Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rensing av allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

Protokollen beskriver en trinnvis metode for å rense ubiquitinerte proteiner fra pattedyrceller ved hjelp av p53 tumor suppressor protein som et eksempel. Ubiquitinated p53 proteiner ble renset fra celler under strenge nondenaturing og denaturing forhold.

Abstract

Ubiquitination er en type posttranslasjonell modifikasjon som regulerer ikke bare stabiliteten, men også lokaliseringen og funksjonen til et substratprotein. Ubiquitinasjonsprosessen skjer intracellulært i eukaryoter og regulerer nesten alle grunnleggende cellulære biologiske prosesser. Rensing av ubiquitinerte proteiner hjelper undersøkelsen av rollen som ubiquitination i å kontrollere funksjonen av substratproteiner. Her beskrives en trinnvis prosedyre for å rense ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller med p53 tumor suppressor protein som et eksempel. Ubiquitinated p53 proteiner ble renset under strenge nondenaturing og denaturing forhold. Totalt cellulært Flag-merket p53-protein ble renset med anti-Flag antistoffkonjugert agarose under ikke-naturlige forhold. Alternativt ble totalt cellulært His-merket ubiquitinated protein renset ved hjelp av nikkelladet harpiks under denatureringsforhold. Ubiquitinated p53 proteiner i eluates ble vellykket oppdaget med spesifikke antistoffer. Ved hjelp av denne prosedyren kan de ubiquitinerte formene av et gitt protein effektivt renses fra pattedyrceller, noe som letter studier av rollene til ubiquitination i regulering av proteinfunksjon.

Introduction

Ubiquitin er et evolusjonært konservert protein av 76 aminosyrer 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner gjennom kaskader som involverer aktivering (E1), konjugerende (E2) og ligase (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveres først av E1-enzymet og overføres deretter til E2-konjugerende enzymer. Deretter interagerer E3 ubiquitin-ligaser med både ubiquitinbelastede E2-enzymer og substratproteiner og formidler dannelsen av en isopeptidbinding mellom C-terminalen av ubiquitin og en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination innebærer festing av ubiquitin deler til lysinrester på substratproteiner eller til seg selv, noe som fører til protein monoubiquitination eller polyubiquitination. Denne ubiquitinasjonsprosessen skjer intracellulært i eukaryoter og regulerer et stort utvalg av biologiske prosesser. Ubiquitination resulterer i nedbrytning av substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. I tillegg modulerer ubiquitination protein subcellulær lokalisering, proteinkompleksdannelse og proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindeler ligert til substratproteiner kan fjernes ved deubiquitinating enzymer (DUBs) 6,7. Spesielt gir de forskjellige måtene som ubiquitinkjeder er satt sammen et mylder av midler for å regulere ulike biologiske prosesser 1,5. De nøyaktige rollene til ubiquitination i regulering av substratproteinfunksjonen forblir ufullstendig forstått til nå. Rensingen av ubiquitinated proteiner bidrar til å belyse effekten av protein ubiquitination på en rekke cellulære prosesser.

P53-proteinet er et av de viktigste tumorsuppressorproteinene og utviser genetiske mutasjoner eller inaktivering i nesten alle humane kreftformer 8,9,10,11. P53 stabilitet og aktivitet reguleres delikat in vivo ved posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert ubiquitination, fosforylering, acetylering og metylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid fra 6 minutter til 40 minutter i forskjellige celler, noe som hovedsakelig skyldes polyubiquitinering og påfølgende proteasomal nedbrytning10,12. Mus dobbelt minutt 2 (Mdm2) er en E3 ubiquitin ligase av p53 som binder seg til N-enden av p53 for å hemme dens transkripsjonsaktivitet12,14,15. Mdm2 fremmer polyubiquitination og proteasomal nedbrytning av p53 for å kontrollere stabiliteten og induserer monoubiquitination av p53 for å lette sin kjernefysiske eksport12,14,15,16. Her brukes Mdm2-mediert p53 ubiquitination som et eksempel for å introdusere en metode for rensing av ubiquitinerte proteiner fra pattedyrceller i detalj. Regulatorene som påvirker ubiquitinasjonsstatusen til målproteiner, kan identifiseres ved hjelp av denne in vivo ubiquitination-analysen når de overuttrykkes eller slås ned / slås ut i pattedyrceller. I tillegg kan ubiquitinerte proteiner brukes som substrater for in vitro deubiquitination assay. En høy gjennomstrømningsscreening kan utføres for å identifisere spesifikke DUBer for målproteiner ved å inkubere ubiquitinerte substrater med individuelle DUBs. Ubiquitinated proteiner kan fungere som et stillas for å rekruttere nedstrøms signalproteiner i celler. Et ubiquitinated målproteinkompleks kan renses ved sekvensiell immunprecipitation under innfødte renseforhold og identifiseres ved massespektrometri. Den nåværende protokollen kan i stor grad brukes til å undersøke de cellulære proteiner regulert av ubiquitination.

Flere metoder er etablert for å rense ubiquitinerte proteiner, som inkluderer bruk av affinitetsmerkede ubiquitin, ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerte ubiquitinbindende domener (UBDs)17. Her gir vi en protokoll som bruker affinitetsmerket ubiquitin som mediator for å rense ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller. Bruken av poly-His-merket ubiquitin gir fordeler i forhold til de andre metodene. Ubiquitinerte proteiner renses i nærvær av sterke denaturanter, noe som reduserer ikke-spesifikk binding til nikkelladet harpiks ved å linearisere cellulære proteiner og forstyrre protein-protein-interaksjoner. I motsetning til dette kan bruk av ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerte UBDs som mediatorer ikke effektivt utelukke bindende partnere fra målprotein fordi rensing må utføres under mindre strenge forhold. Videre kan rensing også føre til økt binding av ikke-relaterte proteiner ved bruk av disse mediatorene. I tillegg er det en bindende tilbøyelighet for ulike ubiquitinkoblingstyper samt mono- og poly-ubiquitinering av ubiquitinbindende proteiner eller isolerte UBDs17. Bruken av poly-His-merket ubiquitin bidrar til å trekke ned alle cellulære ubiquitinerte proteiner. Alternativt kan bruk av kommersielt tilgjengelige anti-flagg eller anti-HA antistoffkonjugert agarose gjøre det lettere å immunsupplere storskala Flag- eller HA-merkede målproteiner under ikke-naturlige forhold. Et annet rensetrinn, for eksempel ved nikkelladet harpiks rettet mot poly-His-merket ubiquitin, kan brukes til å skaffe ubiquitinated målproteiner med høy renhet for nedstrøms eksperimenter. Spesielt kan en epitop merking rensing strategi tilpasses når et spesifikt antistoff ikke kan erverves for å immunoprecipitate målproteiner effektivt. Endelig beholder rensing av ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller, sammenlignet med rensing in vitro, ubiquitin-koblingsmodusen for målproteiner under mer fysiologiske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: H1299-celler ble vennlig levert av Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences og ble bevist å være negative for mykoplasmaforurensning.

1. Cellekultur

  1. For den opprinnelige kulturen, plasser 1 x 106 celler av human lungeadenokarsinom cellelinje, H1299 i en 10 cm petriskål med 10-12 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutaminadditiv, 1% natriumpyruvat og antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin). Hold cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2. Del cellene hver 2-3 dag, avhengig av når de når 80% -90% sammenløp.
  2. En dag før transfeksjon, tilbered 6-9 x 10 6 celler for tre petriskåler og tallerken 2-3 x 106 celler i en enkelt 10 cm petriskål som inneholder 10-12 ml medium for å oppnå en sammenløp på 70% -90% under transfeksjon.
    MERK: HEK293T-celler kan også brukes til å rense ubiquitinerte proteiner på grunn av deres høye transfeksjonseffektivitet og proteinuttrykksnivå.

2. Plasmid transfeksjon

  1. Tilsett 1,5 ml redusert serummedium i tre 15 ml sentrifugerør.
  2. Legg plasmid DNA klar for transfeksjon til hvert rør for å lage fortynninger som følger. Rør 1: 1 μg Flagg-p53 plasmid, 12 μg tom vektor; Rør 2: 1 μg Flagg-p53 plasmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plasmid og 9 μg tom vektor; Rør 3: 1 μg Flagg-p53 plasmid, 3 μg HH-Ub plasmid og 9 μg Mdm2 plasmid. Tilsett totalt 0,2 μg grønt fluorescerende protein (GFP) plasmid til hvert rør for å overvåke transfeksjonseffektiviteten.
    MERK: Et piloteksperiment bør utføres for å bestemme de optimale mengdene plasmider som trengs for å oppnå effektiv målproteinuttrykk i celler.
  3. Tilsett 78 μL liposomtransfeksjonsreagens til 4,5 ml redusert serummedium i et annet sentrifugerør for å fortynne liposomer. Bland grundig ved å flikke på røret og la det stå i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
  4. Tilsett 1,5 ml av den fortynnede liposomoppløsningen i hvert rør fra trinn 2.2 som inneholder 1,5 ml av den fortynnede DNA-oppløsningen. Bland grundig og krysskoble plasmidene med liposomene i minst 20 minutter ved RT. Bruk et plasmid-DNA: liposomforhold på 1: 2 (μg: μL) for hver transfeksjon.
  5. Kast originalmediet fra petriskålene og tilsett 9 ml redusert serummedium i hver rett. Tilsett 3 ml liposom-DNA-blandingen til hver tallerken og bland løsningen ved å riste platen forsiktig frem og tilbake 3x, og deretter venstre og høyre 3x for jevn fordeling av blandingen i platen.
  6. Dyrk cellene i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Bytt ut mediet etter 4-6 timer og fortsett å dyrke cellene i 24-36 timer.

3. Cell samling

  1. Etter 24-36 timer, behandle cellene med MG132 ved en endelig konsentrasjon på 10 μM i 4-6 timer.
    MERK: MG132 er et peptidaldehyd som effektivt blokkerer den proteolytiske aktiviteten til 26S proteasomkomplekset. Mengden proteiner som er allestedsnærværende med lysin-48 (K48)-bundne polyubiquitinkjeder kan økes etter at cellene er behandlet med MG132 eller andre proteasomhemmere.
  2. Kast mediet, vask cellene 2x (pass på at cellene ikke skylles ut) med iskaldt fosfatbufret saltvann (PBS), og aspirer cellene med serologiske pipetter.
  3. Tilsett 1 ml PBS i fatet, fjern cellene ved å skrape med en ren skrape, og overfør cellesuspensjonen til mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 700 x g i 5 minutter for å samle cellepellets.

4. Rensing av ubiquitinated proteiner under nondenaturing forhold

  1. Forbered Flag lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM etylen diamin tetraeddiksyre (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl, og 10% glyserol) ferskt supplert med proteaseinhibitor cocktail før bruk.
  2. Tilsett 800 μL iskald Flag-lysebuffer til cellene i hvert rør, bland cellene ved hjelp av en virveloscillator eller pipettepistol, og inkuber deretter blandingen på en rotator ved 4 °C i 30 minutter.
  3. Emne blandingen til 5-10 korte pulser av ultralydbehandling. Utfør ultralydbehandling på isen ved en sonikeringsfrekvens på 20 kHz og 80% amplitude med hver puls som varer i 1 s. Inkuber blandingen på en rotator ved 40 omdreininger per minutt (rpm) ved 4 °C i 30 minutter.
  4. Sentrifuge de ultralyderte prøvene ved 8000 x g i 20-30 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør.
  5. Aliquot 80 μL (1/10) av celleekstraktet og bland med 20 μL 5x natriumdodecylsulfat (SDS) belastningsbuffer. Kok prøvene ved 98 °C i 5 minutter, avkjøl på is i 2 minutter og oppbevar ved -20 °C til bruk. Bruk disse prøvene som inngangsgruppe for å overvåke proteinuttrykk.
  6. Tilsett 30 μL anti-Flag M2 antistoffkonjugerte (Flag / M2) perler til de resterende celleekstraktene og inkuber på en rotator ved 4 ° C i minst 4 timer eller over natten.
  7. Sentrifuge ved 1 500 x g i 2 minutter ved 4 °C for å samle perlene. Tilsett 1 ml iskald flagglysebuffer til perlene og bland ved å invertere røret flere ganger.
  8. Sentrifuge ved 1 500 x g i 2 minutter ved 4 °C for å samle perlene. Gjenta trinn 4.7 4-6 ganger.
  9. Tilsett 40 μL flaggpeptider ved en endelig konsentrasjon på 200 ng / μL til perlene og inkuber på en rotator ved 4 ° C i 2 timer for å eluere de bundne proteinene.
  10. Sentrifuge ved 1 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør.
  11. Tilsett 10 μL 5x SDS lastebuffer, kok blandingen ved 98 °C i 5 min, avkjøl på is i 2 min, og oppbevar ved -20 °C for Western blotting. Alternativt kan du lagre eluatet fra trinn 4.10 direkte ved -80 °C for andre nedstrømseksperimenter.
    MERK: Mengden rensede ubiquitinerte proteiner kan skaleres opp ved å øke antall celler og mengder plasmider transfisert. En epitopmerkingsstrategi kan tilpasses for å rense cellulære komplekser som binder seg spesifikt til ubiquitinated p53 under innfødte renseforhold. Ved å uttrykke Flag-p53, mdm2 og HA-ubiquitin, kan det ubiquitinerte p53-proteinkomplekset immunpreduseres av sekvensiell Flag- og HA-antistoffkonjugert agarose fra pattedyrceller. For å holde bindende partnere av ubiquitinated p53-proteiner, bør den mindre strenge BC100 lysisbufferen (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glyserol, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 og 1x proteasehemmer) brukes under renseprosessen. Eluatet fra HA-peptidet blir utsatt for massespektrometri for å identifisere alle partnere som binder seg spesifikt til ubiquitinated p53.

5. Rensing av ubiquitinated proteiner under denatureringsforhold

  1. Tilsett 1 ml iskald PBS til cellepellets oppnådd i trinn 3.3 og bland jevnt. Aliquot 100 μL (1/10 volum) av cellesuspensjonen i et mikrosentrifugerør som inngangsprøve.
  2. Sentrifuge ved 700 x g i 5 minutter ved 4 °C for å samle cellepellets. Tilsett 80 μL flagglysisbuffer i inngangsprøven, bland cellene ved hjelp av en virveloscillator eller pipettepistol, og lys cellene på is i 1 time.
  3. Sentrifuge ved 8 000 x g i 20-30 min ved 4 °C. Aliquot 80 μL av supernatanten inn i et nytt mikrosentrifugerør.
  4. Tilsett 20 μL 5x SDS lastebuffer til supernatanten, kok ved 98 °C i 5-10 minutter, avkjøl på is i 2 minutter og oppbevar ved -20 °C til bruk.
  5. Sentrifuge de resterende 900 μL av cellesuspensjonen ved 700 x g i 5 minutter ved 4 °C for å samle cellepelleten. Tilsett 1 ml ubiquitinbuffer 1 (UB-buffer 1; 6 M guanidin-HCI, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) og0,2% Triton X-100, nysupplert med 10 mM β-merkaptoetanol og 5 mM imidazol) til cellepellets og bland flere ganger ved pipettering opp og ned for å fordele cellene jevnt.
    MERK: Konsentrasjonen av imidazol kan variere fra 5 mM til 20 mM for å redusere uspesifikk proteinbinding på den nikkelladede harpiksen. Ubiquitin buffer inneholder guanidinhydroklorid, som inaktiverer både ligaser og DUBs. β-merkaptoetanol er en klar, fargeløs væske med en sterk, ubehagelig lukt som ligner på råtne egg. En løsning med høy konsentrasjon vil forårsake alvorlig skade på slimhinnen, øvre luftveier, hud og øyne. Bruk hansker og vernebriller og bruk i avtrekksviften.
  6. Utsett cellelysatene til 10-20 runder med ultralydbehandling til løsningen ikke lenger er viskøs. Utfør ultralydbehandling på isen ved en sonikeringsfrekvens på 20 kHz og 80% amplitude med hver puls som varer i 1 s. Sentrifuge ved 8,000 x g i 20-30 min ved RT og overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør.
  7. Tilsett 30 μL nikkelladet harpiks til supernatanten og inkuber på en rotator satt til 15 o / min i 4 timer eller over natten ved RT. Sentrifuge ved 1,500 x g i 2 minutter ved RT for å samle perlene.
  8. Tilsett 1 ml UB-buffer 1, inkuber med rotasjon i en shaker i 10 minutter ved RT, og sentrifuger ved 1 500 x g i 2 minutter ved RT for å samle perlene.
  9. Tilsett 1 ml ubiquitinbuffer 2 (UB-buffer 2; 8 M urea, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) og 0,2 % Triton X-100) til perlene, inkuber med rotasjon i en shaker i 10 minutter ved RT, og sentrifuger ved 1 500 x g i2minutter for å samle perlene. Gjenta dette en gang til.
  10. Til perlene, tilsett 1 ml PBS, inkuber med rotasjon i en shaker i 10 minutter ved RT, og sentrifuge ved 1,500 x g i 2 minutter ved RT for å samle perlene. Gjenta dette en gang til.
  11. Eluere bundne proteiner ved å inkubere kulene med 40 μL imidazol ved en endelig konsentrasjon på 0,5 M i 1 time ved RT. Sentrifuge ved 1 500 x g i 2 minutter ved RT.
  12. Overfør supernatanten til et rent mikrosentrifugerør, tilsett 10 μL 5x SDS lastebuffer, kok ved 98 °C i 5 minutter, avkjøl på is i 2 minutter og oppbevar ved -20 °C for vestlig blotting. Alternativt kan du lagre det ubehandlede eluatet ved -80 °C for andre nedstrømseksperimenter.

6. Påvisning av rensede ubiquitinated proteiner ved Western blotting

  1. Løs prøvene fra trinn 4.11 og 5.12 ved natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og overfør dem deretter til en nitrocellulosemembran ved Western blotting for å oppdage målproteiner ved bruk av de tilsvarende antistoffene som beskrevet18.
  2. Kort sagt, inkuber membranen ved å nedsenke i 20 ml blokkeringsoppløsning som inneholder 5% defat melkepulver i TBST-buffer (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, ferskt supplert med 0,1% Tween-20 før bruk) ved RT i 1 time. Deretter inkuberer du membranen med primære antistoffer ved RT i 2 timer eller over natten ved 4 °C. Bruk følgende antistoffer for hvert sett. Alle primære antistoffer ble brukt ved en fortynning på 1:1000.
    1. Påvis totalt p53-protein, inkludert ubiquitinated p53, med et anti-p53 monoklonalt antistoff etter immunprecipitasjon med Flag/M2 agaroseperler.
    2. Påvis ubiquitinerte p53-proteiner med et anti-HA antistoff eller anti-ubiquitin antistoff etter immunprecipitasjon med Flag/M2 agaroseperler.
    3. Oppdag ubiquitinated p53 proteiner med et anti-p53 monoklonalt antistoff etter nikkelladet harpiks pulldown.
    4. Oppdag totalt ubiquitinated protein med et anti-HA antistoff eller anti-ubiquitin antistoff etter nikkelladet harpiks pulldown.
  3. Inkuber membranen med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugerte sekundære antistoffer ved RT i 1 time etter vask 3x med TBST-buffer i 5 minutter hver. Alle sekundære antistoffer ble brukt ved en fortynning på 1:3000. Vask deretter membranen med TBST-buffer 3x i 5 minutter hver med forsiktig omrøring.
  4. Start kjemiluminescens imaging system for å oppdage signaler fra Western blotting. Klargjør substratløsningen for HRP ved å blande løsninger A og B i forholdet 1: 1.
  5. Plasser nitrocellulosemembranen i camera obscura med forsiden opp og belegg substratløsningen jevnt på membranen ved hjelp av en pipetteringspistol. Velg den automatiske eksponeringsprosedyren for å fange opp kjemiluminescerende signaler og juster eksponeringstiden manuelt til et ideelt signal er oppnådd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det skjematiske diagrammet viser Flag-tagged p53 (Flag-p53) og His/HA dobbeltmerkede ubiquitin (HH-Ub) proteiner (figur 1A). Prosedyrene som brukes til å rense ubiquitinerte proteiner er oppsummert i figur 1B. Poly-His-merket ubiquitin kan ligeres for å målrette proteiner i pattedyrceller. Ubiquitinated proteiner kan renses med Flag / M2 perler under nondenaturing forhold eller ved immobilisert metall ion affinitet kromatografi (IMAC) under denaturerende forhold (figur 1B). Totalt p53-protein, inkludert ubiquitinert p53, ble immunpredusert med Flag/M2-perler fra H1299-celler under ikke-naturlige forhold. Signalet fra ubiquitinated p53-protein, som fremstår som et smurt bånd fra lav til høy molekylvekt, ble markant økt når Mdm2 ble ektopisk uttrykt i disse cellene, noe som tyder på at ubiquitinated p53-protein har blitt effektivt renset fra celler (figur 2). Deretter ble cellene lyset under denaturerende forhold, og totalt cellulært ubiquitinert protein ble trukket ned med nikkelladet harpiks. Totalt cellulært protein ble påvist ved Western blotting med et anti-HA monoklonalt antistoff og ubiquitinert p53 protein ble påvist med et anti-p53 monoklonalt antistoff. Resultatene viste at det totale ubiquitinerte proteinnivået var uendret, men det ubiquitinerte p53-proteinnivået ble dramatisk økt etter at Mdm2 ble overuttrykt i disse cellene. Disse resultatene indikerte at totale ubiquitinproteiner som inneholdt ubiquitinated p53 effektivt ble trukket ned fra cellelysater under denaturerende forhold (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Et sammendrag av prosedyrene som brukes til å rense ubiquitinerte proteiner. (A) Skjematisk diagram over Flag-tagged p53 (Flag-p53) og His/HA dobbeltmerkede ubiquitin (HH-Ub) proteiner. (B) Ubiquitinated proteiner kan renses med Flag / M2 perler under nondenaturing forhold og av IMAC under denaturering forhold. Forkortelser: Hans/HA = polyhistidin/hemagglutinin; Ub = ubiquitin; Flagg/M2-perler = anti-flagg M2 antistoffkonjugerte perler; IMAC = immobilisert metallion affinitetskromatografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Ubiquitinated p53 proteiner ble renset under nondenaturing forhold. Flag-p53-ekspresjonsplasmidet ble transfisert alene, med HH-Ub, eller med Mdm2 og HH-Ub til H1299-celler. De totale p53-proteinene og ubiquitinerte formene ble immunprecipitated av Flag / M2-perler fra celleekstrakter. Eluatet ble utsatt for western blotting med anti-p53 (A) og anti-HA (B) monoklonale antistoffer. (C) Råcelleekstraktene (Input) ble utsatt for Western blotting med anti-p53 og anti-Mdm2 monoklonale antistoffer. GFP ble brukt som lastekontroll. Forkortelser: HH-Ub = Hans/HA dobbeltmerket ubiquitin; HA = hemagglutinin; Flagg/M2-perler = anti-flagg M2 antistoffkonjugerte perler; GFP = grønt fluorescerende protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ubiquitinated p53 proteiner ble renset under denatureringsforhold. Flag-p53-ekspresjonsplasmidet ble transfisert alene, med HH-Ub, eller med Mdm2 og HH-Ub til H1299-celler. De totale cellulære ubiquitinerte proteinene ble trukket ned med nikkelladet harpiks og ble deretter utsatt for vestlig blotting med anti-p53 og anti-HA monoklonale antistoffer. (A) Ubiquitinated p53 protein ble detektert ved hjelp av et anti-p53 antistoff. (B) Totalt ubiquitinert protein ble påvist ved bruk av et anti-HA antistoff. (C) Råcelleekstraktene (Input) ble utsatt for Western blotting med anti-p53 og anti-Mdm2 monoklonale antistoffer. GFP ble brukt som lastekontroll. Forkortelser: HH-Ub = Hans/HA dobbeltmerket ubiquitin; HA = hemagglutinin; GFP = grønt fluorescerende protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ubiquitination spiller en kritisk rolle i nesten alle fysiologiske og patologiske cellulære prosesser2. I de senere år har det blitt gjort store fremskritt i å forstå den molekylære rollen til ubiquitin i signalveier og hvordan endringer i ubiquitin-systemet fører til forskjelligemenneskelige sykdommer. Rensingen av ubiquitinerte proteiner bidrar til å gi innsikt i de nøyaktige rollene til ubiquitination i disse prosessene. Blandingene av ubiquitin-konjugerte proteiner kan renses fra celler under ikke-denaturerende og denaturerende forhold. IMAC ved bruk av nikkelharpikser kan brukes til å rense poly-Hans-merkede proteiner under denatureringsforhold. Målet med å rense allestedsnærværende proteiner under denaturerende forhold er å kaste bort interaksjonspartnerne fra målproteiner. Alle cellulære komponenter som binder seg til målproteinene vil bli slettet fra eluering under denatureringsforhold. I motsetning til dette kan noen cellulære proteiner som binder seg til målproteiner, holdes i eluering under innfødte forhold, noe som kan forstyrre nedstrømseksperimentene. Ubiquitinated proteiner kan renses selv i nærvær av sterke denaturanter, noe som i stor grad reduserer ikke-spesifikk proteinbinding til nikkelharpikser. I motsetning til dette kan de totale målproteinene, inkludert deres ubiquitinerte former, renses ved epitopmerkingsstrategier ved bruk av antistoffkonjugerte agaroseperler under ikke-naturlige forhold. Proteiner ble renset under mindre strenge forhold fordi antistoffmediert affinitetsrensing ble brukt under denne prosessen. Målproteinene og deres ubiquitinerte former ble påvist med protein- eller ubiquitinspesifikke antistoffer. HA- og Myc-merkede proteiner kan enkelt renses ved hjelp av samme prosedyre med antistoffkonjugerte agaroseperler. Spesielt er det lettere å oppdage proteiner med enkle eller flere monoubiquitinkjeder enn de med polyubiquitinkjeder med proteinspesifikke antistoffer. I motsetning til dette kan proteiner med polyubiquitinkjeder lettere gjenkjennes av ubiquitinspesifikke antistoffer.

For effektivt å rense ubiquitinerte proteiner, bør ekspresjonsnivået av målproteiner være høyt i pattedyrceller. Ekspresjonsvektorer med sterke CMV-promotorer kan brukes til å oppnå høye nivåer av proteinuttrykk i celler. I tillegg kan E3 ubiquitin ligase og ubiquitin uttrykkes sammen med målproteinene. Det vil legge ubiquitin moieties mer effektivt til proteiner. Aktiviteten til 26S proteasom kan blokkeres av småmolekylær hemmer for å akkumulere ubiquitinerte proteiner i celler. For å få ubiquitinerte proteiner effektivt til å binde seg til harpiksen, bør celleekstrakter kort sonikeres for å forstyrre DNA-komplekset for å gjøre løsningen ikke-viskøs. For å redusere uspesifikk binding bør en lav konsentrasjon av imidazol tilsettes lysisbufferen under denatureringsforhold. De allestedsnærværende proteinene med svært høy molekylvekt er lettere å knytte seg til harpiksen etter denaturerings- og omfoldingsprosedyren. For å øke effektiviteten av eluering, prøv å bruke en høyere konsentrasjon av imidazol. Hvis effektiviteten av eluering fortsatt var ekstremt lav, prøv å eluere de ubiquitinerte proteinene ved å koke direkte i SDS Laemmli lastbuffer. De fleste av ubiquitinated proteiner bundet til harpiks kan elueres i denne sterke denaturering buffer. For å oppnå en høyere renhet av ubiquitinerte proteiner, kan en to-trinns affinitetsrensing tilpasses. Etter Flag / M2 immunoprecipitation under nondenaturing forhold, kan et andre trinn rensing av nikkel-ladet harpiks brukes til å trekke ned His-merket ubiquitinated protein og kvitte seg med ikke-ubiquitinated substrater. I motsetning til dette, etter nikkelladet harpiksnedtrekk under denatureringstilstand, kan et andre affinitetsrensingstrinn tilpasses for å immunsupplere målproteinene ved hjelp av epitopmerkingsstrategien ved anti-flagg eller anti-HA antistoffkonjugerte agaroseperler.

Vi har brukt mer sensitiv immunoblotting i stedet for sølvfarging eller Coomassie-farging for å oppdage ubiquitinated proteiner fordi vi utførte en liten skala av rensing i denne studien. Faktisk, selv om noen cellulære proteiner lett blir allestedsnærværende i celler, kan bare en liten del av proteiner ligeres med ubiquitindeler. For å kunne oppdage disse proteinene ved sølvfarging eller Coomassie-farging, bør en stor skala av rensing utføres. For å øke renheten av ubiquitinerte proteiner, bør et andre affinitetsrensetrinn også gjøres. Vi utførte ikke disse eksperimentene fordi ubiquitinerte proteiner renset gjennom denne protokollen helt oppfyller kravet om nedstrømsanalyser. For eksempel, for å identifisere spesifikke DUBs for et målprotein regulert av ubiquitination, må vi rense en stor mengde ubiquitinated målproteiner. Disse proteinene kan inkuberes med individuelle DUBs renset fra pattedyrceller i en deubiquitination buffer. Ved denne in vitro high throughput screening, kan vi identifisere DUBs spesifikke for et målprotein i pattedyrceller.

Det er flere begrensninger av teknikken. De ubiquitinerte proteinene står for en svært liten del av målproteiner, det er vanskelig å rense en stor mengde ubiquitinated målproteiner. Prøv å skalere opp proteinuttrykket i celler for å oppnå høy renseeffektivitet. Et alternativ er å utføre en in vitro ubiquitination reaksjon for å skaffe mer ubiquitinated proteiner. Noen proteiner er vanskelige å uttrykke høyt i pattedyrcellene, noe som setter en annen begrensning på rensing av høyere mengder ubiquitinerte proteiner. Endelig er den nåværende protokollen begrenset til rensing av merkede proteiner som overuttrykkes ved bruk av plasmid-DNA. Ekspresjonsnivåene til målproteinene er høyere enn for de endogene målproteinene. For å vurdere den endogene ubiquitinasjonsstatusen til et målprotein, kan proteinene med deres ubiquitinerte former bli direkte immunprecipitated av målproteinspesifikke antistoffer fra celler. Anti-ubiquitin antistoffer kan brukes til å bestemme ubiquitination status for målproteinet. Under noen omstendigheter kan imidlertid det lavere ekspresjonsnivået, det lavere ubiquitinasjonsnivået av målproteinet eller den lavere immunoprecipitasjonseffektiviteten til spesifikke antistoffer begrense påvisning av ubiquitinasjonsstatus for de endogene målproteinene fra pattedyrceller. Den nåværende protokollen kan gi et eksperimentelt system i stedet.

P53 tumor suppressor protein spiller en kritisk rolle i å forhindre ondartet transformasjon av normale celler 8,9,10,11. Stabiliteten til p53 reguleres tett av ubiquitination-mediert nedbrytning i celler. Mdm2 fungerer som en E3 ubiquitin ligase for å fremme p53 mono- og polyubiquitination på en doseavhengig måte16. Her ble allestedsnærværende p53-proteiner renset under denaturerende og ikke-naturlige forhold i pattedyrceller i nærvær av Mdm2-overuttrykk. De monoubiquitinerte p53-proteinene ble fortrinnsvis påvist med anti-p53 monoklonale antistoffer, mens de polyubiquitinerte formene lett ble påvist med ubiquitinspesifikke antistoffer. Nivåene av polyubiquitinated former kan effektivt økes ved å heve uttrykket av Mdm2 i celler. Dette papiret gir et ideelt eksperimentelt system for fremstilling av ubiquitinerte proteiner for å belyse rollen som ubiquitination i modulerende proteinfunksjon. Ubiquitinated proteiner kan brukes til å identifisere spesifikke DUBs for et målprotein og for å avsløre rollene til forskjellige typer ubiquitinkjeder, for eksempel K48- og K63-koblede kjeder, i signalering. Denne protokollen kan brukes til å undersøke rollene til ubiquitination i protein-protein interaksjon og proteinkompleksdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (81972624) til D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
  2. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  3. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  4. Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
  5. Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
  6. Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
  7. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
  8. Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
  9. Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
  10. Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
  11. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
  12. Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
  13. Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
  14. Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
  15. Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
  16. Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
  17. Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
  18. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).

Tags

Biokjemi utgave 181
Rensing av allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter