Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

Protokollet beskriver en steg-för-steg-metod för att rena ubiquitinerade proteiner från däggdjursceller med hjälp av p53-tumörsuppressorproteinet som exempel. Ubiquitinerade p53-proteiner renades från celler under stränga icke-denaturerings- och denatureringsförhållanden.

Abstract

Ubiquitination är en typ av posttranslationell modifiering som reglerar inte bara stabiliteten utan också lokaliseringen och funktionen hos ett substratprotein. Ubiquitinationsprocessen sker intracellulärt i eukaryoter och reglerar nästan alla grundläggande cellulära biologiska processer. Rening av ubiquitinerade proteiner hjälper till att undersöka ubiquitinationens roll för att kontrollera funktionen hos substratproteiner. Här beskrivs ett steg-för-steg-förfarande för att rena ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller med p53-tumörsuppressorproteinet som ett exempel. Ubiquitinerade p53-proteiner renades under stränga icke-denaturerings- och denatureringsförhållanden. Totalt cellulärt flaggmärkt p53-protein renades med anti-flaggantikroppskonjugerad agaros under icke-denaturerande förhållanden. Alternativt renades totalt cellulärt His-märkt ubiquitinerat protein med användning av nickelladdat harts under denatureringsförhållanden. Ubiquitinerade p53-proteiner i eluaterna detekterades framgångsrikt med specifika antikroppar. Med hjälp av denna procedur kan de allestädes närvarande formerna av ett givet protein effektivt renas från däggdjursceller, vilket underlättar studier av ubiquitinationens roller vid reglering av proteinfunktionen.

Introduction

Ubiquitin är ett evolutionärt konserverat protein av 76 aminosyror 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner genom kaskader som involverar aktiverande (E1), konjugerande (E2) och ligas (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveras först av E1-enzymet och överförs sedan till de E2-konjugerande enzymerna. Därefter interagerar E3 ubiquitinligaser med både ubiquitinbelastade E2-enzymer och substratproteiner och förmedlar bildandet av en isopeptidbindning mellan C-terminalen av ubiquitin och en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination involverar bindning av ubiquitindelar till lysinrester på substratproteiner eller till sig själv, vilket leder till proteinmonoubiquitination eller polyubiquitination. Denna ubiquitinationsprocess sker intracellulärt i eukaryoter och reglerar en mängd olika biologiska processer. Ubiquitination resulterar i nedbrytning av substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. Dessutom modulerar ubiquitination protein subcellulär lokalisering, proteinkomplexbildning och proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindelar som ligerats till substratproteiner kan avlägsnas med deubiquitinerande enzymer (DUB)6,7. I synnerhet ger de olika sätten på vilka ubiquitinkedjor monteras en myriad av medel för att reglera olika biologiska processer 1,5. De exakta rollerna för ubiquitination för att reglera substratproteinfunktionen förblir ofullständigt förstådda hittills. Rening av ubiquitinerade proteiner bidrar till att belysa effekterna av proteinubiquitination på en mängd olika cellulära processer.

P53-proteinet är ett av de viktigaste tumörsuppressorproteinerna och uppvisar genetiska mutationer eller inaktivering i nästan alla mänskliga cancerformer 8,9,10,11. p53 stabilitet och aktivitet regleras delikat in vivo genom posttranslationella modifieringar, inklusive ubiquitination, fosforylering, acetylering och metylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid som sträcker sig från 6 min till 40 min i olika celler, vilket huvudsakligen beror på dess polyubiquitination och efterföljande proteasomala nedbrytning10,12. Mus dubbelminut 2 (Mdm2) är en E3 ubiquitinligas av p53 som binder till N-änden av p53 för att hämma dess transkriptionella aktivitet12,14,15. Mdm2 främjar polyubiquitination och proteasomal nedbrytning av p53 för att kontrollera dess stabilitet och inducerar monoubiquitination av p53 för att underlätta dess kärnexport12,14,15,16. Här används Mdm2-medierad p53-ubiquitination som ett exempel för att introducera en metod för rening av ubiquitinerade proteiner från däggdjursceller i detalj. De regulatorer som påverkar målproteinernas ubiquitinationsstatus kan identifieras med hjälp av denna in vivo ubiquitinationsanalys när de överuttrycks eller slås ner/slås ut i däggdjursceller. Dessutom kan ubiquitinerade proteiner användas som substrat för in vitro-deubiquitinationsanalys. En screening med hög genomströmning kan utföras för att identifiera specifika DUB för målproteiner genom att inkubera ubiquitinerade substrat med enskilda DUB. Ubiquitinerade proteiner kan fungera som en byggnadsställning för att rekrytera nedströms signaleringsproteiner i celler. Ett ubiquitinerat målproteinkomplex kan renas genom sekventiell immunoprecipitation under inhemska reningsförhållanden och identifieras med masspektrometri. Det nuvarande protokollet kan användas i stor utsträckning för att undersöka de cellulära proteiner som regleras av ubiquitination.

Flera metoder har etablerats för att rena ubiquitinerade proteiner, som inkluderar användning av affinitetsmärkt ubiquitin, ubiquitinantikroppar, ubiquitinbindande proteiner och isolerade ubiquitinbindande domäner (UBD)17. Här tillhandahåller vi ett protokoll som använder affinitetsmärkt ubiquitin som medlare för att rena ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller. Användningen av poly-His-taggad ubiquitin erbjuder fördelar jämfört med de andra metoderna. Ubiquitinerade proteiner renas i närvaro av starka denatureringsmedel, vilket minskar icke-specifik bindning till nickelladdat harts genom att linjärisera cellulära proteiner och störa protein-proteininteraktioner. Däremot kan användningen av ubiquitinantikroppar, ubiquitinbindande proteiner och isolerade UBD som mediatorer effektivt utesluta bindande partners från målprotein eftersom rening måste utföras under mindre stränga förhållanden. Dessutom kan rening också leda till ökad bindning av orelaterade proteiner med hjälp av dessa mediatorer. Dessutom finns det en bindningsbenägenhet för olika ubiquitinlänktyper samt mono- och poly-ubiquitination av ubiquitinbindande proteiner eller isolerade UBD17. Användningen av poly-His-taggad ubiquitin bidrar till att dra ner alla cellulära ubiquitinerade proteiner. Alternativt gör användningen av kommersiellt tillgänglig anti-flagga eller anti-HA-antikroppskonjugerad agaros det lättare att immunoprecipitera storskaliga flagg- eller HA-märkta målproteiner under icke-denaturerande förhållanden. Ett andra reningssteg, till exempel av nickelladdat harts riktat mot poly-His-märkt ubiquitin, kan användas för att förvärva allestädes närvarande målproteiner med hög renhet för nedströmsexperiment. I synnerhet kan en epitopmärkningsreningsstrategi anpassas när en specifik antikropp inte kan förvärvas för att immunoprecipitera målproteiner effektivt. Slutligen behåller rening av ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller, i jämförelse med rening in vitro, ubiquitinbindningsläget för målproteiner under mer fysiologiska förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: H1299-celler tillhandahölls vänligen av stamcellsbanken, Chinese Academy of Sciences och visade sig vara negativa för mykoplasmakontaminering.

1. Cellodling

  1. För den ursprungliga odlingen, placera 1 x 106 celler av human lungadenokarcinomcellinje, H1299 i en 10 cm petriskål med 10-12 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% glutaminadditiv, 1% natriumpyruvat och antibiotika (100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin). Håll cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5%CO2. Dela cellerna var 2-3: e dag beroende på när de når 80% -90% sammanflöde.
  2. En dag före transfektion, förbered 6-9 x 10 6 celler för tre petriskålar och tallrik 2-3 x 106 celler i en enda 10 cm petriskål innehållande 10-12 ml medium för att uppnå en sammanflöde av 70% -90% under transfektion.
    OBS: HEK293T-celler kan också användas för att rena allestädes närvarande proteiner på grund av deras höga transfektionseffektivitet och proteinuttrycksnivå.

2. Plasmidtransfektion

  1. Tillsätt 1,5 ml reducerat serummedium i tre 15 ml centrifugrör.
  2. Tillsätt plasmid-DNA redo för transfektion till varje rör för att göra utspädningar enligt följande. Rör 1: 1 μg flagg-p53-plasmid, 12 μg tom vektor; Rör 2: 1 μg flagg-p53-plasmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plasmid och 9 μg tom vektor; Rör 3: 1 μg Flag-p53-plasmid, 3 μg HH-Ub-plasmid och 9 μg Mdm2-plasmid. Tillsätt totalt 0,2 μg grön fluorescerande protein (GFP) plasmid till varje rör för att övervaka transfektionseffektiviteten.
    OBS: Ett pilotexperiment bör utföras för att bestämma de optimala mängderna plasmider som behövs för att uppnå effektivt målproteinuttryck i celler.
  3. Tillsätt 78 μl liposomtransfektionsreagens till 4,5 ml reducerat serummedium i ett annat centrifugrör för att späda liposomer. Blanda noggrant genom att snärta till röret och låt stå i 5 min vid rumstemperatur (RT).
  4. Tillsätt 1,5 ml av den utspädda liposomlösningen i varje rör från steg 2.2 innehållande 1,5 ml av den utspädda DNA-lösningen. Blanda noggrant och tvärbinda plasmiderna med liposomerna i minst 20 minuter vid RT. Använd ett plasmid-DNA: liposomförhållande på 1:2 (μg:μL) för varje transfektion.
  5. Kassera det ursprungliga mediet från petriskålarna och tillsätt 9 ml reducerat serummedium i varje skål. Tillsätt 3 ml liposom-DNA-blandningen till varje skål och blanda lösningen genom att försiktigt skaka plattan fram och tillbaka 3x och sedan åt vänster och höger 3x för jämn fördelning av blandningen i plattan.
  6. Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5 %CO2. Byt ut mediet efter 4-6 h och fortsätt att odla cellerna i 24-36 timmar.

3. Cellsamling

  1. Efter 24-36 h, behandla cellerna med MG132 i en slutlig koncentration av 10 μM i 4-6 h.
    OBS: MG132 är en peptidaldehyd som effektivt blockerar den proteolytiska aktiviteten hos 26S-proteasomkomplexet. Mängden proteiner som ubiquitineras med lysin-48 (K48)-länkade polyubiquitinkedjor kan ökas efter att celler behandlats med MG132 eller andra proteasomhämmare.
  2. Kassera mediet, tvätta cellerna 2x (var noga med att inte spola ut cellerna) med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och aspirera cellerna med serologiska pipetter.
  3. Tillsätt 1 ml PBS i skålen, ta bort cellerna genom att skrapa med en ren skrapa och överför cellsuspensionen till mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 700 x g i 5 minuter för att samla cellpellets.

4. Rening av ubiquitinerade proteiner under icke-denatureringsförhållanden

  1. Förbered flagglysbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl och 10% glycerol) nyligen kompletterad med proteashämmare cocktail före användning.
  2. Tillsätt 800 μl iskall flagglysbuffert till cellerna i varje rör, blanda cellerna med hjälp av en virveloscillator eller pipettpistol och inkubera sedan blandningen på en rotator vid 4 °C i 30 minuter.
  3. Utsätt blandningen för 5-10 korta pulser av ultraljud. Utför ultraljud på isen vid en ultraljudsbehandling frekvens av 20 kHZ och 80% amplitud med varje puls varar i 1 s. Inkubera blandningen på en rotator vid 40 varv per minut (rpm) vid 4 °C i 30 minuter.
  4. Centrifugera ultraljudsproverna vid 8,000 x g för 20-30 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
  5. Alikvot 80 μl (1/10) av cellextraktet och blanda med 20 μl 5x natriumdodecylsulfat (SDS) laddningsbuffert. Koka proverna vid 98 °C i 5 minuter, låt svalna på is i 2 minuter och förvara vid -20 °C tills de används. Använd dessa prover som indatagrupp för att övervaka proteinuttryck.
  6. Tillsätt 30 μl anti-flagg M2-antikroppskonjugerade (flagg/M2) pärlor till de återstående cellextrakten och inkubera på en rotator vid 4 °C i minst 4 timmar eller över natten.
  7. Centrifugera vid 1 500 x g i 2 minuter vid 4 °C för att samla upp pärlorna. Tillsätt 1 ml iskall flagglysbuffert till pärlorna och blanda genom att vända röret flera gånger.
  8. Centrifugera vid 1 500 x g i 2 minuter vid 4 °C för att samla upp pärlorna. Upprepa steg 4.7 i 4-6 gånger.
  9. Tillsätt 40 μl flaggpeptider i en slutlig koncentration av 200 ng/μl till pärlorna och inkubera på en rotator vid 4 °C i 2 timmar för att eluera de bundna proteinerna.
  10. Centrifugera vid 1 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
  11. Tillsätt 10 μl 5x SDS-laddningsbuffert, koka blandningen vid 98 °C i 5 minuter, kyl på is i 2 minuter och förvara vid -20 °C för Western blotting. Alternativt kan du lagra eluatet från steg 4.10 direkt vid -80 °C för andra nedströmsexperiment.
    OBS: Mängden renade ubiquitinerade proteiner kan skalas upp genom att öka antalet celler och mängder plasmider som transfekteras. En epitopmärkningsstrategi kan anpassas för att rena cellulära komplex som binder specifikt till allestädes närvarande p53 under inbyggda reningsförhållanden. Genom att samuttrycka Flag-p53, mdm2 och HA-ubiquitin kan det ubiquitinerade p53-proteinkomplexet immunutfällas av sekventiell flagga och HA-antikroppskonjugerad agaros från däggdjursceller. För att hålla bindande partners av ubiquitinerade p53-proteiner bör den mindre stränga BC100-lysbufferten (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glycerol, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 och 1x proteashämmare) användas under reningsprocessen. Eluatet från HA-peptiden utsätts för masspektrometri för att identifiera alla partners som binder specifikt till ubiquitinerad p53.

5. Rening av ubiquitinerade proteiner under denatureringsförhållanden

  1. Tillsätt 1 ml iskall PBS till cellpelletsen som erhålls i steg 3.3 och blanda jämnt. Alikvot 100 μl (1/10 volym) av cellsuspensionen i ett mikrocentrifugrör som ingående prov.
  2. Centrifugera vid 700 x g i 5 minuter vid 4 °C för att samla upp cellpelletsen. Tillsätt 80 μL flagglysbuffert till ingångsprovet, blanda cellerna med en virveloscillator eller pipettpistol och lysera cellerna på is i 1 timme.
  3. Centrifugera vid 8 000 x g i 20–30 minuter vid 4 °C. Alikvotera 80 μL av supernatanten i ett nytt mikrocentrifugrör.
  4. Tillsätt 20 μl 5x SDS-laddningsbuffert till supernatanten, koka vid 98 °C i 5-10 min, svalna på is i 2 min och förvara vid -20 °C tills den används.
  5. Centrifugera de återstående 900 μl av cellsuspensionen vid 700 x g i 5 minuter vid 4 °C för att samla upp cellpelleten. Tillsätt 1 ml ubiquitinbuffert 1 (UB-buffert 1; 6 M guanidin-HCI, 0,1 MNa2HPO4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) och0,2% Triton X-100, nyligen kompletterad med 10 mM β-merkaptoetanol och 5 mM imidazol) till cellpelletsen och blanda flera gånger genom pipettering upp och ner för att jämnt fördela cellerna.
    OBS: Koncentrationen av imidazol kan variera från 5 mM till 20 mM för att minska ospecifik proteinbindning på det nickelladdade hartset. Ubiquitinbuffert innehåller guanidinhydroklorid, som inaktiverar både ligaser och DUB. β-merkaptoetanol är en klar, färglös vätska med en stark, obehaglig lukt som liknar ruttna ägg. En lösning med hög koncentration kommer att orsaka allvarliga skador på slemhinnan, övre luftvägarna, huden och ögonen. Använd handskar och skyddsglasögon och använd i dragskåpet.
  6. Utsätt cellen lysates till 10-20 rundor av ultraljud tills lösningen inte längre är viskös. Utför ultraljud på isen vid en ultraljudsbehandling frekvens av 20 kHZ och 80% amplitud med varje puls varar i 1 s. Centrifugera vid 8 000 x g i 20–30 minuter vid rt och överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
  7. Tillsätt 30 μl nickelladdat harts till supernatanten och inkubera på en rotatorsats vid 15 rpm i 4 timmar eller över natten vid RT. Centrifugera vid 1 500 x g i 2 min vid RT för att samla upp pärlorna.
  8. Tillsätt 1 ml UB-buffert 1, inkubera med rotation i en skakapparat i 10 min vid RT och centrifugera vid 1 500 x g i 2 min vid RT för att samla upp pärlorna.
  9. Tillsätt 1 ml ubiquitinbuffert 2 (UB-buffert 2; 8 M urea, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) och 0,2 % Triton X-100) till pärlorna, inkubera med rotation i en shaker i 10 min vid RT och centrifugera vid 1 500 x g i2minuter för att samla upp pärlorna. Upprepa detta en gång till.
  10. Tillsätt 1 ml PBS till pärlorna, inkubera med rotation i en skakapparat i 10 minuter vid RT och centrifugera vid 1 500 x g i 2 minuter vid RT för att samla upp pärlorna. Upprepa detta en gång till.
  11. Elutbundna proteiner genom inkubering av pärlorna med 40 μl imidazol i en slutlig koncentration av 0,5 M i 1 timme vid RT. Centrifugera vid 1 500 x g i 2 min vid RT.
  12. Överför supernatanten till ett rent mikrocentrifugrör, tillsätt 10 μL 5x SDS-laddningsbuffert, koka vid 98 °C i 5 minuter, kyl på is i 2 minuter och förvara vid -20 °C för Western blotting. Alternativt kan du lagra det obearbetade eluatet vid -80 °C för andra nedströmsexperiment.

6. Detektion av renade ubiquitinerade proteiner genom Western blotting

  1. Lös proverna från steg 4.11 och 5.12 med natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och överför dem sedan till ett nitrocellulosamembran genom Western blotting för att detektera målproteiner med hjälp av motsvarande antikroppar enligt beskrivningen18.
  2. I korthet, inkubera membranet genom att nedsänka i 20 ml blockerande lösning innehållande 5% deflaterat mjölkpulver i TBST-buffert (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-bas, 150 mM NaCI, nyligen kompletterat med 0,1% Tween-20 före användning) vid RT i 1 timme. Inkubera sedan membranet med primära antikroppar vid RT i 2 timmar eller över natten vid 4 °C. Använd följande antikroppar för varje uppsättning. Alla primära antikroppar användes med en spädning av 1:1000.
    1. Upptäck totalt p53-protein, inklusive ubiquitinerad p53, med en monoklonal anti-p53-antikropp efter immunoprecipitation med Flag / M2-agarospärlor.
    2. Upptäck ubiquitinerade p53-proteiner med en anti-HA-antikropp eller anti-ubiquitin-antikropp efter immunoprecipitation med Flag / M2 agarospärlor.
    3. Upptäck ubiquitinerade p53-proteiner med en monoklonal anti-p53-antikropp efter nickelladdad hartsdragning.
    4. Upptäck totalt ubiquitinerat protein med en anti-HA-antikropp eller anti-ubiquitinantikropp efter nickelladdad hartsneddragning.
  3. Inkubera membranet med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerade sekundära antikroppar vid RT i 1 h efter tvättning 3x med TBST-buffert i 5 min vardera. Alla sekundära antikroppar användes vid en utspädning av 1:3000. Tvätta sedan membranet med TBST-buffert 3x i 5 min vardera med försiktig omrörning.
  4. Starta kemiluminescensavbildningssystem för att upptäcka signaler från Western blotting. Bered substratlösningen för HRP genom att blanda lösningarna A och B i förhållandet 1:1.
  5. Placera nitrocellulosamembranet i camera obscura med framsidan uppåt och täck substratlösningen jämnt på membranet med en pipettpistol. Välj den automatiska exponeringsproceduren för att fånga kemiluminescerande signaler och justera exponeringstiden manuellt tills en idealisk signal förvärvas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det schematiska diagrammet visar flaggmärkta p53 (Flag-p53) och His/HA dubbelmärkta ubiquitinproteiner (HH-Ub) (figur 1A). De procedurer som används för att rena ubiquitinerade proteiner sammanfattas i figur 1B. Poly-His-taggat ubiquitin kan ligeras till målproteiner i däggdjursceller. Ubiquitinerade proteiner kan renas med flagg/M2-pärlor under icke-denaturerande förhållanden eller genom immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi (IMAC) under denatureringsförhållanden (figur 1B). Totalt p53-protein, inklusive ubiquitinerat p53, immunutfälldes med Flag/M2-pärlor från H1299-celler under icke-denaturerande förhållanden. Signalen från ubiquitinerat p53-protein, som framträder som ett utsmetat band från låg till hög molekylvikt, ökade markant när Mdm2 ektopiskt uttrycktes i dessa celler, vilket tyder på att ubiquitinerat p53-protein effektivt har renats från celler (Figur 2). Därefter lyserades cellerna under denatureringsförhållanden och totalt cellulärt ubiquitinerat protein drogs ner med nickelladdat harts. Totalt cellulärt protein detekterades genom Western blotting med användning av en monoklonal anti-HA-antikropp och ubiquitinerat p53-protein detekterades med användning av en monoklonal anti-p53-antikropp. Resultaten visade att den totala ubiquitinerade proteinnivån var oförändrad men den ubiquitinerade p53-proteinnivån ökade dramatiskt efter att Mdm2 överuttrycktes i dessa celler. Dessa resultat indikerade att totala ubiquitinproteiner innehållande ubiquitinerad p53 effektivt drogs ner från celllysater under denatureringsförhållanden (figur 3).

Figure 1
Figur 1: En sammanfattning av de procedurer som används för att rena ubiquitinerade proteiner. (A) Schematiskt diagram över flaggmärkta p53 (Flag-p53) och His/HA dubbelmärkta ubiquitinproteiner (HH-Ub). (B) Ubiquitinerade proteiner kan renas med flagg-/M2-pärlor under icke-denatureringsförhållanden och med IMAC under denatureringsförhållanden. Förkortningar: Hans / HA = polyhistidin / hemagglutinin; Ub = ubiquitin; Flagga / M2-pärlor = anti-Flag M2 antikroppskonjugerade pärlor; IMAC = immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Ubiquitinerade p53-proteiner renades under icke-denatureringsbetingelser. Flag-p53-uttrycksplasmiden transfekterades ensam, med HH-Ub, eller med Mdm2 och HH-Ub till H1299-celler. De totala p53-proteinerna och ubiquitinerade formerna immunutfälldes av Flag / M2-pärlor från cellextrakt. Eluatet utsattes för Western blotting med anti-p53 (A) och anti-HA (B) monoklonala antikroppar. (C) Råcellsextrakten (Input) utsattes för Western blotting med anti-p53 och anti-Mdm2 monoklonala antikroppar. GFP användes som lastkontroll. Förkortningar: HH-Ub = Hans / HA dubbelmärkt ubiquitin; HA = hemagglutinin; Flagga / M2-pärlor = anti-Flag M2 antikroppskonjugerade pärlor; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Ubiquitinerade p53-proteiner renades under denatureringsförhållanden. Flag-p53-uttrycksplasmiden transfekterades ensam, med HH-Ub, eller med Mdm2 och HH-Ub till H1299-celler. De totala cellulära ubiquitinerade proteinerna drogs ner med nickelladdat harts och utsattes sedan för Western blotting med anti-p53 och anti-HA monoklonala antikroppar. (A) Ubiquitinerat p53-protein detekterades med användning av en anti-p53-antikropp. (B) Totalt ubiquitinerat protein påvisades med användning av en anti-HA-antikropp. (C) Råcellsextrakten (Input) utsattes för Western blotting med anti-p53 och anti-Mdm2 monoklonala antikroppar. GFP användes som lastkontroll. Förkortningar: HH-Ub = Hans / HA dubbelmärkt ubiquitin; HA = hemagglutinin; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ubiquitination spelar en kritisk roll i nästan alla fysiologiska och patologiska cellulära processer2. Under de senaste åren har stora framsteg gjorts för att förstå ubiquitins molekylära roll i signalvägar och hur förändringar i ubiquitinsystemet leder till olika mänskliga sjukdomar2. Rening av ubiquitinerade proteiner bidrar till att ge insikt i de exakta rollerna för ubiquitination i dessa processer. Blandningarna av ubiquitinkonjugerade proteiner kan renas från celler under icke-denaturerande och denaturerande förhållanden. IMAC med nickelhartser kan användas för att rena poly-Hans-märkta proteiner under denatureringsförhållanden. Målet med att rena ubiquitinerade proteiner under denatureringsförhållanden är att kassera interaktionspartnerna från målproteiner. Alla cellulära komponenter som binder till målproteinerna kommer att raderas från elueringen under denatureringsförhållanden. Däremot kan vissa cellulära proteiner som binder till målproteiner hållas i elueringen under inhemska förhållanden, vilket kan störa nedströmsexperimenten. Ubiquitinerade proteiner kan renas även i närvaro av starka denatureringsmedel, vilket kraftigt minskar ospecifik proteinbindning till nickelhartser. Däremot kan de totala målproteinerna, inklusive deras allestädes närvarande former, renas genom epitopmärkningsstrategier med hjälp av antikroppskonjugerade agarospärlor under icke-denaturerande förhållanden. Proteiner renades under mindre stränga förhållanden eftersom antikroppsmedierad affinitetsrening användes under denna process. Målproteinerna och deras ubiquitinerade former detekterades med protein- eller ubiquitinspecifika antikroppar. HA- och Myc-märkta proteiner kan enkelt renas med samma procedur med antikroppskonjugerade agarospärlor. Det är särskilt lättare att detektera proteiner med enstaka eller flera monoubiquitinkedjor än de med polyubiquitinkedjor med proteinspecifika antikroppar. Däremot kan proteiner med polyubiquitinkedjor lättare kännas igen av ubiquitinspecifika antikroppar.

För att effektivt rena ubiquitinerade proteiner bör uttrycksnivån för målproteiner vara hög i däggdjursceller. Uttrycksvektorer med starka CMV-promotorer kan användas för att uppnå höga nivåer av proteinuttryck i celler. Dessutom kan E3 ubiquitinligas och ubiquitin samuttryckas med målproteinerna. Det kommer att lägga till ubiquitin-enheter mer effektivt till proteinerna. Aktiviteten hos 26S-proteasom kan blockeras av småmolekylär hämmare för att ackumulera allestädes närvarande proteiner i celler. För att göra ubiquitinerade proteiner effektivt binda till hartset, bör cellextrakt kort sonikeras för att störa DNA-komplexet för att göra lösningen icke-viskös. För att minska icke-specifik bindning bör en låg koncentration av imidazol tillsättas lysbufferten under denatureringsbetingelser. De ubiquitinerade proteinerna med mycket hög molekylvikt är lättare att binda med hartset efter denaturerings- och omveckningsproceduren. För att öka effektiviteten av eluering, försök att använda en högre koncentration av imidazol. Om effektiviteten av eluering fortfarande var extremt låg, försök att eluera de allestädes närvarande proteinerna genom att direkt koka i SDS Liemmli-laddningsbuffert. De flesta av allestädes närvarande proteiner bundna till hartset kan elueras i denna starka denatureringsbuffert. För att uppnå en högre renhet av ubiquitinerade proteiner kan en tvåstegs affinitetsrening anpassas. Efter flagg / M2-immunprecipitation under icke-denatureringsförhållanden kan ett andra stegs rening med nickelladdat harts användas för att dra ner His-taggat ubiquitinerat protein och bli av med icke-ubiquitinerade substrat. Däremot, efter nickelladdad hartsneddragning under denatureringstillstånd, kan ett andra affinitetsreningssteg anpassas för att immunoprecipitera målproteinerna med hjälp av epitopmärkningsstrategin med anti-Flag eller anti-HA-antikroppskonjugerade agarospärlor.

Vi har använt känsligare immunoblotting istället för silverfärgning eller Coomassie-färgning för att upptäcka allestädes närvarande proteiner eftersom vi utförde en liten skala av rening i denna studie. Faktum är att även om vissa cellulära proteiner lätt allestädes in i celler, kan endast en liten del av proteinerna ligeras med ubiquitindelar. För att framgångsrikt upptäcka dessa proteiner genom silverfärgning eller Coomassie-färgning bör en stor skala av rening utföras. För att öka renheten hos ubiquitinerade proteiner bör ett andra affinitetsreningssteg också göras. Vi utförde inte dessa experiment eftersom ubiquitinerade proteiner renade genom detta protokoll helt uppfyller kravet på nedströmsanalyser. Till exempel, för att identifiera specifika DUB för ett målprotein som regleras av ubiquitination, måste vi rena en stor mängd ubiquitinerade målproteiner. Dessa proteiner kan inkuberas med enskilda DUB renade från däggdjursceller i en deubiquitinationsbuffert. Genom denna in vitro-screening med hög genomströmning kan vi identifiera DUB: er som är specifika för ett målprotein i däggdjursceller.

Det finns flera begränsningar av tekniken. De ubiquitinerade proteinerna står för en mycket liten del av målproteinerna, det är svårt att rena en stor mängd allestädes närvarande målproteiner. Försök att skala upp proteinuttrycket i celler för att uppnå hög reningseffektivitet. Ett alternativ är att utföra en in vitro ubiquitinationsreaktion för att förvärva mer ubiquitinerade proteiner. Vissa proteiner är svåra att uttryckas starkt i däggdjurscellerna, vilket sätter ytterligare en begränsning för att rena högre mängder ubiquitinerade proteiner. Slutligen är det nuvarande protokollet begränsat till rening av märkta proteiner som överuttrycks med användning av plasmid-DNA. Uttrycksnivåerna för målproteinerna är högre än för de endogena målproteinerna. För att bedöma den endogena ubiquitinationsstatusen för ett målprotein kan proteinerna med sina ubiquitinerade former direkt immunutfällas av målproteinspecifika antikroppar från celler. Anti-ubiquitinantikroppar kan användas för att bestämma ubiquitinationsstatusen för målproteinet. Under vissa omständigheter kan emellertid den lägre uttrycksnivån, målproteinets lägre ubiquitinationsnivå eller den lägre immunoprecipitationseffektiviteten hos specifika antikroppar begränsa detektionen av ubiquitinationsstatus för de endogena målproteinerna från däggdjursceller. Det nuvarande protokollet kan i stället tillhandahålla ett experimentellt system.

P53-tumörsuppressorproteinet spelar en avgörande roll för att förhindra malign transformation av normala celler 8,9,10,11. Stabiliteten hos p53 regleras tätt av ubiquitinationsmedierad nedbrytning i celler. Mdm2 fungerar som en E3 ubiquitinligas för att främja p53 mono- och polyubiquitination på ett dosberoende sätt16. Här renades ubiquitinerade p53-proteiner under denaturerande och icke-denaturerande förhållanden i däggdjursceller i närvaro av Mdm2-överuttryck. De monoubiquitinerade p53-proteinerna detekterades företrädesvis med monoklonala anti-p53-antikroppar, medan de polyubiquitinerade formerna lätt detekterades med ubiquitinspecifika antikroppar. Nivåerna av polyubiquitinerade former kan effektivt ökas genom att höja uttrycket av Mdm2 i celler. Detta papper ger ett idealiskt experimentellt system för beredning av ubiquitinerade proteiner för att belysa rollen av ubiquitination för att modulera proteinfunktionen. Ubiquitinerade proteiner kan användas för att identifiera specifika DUB för ett målprotein och för att avslöja rollerna för olika typer av ubiquitinkedjor, till exempel K48- och K63-länkade kedjor, i signalering. Detta protokoll kan användas för att undersöka rollerna för ubiquitination i protein-proteininteraktion och proteinkomplexbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (81972624) till D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
  2. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  3. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  4. Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
  5. Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
  6. Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
  7. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
  8. Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
  9. Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
  10. Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
  11. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
  12. Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
  13. Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
  14. Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
  15. Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
  16. Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
  17. Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
  18. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).

Tags

Biokemi utgåva 181
Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter