروف صارمة غير مسخ وتغيير طبيعة .
Abstract
Ubiquitination هو نوع من التعديل بعد الترجمة الذي ينظم ليس فقط الاستقرار ولكن أيضا توطين ووظيفة بروتين الركيزة. تحدث عملية الانتشار في كل مكان داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم جميع العمليات البيولوجية الخلوية الأساسية تقريبا. تساعد تنقية البروتينات في كل مكان على التحقيق في دور الوجود في كل مكان في التحكم في وظيفة بروتينات الركيزة. هنا ، يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات مع بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان في ظل ظروف صارمة غير تغيير طبيعة وتغيير الطبيعة. تم تنقية إجمالي بروتين p53 الخلوي الموسوم بالعلم باستخدام الأغاروز المترافق بالأجسام المضادة للعلم في ظل ظروف غير طبيعية. بدلا من ذلك ، تم تنقية البروتين الخلوي الكلي الموسوم في كل مكان باستخدام راتنج مشحون بالنيكل في ظل ظروف تغيير الطبيعة. تم الكشف بنجاح عن بروتينات p53 في كل مكان في الشطف بأجسام مضادة محددة. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تنقية الأشكال المنتشرة في كل مكان من بروتين معين بكفاءة من خلايا الثدييات ، مما يسهل الدراسات حول أدوار الانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة البروتين.
Introduction
Ubiquitin هو بروتين محفوظ تطوريا من 76 من الأحماض الأمينية1،2،3. يوبيكويتين يربط تساهميا بقايا ليسين على البروتينات المستهدفة من خلال الشلالات التي تنطوي على تنشيط (E1) ، واقتران (E2) ، وإنزيمات ligase (E3). يتم تنشيط Ubiquitin أولا بواسطة إنزيم E1 ثم يتم نقله إلى إنزيمات الاقتران E2. بعد ذلك ، تتفاعل أربطة يوبيكويتين E3 مع كل من إنزيمات E2 المحملة باليوبيكويتين وبروتينات الركيزة وتتوسط في تكوين رابطة إيزوببتيد بين الطرف C من يوبيكويتين وبقايا ليسين في الركيزة1،2،3،4،5. يتضمن الوجود في كل مكان ربط شقوق ubiquitin ببقايا اللايسين على بروتينات الركيزة أو على نفسها ، مما يؤدي إلى أحادي البروتين أو تعدد البيئات. تحدث عملية الانتشار هذه داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية. يؤدي الوجود في كل مكان إلى تدهور بروتينات الركيزة عبر نظام يوبيكويتين بروتيازوم1،2،3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، يعدل الانتشار في كل مكان توطين البروتين تحت الخلوي ، وتكوين مركب البروتين ، والاتجار بالبروتين في الخلايا 3,5. يمكن إزالة شقوق Ubiquitin المرتبطة ببروتينات الركيزة عن طريق إنزيمات deubiquitinating (DUBs)6,7. والجدير بالذكر أن الطرق المختلفة التي يتم بها تجميع سلاسل ubiquitin توفر عددا لا يحصى من الوسائل لتنظيم العمليات البيولوجية المختلفة 1,5. لا تزال الأدوار الدقيقة للانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة بروتين الركيزة غير مفهومة بشكل كامل حتى الآن. يساهم تنقية البروتينات في كل مكان في توضيح آثار انتشار البروتين في كل مكان على مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية.
يعد بروتين p53 أحد أهم البروتينات المثبطة للورم ويظهر طفرات جينية أو تعطيلا في جميع أنواع السرطان البشرية تقريبا8،9،10،11. يتم تنظيم استقرار ونشاط P53 بدقة في الجسم الحي من خلال تعديلات ما بعد الترجمة ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، والفسفرة ، والأستيل ، والمثيلة12،13. يحتوي بروتين p53 على عمر نصف قصير يتراوح من 6 دقائق إلى 40 دقيقة في خلايا مختلفة ، والذي ينتج بشكل رئيسي عن تعدد الجزيئات والتحلل البروتيني اللاحق10,12. الماوس المزدوج الدقيقة 2 (Mdm2) هو E3 ubiquitin ligase من p53 الذي يرتبط بنهاية N من p53 لمنع نشاطه النسخي12،14،15. يعزز Mdm2 تعدد البائن والتدهور البروتيني ل p53 للتحكم في استقراره ويحث على تعدد p53 لتسهيل تصديره النووي12،14،15،16. هنا ، يتم استخدام انتشار p53 بوساطة Mdm2 كمثال لتقديم طريقة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات بالتفصيل. يمكن تحديد المنظمين الذين يؤثرون على حالة انتشار البروتينات المستهدفة في كل مكان باستخدام مقايسة الانتشار في الجسم الحي عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط أو هدمها / إخراجها في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البروتينات في كل مكان كركائز لمقايسة deubiquitination في المختبر. يمكن إجراء فحص عالي الإنتاجية لتحديد DUBs محددة للبروتينات المستهدفة عن طريق احتضان ركائز موجودة في كل مكان مع DUBs الفردية. قد تعمل البروتينات الموجودة في كل مكان كسقالة لتجنيد بروتينات الإشارات في الخلايا. يمكن تنقية مركب البروتين المستهدف في كل مكان عن طريق الترسيب المناعي المتسلسل في ظل ظروف التنقية الأصلية وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي. يمكن استخدام البروتوكول الحالي على نطاق واسع للتحقيق في البروتينات الخلوية التي ينظمها الوجود في كل مكان.
تم إنشاء عدة طرق لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان ، والتي تشمل استخدام يوبيكويتين الموسومة بالتقارب ، والأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، والمجالات المعزولة المرتبطة باليوبيكويتين (UBDs)17. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام يوبيكويتين الموسوم بالتقارب كوسيط لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات. يوفر استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة مزايا على الطرق الأخرى. يتم تنقية البروتينات في كل مكان في وجود مسخ قوي ، مما يقلل من الارتباط غير المحدد بالراتنج المشحون بالنيكل عن طريق خطي البروتينات الخلوية وتعطيل تفاعلات البروتين والبروتين. في المقابل ، فإن استخدام الأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، و UBDs المعزولة كوسطاء لا يمكن أن يستبعد بشكل فعال شركاء الربط من البروتين المستهدف لأن التنقية تحتاج إلى إجراء في ظل ظروف أقل صرامة. علاوة على ذلك ، قد تؤدي التنقية أيضا إلى زيادة ارتباط البروتينات غير ذات الصلة باستخدام هذه الوسطاء. بالإضافة إلى ذلك ، هناك ميل ملزم لأنواع ربط ubiquitin المختلفة بالإضافة إلى أحادي ومتعدد الوجود بواسطة بروتينات ملزمة لليوبيكويتين أو UBDsالمعزولة 17. يساهم استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة في سحب جميع البروتينات الخلوية في كل مكان. بدلا من ذلك ، فإن استخدام الأغاروز المقترن بالأجسام المضادة للعلم أو الأجسام المضادة لحمض الهيمونيك المتاح تجاريا يجعل من السهل ترسيب البروتينات المستهدفة واسعة النطاق التي تحمل علامة العلم أو HA في ظل ظروف غير مسخة. يمكن استخدام خطوة تنقية ثانية ، على سبيل المثال ، عن طريق راتنج مشحون بالنيكل يستهدف يوبيكويتين بولي هيس ، للحصول على بروتينات مستهدفة في كل مكان ذات نقاوة عالية للتجارب النهائية. والجدير بالذكر أنه يمكن تكييف استراتيجية تنقية علامات الخاتمة عندما لا يمكن الحصول على جسم مضاد معين لترسيب البروتينات المستهدفة بشكل فعال. أخيرا ، فإن تنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات ، مقارنة بالتنقية في المختبر ، تحتفظ بوضع ربط ubiquitin للبروتينات المستهدفة في ظل ظروف فسيولوجية أكثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم توفير خلايا H1299 من قبل بنك الخلايا الجذعية ، الأكاديمية الصينية للعلوم وثبت أنها سلبية للتلوث الميكوبلازما.
1. ثقافة الخلية
- بالنسبة للمزرعة الأولية ، ضع 1 × 106 خلايا من خط خلايا الورم الغدي الرئوي البشري ، H1299 في طبق بتري 10 سم مع 10-12 مل من وسط RPMI 1640 مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ مضاف جلوتامين ، 1٪ بيروفات الصوديوم ، ومضادات حيوية (100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2. قم بتقسيم الخلايا كل 2-3 أيام اعتمادا على وقت وصولها إلى 80٪ -90٪ التقاء.
- قبل يوم واحد من النقل ، قم بإعداد 6-9 × 106 خلايا لثلاثة أطباق بتري وطبق 2-3 × 106 خلايا في طبق بتري واحد 10 سم يحتوي على 10-12 مل من الوسط لتحقيق التقاء 70٪ -90٪ أثناء النقل.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام خلايا HEK293T لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان نظرا لكفاءتها العالية في النقل ومستوى تعبير البروتين.
2. نقل البلازميد
- أضف 1.5 مل من وسط المصل المختزل في ثلاثة أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل.
- أضف الحمض النووي البلازميد الجاهز للنقل إلى كل أنبوب لعمل التخفيفات على النحو التالي. الأنبوب 1: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، 12 ميكروغرام من المتجه الفارغ ؛ الأنبوب 2: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، و 3 ميكروغرام من بلازميد His-HA-Ub (HH-Ub) ، و 9 ميكروغرام من المتجه الفارغ ؛ الأنبوب 3: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، 3 ميكروغرام من بلازميد HH-Ub ، و 9 ميكروغرام من بلازميد Mdm2. أضف ما مجموعه 0.2 ميكروغرام من بلازميد البروتين الفلوري الأخضر (GFP) إلى كل أنبوب لمراقبة كفاءة النقل.
ملاحظة: يجب إجراء تجربة تجريبية لتحديد الكميات المثلى من البلازميدات اللازمة لتحقيق تعبير البروتين المستهدف الفعال في الخلايا. - أضف 78 ميكرولتر من كاشف نقل الجسيمات الشحمية إلى 4.5 مل من وسط المصل المختزل في أنبوب طرد مركزي آخر لتخفيف الجسيمات الشحمية. امزج جيدا عن طريق تحريك الأنبوب واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- أضف 1.5 mL من محلول الجسيمات الشحمية المخففة إلى كل أنبوب من الخطوة 2.2 التي تحتوي على 1.5 mL من محلول الحمض النووي المخفف. امزج جيدا واربط البلازميدات بالليبوزومات لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. استخدم الحمض النووي البلازميدي: نسبة الجسيمات الشحمية 1: 2 (ميكروغرام: ميكرولتر) لكل عملية نقل.
- تخلصي من الوسط الأصلي من أطباق بتري وأضيفي 9 مل من وسط المصل المختزل إلى كل طبق. أضف 3 مل من خليط الحمض النووي الشحمي إلى كل طبق واخلط المحلول عن طريق هز الطبق برفق ذهابا وإيابا 3x ، ثم اليسار واليمين 3x لتوزيع الخليط بالتساوي في الطبق.
- زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استبدل الوسط بعد 4-6 ساعات واستمر في زراعة الخلايا لمدة 24-36 ساعة.
3. جمع الخلايا
- بعد 24-36 ساعة ، عالج الخلايا ب MG132 بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر لمدة 4-6 ساعات.
ملاحظة: MG132 هو ألدهيد الببتيد الذي يمنع بكفاءة النشاط المحلل للبروتين لمركب البروتيازوم 26S. يمكن زيادة كميات البروتينات الموجودة في كل مكان مع سلاسل البولي يوبيكويتين المرتبطة بالليسين -48 (K48) بعد معالجة الخلايا ب MG132 أو مثبطات البروتيازوم الأخرى. - تخلص من الوسط ، واغسل الخلايا 2x (مع الحرص على عدم طرد الخلايا) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) ، واستنشاق الخلايا باستخدام ماصات مصلية.
- أضف 1 مل من PBS إلى الطبق ، وقم بإزالة الخلايا عن طريق الكشط باستخدام مكشطة نظيفة ، ونقل تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. جهاز طرد مركزي بسرعة 700 × جم لمدة 5 دقائق لجمع كريات الخلايا.
4. تنقية البروتينات في كل مكان في ظل ظروف غير تغيير طبيعة
- تحضير مخزن تحلل العلم (50 مللي مول Tris-HCl (درجة الحموضة 7.9) ، 137 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 1 مللي مول حمض رباعي الخليك ثنائي الأمين الإيثيلين (EDTA) ، 1٪ Triton X-100 ، 0.2٪ ساركوسيل ، و 10٪ جلسرين) مكمل طازجا بكوكتيل مثبط للبروتياز قبل الاستخدام.
- أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل العلم المثلج إلى الخلايا الموجودة في كل أنبوب ، وامزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ، ثم احتضن الخليط على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تخضع الخليط إلى 5-10 نبضات قصيرة من الموجات فوق الصوتية. أداء الموجات فوق الصوتية على الجليد في تردد صوتنة من 20 كيلو هرتز و 80 ٪ السعة مع كل نبضة دائمة لمدة 1 ثانية. احتضان الخليط على دوار بسرعة 40 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي للعينات بالموجات فوق الصوتية عند 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
- حصة 80 ميكرولتر (1/10) من مستخلص الخلية وتخلط مع 20 ميكرولتر من 5x كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) تحميل المخزن المؤقت. تغلى العينات على حرارة 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدم هذه العينات كمجموعة إدخال لمراقبة تعبير البروتين.
- أضف 30 ميكرولتر من حبات الأجسام المضادة M2 المترافقة (Flag / M2) المضادة للعلم إلى مستخلصات الخلايا المتبقية واحتضانها على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل أو طوال الليل.
- جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع الخرز. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل العلم المثلج إلى الخرز واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.
- جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع الخرز. كرر الخطوة 4.7 لمدة 4-6 مرات.
- أضف 40 ميكرولتر من ببتيدات العلم بتركيز نهائي قدره 200 نانوغرام / ميكرولتر إلى الخرز واحتضانها على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة لتقشير البروتينات المرتبطة.
- جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
- أضف 10 ميكرولتر من مخزن تحميل SDS 5x ، وغلي الخليط عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وخزنه في -20 درجة مئوية للنشاف الغربي. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الشطف من الخطوة 4.10 مباشرة عند -80 درجة مئوية لتجارب المصب الأخرى.
ملاحظة: يمكن زيادة كمية البروتينات المنقاة في كل مكان عن طريق زيادة عدد الخلايا وكميات البلازميدات المنقولة. يمكن تكييف استراتيجية وضع العلامات على epitope لتنقية المجمعات الخلوية التي ترتبط على وجه التحديد ب p53 في كل مكان في ظل ظروف التنقية الأصلية. من خلال التعبير المشترك عن Flag-p53 و mdm2 و HA-ubiquitin ، قد يتم ترسيب مركب بروتين p53 في كل مكان بواسطة الأغاروز المتتابع Flag و HA المترافق بالأجسام المضادة من خلايا الثدييات. للحفاظ على شركاء الربط لبروتينات p53 في كل مكان ، يجب استخدام محلول تحلل BC100 الأقل صرامة (20 mM Tris-HCl (pH 7.9) ، 100 mM NaCl ، 10٪ glycerol ، 0.2 mM EDTA ، 0.2٪ Triton X-100 ، و 1x مثبط الأنزيم البروتيني) أثناء عملية التنقية. يخضع الشطف من ببتيد HA لقياس الطيف الكتلي لتحديد جميع الشركاء الذين يرتبطون على وجه التحديد ب p53 في كل مكان.
5. تنقية البروتينات في كل مكان تحت ظروف تغيير طبيعة
- أضف 1 مل من PBS المثلج إلى كريات الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.3 واخلطها بالتساوي. القسمة 100 ميكرولتر (حجم 1/10) من تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق كعينة إدخال.
- جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع كريات الخلية. أضف 80 ميكرولتر من مخزن تحلل العلم إلى عينة الإدخال ، وامزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ، وقم بتحليل الخلايا على الجليد لمدة 1 ساعة.
- جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حاصل 80 ميكرولتر من المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
- أضف 20 ميكرولتر من مخزن تحميل SDS 5x إلى الطافي ، ثم غليه عند 98 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة دقيقتين ، واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- جهاز طرد مركزي 900 ميكرولتر المتبقية من تعليق الخلية عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع حبيبات الخلية. أضف 1 مل من المخزن المؤقت يوبيكويتين 1 (المخزن المؤقت UB 1 ؛ 6 M guanidine-HCI ، 0.1 M Na 2 HPO 4 ، 6.8 mM NaH 2 PO4 ، 10 mM Tris-HCI (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، و0.2٪ Triton X-100 ، مكمل حديثا ب 10 mM β-mercaptoethanol و 5 mM imidazole) إلى كريات الخلية واخلطها عدة مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لتوزيع الخلايا بالتساوي.
ملاحظة: قد يختلف تركيز إيميدازول من 5 مليمول إلى 20 مليمول لتقليل ارتباط البروتين غير النوعي بالراتنج المشحون بالنيكل. يحتوي المخزن المؤقت Ubiquitin على هيدروكلوريد جوانيدين ، الذي يعطل كل من الأربطة و DUBs. β-mercaptoethanol هو سائل واضح عديم اللون مع رائحة قوية غير سارة تشبه البيض الفاسد. سوف يتسبب المحلول عالي التركيز في أضرار جسيمة للغشاء المخاطي والجهاز التنفسي العلوي والجلد والعينين. ارتداء القفازات والنظارات الواقية والعمل في غطاء الدخان. - تخضع الخلية المحللة إلى 10-20 جولات من الموجات فوق الصوتية حتى الحل لم يعد لزجا. أداء الموجات فوق الصوتية على الجليد في تردد صوتنة من 20 كيلو هرتز و 80 ٪ السعة مع كل نبضة دائمة لمدة 1 ثانية. جهاز طرد مركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة في RT ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
- أضف 30 ميكرولتر من الراتنج المشحون بالنيكل إلى المادة الطافية واحتضانها على دوار مضبوط على 15 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات أو طوال الليل في RT. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة في RT لجمع الخرز.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت UB 1 ، واحتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقتين في RT لجمع الخرز.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت ubiquitin 2 (المخزن المؤقت UB 2 ؛ 8 M اليوريا ، 0.1 M Na 2 HPO 4 ، 6.8 mM NaH 2 PO4 ، 10 mM Tris-HCI (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، و0.2٪ Triton X-100) إلى الخرز ، واحتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقتين لجمع الخرز. كرر هذا مرة أخرى.
- إلى الخرز ، أضف 1 مل من PBS ، واحتضن بالتناوب في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة في RT لجمع الخرز. كرر هذا مرة أخرى.
- قم بإذابة البروتينات المرتبطة عن طريق احتضان الخرز ب 40 ميكرولتر من الإيميدازول بتركيز نهائي قدره 0.5 M لمدة 1 ساعة عند RT. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند RT.
- انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف ، وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل 5x SDS ، ثم غليها عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وخزنها في -20 درجة مئوية للنشاف الغربي. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الشطف غير المعالج عند -80 درجة مئوية لتجارب المصب الأخرى.
6. الكشف عن البروتينات المنقاة في كل مكان عن طريق النشاف الغربي
- حل العينات من الخطوتين 4.11 و 5.12 بواسطة كبريتات دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) ، ثم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام الأجسام المضادة المقابلة كما هو موضح18.
- باختصار ، احتضن الغشاء عن طريق غمر 20 مل من محلول الحجب الذي يحتوي على مسحوق حليب defat بنسبة 5٪ في محلول TBST (15 mM Tris-HCI ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.6 ، 4.6 mM Tris-base ، 150 mM NaCI ، مكمل حديثا بنسبة 0.1٪ Tween-20 قبل الاستخدام) في RT لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية في RT لمدة 2 ساعة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم الأجسام المضادة التالية لكل مجموعة. تم استخدام جميع الأجسام المضادة الأولية بتخفيف 1: 1000.
- الكشف عن إجمالي بروتين p53 ، بما في ذلك p53 في كل مكان ، مع جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل p53 بعد الترسيب المناعي باستخدام حبات الأغاروز Flag / M2.
- الكشف عن بروتينات p53 في كل مكان مع الجسم المضاد لحمض الهيمونيك أو الجسم المضاد لليوبيكويتين بعد الترسيب المناعي باستخدام حبات الأغاروز Flag / M2.
- اكتشف بروتينات p53 المنتشرة في كل مكان باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل p53 بعد سحب الراتنج المشحون بالنيكل.
- اكتشف البروتين الكلي في كل مكان باستخدام جسم مضاد مضاد لحمض الهيالورونيك أو جسم مضاد لليوبيكويتين بعد سحب الراتنج المشحون بالنيكل.
- احتضان الغشاء بأجسام مضادة ثانوية مترافقة من بيروكسيديز الفجل (HRP) في RT لمدة 1 ساعة بعد غسل 3x باستخدام محلول TBST لمدة 5 دقائق لكل منهما. تم استخدام جميع الأجسام المضادة الثانوية بتخفيف 1: 3000. بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام المخزن المؤقت TBST 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما بتحريض لطيف.
- بدء نظام التصوير الكيميائي للكشف عن الإشارات من النشاف الغربي. تحضير محلول الركيزة ل HRP عن طريق خلط المحاليل A و B بنسبة 1: 1.
- ضع غشاء النيتروسليلوز في الكاميرا الغامضة ووجهه لأعلى وقم بتغطية محلول الركيزة بالتساوي على الغشاء باستخدام مسدس ماص. حدد إجراء التعرض التلقائي لالتقاط إشارات الإضاءة الكيميائية وضبط وقت التعرض يدويا حتى يتم الحصول على إشارة مثالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الرسم التخطيطي بروتينات يوبيكويتين (HH-Ub) ذات العلامات المزدوجة (HH-Ub) (الشكل 1 أ). يلخص الشكل 1 ب الإجراءات المستخدمة لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان. يمكن ربط يوبيكويتين الموسومة بولي هيه لاستهداف البروتينات في خلايا الثدييات. يمكن تنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان باستخدام حبات Flag / M2 في ظل ظروف غير متغيرة أو عن طريق كروماتوغرافيا تقارب أيون المعادن المجمدة (IMAC) في ظل ظروف تغيير الطبيعة (الشكل 1 ب). تم ترسيب إجمالي بروتين p53 ، بما في ذلك p53 في كل مكان ، بخرز Flag / M2 من خلايا H1299 في ظل ظروف غير طبيعية. زادت الإشارة من بروتين p53 في كل مكان ، والذي يظهر كشريط ملطخ من الوزن الجزيئي المنخفض إلى العالي ، بشكل ملحوظ عندما تم التعبير عن Mdm2 خارج الرحم في هذه الخلايا ، مما يشير إلى أن بروتين p53 في كل مكان قد تم تنقيته بشكل فعال من الخلايا (الشكل 2). بعد ذلك ، تم تحليل الخلايا في ظل ظروف تغيير الطبيعة ، وتم سحب البروتين الخلوي الكلي في كل مكان باستخدام راتنج مشحون بالنيكل. تم الكشف عن البروتين الخلوي الكلي عن طريق النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لحمض الهيمونيك وتم اكتشاف بروتين p53 في كل مكان باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل p53. أظهرت النتائج أن مستوى البروتين الكلي في كل مكان لم يتغير ولكن مستوى بروتين p53 في كل مكان زاد بشكل كبير بعد الإفراط في التعبير عن Mdm2 في هذه الخلايا. أشارت هذه النتائج إلى أن إجمالي بروتينات يوبيكويتين التي تحتوي على p53 في كل مكان تم سحبها بشكل فعال من محللات الخلايا في ظل ظروف تغيير طبيعة (الشكل 3).
الشكل 1: ملخص للإجراءات المستخدمة لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان. (أ) رسم تخطيطي لبروتينات يوبيكويتين (HH-Ub) الموسومة بالعلم (Flag-p53) وبروتينات يوبيكويتين مزدوجة العلامات (HH-Ub). (ب) يمكن تنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان باستخدام خرز Flag/M2 في ظل ظروف غير متغيرة وبواسطة IMAC في ظل ظروف تغيير الطبيعة. الاختصارات: His/HA = بولي هيستيدين / هيماغلوتينين; Ub = يوبيكويتين ؛ خرز العلم / M2 = خرز مترافق للأجسام المضادة M2 ؛ IMAC = كروماتوغرافيا تقارب أيون المعادن المجمد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان في ظل ظروف غير طبيعية. تم نقل بلازميد تعبير Flag-p53 بمفرده ، مع HH-Ub ، أو مع Mdm2 و HH-Ub إلى خلايا H1299. تم ترسيب إجمالي بروتينات p53 والأشكال المنتشرة في كل مكان بواسطة حبات Flag / M2 من مستخلصات الخلايا. تعرض الشطف للنشاف الغربي بأجسام مضادة أحادية النسيلة مضادة ل p53 (A) ومضادة ل HA (B). (ج) تعرضت مستخلصات الخلايا الخام (المدخلات) للنشاف الغربي بالأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 والمضادة ل Mdm2. تم استخدام GFP كعنصر تحكم في التحميل. الاختصارات: HH-Ub = له / HA يوبيكويتين مزدوج العلامات ؛ HA = هيماغلوتينين ؛ خرز العلم / M2 = خرز مترافق للأجسام المضادة M2 ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان في ظل ظروف تغيير الطبيعة. تم نقل بلازميد تعبير Flag-p53 بمفرده ، مع HH-Ub ، أو مع Mdm2 و HH-Ub إلى خلايا H1299. تم سحب إجمالي البروتينات الخلوية في كل مكان باستخدام راتنج مشحون بالنيكل ثم تم إخضاعها للنشاف الغربي بأجسام مضادة أحادية النسيلة مضادة ل p53 ومضادة ل HA. (أ) تم الكشف عن بروتين p53 في كل مكان باستخدام جسم مضاد ل p53. (ب) تم الكشف عن البروتين الكلي في كل مكان باستخدام جسم مضاد لحمض الهيمونيك. (ج) تعرضت مستخلصات الخلايا الخام (المدخلات) للنشاف الغربي بالأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 والمضادة ل Mdm2. تم استخدام GFP كعنصر تحكم في التحميل. الاختصارات: HH-Ub = له / HA يوبيكويتين مزدوج العلامات ؛ HA = هيماغلوتينين ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يلعب الوجود في كل مكان دورا مهما في جميع العمليات الخلوية الفسيولوجية والمرضية تقريبا2. في السنوات الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في فهم الدور الجزيئي لليوبيكويتين في مسارات الإشارات وكيف تؤدي التغييرات في نظام يوبيكويتين إلى أمراض بشرية مختلفة2. تساهم تنقية البروتينات في كل مكان في توفير نظرة ثاقبة للأدوار الدقيقة للانتشار في كل مكان في هذه العمليات. يمكن تنقية مخاليط البروتينات المترافقة يوبيكويتين من الخلايا في ظل ظروف غير تغيير طبيعة وتغيير طبيعة الأسنان. يمكن استخدام IMAC باستخدام راتنجات النيكل لتنقية البروتينات الموسومة بعلامات poly-His. الهدف من تنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان في ظل ظروف تغيير الطبيعة هو التخلص من شركاء التفاعل من البروتينات المستهدفة. سيتم حذف جميع المكونات الخلوية المرتبطة بالبروتينات المستهدفة من الشطف في ظل ظروف تغيير الطبيعة. في المقابل ، قد يتم الاحتفاظ ببعض البروتينات الخلوية المرتبطة بالبروتينات المستهدفة في الشطف في ظل الظروف الأصلية ، مما قد يتداخل مع تجارب المصب. يمكن تنقية البروتينات في كل مكان حتى في وجود مسخ قوي ، مما يقلل بشكل كبير من ارتباط البروتين غير المحدد براتنجات النيكل. في المقابل ، يمكن تنقية إجمالي البروتينات المستهدفة ، بما في ذلك أشكالها في كل مكان ، عن طريق استراتيجيات وضع العلامات على الخاتمة باستخدام حبات الأغاروز المترافقة بالأجسام المضادة في ظل ظروف غير طبيعية. تم تنقية البروتينات في ظل ظروف أقل صرامة لأنه تم استخدام تنقية التقارب بوساطة الأجسام المضادة خلال هذه العملية. تم الكشف عن البروتينات المستهدفة وأشكالها في كل مكان مع الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين أو اليوبيكوتين. يمكن تنقية البروتينات الموسومة ب HA و Myc بسهولة باستخدام نفس الإجراء مع حبات الأغاروز المترافقة بالأجسام المضادة. والجدير بالذكر أنه من الأسهل اكتشاف البروتينات ذات سلاسل monoubiquitin مفردة أو متعددة من تلك التي تحتوي على سلاسل polyubiquitin مع أجسام مضادة خاصة بالبروتين. في المقابل ، يمكن التعرف بسهولة أكبر على البروتينات ذات سلاسل البولي بيوبيكويتين بواسطة الأجسام المضادة الخاصة باليوبيكوتين.
لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان بشكل فعال ، يجب أن يكون مستوى التعبير عن البروتينات المستهدفة مرتفعا في خلايا الثدييات. يمكن استخدام ناقلات التعبير مع مروجي CMV القوي لتحقيق مستويات عالية من التعبير البروتيني في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التعبير عن E3 ubiquitin ligase و ubiquitin مع البروتينات المستهدفة. سيضيف شقوق ubiquitin بشكل أكثر فعالية إلى البروتينات. يمكن حظر نشاط البروتيازوم 26S بواسطة مثبط جزيء صغير من أجل تجميع البروتينات الموجودة في كل مكان في الخلايا. لجعل البروتينات في كل مكان ترتبط بشكل فعال بالراتنج ، يجب أن تكون مستخلصات الخلايا صوتنة لفترة وجيزة لتعطيل مجمع الحمض النووي لجعل المحلول غير لزج. لتقليل الارتباط غير المحدد ، يجب إضافة تركيز منخفض من الإيميدازول إلى مخزن التحلل في ظل ظروف تغيير الطبيعة. من السهل ربط البروتينات الموجودة في كل مكان ذات الوزن الجزيئي العالي جدا بالراتنج بعد إجراء تغيير طبيعة وإعادة الطي. من أجل زيادة كفاءة الشطف ، حاول استخدام تركيز أعلى من إيميدازول. إذا كانت كفاءة الشطف لا تزال منخفضة للغاية ، فحاول التخلص من البروتينات الموجودة في كل مكان عن طريق الغليان مباشرة في مخزن تحميل SDS Laemmli. يمكن استخلاص معظم البروتينات الموجودة في كل مكان والمرتبطة بالراتنج في هذا المخزن المؤقت القوي لتغيير الطبيعة. لتحقيق نقاء أعلى للبروتينات في كل مكان ، يمكن تكييف تنقية التقارب من خطوتين. بعد الترسيب المناعي Flag / M2 في ظل ظروف غير طبيعية ، يمكن استخدام تنقية الخطوة الثانية بواسطة راتنج مشحون بالنيكل لسحب البروتين الموسوم في كل مكان والتخلص من الركائز غير المنتشرة في كل مكان. في المقابل ، بعد سحب الراتنج المشحون بالنيكل تحت ظروف تغيير الطبيعة ، يمكن تكييف خطوة تنقية التقارب الثانية لترسيب البروتينات المستهدفة باستخدام استراتيجية وضع العلامات على الحاشية بواسطة حبات الأغاروز المترافقة المضادة للعلم أو الأجسام المضادة المضادة لحمض الحلقات.
لقد استخدمنا النشاف المناعي الأكثر حساسية بدلا من تلطيخ الفضة أو تلطيخ كوماسي للكشف عن البروتينات الموجودة في كل مكان لأننا أجرينا تنقية صغيرة النطاق في هذه الدراسة. في الواقع ، على الرغم من أن بعض البروتينات الخلوية تنتشر بسهولة في كل مكان في الخلايا ، إلا أنه لا يمكن ربط سوى جزء صغير من البروتينات بأجزاء يوبيكوتين. للكشف بنجاح عن هذه البروتينات عن طريق تلطيخ الفضة أو تلطيخ Coomassie ، يجب إجراء عملية تنقية واسعة النطاق. لزيادة نقاء البروتينات في كل مكان ، يجب أيضا القيام بخطوة تنقية تقارب ثانية. لم نقم بإجراء هذه التجارب لأن البروتينات المنتشرة في كل مكان والتي تم تنقيتها من خلال هذا البروتوكول تلبي تماما متطلبات التحليلات النهائية. على سبيل المثال ، من أجل تحديد DUBs محددة لبروتين مستهدف ينظمه الانتشار في كل مكان ، نحتاج إلى تنقية كمية كبيرة من البروتينات المستهدفة في كل مكان. يمكن تحضين هذه البروتينات مع DUBs الفردية المنقاة من خلايا الثدييات في مخزن مؤقت في كل مكان. من خلال هذا الفحص عالي الإنتاجية في المختبر ، يمكننا تحديد DUBs الخاصة بالبروتين المستهدف في خلايا الثدييات.
هناك العديد من القيود على هذه التقنية. تمثل البروتينات الموجودة في كل مكان جزءا صغيرا جدا من البروتينات المستهدفة ، ومن الصعب تنقية كمية كبيرة من البروتينات المستهدفة في كل مكان. حاول توسيع نطاق تعبير البروتين في الخلايا من أجل تحقيق كفاءة تنقية عالية. البديل هو إجراء تفاعل في المختبر في كل مكان للحصول على المزيد من البروتينات في كل مكان. يصعب التعبير عن بعض البروتينات بشكل كبير في خلايا الثدييات ، مما يضع قيدا آخر على تنقية كميات أكبر من البروتينات الموجودة في كل مكان. أخيرا ، يقتصر البروتوكول الحالي على تنقية البروتينات الموسومة التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط باستخدام الحمض النووي البلازميد. مستويات التعبير للبروتينات المستهدفة أعلى من مستويات تعبير البروتينات المستهدفة الذاتية. لتقييم حالة الانتشار الداخلي للبروتين المستهدف ، يمكن أن تترسب البروتينات بأشكالها المنتشرة في كل مكان بشكل مباشر بواسطة الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف من الخلايا. يمكن استخدام الأجسام المضادة المضادة لليوبيكويتين لتحديد حالة انتشار البروتين المستهدف. ومع ذلك ، في ظل بعض الظروف ، قد يحد مستوى التعبير المنخفض ، أو انخفاض مستوى انتشار البروتين المستهدف ، أو انخفاض كفاءة الترسيب المناعي لأجسام مضادة محددة من اكتشاف حالة الانتشار في كل مكان للبروتينات المستهدفة الذاتية من خلايا الثدييات. قد يوفر البروتوكول الحالي نظاما تجريبيا بدلا من ذلك.
يلعب البروتين الكابت للورم p53 دورا مهما في منع التحول الخبيث للخلايا الطبيعية8،9،10،11. يتم تنظيم استقرار p53 بإحكام عن طريق التدهور بوساطة الوجود في الخلايا. يعمل Mdm2 كإنزيم E3 ubiquitin ligase لتعزيز p53 أحادي وتعدد البائن بطريقة تعتمد على الجرعة16. هنا ، تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان في ظل ظروف تغيير الطبيعة وغير تغيير الطبيعة في خلايا الثدييات في وجود التعبير المفرط Mdm2. تم الكشف عن بروتينات p53 أحادية النقعة بشكل تفضيلي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 ، في حين تم اكتشاف الأشكال متعددة النوى بسهولة باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب ubiquitin. يمكن زيادة مستويات الأشكال متعددة الاستخدامات بشكل فعال عن طريق رفع التعبير عن Mdm2 في الخلايا. توفر هذه الورقة نظاما تجريبيا مثاليا لإعداد البروتينات المنتشرة في كل مكان من أجل توضيح دور الوجود في كل مكان في تعديل وظيفة البروتين. يمكن استخدام البروتينات المنتشرة في كل مكان لتحديد DUBs محددة للبروتين المستهدف وللكشف عن أدوار أنواع مختلفة من سلاسل ubiquitin ، على سبيل المثال ، السلاسل المرتبطة K48 و K63 ، في الإشارات. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في أدوار الانتشار في تفاعل البروتين والبروتين وتكوين البروتين المركب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81972624) إلى D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Proteasome inhibitor |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M.
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J.
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J.
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).
